Departamento de Qumica e Bioqumica Curso de Biologia 1ano (Tronco comum)

Relatrio Laboratorial

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

Lisboa, 11 de Maio de 2008

Trabalho realizado por: Ana Rute Brito, n35251 Ana Raquel Costa, n35690 Isabel Candoso, n35749 Marta Venncio, n32006 Rita Monteiro, n35696

Turma P12

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

ndice

ndice..........................................................................................................................2 Resumo........................................................................................................................3 Introduo....................................................................................................................4 Protocolo Experimental...............................................................................................6 Resultados...................................................................................................................7 Discusso..................................................................................................................11 Bibliografia.................................................................................................................13

Pgina 2 de 13

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

Resumo
Com este trabalho experimental pretendeu-se utilizar um mtodo para o doseamento de glcidos numa farinha alimentar, com base no seu poder redutor. Este mtodo o mtodo do DNS (3,5-dinitrosalicilato) e atravs dele foram comparados dois valores: a quantidade de glcidos redutores presentes numa amostra de farinha alimentar e o valor indicado no rtulo. A farinha alimentar foi sujeita a uma hidrlise cida para se converterem os glcidos presentes na sua forma redutora, pois s assim reagem com o reagente DNS. Isto deve-se ao facto de os polisidos no serem redutores (s com a hidrlise se obtm as suas oses constituintes). Para determinar o contedo em glcidos redutores na farinha alimentar foi traada a curva padro do mtodo do DNS, que tem por base a relao entre a absorvncia de vrias solues (com diferentes quantidades de glucose) e as respectivas concentraes. A partir da curva padro foi obtida a seguinte equao de recta y = 3,337 x que representa a absorvncia da soluo a 540 nm, em funo da concentrao de glcidos. As diferentes solues foram submetidas radiao de 540nm, pois o DNS no absorve este comprimento de onda. Foi ento obtida a concentrao destas molculas na nossa amostra: 0,0018 mg / mL e, consequentemente, 0,17 %.

Pgina 3 de 13

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

Introduo
Os glcidos so compostos que abundam na Natureza e que assumem um papel de extrema importncia biolgica, uma vez que constituem um dos elementos fundamentais da nossa alimentao, sendo umas das principais fontes energticas para os processos vitais. As suas molculas so compostas por carbono, hidrognio e oxignio, sendo por isso tambm designados hidratos de carbono. neste grupo que encontramos as oses simples, como a glucose; diolsidos (duas oses simples), como a maltose; e os polisidos, como a celulose. As oses, ou monossacridos constituem a classe mais simples dos glcidos e no podem ser hidrolisadas. possvel distinguir dois tipos de monossacridos: as aldoses e as cetoses, dependendo do seu grupo funcional ser um aldedo ou uma cetona. Uma das caractersticas dos monossacridos que estes conseguem actuar como agentes redutores, isto porque apresentam um grupo aldedo que pode ser oxidado para formar um grupo carboxilo. Os glcidos que so capazes de desempenhar a tarefa de oxidar outros agentes tm o nome de glcidos redutores. Um dos mtodos para a quantificao de glcidos redutores o do DNS (3,5-dinitrosalicilato). Este baseia-se numa reaco em que o DNS reduz o glcido dando origem a 3amino-5-nitrosalicilato e cido glucnico. O reagente do DNS composto por cido dinitrosalicilico, sal Rochelle (tartrato de potssio e de sdio), fenol, bissulfato de sdio e hidrxido de sdio. Este mtodo, quando em condies alcalinas, testa a presena de um grupo funcional aldedo e envolve a oxidao do mesmo. O DNS reduzido num produto de colorao castanha-avermelhada quando aquecido. Trata-se por isso de um mtodo rpido, simples e de confiana. Dado que a glucose um glcido redutor, consideremos a reaco representada na figura seguinte como sendo a actuao do DNS:
CHO
HO C OH
2N

HO C
HO O C OH
2N

H HO
O

C C C C

OH H OH OH
2N

H HO
H

C C C C

OH H OH OH

2N

H H

H H

C HO H 2

C HO H 2

DNS

Glucose

cido 3-amino-5-nitrosaliclico

cido glucnico

Figura 1 - Reaco de actuao do DNS

Uma vez que todos os reagentes e produtos nesta equao esto numa proporo de 1:1, sabendo a quantidade de 3-amino-5-nitroalicilato sabemos a quantidade de glucose.

Pgina 4 de 13

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

Na reaco d-se a reduo do DNS (que perde um oxignio) e d-se a oxidao da glucose, sendo ento o DNS considerado como agente oxidante e a glucose como agente redutor. Como obtemos um produto de colorao castanho-avermelhado, sabemos que a intensidade de cor absorvida a 540nm corresponde quantidade de glcidos redutores da amostra, isto porque o DNS no absorve a este comprimento de onda, caso contrrio este mtodo no seria bem sucedido. Para a quantificao de substncias em soluo utilizada frequentemente a espectrofotometria (mtodo fsico que quantifica a emisso ou absoro da radiao pela matria). Para relacionar a absorvncia de uma soluo com a quantidade de matria existente na amostra utilizada a lei de Lambert-Beer,

A = Ic
em que:

A- Absorvncia
Coeficiente de absoro molar especifico para cada substncia em funo do comprimento de onda l- Caminho percorrido pela luz (cm) c- Concentrao (mol/L) Neste trabalho prepararam-se solues com as composies indicadas na tabela 1 (apresentada mais frente no protocolo experimental) para posteriormente se obter uma curva padro para o mtodo do DNS com a qual possvel comparar e obter a concentrao da amostra estudada.

Pgina 5 de 13

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

Protocolo Experimental
o Material e Reagentes
Material: - Almofariz - Placa de aquecimento - Espectrofotmetro Reagentes: - Farinha alimentar (Nestum mel) - Soluo de H2SO4 1.5M - Soluo de NaOH a 10% - Soluo de glucose 1.5 mg/mL.

o Procedimento
1. Reduziu-se a p fino uma pequena quantidade da farinha alimentar, da qual se pesou uma amostra de 52,0 mg. 2. Colocou-se a amostra pesada num tubo de ensaio ao qual foram posteriormente adicionados 10 mL de H2SO4 1.5 M. Aqueceu-se o tubo de ensaio num banho de gua em ebulio por 20 minutos, agitando-se de vez em quando. 3. Arrefeceu-se o tubo de ensaio torneira e transferiu-se o seu contedo para o interior de um Erlenmeyer. Adicionaram-se 12 mL de NaOH a 10%. 4. Aqueceu-se ligeiramente, em banho-maria, o Erlenmeyer contendo o hidrolisado, o qual foi filtrado ainda quente para um balo de 50 mL. Lavaram-se o tubo de ensaio e o Erlenmeyer utilizados com gua destilada quente, a qual foi adicionada ao funil de filtrao e, consequentemente, ao balo de 50 mL. Perfez-se o volume deste at aos 50 mL e agitou-se bem. 5. Preparou-se a curva padro para o mtodo DNS de acordo com o quadro seguinte:
Reagente 0 Glucose 1,5 mg/mL (mL) Hidrolisado (mL) Reagente DNS (mL) H2O (mL) 0 0 1 3 1 0,1 0 1 2,9 2 0,2 0 1 2,8 3 0,3 0 1 2,7 Tubo n 4 0,4 0 1 2,6 5 0,6 0 1 2,4 6 0,8 0 1 2,2 7
amostra

1 1 2

Tabela 1 - Quadro indicativo do volume de reagentes por tubo de ensaio

6. Aqueceram-se os 7 tubos de ensaio num banho de gua em ebulio durante 5 minutos 7. Leu-se a absorvncia de cada soluo a 540 nm, utilizando o tubo zero como branco. 8. Registaram-se os valores da absorvncia referentes aos padres de glucose e ao hidrolisado e construiu-se a curva padro para o mtodo do DNS.
Pgina 6 de 13

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

Resultados
A massa inicial de farinha pesada foi de 52,0 mg. Como resultado das absorvncias, obtivemos o seguinte quadro: Nmero do Tubo de Ensaio 0 1 2 3 4 5 6 7 Absorvncia a 540 nm 0 0,016 0,140 0,303 0,453 0,758 1,089 0,006

Tabela 2 - Absorvncia correspondente a cada soluo

o Dados:
V total do Erlenmeyer: Vglucose + VDNS + VH 2 O [Glucose]inicial = 1,5 mg/mL Clculo da massa de glucose para cada soluo: [Glucose]inicial= MGlucose e VGlucose no tubo

Atravs desta expresso, consegue-se calcular o valor da massa de glucose presente em cada soluo: Tubo 0: MGlucose= 1,50 x 0 MGlucose= 0 mg

Tubo 1: MGlucose= 1,50 x 0,1 MGlucose= 0,15 mg Tubo 2: MGlucose= 1,50 x 0,2 MGlucose= 0,30 mg
Pgina 7 de 13

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

Tubo 3: MGlucose= 1,50 x 0,3 MGlucose= 0,45 mg Tubo 4: MGlucose= 1,50 x 0,4 MGlucose= 0,60 mg Tubo 5: MGlucose= 1,50 x 0,6 MGlucose= 0,90 mg Tubo 6: MGlucose= 1,50 x 0,8 MGlucose= 1,20 mg Clculo da concentrao de glucose para cada soluo: [Glucose] no tubo = MGlucose e Vtotal do tubo

Recorrendo a esta expresso, calcula-se a concentrao de glucose presente em cada tubo de ensaio: Tubo 0: [Glucose]no tubo = 0 / 4 [Glucose]no tubo = 0 mg/mL Tubo 1: [Glucose]no tubo = 0,15/ 4 [Glucose]no tubo = 0,038 mg/mL Tubo 2: [Glucose]no tubo = 0,30/ 4 [Glucose]no tubo = 0,075 mg/mL Tubo 3: [Glucose]no tubo = 0,45/ 4 [Glucose]no tubo = 0,113 mg/mL Tubo 4: [Glucose]no tubo = 0,60/ 4 [Glucose]no tubo = 0,150 mg/mL Tubo 5: [Glucose]no tubo = 0,90/ 4 [Glucose]no tubo = 0,225 mg/mL Tubo 6: [Glucose]no tubo = 1,20/ 4 [Glucose]no tubo = 0,300 mg/mL Com os valores da concentrao de glucose em cada tubo de ensaio e com as absorvncias de cada soluo a um comprimento de onda de 540nm, obtm-se o seguinte grfico:

Pgina 8 de 13

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

Absorvncia a 540 nm

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,1 0,2 0,3

y =3 3 x ,3 7 R =0 5 6 ,9 9
2

Abs orvnciaa5 0nm 4 Curva dr -Pa o

0,4

Concentrao de Glucose (mg/mL)

A equao da recta obtida atravs da anlise do grfico y = 3,337 x , ou seja, Absorvncia = 3,337 x [Glucose]

o Clculo da concentrao e da massa da glicose no hidrolisado

Clculo da concentrao de glucose no hidrolisado:

Tendo em conta que as solues experimentadas comprovam a lei de LambertBeer, consegue-se relacionar os valores de absorvncia registados com a concentrao de glcidos em cada amostra. Tendo por base esta lei, verifica-se que o valor de Absorvncia (A) directamente proporcional concentrao da soluo (c).

A = Ic
Assim, pode considerar-se que a curva padro obtida no grfico tem um coeficiente angular igual a I . Deste modo:

A = .I .c y = ax + b

- ax = coeficiente angular -b = ordenada na origem.

Para o tubo que continha a soluo de concentrao desconhecida, o valor de absorvncia encontrado foi de 0,006. Para se obter a concentrao desta soluo, recorre-se equao da curva padro:
Pgina 9 de 13

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

y = 3,337x 0,006 = 3,337x x = 0,006/ 3,337 x = 0,0018 mg / mL

=> A concentrao da soluo de 0,0018 mg/mL.

Clculo do contedo de glcidos no hidrolisado:

Sabendo que a concentrao de glcidos no tubo 7 de 0,0018 mg/mL, pode calcular-se o valor da massa de glcidos presentes em 50 mL de hidrolisado: 0,0018 mg x x = 0,09 mg 1 mL 50 mL => A massa de glcidos hidrolisado de 0,09 mg. no

o Clculo da %(w/w) da farinha analisada:

Massa de farinha=52,0 mg Massa de glcidos redutores contida na farinha=0,09 mg %( w / w) = Massa de glcidos redutores na amostra x 100 Massa total da amostra %(w/w) = (0,09 / 52,0) x 100 %(w/w) = 0,17 % de glcidos redutores na amostra.

Pgina 10 de 13

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

Discusso
O objectivo desta experincia era determinar a percentagem de glcidos numa amostra de farinha alimentar, e assim comprovar o poder redutor destes. Para isso utilizmos o mtodo de DNS, que em meio bsico reage com glcidos redutores, formando um composto castanho avermelhado, que o produto da reduo (3-amino-5-nitrosalicilato). Este produto da reduo encontra-se na mesma quantidade que os glcidos redutores presentes na amostra inicial. No entanto, para que o mtodo do DNS fosse possvel, foi necessrio ter em conta outros factores e realizar outros processos. Como por exemplo, no incio da experincia reduziu-se a farinha alimentar a p fino, de modo a aumentar a superfcie de contacto entre a amostra e os reagentes usados. Tivemos tambm que garantir que os glcidos presentes na amostra apresentavam todos poder redutor, e para tal foi necessrio proceder sua hidrlise cida. Aps a hidrlise cida os glcidos tero passado a oses, que so redutoras. Foi ainda necessria a adio de hidrxido de sdio (NaOH), passando a soluo para um meio alcalino, de forma a parar a hidrlise e favorecer a actuao do DNS. Para obtermos o valor dos glcidos redutores na amostra, tivemos que recorrer elaborao de uma curva padro (onde est representado o valor de absorvncia em funo da concentrao da glucose), com os dados presentes no quadro que se encontra no procedimento. Foi feita portanto uma anlise espectrofotomtrica, em que foi utilizado um comprimento de onda de 540nm, que corresponde ao pico de absoro do 3-amino-5-nitrosalicilato, e tambm a um valor cujo reagente do DNS (de colorao amarela), no absorve, caso contrrio este no teria qualquer eficincia. Construda a curva padro de absorvncia, obtivemos graficamente a absorvncia (A) em funo da concentrao, e a respectiva recta de equao:
y = 3,337 x , ou seja, Absorvncia = 3,337 x [Glucose]

Realizando os clculos necessrios para chegarmos massa de glcidos redutores e sua percentagem (w/w), obtivemos a percentagem de 0,17%. No entanto, o valor terico inscrito na embalagem era de 84,6%. Podemos ento, concluir que a experincia no foi bem sucedida e que o objectivo no foi totalmente conseguido. Esta enorme discrepncia, deve-se obviamente a erros durante a experincia. Um dos principais e mais significativos ser no caso da hidrlise, pois esta poder no ter ocorrido na totalidade e no ter sido bem sucedida. Isto, porque, o DNS apenas reage com glcidos redutores, ou seja se os polmeros no forem completamente convertidos em glicose, esta no vai reagir na sua totalidade com o DNS, originando uma grande diferena entre os valores obtidos e os tericos. Ainda relacionado com o DNS, podemos apontar que a farinha alimentar apresenta compostos com um grupo aldedo livre que tm poder redutor e consequentemente reagem com o DNS. Isto ir, portanto, aumentar a quantidade de 3-amino-5-nitrosalicilato obtido nos produtos de reaco, influenciando, assim, os valores obtidos. Outros erros podero estar ligados com a construo da curva padro. Isto porque foram apenas utilizados dados de uma nica medio de um conjunto de tubos, quando
Pgina 11 de 13

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

sempre aconselhvel que se faam 5 medies diferentes, e da se construa a curva padro. Portanto, isto tornou, a nossa curva padro menos precisa, o que influenciou com certeza os resultados. Para alm destes erros, h ainda a possibilidade de terem ocorrido erros de medies e de manuseamento do material. Isto porque tratando-se de quantidades muito pequenas, qualquer perda, por mais nfima que seja, prejudicial. Apesar de no conseguirmos obter a percentagem de glcidos da farinha alimentar, por termos como resultado um valor muito diferente do terico, conseguimos no entanto comprovar o poder redutor do glcidos e a aco do DNS nestes.

Pgina 12 de 13

Determinao de Glcidos Redutores em Produtos Alimentares

Bibliografia
L. Neves, T. Carreira, Bioquma; AEFCUL. Lisboa, 1998; M. J. Halpern, Bioqumica, Lidel Edies Tcnicas, 1997 (145 a 157); G.L. Miller, Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing sugar, Analytical Chemistry, 1959; J.A.M. Simes, Guia do Laboratrio de Qumica e Bioqumica, Lidel Edies Tcnicas, Lisboa, 2000, pp. 13-22, 64; Protocolo experimental de Bioqumica Determinao de glcidos redutores em produtos alimentares.

Pgina 13 de 13