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Fundao Faculdade Federal de Cincia Mdicas de Porto Alegre Disciplina de Gentica Bsica

DOENA DE TAY-SACHS

Caroline Gregoletto Molinari Maria Julia Machline Carrion Melissa Fernanda Steigleder Monitor: Rafael Bonf

Outubro/2001

RESUMO

A Doena de Tay Sachs (DTS) uma gangliosidose na qual h o acmulo de gangliosdeo GM2 nas clulas neuronais. Esse acmulo gangliosdico deve-se a um defeito na enzima hexosaminidase A (Hex A) decorrente de mutaes no seu gene codificador, o gene HEXA, o que resulta em diferentes fentipos (agudo, subagudo, crnico e variante B1). Essa desordem exibe um padro de herana autosmico recessivo e particularmente prevalente entre os judeus Ashkenazi, populao para a qual sugere-se programas de rastreamento. Ainda hoje no h terapia efetiva para a DTS, no entanto, diversas tcnicas tm sido desenvolvidas.

PALAVRAS-CHAVE: Doena de Tay Sachs, gene HEXA, hexosaminidase A, mutaes, judeus Ashkenazi.

ABSTRACT

Tay Sachs Disease is a gangliosidosis in which there is storage of GM2 ganglioside in neurons. This gangliosidic storage is owned to an enzymatic defect in Hex A enzyme due to mutations in its encoding gene, HEXA gene, resulting in different phenotypes (acute, subacute, chronic and B1 variant). This disorder exhibits a recessive autossomic inheritance pattern and it is particularly prevalent between Ashkenazi jews; screening programs are suggested for this population. Yet today there is no effective therapy for Tay Sachs Disease, however, several technics are being developed.

KEYWORDS: Tay Sachs Disease, HEXA gene, hexosaminidase A, mutations, Ashkenazi jews.

INTRODUO

A doena de Tay-Sachs (DTS), uma gangliosidose GM2 que apresenta um padro de herana autossmico recessivo, uma desordem neurodegenerativa, na qual ocorre um acmulo intralisossomal do gangliosdeo GM2 devido deficincia da enzima hexosaminidase A, particularmente nas clulas neuronais. As gangliosidoses GM2 possuem trs formas de apresentao clnica: a DTS e variantes, que so associadas com a deficincia da enzima hexosaminidase A (Hex A), mas com atividade normal da enzima hexosaminidase B (Hex B); a doena de Sandhoff e variantes, que so associadas com a deficincia na atividade de ambas as enzimas Hex A e Hex B e a deficincia da protena GM2 ativador, caracterizada por Hex A e Hex B normais, mas com inabilidade de formar o complexo gangliosdeo GM2/GM2 ativador funcional. A importncia do estudo sobre a DTS deve-se sua alta prevalncia na populao de judeus Ashkenazi, alm do acometimento, apesar de menos significativo, na populao em geral. Alm disso, os fentipos da DTS variam extensamente, desde a forma aguda, ou infantil, doena neurodegenerativa rapidamente progressiva que culmina com a morte antes dos quatro anos de idade; at a forma de incio tardio, subaguda ou crnica, que so condies neurolgicas mais lentamente progressivas compatveis com a sobrevida na infncia ou adolescncia (forma subaguda) ou uma sobrevida, longo prazo,

(forma crnica ou de incio na vida adulta). So reconhecidas, tambm, a variante B1 da DTS e a pseudodeficincia da Hex A. Os programas de rastreamento de heterozigotos e o diagnstico pr-natal auxiliam na diminuio da taxa de incidncia da doena, assim como o aconselhamento gentico esclarece os casais de risco sobre a possibilidade de virem a gerar um concepto afetado e os possveis prognsticos para a criana. Considerando as inovaes das tcnicas diagnsticas, formas de preveno e tratamento da DTS, o presente artigo tem como objetivo uma reviso bibliogrfica atual a respeito dos dados epidemiolgicos, da fisiopatologia, do diagnstico, do tratamento e, principalmente, sobre os aspectos genticos da DTS.

HISTRICO

Em 1881 Warren Tay, oftalmologista britnico, foi o primeiro a perceber as caractersticas clnicas da amaurose infantil idioptica ao observar pontos vermelhocereja na retina de uma criana de um ano de idade com retardo fsico e mental1,2,3. Bernard Sachs, neurologista americano, em 1896, estabeleceu o termo amaurose familiar idioptica, aps notar uma distenso citoplasmtica neuronal, e reconheceu sua prevalncia em Judeus. A compreenso da doena de Tay-Sachs, como ficou conhecida, teve que esperar pelo desenvolvimento de anlises qumicas, bioqumicas e histoqumicas. Isso perdurou at 1930 quando o bioqumico alemo Ernst Klenk identificou o material depositado no crebro de pacientes com amaurose idioptica como um novo grupo de glicoesfingolipdios cidos e nomeou-os como gangliosdeos, porque eram achados em grande quantidade nas clulas ganglionares normais1. O principal composto armazenado nos neurnios o gangliosdeo GM2, o qual foi identificado por Svennerholm em 19621,2. Esta estrutura foi elucidada por Makita e Yamakama e confirmada por Ledeen e Salsman1 . Os nveis de hexosaminidase nos pacientes com Tay-Sachs estavam sempre prximos do normal ou levemente elevados, pois at ento, ainda no eram conhecidas as

duas formas da hexosaminidase e suas propriedades. Na verdade, eram os valores da Hex B que estavam elevados e mascaravam a deficincia de Hex A3. Em 1968, Robinson e Stirling, atravs da tcnica da eletroforese, constataram que a hexosaminidase esplnica humana poderia ser separada em duas formas, uma cida, termolbil hexosaminidase A e uma bsica, termoestvel hexosaminidase B3. Assim, em 1969, Okada, OBrien e Sandhoff demonstraram que a atividade de um componente da hexosaminidase A era ausente em pacientes judeus com a doena de Tay-Sachs. Esses achados logo levaram a um diagnstico bioqumico da doena, ao screening de portadores e ao diagnstico prnatal em gestaes de risco1,2,4. O termo GM2 gangliosidoses foi introduzido por Suzuki e Chen para as desordens caracterizadas pelo acmulo primrio de gangliosdeo GM2 resultante do bloqueio do seu catabolismo1. O perodo corrente da investigao foi estimulado pela purificao das hexosaminidases, pela descrio do metabolismo atravs de experimentos em culturas de fibroblastos e pela clonagem de cDNA e de genes; seguidos por estudos similares com a protena ativadora de GM2, cDNA e genes. O conhecimento da protena primria e das estruturas gnicas proporcionou o entendimento detalhado da biossntese e do processo subcelular das hexosaminidases e do ativador do GM2, abrindo caminho para a definio das gangliosidoses GM2 em termos moleculares1.

EPIDEMIOLOGIA

A doena de Tay-Sachs (DTS), que exibe um padro de herana autossmico recessivo, especialmente prevalente entre os judeus particularmente do leste da Europa (judeus Ashkenazi)1,5. A incidncia da DTS de aproximadamente 1 em 3600 judeus Ashkenazi nascidos nos EUA, nesta a taxa de portadores para a DTS de aproximadamente 1 em 30. Entre os judeus Sephardic e todos os no judeus a incidncia da doena tem sido observada como sendo de aproximadamente 100 vezes menor, correspondendo, ento, a uma menor freqncia de portadores, ou seja, de aproximadamente 1 em 3005,6. A DTS tem sido observada em crianas de todas as etnias, raas e grupos religiosos. Certas populaes que so geneticamente isoladas, como por exemplo, francocanadenses do leste do Vale do Rio So Loureno. Cajuns da Lousiana e os Amish da Pensilvnia tm sido descritos como portadores de mutaes no gene HEXA, com freqncias comparveis ou mesmo maiores do que aquelas observadas nos judeus Ashkenazi6.

O aconselhamento gentico de portadores identificados atravs de programas de screening e monitorizao das gestaes de alto risco tem reduzido a incidncia da DTS na populao dos judeus Ashkenazi da Amrica do Norte em mais de 90% 6. A populao de judeus brasileiros estimada em 90 mil indivduos, atualmente no h programas de screening para a DTS nesta populao. Um estudo realizado no instituto de biocincias da universidade de So Paulo concluiu que a freqncia de portadores dessa doena no Brasil similar a dos outros pases onde o programa de screening para deteco de portadores tem obtido significativo decrscimo na incidncia da doena. Portanto, segundo Rozenberg e Pereira, justifica o implemento do programa de screening para a populao de judeus brasileiros7.

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FISIOPATOLOGIA

1) Aspectos Bioqumicos As gangliosidoses GM2 so um grupo de distrbios herdados causados por excessivo acmulo intralisossomal de gangliosdeos GM2, como, por exemplo, na DTS, e glicolipdios relacionados, particularmente nas clulas neuronais1. O gangliosdeo GM2 formado por uma ceramida, por molculas de glicose, galactose, N-acetilgalactosamina e uma molcula de cido N-acetilneuramnico8. Figura 1 (anexo). Os gangliosdeos so os mais complexos glicoesfingolipdios8, sendo encontrados principalmente nas terminaes nervosas e dendritos neuronais; as clulas gliais, como oligodendrcitos e astrcitos, tambm tm sua singular composio glicosdica. No crebro adulto humano, pelo menos doze diferentes gangliosdios foram identificados, quatro dos quais (GM1, GD1a, GD1b e GT1b) representam 90% do total1. Apesar de suas funes fisiolgicas permanecerem obscuras, gangliosdeos especficos foram implicados como stios ligantes na superfcie celular para toxinas bacterianas e vrus, como co-receptores hormonais para o hormnio tireotrfico, para os fatores de crescimento e para os interferons, e tambm na mobilidade celular. Experimentos recentes mostram que os gangliosdeos tm efeitos neurotognicos e

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neurotrficos, nos quais podem induzir diferenciaes em algumas culturas neuronais primrias e linhagens de clulas neuroblastmicas. Gangliosdeos exgenos tambm facilitam a sobrevida e reparo, in vivo, de neurnios danificados tanto no sistema nervoso central como no sistema nervoso perifrico1. A sntese dos glicoesfingolipdios ocorre por adio seqencial de monmeros glicosila transferidos de acares-nucleotdeos (doadores) para a molcula aceptora. Esse processo ocorre no retculo endoplasmtico (RE) e no complexo de Golgi8. O gangliosdeo GM2 degradado no compartimento lisossomal pela hexosaminidase A, a qual remove o terminal N-acetilgalactosamina. A hexosaminidase A no interage diretamente com o gangliosdeo GM2 ligado membrana celular, necessria a extrao do glicolipdio da membrana celular pelo GM2 ativador, o qual formar com o gangliosdio o complexo GM2ativador/GM2, que hidrossolvel, e o substrato para a hidrlise realizada pela enzima1.Figura 2 (anexo) Existem duas isoenzimas da -hexosaminidase: a Hex A, que possui duas subunidades, e ; e a Hex B, um homodmero da subunidade . Somente a Hex A pode atuar sobre o complexo gangliosdeo GM2/GM2 ativador. Os genes que codificam essas subunidades: gene HEXA, que codifica a subunidade da Hex A; o gene HEXB, que codifica a subunidade da Hex A e da Hex B; ou ainda o gene GM2A que codifica o GM2 ativador; podem sofrer mutaes. Tais alteraes gnicas acarretam deficincias ou defeitos enzimticos que levam ao desenvolvimento de gangliosidoses do tipo GM21,9. O nmero de xons e a localizao das junes xon-ntron nos genes HEXA e HEXB so bastante similares; ademais, as suas seqncias de cDNA codificam protenas que so 60% idnticas. Dessa forma, demonstra-se que esses genes so oriundos de um gene ancestral

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comum, e espera-se que as subunidades e tenham a mesma estrutura tridimensional. Essa hiptese consistente com a habilidade de formar dmeros com especificidade similar a substratos, a partir de qualquer combinao das duas subunidades3. Embora somente as formas dimricas da Hex sejam ativas, a existncia de duas isoenzimas Hex indica que cada subunidade contm todos os elementos necessrios para formar um stio ativo. Os stios ativos associados com ambas subunidades e hidrolizam muitos dos mesmos substratos naturais e artificiais como o MUG (4- metilumbeliferil 2acetamido-2-deoxi--D-glicopiranosdio).Entretanto somente a presena do stio ativo associado com a subunidade resulta na hidrlise eficiente dos substratos carregados negativamente como o gangliosdio GM2 e o 4-MUGS (2-acetamido-2-deoxi--Dglicopiranosdio-6-sulfato)3. As hexosaminidases e o GM2 ativador so glicoprotenas sintetizadas no lmen do retculo endoplasmtico e processadas pelo complexo de Golgi. Elas so transportadas via receptor da manose 6-fosfato para o lisossomo, onde so processadas at a sua forma final madura1. Em uma deficincia herdada de uma enzima funcional, o catabolismo de seu substrato permanece incompleto, levando ao acmulo de metablitos insolveis, parcialmente degradados, dentro do lisossomo. Abarrotadas de macromolculas incompletamente digeridas, estas organelas tornam-se grandes e suficientemente numerosas para interferir no funcionamento normal das clulas, originando os chamados distrbios do armazenamento lisossmico10.Figura 3 (anexo). Um desses distrbios a DTS, a qual apresenta uma deficincia ou defeito na subunidade da hexosaminidase A,

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levando ao depsito do gangliosdeo GM2 nas clulas neuronais, o que explica as manifestaes neurolgicas observadas nesse transtorno1,10.

2) Aspectos Patolgicos De maneira geral, a patologia bastante similar na DTS, na Doena de Sandhoff e na deficincia do GM2 ativador; exceto na Doena de Sandhoff h o evidente comprometimento visceral. A alterao celular mais pronunciada a presena de neurnios distendidos por todo o sistema nervoso, com acmulo macio de material de armazenamento nos lisossomos1. Os achados patolgicos na DTS caracterizam-se primariamente pelo

entumescimento neuronal, constitudo por lisossomos extremamente distendidos, repletos de gangliosdeos GM2 e secundariamente por glioses a qual a fonte provvel da macrocefalia. O acmulo do gangliosdeo GM2 ocorre principalmente nos neurnios do sistema nervoso central e sistema nervoso autnomo, bem como na retina particularmente nas margens da mcula, surge, ento, um ponto vermelho-cereja na mcula, representando a acentuao da cor normal da coride macular contrastada com a palidez produzida pelas clulas ganglionares ingurgitadas no restante da retina. Apesar da hepatoesplenomegalia ausente, clulas carregadas de lipdios so identificveis no fgado, bao e pulmes
2,10

. Nos pacientes com a forma infantil da DTS o acmulo gangliosdico

pode representar at 12% do peso seco cerebral. Pacientes com a forma crnica apresentam menor acmulo gangliosdico e esse, pode mesmo ser restrito a regies cerebrais especficas como, por exemplo, o hipocampo, os ncleos do tronco cerebral e a medula espinhal6.

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A microscopia eletrnica revela corpos citoplasmticos membranosos (MCB), compostos de camadas concntricas de membranas densas por todo citoplasma dos neurnios envolvidos1. Apesar dos MCB estarem presentes na grande maioria dos casos, no estudo de Hunda et al., esse achado histopatolgico no foi observado, tanto devido ao incio tardio da doena nos casos relatados como pela escassez dos axnios envolvidos11.

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MANIFESTAES CLNICAS

As diferentes variantes da DTS, assim como outras formas de gangliosidoses GM2, foram subclassificadas clinicamente de acordo com a idade de incio dos sintomas em forma infantil, juvenil e adulta. Entretanto, a diferenciao entre as formas juvenil e adulta geralmente difcil e at mesmo arbitrria, j que muitos pacientes com apresentao na idade adulta relatam sintomas desde a infncia1. Acentuada heterogeneidade fenotpica encontrada mesmo nos membros de uma mesma famlia1,6,11. Todavia, h relato de homogeneidade fenotpica entre todos os membros afetados de uma mesma famlia11.

1) Forma Aguda ou Infantil da DTS: Na forma aguda da DTS, as crianas afetadas so aparentemente normais ao nascimento. Os primeiros sinais da doena geralmente apreciados em retrospecto so uma moderada fraqueza motora que aparece entre os trs e seis meses de idade em conjunto com as contraes mioclnicas e uma exagerada reao aos sons agudos (startle reaction)1,2,6. Essa reao caracterizada por uma sbita extenso das extremidades inferiores e superiores, semelhante aos componentes iniciais do reflexo de Moro normal1. Entre os sexto e o dcimo ms de idade, a criana no consegue adquirir novas habilidades motoras ou, at mesmo, perde as habilidades previamente demonstradas6,12; a

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progressiva fraqueza e hipotonia associadas com um pobre controle da cabea, dificuldade de engatinhar e sentar so geralmente os fatores que levam os pais a procurar ateno mdica1,2. A acuidade visual diminuda e movimentos oculares no usuais esto associados com palidez excessiva da mcula perifoveal da retina com proeminncia da fvea centralis, a to chamada mancha vermelho-cereja (cherry-red spot)1,2,6,12, que imediatamente leva possibilidade da DTS ou outra doena neurodegenerativa de depsito. Apesar de no ser patognomnica das gangliosidoses GM2 infantis, esse achado visto em virtualmente todos os pacientes com DTS infantil ou Doena de Sandhoff1 e pode desaparecer com o tempo2. Alm dessas manifestaes tpicas, h relato de um caso com presena de ptose unilatera12. Aps o oitavo ms, a progresso da doena rpida. Este perodo se caracteriza pela diminuio dos movimentos voluntrios espontneos e a criana torna-se progressivamente menos responsiva aos pais e ao ambiente. A viso deteriora rapidamente1,6, embora a habilidade para distinguir entre o claro e o escuro pode ser preservada1. Convulses so comuns por volta do dcimo segundo ms de vida1,6, convulses parciais sutis1,6,12 ou crises de ausncia tipicamente tornam-se mais freqentes e mais severas com o tempo. As mudanas eletroencefalogrficas so relativamente moderadas at o primeiro ano de vida, a partir de ento, mostram deteriorao rapidamente progressiva at a morte 1,6. Macrocefalia progressiva tipicamente inicia por volta do dcimo oitavo ms de vida; resultante de gliose cerebral reativa, e dessa forma difere da hidrocefalia verdadeira com aumento ventricular1.

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Deteriorao no segundo ano de vida, invariavelmente, leva postura de decerebrao, dificuldade em engolir, atividade convulsgena crescente e, finalmente, a um estado completamente no responsivo - estado vegetativo1. O bito usualmente causado por broncopneumonia1,6, resultante de estase ou aspirao, juntamente com depresso do reflexo da tosse. Usualmente, crianas que sofrem de gangliosidoses GM2 infantis no sobrevivem alm do quarto ano de vida, entretanto, conhecido um caso de sobrevivncia at o sexto ano de vida1. Esse curso agudo e mais agressivo deve-se a uma inexistente ou pequena atividade da enzima Hex A.

2) Forma subaguda ou Juvenil da DTS: A forma subaguda da DTS marcada pelo desenvolvimento de ataxia e incoordenao que ocorre entre os dois e os dez anos de idade. Regresso do desenvolvimento e demncia, envolvendo particularmente a fala e as capacidades vitais e declnio da cognio so caractersticas proeminentes nessa variante. Alm do progressivo retardo motor, o curso da doena caracterizado pelo aumento da espasticidade e aparecimento de convulses, principalmente no final da primeira dcada de vida. A perda da viso, nesta forma, ocorre mais tardiamente em comparao com a forma aguda, e a degenerao da mcula (cherry-red spot) no freqentemente encontrada. Ao invs disso, atrofia ptica e retinite pigmentosa podem ser vistas tardiamente com a progresso dessa forma1.

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Um estado vegetativo com rigidez de decerebrao desenvolve-se entre o dcimo e o dcimo quinto ano de vida, seguido pela morte dentro de poucos anos, freqentemente devido a uma intercorrncia infecciosa1,6. Em alguns casos, essa doena apresenta um curso particularmente agressivo, culminando com a morte entre os dois e os quatro anos de idade. Esse fentipo da forma subaguda tem sido descrito em pacientes com mutao no gene HEXA ou no gene HEXB1,6.

3) Forma Crnica ou Adulta da DTS: A apresentao crnica da DTS caracterizada por uma neurodegenerao progressiva lenta associada com baixos nveis de atividade residual da enzima Hex A. A idade de incio varia desde a primeira infncia at o final da primeira dcada. Os fentipos descritos variam conforme o local, a intensidade e a extenso do comprometimento do sistema nervoso central; entretanto, em virtualmente todos os casos, h evidncia de envolvimento amplo desse sistema, resultando em sobreposio entre os diferentes fentipos. Os primeiros sintomas podem variar desde fraqueza muscular at achados extrapiramidais e manifestaes cerebelares alteradas, regresso psicomotora pode ser menos proeminente. Em alguns pacientes sinais extrapiramidais de distonia, coreoatetose, e ataxia podem ser evidentes. Em outros pacientes, sinais cerebelares de disartria, ataxia, descoordenao motora e anormalidades posturais desenvolvem-se entre dois e dez anos de idade, entretanto, fala e pensamento tendem a ser envolvidos tardiamente no curso da

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doena. Essa apresentao clnica pode sugerir possveis diagnsticos diferenciais: degenerao espinocerebelar, ataxia de Friedriech, ou esclerose lateral amiotrfica (ALS). Pacientes com a forma adulta da doena tendem a mostrar fraqueza muscular, fasciculaes, e disartria indistingveis da forma progressiva da atrofia espino-muscular13 de incio na adolescncia (Doena de Kugelberg-Welander) ou incio precoce da ALS1,6. Aproximadamente 40% dos pacientes tm manifestaes psiquitricas (sem demncia)
1,6,14

incluindo depresso psictica recorrente, sintomas bipolares e esquizofrenia aguda

com desorganizao do pensamento, agitao, alucinaes e parania1,6 Esse curso lento das formas de incio tardio da DTS devido presena de alguma atividade hidroltica residual da enzima Hex A sobre o gangliosdeo GM2.

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ASPECTOS GENTICOS

1) Padro de Herana A DTS exibe um padro de herana autossmica recessivo, pois se enquadra dentro dos critrios que definem essa herana15. Entre os critrios para a herana autossmica recessiva podemos incluir: 1)um fentipo autossmico recessivo, caso aparea em mais de um membro de uma famlia, encontrado tipicamente apenas na irmandade do probando, no nos pais, filhos ou outros parentes; 2)o risco de recorrncia para cada irmo do probando de um em quatro; 3)para a maioria dos distrbios autossmicos recessivos, ambos os sexos tm a mesma probabilidade de ser afetados; 4)os pais do indivduo afetado em alguns casos so consangneos, isto especialmente provvel se o gene responsvel pela afeco for raro na populao; o que no pode ser aplicado DTS na populao do judeus Ashkenazi devido a presena do heterozigoto e pelo fato de comporem uma populao fechada, facilitando o casamento entre esses heterozigotos, entretanto, na populao em geral esse critrio vlido15. Diversamente dos distrbios autossmicos dominantes, nos quais as pessoas afetadas geralmente so heterozigotas, os distrbios autossmicos recessivos expressam-se

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apenas em homozigotos, que, portanto devem ter herdado um alelo mutante de cada genitor. Heterozigotos para doenas autossmicas recessivas so completamente assintomticos15.

2) Estrutura do Gene HEXA O gene HEXA, identificado no cromossomo 15q23-q244, o responsvel pela codificao da subunidade da enzima Hex A1. formado por, aproximadamente, 26Kb635Kb3 e composto por 14 xons e 13 ntrons6.Sua regio promotora rica em guanina e citosina e contm possveis TATA e CAAT Box. O gene HEXA transcrito em dois RNAm ambos os quais codificam o mesmo prepro--polipeptdeo3. Vrios alelos foram identificados no lcus da subunidade , cada um associado a um grau varivel de deficincia enzimtica e, portanto, com manifestaes clnicas diversas10. Como a seqncia primria de aminocidos das cadeias e foram determinadas, tornou-se bvio, mesmo para uma pequena quantidade de seqncias estabelecidas, que elas compartilham de um grande grau de estruturas primrias homlogas. A comparao das seqncias aproximadamente completas revelou um total de 57% de homologia. Da mesma forma, as estruturas dos genes HEXA (que codifica a subunidade ) e HEXB (que codifica a subunidade ) demonstraram um impressionante grau de homologia entre os nmeros e a localizao das junes xon-ntron. Apesar do fato dos genes localizarem-se em diferentes cromossomos, sugere-se que os genes HEXA e HEXB so provenientes de um ancestral comum1.

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Uma importante implicao da estrutura das subunidades e que reas idnticas entre as estruturas primrias aderidas comumente coincidem com domnios funcionais comuns. Um resduo conservado, - arg178/-Arg211, demonstra ser necessrio para manter a atividade cataltica das duas subunidades, sendo essa hiptese munida de um suporte experimental1.

3) Mutaes Como tpico das doenas genticas, muitas classes de mutaes tm sido identificadas na DTS. No gene HEXA foram encontrados os seguintes tipos de mutaes: a substituio de nucleotdeos - na qual ocorre a troca de um nico nucleotdeo (mutao puntiforme) numa seqncia de DNA, podendo alterar o cdigo de uma trinca de bases e levar substituio de um aminocido por outro no produto gnico. Tais mutaes denominam-se mutaes de sentido trocado (missense), pois especificam um aminocido diferente. Outro tipo a mutao sem sentido (nonsense), a qual gera um dos trs cdons de parada. Existem, ainda, as mutaes da emenda (splicing) do RNAm; as que afetam as bases necessrias no stio doador (limite xon-ntron) ou aceptor (limite ntron- xon) da emenda, interferindo na emenda normal do RNAm naquele stio, e em alguns casos at abolindo-a15. As mutaes na DTS tambm podem ser causadas pela insero ou pela deleo de um ou mais pares de bases. No caso de delees ou inseres envolvendo apenas alguns pares de bases (pequenas delees ou inseres), quando o nmero de bases envolvidas no mltiplo de trs, a mutao de uma seqncia codificadora altera a matriz de leitura da traduo a partir do ponto de mutao que resulta numa seqncia de aminocidos

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diferentes na extremidade carboxil da protena codificadora estas so as mutaes por mudana na matriz de leitura, as quais tambm podem produzir cdons de parada jusante. Tambm foram identificadas na DTS grandes delees, as quais apresentam grandes alteraes da estrutura do gene15. A tabela a seguir demonstra o nmero total de mutaes conhecidas at o momento16.

Tipos de mutaes Substituies de nucleotdeos (mis (missense/nonsense) Substituies de nucleotdeos (splicing) Pequenas delees Pequenas inseres Grandes delees Total

Nmero total de mutaes 54 19 13 4 1 91

Enquanto as mutaes que causam a diminuio completa da atividade da enzima Hex A, ou seja, delees parciais, originam a forma aguda da DTS, a qual devastadora, acredita-se que mutaes que permitem um nvel residual de atividade da enzima Hex A originam a forma de incio tardio da DTS e um curso menos agressivo. Assim pacientes com nveis muito reduzidos ou ausentes da Hex A tero um rpido acmulo do gangliosdeo GM2, assim apresentando manifestaes clnicas mais precoces, enquanto os pacientes com nveis residuais dessa enzima tero um acmulo mais lento do gangliosdeo, assim apresentando manifestaes clnicas mais tardias. Um ensaio, no qual foram empregados a protena GM2 ativador e o gangliosdeo GM2 como substratos, determinou a correlao entre a atividade residual da enzima Hex A e a severidade da

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doena resultante. As atividades enzimticas encontradas para as formas aguda, subaguda e crnica foram 0,1; 0,5 e 2-4% do controle normal, respectivamente3. Dois probandos clinicamente saudveis com baixa atividade da Hex A foram identificados como possuindo uma atividade da enzima entre 11 e 20% . Isto sugere um limiar crtico, ou seja, o valor mnimo de atividade da Hex A necessrio para manter uma taxa de hidrlise do GM2 maior que ou igual a taxa de transporte do gangliosdeo a ser incorporado no lisossomo, a qual na DTS deve ficar entre 5 e 10% da atividade normal da enzima Hex A3.

3.2) Mutaes do Gene HEXA Indivduos com a forma aguda infantil tm dois alelos nulos sem atividade enzimtica da Hex A, indivduos com as formas juvenil e crnica so usualmente heterozigotos compostos para um alelo nulo e um alelo expressivo que resulta numa baixa atividade residual da Hex A em relao ao ganglisdeo GM26.

3.2.1) Associadas com a DTS Infantil A maioria das mais de noventa mutaes identificadas at agora como causadoras da DTS esto relacionadas com o fentipo infantil. Todas as pequenas inseres ou delees que produzem frameshift
1

(mutaes por mudana da matriz de

leitura)15 e substituies nucleotdicas que produzem cdon de parada (nonsense) resultam nesse fentipo, pois levam a formao de uma protena truncada. A maioria das mutaes da emenda (splicing) entra nessa categoria, mas h excees importantes1.

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A primeira mutao identificada foi uma deleo de 7,6 Kb na extremidade 5 do gene HEXA em pacientes franco-canadenses. A deleo extende-se por aproximadamente 2 Kb montante da extremidade 5 dentro do ntron 1. Imagina-se que isso tenha surgido de uma recombinao entre duas seqncias Alu (DNA repetitivo). Essa mutao resulta em um RNAm-negativo, ou seja que no pode ser transcrito1. Essa descoberta foi seguida pela identificao das duas mutaes mais comuns na DTS infantil em judeus Ashkenazi. Myrowitz e Costigan, em 1988, demonstraram que a mutao mais freqente nessa doena a insero de quatro pares de bases (4bp), + TATC1278, no xon 111,17. Essa mutao cria um frameshift e um cdon de parada, 9 nucleotdeos jusante, nesse xon, resultando numa deficincia de RNAm. O gene HEXA transcrito normalmente e a expresso dessa mutao resulta na produo de um RNAm estvel, mas na sntese de um -polipeptdeo truncado. A segunda mutao mais freqente a substituio do primeiro nucleotdeo, guanina, do stio doador da emenda (splicing junction mutation) do ntron 12, por citosina (GC) o que resulta num RNAm instvel, que, quando maduro, retm o ntron 12 ou exclui o xon 12, ocasionando a formao de uma protena truncada1,3,6. Muitas mutaes missense descritas afetam a juno das subunidades enzimticas ou o processamento do precursor -polipeptdeo sintetizado. A maioria foi detectada na extremidade 3 da protena, apesar de no haver evidncia direta de uma seqncia ou estrutura prxima ao C-terminal envolvida especificamente com o transporte subcelular. H dois grupos de protenas mutantes. No primeiro grupo, o precursor retido no retculo endoplasmtico, a protena no fosforilada, no se combinando com a subunidade , no formando, dessa forma, a enzima Hex A, a qual deixa de ser secretada

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e transportada para o lisossomo. Como exemplos temos as mutaes G1444A (no xon 13) a qual resulta na substituio da lisina pela glutamina na posio 482 da molcula HEXA (Glu482Lis) e G1496A (no xon 13) a qual resulta na substituio da histidina pela arginina na posio 499 da molcula HEXA (Arg499His). A primeira leva a forma aguda da DTS e essa ltima foi descoberta em um paciente com a doena subaguda que era um heterozigoto composto com um segundo alelo funcionalmente nulo. No segundo grupo, o precursor fosforilado, mas no se associa com a subunidade : a enzima, ento, no processada na forma madura. Como exemplos dessa mutao temos C1510T (no xon 13) a qual resulta em Arg504Cis, G1511A (no xon 13) a qual resulta em Arg504His e G805A (no xon 1) a qual resulta em Gli269Ser (encontrada em pacientes com doena crnica). Em pacientes homozigotos para a mutao Arg
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, a

severidade da expresso clnica varia de acordo com o aminocido substitudo. Um paciente homozigoto para a mutao Arg504Cis e o outro no qual essa mutao ocorreu juntamente com uma mutao no stio doador, funcionalmente nula, apresentaram um fentipo infantil. Por outro lado, um paciente homozigoto para a mutao Arg504His e outro com essa mutao ocorrendo juntamente com uma insero + TATC1278 funcionalmente nula, apresentaram a doena subaguda1,2,13. As clulas apresentam um sistema de controle de qualidade, no qual ocorre a reteno de subunidade(s) no agrupadas de protenas multimricas, assim como de protenas corretamente folded, no RE e no complexo de Golgi, sendo realizada atravs da interao com protenas residentes nesses compartimentos, as quais tambm so normalmente recicladas, como exemplos temos as chaperones, como a GRP94; protena isomerase dissulfdica, PDI; BiP; Erp72; ER60; calreticulina; e calnexina. Acredita-se que

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essas protenas tambm auxiliem monmeros normais (no mutados) em seu folding, enquanto que os monmeros mutados so retidos e tm sua degradao acelerada3. A presena desse sistema de controle de qualidade no RE sugere que subunidades com mutaes missense, mesmo aquelas associadas com o fentipo mais severo, no necessariamente so incapazes de formar uma Hex A parcialmente funcional, pois isso pode ser prevenido pela afinidade aumentada dessas subunidades por uma ou mais chaperones3. O diferente grau de afinidade pelas chaperones, o qual determinado pela nova estrutura formada pela mutao, levar s diferentes formas de manifestao da doena (aguda, subaguda e crnica). A maioria das mutaes da emenda produz um fentipo bioqumico funcionalmente nulo e so associadas com a DTS infantil. Na maioria dos casos o nvel de RNAm nas clulas to baixo que o RNA transcrito pode ser altamente instvel ou no atingir o citoplasma, no havendo, ento, a formao da protena.Como exemplos temos a mutao GC (+1 IVS-12), que significa a substituio de uma guanina por uma citosina no primeiro nucleotdeo do ntron 12 e a GA (+1 IVS-9), que significa a substituio de uma guanina por uma adenosina no primeiro nucleotdeo do ntron 91,4. Todas essas mutaes levam ou a no formao da subunidade ou a formao de uma subunidade alterada, o que determina uma atividade muito pequena da enzima Hex A ou uma inatividade completa dessa enzima, levando a ao desenvolvimento da forma aguda da doena.

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3.2.2) Associadas com a DTS Subaguda Akli et al. relataram um paciente que apresentava doena de incio tardio, o qual era homozigoto para a mutao silenciosa G570A no ltimo nucleotdeo do xon 5 (Leu190Leu). Essa mutao permite uma pequena produo de RNAm normal, o que possibilita uma atividade residual da enzima Hex A1,6. Duas mutaes que afetam o processamento da cadeia foram associadas com o fentipo subagudo, so elas a G1496A (xon 13) que resulta em Arg499His e a G1511A (xon13) que resulta em Arg504His. A substituio mais conservativa da histidina (em comparao com a cistena, que origina um fentipo infantil) permite a algumas cadeias mutantes tornarem-se fosforiladas, associarem-se a cadeias e serem levadas ao lisossomo, o que tambm possibilita uma atividade residual da Hex A1. Assim, essa forma tardia e no to severa da doena explicada pela permanncia de alguma atividade da Hex A1.

3.2.3) Associadas com a Variante B1 Uma importante classe de mutaes representada pela variante B1 da DTS. Indivduos afetados por essa variante produzem Hex A ativa para o substrato sinttico 4MUG, mas no para o substrato sinttico 4MUGS ou para o gangliosdeo GM2. Isso porque a atividade da enzima Hex A sobre o substrato 4MUG deve-se subunidade , que permanece ativa nessa variante, enquanto a subunidade apresenta-se deficiente, provavelmente por uma mutao no stio ativo dessa subunidade. Um exemplo dessa classe de mutaes a G533A (xon 5) que resulta em Arg178His, a qual muito comum em portugueses. Pacientes homozigotos para essa mutao apresentam fentipo

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subagudo, enquanto que aqueles que so heterozigotos apresentam um segundo alelo agudo associado, o que leva a um fentipo mais severo. Outros exemplos so C532T (xon 5) que resulta em Arg178Cis e a G533T (xon 5) a qual resulta em Arg178Leu1. Essas duas mutaes acarretam fentipos agudos mais severos. Essa severidade crescente consistente com informaes bioqumicas, as quais sugerem que nveis mais baixos da cadeia poderiam formar heterodmeros (Hex A) e sair do RE. Esses dados esto correlacionados com o grau de conservatividade das substituies dos aminocidos (Arg>His>CisLeu)3. Em outro estudo verificou-se que o indivduo que heterozigoto para um alelo no expressivo e um alelo causador da variante B1 tem o fentipo juvenil. J o indivduo que homozigoto para a mutao causadora da variante B1 possui o dobro da atividade enzimtica em relao ao heterozigoto composto, e dessa forma apresenta o fentipo crnico moderado6.

3.2.4) Associadas com a Forma Crnica At o presente momento, somente duas mutaes responsveis pela forma crnica da DTS foram identificadas. A mutao G805A (xon 7) a qual resulta em Gli269Ser1,18 mais a formao de uma emenda anormal, que ocorre com significativa freqncia na populao Ashkenazi, permite a sntese do precursor da cadeia , mas o polipeptdeo mutante instvel e no se associando sempre subunidade . Assim, a atividade da Hex A resultante varivel, o que explica a heterogeneidade clnica mesmo dentro de uma mesma famlia1,3,6.

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A segunda mutao associada com o fentipo crnico a A590C (xon 6) que resulta em Lis197Thr, a qual foi identificada num paciente cujo segundo alelo tinha uma mutao Arg499His1,4,6. Assim como na forma subaguda, essas mutaes permitem uma atividade residual da Hex A levando a um fentipo no to agressivo e de incio mais tardio.

3.2.5) Associadas com a Pseudodeficincia Hex A-Minus A pseudodeficincia de Hex A causada por uma ou duas mutaes puntiformes que levam a atividade reduzida, mas varivel da enzima sobre os substratos sintticos (4MUG e 4MUGS), mas com atividade funcional sobre o gangliosdeo GM2. Triggs-Raine et al. rastrearam muitos casos de pseudodeficincia com mutaes no gene HEXA e identificaram a mutao C739T (xon 7) que resulta em Arg247Trp em sete dos oito casos analisados. Todos eram heterozigotos compostos nos quais o alelo mutado era acoplado com outro alelo portador de uma insero + TATC1278 ou de uma mutao da emenda +1 IVS-12. Recentemente foi identificada uma outra mutao, C745T (xon 7) que resulta em Arg249Trp1. A enzima Hex A codificada nessas mutaes e totalmente funcional sobre o substrato endgeno e a atividade enzimtica encontra-se acima do limiar crtico, ou seja, maior do que 5%, necessrio para prevenir o acmulo gangliosdico3.

4) Percentagens das mutaes encontradas Triggs-Raine et al. (1990) realizaram um rastreamento, comparando testes moleculares e ensaios enzimticos para detectar portadores para a DTS entre judeus

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Ashkenazi. Entre judeus Ashkenazi dos Estados Unidos e de Israel, as duas mutaes associadas com a forma aguda infantil da doena estavam presentes em 90 a 95% de todos os alelos, a mutao Gli269Ser, associada com a forma crnica da doena foi encontrada em 3%, e a mutao para a pseudodeficincia (Arg247Trp) estava presentes em 2% . Na populao geral no judaica, aproximadamente 35% dos alelos apresentavam duas mutaes associadas com o fentipo da doena aguda, e aproximadamente 5% dos alelos apresentavam mutaes associadas com as formas juvenil e crnica. Aproximadamente 35% dos heterozigotos no judeus, definidos enzimaticamente, so portadores de um dos dois alelos para a pseudodeficincia (Arg247Trp ou Arg249Trp)4.

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A ORIGEM DAS MUTAES

Tem-se sugerido que a mutao inicial da DTS na populao de judeus Ashkenazi ocorreu entre 70 d.c e 1100 d.c em reas do centro-leste europeu1,4. Previamente acreditava-se que a mutao tinha sido originada numa rea mais ao norte. Como os judeus Sephardic e outros grupos no-Ashkenazi no portam o gene em freqncia crescente, esse histrico parece ser apropriado1. H muitos grupos pequenos nos quais a freqncia de certos genes recessivos raros bem diferente daquela na populao em geral. Tais grupos so denominados isolados genticos. Quando um carter recessivo tem alta freqncia numa determinada populao, a consanginidade geralmente no uma caracterstica marcante. Em conseqncia, entre judeus Ashkenazi, os pais de crianas afetadas no costumam ser consangneos, ao passo que nas outras populaes cuja freqncia de portadores muito baixa, a taxa de consanginidade nos genitores dos pacientes com DTS alta4,15 Duas explicaes tm sido propostas para esclarecer a origem das mutaes na DTS. Uma delas o efeito do fundador1 o qual ocorre se um dos fundadores de uma nova populao (subpopulao pequena por isolamento de uma populao maior) possuir um alelo relativamente raro, esse alelo pode tornar-se fixo no novo grupo com uma freqncia relativamente alta15. A outra explicao o fator de seletividade ambiental que confere

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vantagem biolgica aos heterozigotos. Os homozigotos, por serem mais afetados pela deficincia enzimtica, apresentam maiores alteraes nas membranas celulares, o que afeta os mecanismos de defesa. Dessa forma tornam-se mais suscetveis a doenas, como por exemplo a tuberculose1,19. Fatores como a dieta, tratamento mdico, diagnstico pr-natal e interrupo seletiva da gravidez alteram o processo de seleo natural de um gene15.

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DIAGNSTICO

Historicamente o diagnstico deste grupo de desordens depende da histria clnica, dos achados fsicos, assim como das determinaes histopatolgicas ou bioqumicas derivadas de amostras de bipsia ou de espcimes posmortem1. Entretanto, o emprego de novas tcnicas como os ensaios enzimticos e o diagnstico molecular proporcionam um diagnstico especfico do indivduo investigado.

1) Ensaios enzimticos O diagnstico de defeitos na subunidade causados por mutaes no gene HEXA requer a demonstrao especfica da deficincia de atividade da enzima Hex A na presena de uma atividade normal ou mesmo elevada da Hex B1,6 . Isso pode ser realizado atravs da separao das enzimas Hex A e Hex B pelo uso de substratos artificiais cromognicos ou flurognicos que so hidrolizados por ambas as enzimas. Alternativamente, pode-se utilizar um substrato especificamente hidrolizado pela Hex A. Essas enzimas so usualmente separadas por cromatografia1 ou por eletroforese1,20. Enquanto a eletroforese permite somente um ensaio qualitativo, as outras tcnicas permitem uma determinao quantitativa de cada enzima1.

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Os programas de rastreamento utilizam mtodos enzimticos baseados na baixa estabilidade trmica e no pH da Hex A. No pH 4,4 a Hex B estvel at 55 C, entretanto a Hex A inativada com uma meia-vida de 10 minutos, na temperatura de 50 C, e de 3 minutos em 55C. A atividade total mensurada antes e depois da desnaturao seletiva da Hex A e a atividade das enzimas calculada pela diferena entre essas medidas1. O substrato sinttico 4MUGS hidrolizado quase exclusivamente pela Hex A esse substrato provou ser til no diagnstico da DTS, particularmente na variante B1.Infelizmente, os ensaios com esse substrato no fazem a distino dos heterozigotos para os alelos responsveis pela pseudodeficincia, nem so to sensveis como os substratos - padres utilizados para a deteco dos portadores de outras mutaes na subunidade . O mtodo mais especfico para a determinao da atividade da enzima Hex A emprega o substrato natural, gangliosdeo GM2, na presena da protena ativadora. Esse substrato til para o diagnstico pr-natal da variante B1 ou para diferenciao entre as variantes infantil e crnica1.

2) Diagnstico Molecular O diagnstico molecular da deficincia da Hex A baseado na anlise de DNA para identificar mutaes especficas no gene HEXA causadoras da DTS. Essa

abordagem diagnstica proposta especialmente no aconselhamento gentico, a fim de distinguir alelos causadores da pseudodeficincia de alelos causadores da doena em si, e especificar quais so os alelos causadores da doena em indivduos afetados6. Embora mais de 90 mutaes tenham sido identificada no gene HEXA16, somente as seis mais freqentes so utilizadas como parmetro para as anlises do DNA.

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O painel abaixo ilustra as seis mutaes mais freqentes, que compreendem: 1) trs alelos nulos os quais em homozigose ou heterozigose composta esto associados com a DTS na forma aguda; 2) o alelo Gli269Ser, associado com a forma de incio tardio da doena em homozigose ou heterozigose composta; e 3) dois alelos para pseudodeficincia, que no esto associados com a doena neurolgica6.

Teste utilizando o diagnstico molecular na deteco da deficincia da hexosaminidase A . % de Heterozigotos Obrigatrios1 Rastreamento 2 Alelo Condio do Alelo No Jud No Jude judeu eus judeus us s 81% 15% 0 2% 0 0 98% 32% 0 14% 0 0 0 46% 0 0 4 1 80% 9% 0 3% 2% 0 91% 8% 0 10% 3 5% 32% 4% 23% +TAC1278 +1 IVS 12 +1 IVS 9 Gly269Ser Arg247Trp Arg249Trp Nulo Nulo Nulo Forma tardia da doena Pseudodeficincia Pseudodeficincia

% de alelos causadores da doena detectados atravs do painel das seis mutaes do gene HEXA.

Fonte: Kaback et al 1993 1. heterozigotos obrigatrios, isto , parentes de alguma criana com deficincia da hexosaminidase A. 2. Indivduos identificados por programas de rastreamento os quais possuam nveis de hexosaminidase A semelhantes aos nveis apresentados pelos heterozigotos. 3. primariamente pessoas de ascendncia celta, francesa, cajun e holandesa da Pensilvnia

A anlise do DNA realizada atravs do uso de enzimas de restrio, Southern blotting e das tcnicas de PCR (polimerase chain reaction)21,22. Outro mtodo utilizado para o diagnstico da DTS o MALDI-MS (matrix-assisted laser desorption/ionization

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mass spectrometry) o qual requer a realizao da amplificao do stio de mutao seguido pela ao das enzimas de restrio. Em comparao com a eletroforese, o MALDI-MS obtm as mesmas informaes, porm com maior rapidez23.

3) Programas de Rastreamento
A Doena de Tay-Sachs foi a primeira condio gentica para a qual um programa de rastreamento de heterozigotos baseado na comunidade foi institudo com a inteno de reduzir a incidncia desse distrbio22. A elucidao da fisiopatologia da DTS levou ao desenvolvimento de mtodos simples, precisos e economicamente viveis para a identificao de heterozigotos. Esses indivduos, portadores de mutaes para a DTS, geralmente so assintomticos, havendo assim, o risco de transmisso do gene alterado para a sua prole. Adicionalmente, devido a predileo tnica da DTS e a disponibilidade do aconselhamento gentico e do diagnstico pr-natal, estabeleceu-se um motivo para a implementao de um rastreamento populacional entre judeus em idade reprodutiva1,6. A anlise da atividade enzimtica a partir de amostras do soro24 (por fracionamento atravs da temperatura ou do pH)1 foi o mtodo de escolha para programas de rastreamento da DTS por inmeras razes: econmica, pode ser feita em larga escala e pode-se utilizar amostras congeladas. Entretanto, a gravidez, o diabetes e o uso de medicamentos podem alterar os resultados24. Os mtodos que utilizam plaquetas e leuccitos so mais confiveis24 por no sofrerem as mesmas alteraes que as anlises do soro1. Contudo requerem amostras

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frescas, s podem ser processados em um curto espao de tempo, so mais caros e exigem uma tcnica mais elaborada24. O maior problema dos ensaios enzimticos a sobreposio nas distribuies da atividade enzimtica entre portadores e no-portadores, o que origina resultados falsopositivos e falso-negativos. A soluo para esse problema a classificao dos resultados encontrados nessa regio de sobreposio como inconclusivos, o que requer testes adicionais (que levam a um aumento de custo e da ansiedade do indivduo submetido a testagem)24. Um estudo recente (2001) realizado a partir de um programa de rastreamento em judeus Ashkenazi ortodoxos nos Estados Unidos, deu preferncia utilizao da anlise de DNA como nico mtodo de rastreamento. Esse mesmo estudo afirma que a anlise de DNA, como mtodo nico, em comparao com outros mtodos (ensaios enzimticos ou a combinao de ensaios enzimticos com anlise de DNA) muito mais barata e efetiva, j que altamente especfica e sensvel24. O rastreamento de rotina atravs de ensaios enzimticos no pode ser usado para distinguir as diferentes mutaes do gene HEXA. Para o rastreamento inicial da populao os testes enzimticos identificam a maioria das mutaes genotpicas, enquanto os testes de DNA so limitados pela a sua especificidade singular para cada mutao. Mesmo com a definio da anormalidade enzimtica, a anlise das mutaes em todos os portadores e casais portadores essencial e decisivo para definir a forma da DTS para a qual a prole do casal teria risco infantil, subaguda ou crnica. Mais particularmente, se os pais aparentemente heterozigotos, na verdade tm um alelo para a pseudodeficincia, no havendo risco, ento, de condies neurologicamente significativas na sua prole: o

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feto heterozigoto composto poderia ser enzimaticamente deficiente, mas poderia no ter o desenvolvimento de manifestaes neurolgicas1. Em 1992 foi realizado, mundialmente, um amplo screening, no qual mais de 950 mil adultos jovens foram voluntrios para determinar o ndice de portadores do gene para DTS. Foram identificados mais de 36 mil heterozigotos e aproximadamente 1100 casais de risco (ambos os pais portadores do gene). Nenhum desses casais teve previamente uma criana com DTS ou outra gangliosidose GM2. Esses resultados so apresentados na tabela a seguir1,19.

Pas EUA Israel Canad frica do Sul Europa Brasil, Mxico Austrlia Total

N de pacientes testados 712.818 159.544 55.922 11.638 10.927 1.682 473 953.004

Portadores do gene 27.150 4.229 2.922 1.286 725 96 10 36.418

Casais de risco 657 263 57 36 21 20 2 1.056

4) Diagnstico Pr-Natal O rpido progresso das descobertas genticas tem aumentado dramaticamente a capacidade diagnstica para o rastreamento de portadores e o diagnstico pr-natal das doenas genticas25. A Doena de Tay-Sachs foi um dos primeiros distrbios metablicos submetidos ao diagnstico pr-natal1.

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Inicialmente os testes pr-natais eram empregados somente para casais, os quais j possuam filhos portadores da doena. Mais recentemente, a maioria das gestaes monitoradas envolvem casais identificados como de risco. A quantificao das enzimas Hex A e Hex B pode ser feita atravs dos tecidos fetais na primeira metade da gestao. O material pode ser obtido atravs do lquido amnitico, cultura de clulas desse lquido, e das vilosidades corinicas ou de derivados da cultura desse material1. As tcnicas diagnsticas baseadas na anlise molecular do DNA apresentam maior especificidade na deteco pr-natal da DTS. Quando uma mutao especfica detectada em cada progenitor, a identificao de homozigose ou heterozigose composta feita sem dificuldades no feto; quando as mutaes no so conhecidas ou no foram identificadas deve-se fazer testes enzimticos combinados com anlises de mutaes especficas para excluir alelos para a pseudodeficincia em heterozigotos compostos1. Os testes pr-natais so realizados quando: O ensaio enzimtico da enzima Hex A demonstrar que ambos os pais so heterozigotos e quando no teste molecular for demonstrada a presena de alelo para pseudodeficincia em um dos pais. Para a maioria dos casais, o teste pr-natal pode ser realizado por ensaio da atividade enzimtica da Hex A em clulas fetais obtidas por amostragem das vilosidades corinicas aproximadamente na 10-12 semanas de gestao ou por amniocentese entre a 16-18 semanas de gestao. Se as mutaes causadoras da doena forem identificadas em ambos os pais, o teste pr-natal pode ser realizado por anlise das mutaes do gene HEXA obtido do DNA do feto por vilosidades corinicas ou por amniocentese.

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Um dos pais sabidamente heterozigoto e o outro tem uma atividade enzimtica inconclusiva e a mutao causadora da doena no foi identificada na anlise do DNA. A me heterozigota e o gentipo paterno no conhecido6. Um estudo realizado, mundialmente, em Junho de 1992, num total de 2416 gestantes com risco aumentado para o desenvolvimento da DTS na sua prole foram monitoradas por amniocentese ou por bipsia de vilosidades corinicas. Os resultados desse estudo so apresentados na tabela abaixo19.

250 201 Abortos Espontneos Com DTS 3 2 Nascidos no Afetados 827 1054 * dezoito crianas com a forma aguda da DTS como predito.

Diagnstico Gestaes Monitoradas Conceptos Afetados com DTS Abortos eletivos

Pela prole prvia 1118 268

Identificao de casais de alto risco Pelo screening de portadores 1298 201

Total 2416 469 451* 5 1881

Cada gestao de um casal heterozigoto tem 25% de chance de gerar uma criana afetada, 50% de chance de gerar uma criana normal portadora do gene para a DTS e 25% de chance de gerar uma criana normal no portadora. Um casal que possui um filho afetado, mantm a chance de 25% de gerar outra criana afetada. A irmandade de um heterozigoto tem 50% de chance de ser heterozigota, j a irmandade no afetada de um indivduo afetado tm 2/3 de chance de serem heterozigotos. Indivduos heterozigotos para o alelo da pseudodeficincia no possuem risco aumentado de gerar uma criana com DTS ou algum outro tipo de deficincia da enzima Hex A6.

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Entretanto, como demonstra a tabela, a freqncia da DTS em fetos significativamente menor do que os 25% esperado. Isso explicado pelo significativo nmero de gestaes monitoradas, nas quais risco verdadeiro era menor do que 25% ou era insignificante, ou seja, algumas gestaes monitoradas apresentam um ou ambos os progenitores com testes de rastreamento inconclusivos1,19. O aconselhamento gentico uma alternativa que proporciona populao informaes sobre a natureza, hereditariedade e implicaes da doena. Uma vez

identificados, os casais de risco podem recorrer ao aconselhamento gentico, que inclui a opo do monitoramento pr-natal. Assim, esses casais tm maiores condies de escolher entre levar a gestao a termo ou interromp-la quando legalmente permitido- e at mesmo, optar pelo conhecimento ou no da doena em sua prole6,19. Esses casais tambm possuem como alternativa a escolha entre: ter sua prpria prole ou adotar uma criana ou conceber atravs de inseminao artificial atravs de um gameta doado19, ou ainda optar pelo diagnstico de pr-implantao, no qual o zigoto fecundado in vitro, quando blasto, biopsiado, sendo posteriormente analisado pela tcnica do PCR a fim de identificar o pr-embrio como normal, homozigoto ou heterozigoto para a DTS. Este mtodo tem um custo bastante elevado, alm do que os pais devem estar cientes de que se trata de um mtodo complexo e de que h riscos de um diagnstico errneo21,26,27. O rastreamento de portadores de mutaes para a DTS, o aconselhamento gentico e a monitorizao das gestaes de risco tm reduzido a incidncia da DTS na populao de judeus Ashkenazi dos Estados Unidos e Canad em 90%1,24,28.

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TRATAMENTO

O tratamento para a DTS inespecfico, restringindo-se ao tratamento suporte das manifestaes clnicas e manejo adequado das intercorrncias, como por exemplo, a manuteno adequada da nutrio e da hidratao, manejo das doenas infecciosas e controle das convulses quando e se elas ocorrerem. No entanto, diversas tcnicas tm sido desenvolvidas no intuito de encontrar alguma terapia vivel e realmente efetiva, assim como: a reposio enzimtica, a privao do substrato, o transplante de medula ssea, a terapia gnica mediada por vetor retroviral e a liberao de genes diretamente no sistema nervoso central1,29.

1) Reposio Enzimtica Essa terapia parece ser uma abordagem lgica no tratamento da DTS. Requer que uma quantidade significativa da Hex A alcance o sistema nervoso central (SNC) na forma cataltica ativa e que as clulas defeituosas possam liberar o material de armazenamento em excesso. A base dessa abordagem o estudo in vitro de Brooks, no qual demonstrou-se que clulas cerebelares de um concepto afetado pela doena incorporavam a Hex A exgena e eram capazes de mobilizar o acmulo de GM2. Contudo, in vivo, essa

abordagem no possui valor teraputico. Isso porque a barreira hematoenceflica no

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permite a penetrao de quantidades suficientes de enzima no SNC, e tambm porque a enzima metabolizada no fgado aps a administrao endovenosa (o que diminui a sua biodisponibilidade)29.

2) Privao de Substrato Esse mtodo utiliza um inibidor especfico da biossntese do glicolipdio, para reduzir parcialmente a quantidade de glicolipdio sintetizada pelas clulas. Isso permite que o glicolipdio ainda sintetizado seja catabolizado atravs da atividade residual da enzima. Essa abordagem funciona muito bem em modelos animais, prevenindo o acmulo de gangliosdeo no SNC. Entretanto, em humanos, ainda no se tem certeza a respeito dos resultados pois esses devem ser verificados em ensaios clnicos29,30.

3) Transplante de medula ssea Essa abordagem baseada na transferncia de clulas hematopoiticas normais doadoras para clulas hospedeiras defeituosas, aps o transplante. H evidncias considerveis de que o transplante em pacientes com doenas do armazenamento lipdico corrija o defeito enzimtico no fgado e outros tecidos afetados. Todavia, nas doenas que afetam o SNC, como a DTS, questiona-se o uso dessa terapia pelo fato de a barreira hematoenceflica excluir a enzima circulante29.

4) Terapia gnica mediada por vetor retroviral Os sistemas de liberao de genes para clulas proliferativas so baseados nos vetores retrovirais recombinantes; os quais permitem uma integrao estvel dos genes

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teraputicos com o DNA das clulas hospedeiras e, longo prazo, a expresso do gene transferido, sem gerar uma resposta imune contra os agentes virais29. Devido ao fato desses vetores no infectarem clulas estveis, como o neurnio, essa tcnica no apresenta validade teraputica na DTS, embora seja empregada em outras gangliosidoses GM229.

5) Liberao de genes diretamente no SNC Essa abordagem tem sido utilizada em diversos modelos animais como tentativa de superar o problema da barreira hematoenceflica existente em outras tcnicas. Essa abordagem utiliza dois mtodos: em deles o uso de um vetor viral com tropismo pelo SNC como o herpes simplex vrus (HSV) ou o adenovrus (AV); o outro o implante cerebral de clulas geneticamente modificadas que superexpressam o gene teraputico. O HSV e o AV infelizmente no permitem uma expresso contnua do gene nas clulas hospedeiras, pois no se integram ao genoma. Tambm podem direcionar a liberao de genes para clulas no proliferativas como os neurnios. Tem sido desenvolvido outro sistema que utiliza vetor viral baseado no vrus da imunodeficincia humana (HIV), que j foi testado em injees intracerebrais no estriado e hipocampo de ratos adultos29.

Uma nova abordagem que promete grandes mudanas no tratamento das leses amplas de SNC o transplante de clulas neurais progenitoras multipotenciais que podem diferenciar-se em neurnios, astrcitos e oligodendrcitos. A vantagem dessa tcnica a possvel correo, longo prazo, dos distrbios do armazenamento. Mas, so necessrias outras investigaes a cerca dos resultados obtidos com o uso dessa tcnica29.

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CONCLUSO

A DTS o prottipo das desordens de armazenamento lisossomal de esfingolipdios. A natureza hereditria dessa doena, invariavelmente, neurodegenerativa fatal, sua predileo tnica (judeus Ashkenazi), os achados neuropatolgicos caractersticos (balonamento de neurnios com macio acmulo de corpos membranosos citoplasmticos), e a natureza e a estrutura do material intraneuronal estocado (gangliosdeo GM2) so bem estabelecidos. Devido ao fato dessa doena, na maioria das vezes, levar a uma deteriorao mental e fsica intensa, culminando com a morte da criana afetada por volta dos quatro anos de idade, esforos foram aplicados com o intuito de diminuir a incidncia dessa doena atravs do screening de portadores de genes causadores da DTS, diagnstico prnatal e programas de aconselhamento gentico. Estudos demonstraram que esses esforos tm surtido efeitos, pois a incidncia da DTS em judeus Ashkenazi reduziu em 90% nos Estados Unidos e Canad. Como, ainda hoje, o tratamento para a DTS inespecfico, restringindo-se ao tratamento de suporte e ao manejo adequado das intercorrncias, tem-se buscado o

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desenvolvimento de novas tcnicas com o intuito de encontrar alguma terapia vivel e realmente efetiva.

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ANEXOS

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FIGURA 1

* estrutura do gangliosdio GM

FIGURA 2

* sistema de trs genes essenciais atividade da hexosaminidase A e as doenas que resultam de defeitos em cada um dos genes.

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FIGURA 3

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