PRACTICO N1: ESPECTROFOTOMETRIA 1.

- INTRODUCCIN Utilizando trminos quizs excesivamente simplistas puede definirse la espectrofotometra de absorcin, como la medida de la atenuacin que el material a estudiar (muestra) efecta sobre una radiacin incidente sobre el mismo con un espectro definido. En general, las medidas se realizan dentro del espectro comprendido entre 220 y 800 nm, y este espectro, a su vez, puede dividirse en dos amplias zonas: la zona de la radiacin visible, situada por encima de 380 nm, y la zona de la radiacin ultravioleta situada por debajo de estos 380 nm. La regin del infrarrojo se sita por encima de los 800 nm.

La energa de una onda electromagntica est dada por la ecuacin: E = h, donde h es la constante de Planck y v es el nmero de onda (el recproco de la longitud de onda ). La energa de la luz UV y visible es capaz de excitar electrones y electrones no enlazantes desde su estado basal a un nivel energtico mayor (estado excitado) y, en consecuencia, se dice que la molcula que contiene estos electrones absorbe luz a la longitud de onda correspondiente. Generalmente, este tipo de electrones se encuentran en molculas conjugadas (molculas que poseen dobles enlaces separados por un enlace simple). La conjugacin aumenta la longitud de onda de la absorcin al disminuir la diferencia energtica entre el estado basal y el estado excitado, de modo que un dieno conjugado absorbe luz de alrededor de 215 nm, mientras que un compuesto con un alto nmero de enlaces conjugados, como el -caroteno absorbe a 450 nm. La estructura de enlaces conjugados que permite la absorcin de luz se denomina cromforo. Si una luz blanca pasa a travs de una solucin que contiene compuestos que actan como cromforos, ciertas longitudes de onda son absorbidas selectivamente. El color resultante de la solucin se debe a la luz transmitida. La absorcin de luz por parte de una sustancia es una propiedad caracterstica de ella, que puede ser utilizada para su identificacin y cuantificacin, ya que un compuesto determinado tiene un espectro de absorcin caracterstico, por lo tanto la comparacin del espectro de este compuesto puro con los espectros de compuestos conocidos permitir su identificacin.

Leyes de la absorcin de energa radiante Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es absorbida la energa radiante. En trminos generales, puede decirse que hay dos variables capaces de afectar al grado de absorcin: la concentracin del absorbente y la longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a travs de la solucin. La Ley de Lambert - Beer establece que la absorcin es proporcional al nmero de molculas de la sustancia absorbente presente en la solucin por donde pasa el haz electromagntico. La expresin matemtica para esta ley es: A=lc Donde es la absortividad molar (una medida de la radiacin absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda . Cuando la concentracin, c, es expresada en moles por litro se denomina coeficiente de extincin molar y cuando es expresada en gramos por litro coeficiente de extincin especfico. El trmino l representa el espesor de la capa absorbente y est en unidades de cm. Cuando las medidas se efectan utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de cubetas estandarizadas que posean un paso de luz constante) y los efectos pticos debidos a la cubeta son reproducibles, el trmino l de la expresin de la absorbancia se hace constante. Dado que , es tambin constante para un determinado absorbente y una concreta longitud de onda, resulta entonces que la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin: A = k c (k = l) Caractersticas de un espectrofotmetro La medida de absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotmetro:

Estos equipos contienen los siguientes componentes bsicos:

Posee una fuente de luz capaz de emitir luz a las longitudes de onda que se quiere medir. El selector de longitud de onda permite el paso de la luz a la longitud de onda deseada. Una rendija u orificio define la intensidad de luz incidente sobre la muestra dispuesta en una celda o cubeta que posee un dimetro de 1 cm y no interfiere con el paso de la luz, y finalmente, la luz emitida despus de su paso por la celda es cuantificada por un detector. La fuente de luz emite un rango continuo de longitudes de onda y es regulada por voltaje. Generalmente, la luz del rango visible es emitida por una lmpara de tungsteno (340-900 nm) y la luz UV es emitida por una lmpara de deuterio (200-360). Las cubetas empleadas son de vidrio para el rango visible y de cuarzo para el rango UV (el vidrio no es transparente a la luz UV). Los espectrofotmetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje de transmitancia (%T). La relacin entre ambos es: A = 2 - log % T La ventaja fundamental que ofrece el empleo de la Absorbancia en lugar de la Transmitancia es que la relacin existente entre la concentracin y la absorbancia es lineal, cosa que no sucede con el %T.

La absorbancia de una solucin es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentracin se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben tambin a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para

ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de ste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisin. Curvas de calibracin Una curva de calibracin relaciona las A %T con las concentraciones y su empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentracin del absorbente. Siempre que sea posible, es aconsejable la construccin de una curva de calibracin que cubra la zona de concentraciones que se van a encontrar en la prctica. La elaboracin de la curva debe ser la fase primera al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotomtrico. Las concentraciones pueden expresarse en cualquier tipo de unidades de medida; sin embargo, la medida ms conveniente es emplear para las curvas las mismas unidades en las que se debe expresar el resultado final.

Ejemplo: curva de la Hemoglobina. Dado que la Absorbancia es proporcional a la concentracin, tendremos que: A1 / A2 = C1/ C2 Donde: A1 = Absorbancia del problema A2 = Absorbancia de un estndar de concentracin conocida C1 = Concentracin del problema C2 = Concentracin del estndar Concentracin (problema) = A1 (problema) / A2 (estndar)* Concentracin estndar 2.- OBJETIVOS Una de las aplicaciones prcticas de mayor inters de la espectrofotometra de absorcin UV-Visible es la del anlisis cuantitativo, basada en la aplicacin de la ecuacin de Lambert- Beer.
Mediante el siguiente prctico se buscar: - Aprender a usar correctamente el espectrofotmetro - Conocer y aplicar los principios bsicos de la espectrofotometra

3.- PARTE EXPERIMENTAL Uso del espectrofotmetro 1.- Preparacin de soluciones de colorantes: 1.1.- Prepare las siguientes soluciones: a) 250 mL de solucin de Eosina Amarilla al 0,04 % p/v b) 250 mL de solucin de Fuccina cida al 0,05 % p/v c) 500 mL de solucin de Verde Malaquita al 0,05 % p/v 1.2.- A partir de las soluciones anteriores, realice diluciones para preparar: a) 100 mL de solucin de Eosina Amarilla 20 ppm b) 100 mL de solucin de Fuccina cida 5 ppm c) 100 mL de solucin de Verde Malaquita 5 ppm 2.- Realice el espectro de absorcin de su colorante: Para el uso del espectrofotmetro siga las siguientes instrucciones: l. Encendido de lmparas: 1.1.- Lmpara de tungsteno (Zona del visible, 900 a 340 nm), encendido instantneo 1.2.- Lmpara de Deuterio (Zona del UV, 340 a 200 nm aprox), encienda el equipo 30 min antes de usarlo 2. Oprima la tecla A/T/C para accionar el modo absorbancia 3. Seleccionar la longitud de onda con el mando correspondiente. 4. Inserte el blanco en el portaceldas y cierre la puerta del compartimiento de muestras 5. Oprima la tecla 0 ABS para llevar a cero absorbancia 6. Saque el blanco e inserte la muestra problema en el portaceldas, cierre la puerta del compartimiento. 7. Lea la medicin de absorbancia en la pantalla. Importante: las cubetas empleadas en el espectrofotmetro (1 cm de espesor) deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras esmeriladas u opacas. No es conveniente secarlas con papel corriente por el carcter abrasivo de ste sino con un papel suave.
Actividad: Siguiendo las instrucciones anteriores sobre la utilizacin del equipo: - Seleccione una longitud de onda de 400 nm. en el modo absorbancia. - Inserte el blanco y calibre a cero - Saque el blanco, coloque su muestra y determine el valor de absorbancia a 400 nm - Seleccione una nueva longitud de onda en 420 nm - Vuelva a calibrar con el blanco - Lea absorbancia de la muestra a 420 nm - Repita el procedimiento hasta los 700 nm para obtener el espectro visible de su colorante. - Registre sus valores en la siguiente tabla:

- Realice el grfico de la absorbancia en funcin de la longitud de onda en papel milimetrado. 3.- Determine el coeficiente de extincin molar: Cuando tenga el espectro determine la longitud de onda del mximo de absorcin y calibre el equipo a dicha longitud de onda ( mx). Prepare 5 diluciones seriadas de su colorante (1/2, 1/4, 1/8 y 1/16) y mida la absorbancia. No necesita recalibrar el equipo al no cambiar la longitud de onda. Grafique en papel milimetrado absorbancia v/s concentracin y determine el coeficiente de extincin molar de su colorante.