17 Mtodos Basados en la unin Ag-Ac

R. Gonzlez, R. Tarazona, M.D. Galiani, G. Bugella y J. Pea

INTRODUCCIN. Gran parte de los progresos alcanzados por la biologa moderna se deben al perfeccionamiento de los mtodos analticos de medida. La introduccin de los procedimientos basados en las reacciones inmunolgicas ha representado un importante avance en el anlisis de sustancias de inters en biologa animal y vegetal difciles de medir empleando los mtodos bioqumicos habituales. Dentro de los procedimientos inmunolgicos, los ms tiles y prcticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unin Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unin y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenmenos de precipitacin, aglutinacin y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluorescena, con radioistopos o con enzimas) hacen que estos mtodos se empleen ampliamente. Existen diversos mtodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unin Ag-Ac (Tabla 17.1).

TABLA 17.1. Principales mtodos analticos basados en la unin Ag-Ac

Trazador Complejo Ag-Ac Aglutinado Fluorocromo Radioistopos Enzimas As tenemos:

Denominacin Tcnicas de inmunoprecipitacin. (tcnica de Ouchterlony, inmunoelectroforesis, difusin radial Mancini, nefelometra, etc.) Tcnicas de inmunoaglutinacin. (Hemaglutinacin directa e indirecta y otras tcnicas con ltex, etc.) Tcnicas inmunofluorimtricas Tcnicas inmunorradiolgicas (Radioinmunoensayo -RIA-) Tcnicas inmunoenzimticas

1. Tcnicas de aglutinacin. Cuando el antgenos e encuentra unido o formando parte de clulas, bacterias o partculas, la reaccin Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado. 2. Tcnicas de fluorescencia y citometra de flujo. Para la realizacin de estas tcnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo detectndose la formacin del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida. 3. Tcnicas de radioinmunoensayo. En estas tcnicas al anticuerpo se une un istopo radiactivo siendo posible la cuantificacin del complejo Ag-Ac a travs de la radiactividad emitida. 4. Cromatografa de afinidad. La especificidad de la unin Ag-Ac puede utilizarse para obtener Acs y Ags puros. 5. Inmunoprecipitacin e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antgenos y anticuerpos especficos.

TCNICAS DE PRECIPITACIN

Para la realizacin de estas tcnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitacin del complejo Ag-Ac. Existen diferentes modalidades siendo las principales: 1. Tcnica de precipitacin propiamente dicha. 2. Tcnica de difusin radial de Ouchterlony. 3. Tcnica de inmunoelectroforesis. 4. Tcnica de difusin radial simple de Mancini.

Tcnica de precipitacin El complejo Ag-Ac precipita espontneamente o por centrifugacin cuando la proporcin de Ags y Acs de la mezcla es equivalente. En la Figura 17.1 se muestra un esquema de los tipos de complejos formados al mezclar, en tubos de ensayo, soluciones con diferentes cantidades de antgenos a los que se aaden igual cantidad de un anti-suero.
Figura 17.1

La precipitacin es mxima all donde la proporcin entre ambos es ptima (parte central de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva respectivamente) Este tipo de reaccin no es muy utilizado al requerirse grandes concentraciones de antgeno y de anticuerpo para poder medir el precipitado formado.

Tcnica de difusin radial doble de Ouchterlony Esta tcnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos (Figura 17.2). En uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca el anticuerpo preparado frente a la sustancia que se quiere identificar. Cuando difunden, ambos sistemas se encontrarn y se formar en la zona de equivalencia el complejo Ag-Ac correspon-diente que se hace visible en forma de una lnea de precipitacin. En una preparacin que contenga varios antgenos, se obtendrn mltiples lneas de precipitado.

Figura 17.2

La tcnica de Ouchterlony permite identificar sustancias segn la forma de unirse las lneas de precipitacin de dos o varios sistemas.

Tcnica de inmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis es una tcnica que se realiza en dos fases. Primero se separa la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antgeno que se desea detectar se hace reaccionar con un anticuerpo especfico colocado en un pocillo lateral. Por difusin llegan a encontrarse los antgenos y el antisuero, apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma de lneas de precipitacin que pueden ser estudiadas por comparacin con un sistema estndar (Figura 17.3). En Inmunologa clnica, esta tcnica puede utilizarse en la identificacin de las protenas de mieloma. Tcnica de difusin radial simple de Mancini Esta tcnica se basa en la difusin de un antgeno colocado en un pocillo en un gel de agarosa que lleva incorporado un anticuerpo Figura 17.3 especfico. Este anillo de precipitacin es fcilmente visible y las concentraciones ant-gnicas estn en relacin directa con el rea del crculo de precipitacin. Al difundir el antgeno se genera un gradiente de concentracin desde el pocillo donde se ha colocado. Cuando la concentracin del antgeno es la adecuada (zona de equivalencia) el inmunocomplejo se insolubiliza y se forma un anillo de precipitacin (Figura 17.4).

TCNICAS DE AGLUTINACIN En estas tcnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinacin que producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la superficie de glbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partculas de ltex, etc. Normalmente se utilizan glbulos rojos (hemaglutinacin) o partculas de ltex.

Hemaglutinacin directa La presencia de antgenos en la superficie de los glbulos rojos se puede detectar por la hemaglutinacin producida cuando se aade un antisuero con anticuerpos frente a dichos antgenos.
Figura17.4

Esta tcnica se emplea habitualmente para la identificacin de los grupos sanguneos y Rh, para lo cual a la sangre heparinizada se le aaden los antisueros correspondientes: anti- A, antiB o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habr aglutinacin

cuando los glbulos rojos posean la especificidad del antisuero aadido (Tabla 17.2). De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la determinacin de los distintos grupos Rh.

TABLA 17.2 Determinacin del grupo sanguneo Grupo sanguneo Anti-A O A B AB + + Aglutinacin con suero Anti-B + + Anti-AB + + +

Hemaglutinacin indirecta Se basa en el principio de la inhibicin de la hemaglutinacin. Para su realizacin se precisan glbulos rojos a los cuales se les ha unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar (Figura 17.5). Si estos glbulos rojos son puestos en presencia de anticuerpos preparados frente a dicha sustancia se producir su aglutinacin. Por el contrario, cuando se aade un suero problema que contiene la sustancia a cuantificar entonces los anticuerpos se unirn a dicha sustancia y no a los glbulos rojos. En este caso no se producir la hemaglutinacin. Por tanto, aglutinacin (+) indica ausencia de la sustancia a estudiar, y aglutinacin (-) indica presencia de la misma. La medida de gonadotrofina corinica (HCG) para el diagnstico de embarazo puede realizarse por esta tcnica.

Figura 17.5

TCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA La fluorescencia es una propiedad de ciertas molculas que, al ser irradiadas con energa electromagntica de longitud de onda adecuada, emiten radiacin de longitud de onda caracterstica permitiendo su cuantificacin. Las molculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta energa (longitud de onda ms corta) en luz de menor energa (longitud de onda ms larga). Cada fluorocromo tiene un espectro de emisin y excitacin caractersticos; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitacin pero distinto espectro de emisin, se pueden medir dos caractersticas al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores). La inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la deteccin de autoanticuerpos y anticuerpos contra antgenos de superficie de clulas y tejidos. Para ello se emplean anticuerpos preparados frente a la protena que se desea detectar marcados con molculas fluorescentes (Figura 17.6). Se aprecia si hubo unin del anticuerpo con el antgeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta. Este procedimiento (Inmunofluorescencia directa) tiene la limitacin del marcaje con un fluorocromo de cada uno de los anticuerpos necesarios para cada una de las sustancias a investigar. Para evitar esto, lo que se hace es tratar el tejido o clulas con antisueros anti-antgeno producidos, por ejemplo, en conejo y secundariamente anti-inmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo (Inmunofluorescencia indirecta)
Figura 17.6

CITOMETRA DE FLUJO
Figura 17.7

La tcnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el estudio de poblaciones de clulas de sangre perifrica. Actualmente el anlisis de una suspensin de clulas vivas marcadas con un fluorocromo se realiza mediante un citmetro de flujo. La suspensin celular se hace circular en forma de gotas microscpicas. Las clulas pasan por un campo de deteccin atravesado por un potente rayo lser que produce la dispersin de la luz y la activacin de la fluorescencia. Mediante sensores especficos se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio en funcin de sus propiedades fisicoqumicas y del marcaje efectuado. Para la separacin celular este aparato lleva acoplado un sistema que carga elctricamente las clulas y con placas deflectoras se realiza su separacin (Figura 17.7). Adems de basarse en la deteccin de la

fluorescencia emitida por las clulas marcadas, tambin lo hace en otras propiedades diferenciales de las clulas en estudio como tamao (FSC), complejidad (SSC), etc. (Figura 17.8).
Figura17.8

La seal producida como consecuencia de la excitacin del fluorocromo, permite conocer el porcentaje de clulas reconocido por el anticuerpo monoclonal empleado. Como consecuencia se observan imgenes en dos dimensiones (Dot-Plot) (Figura 17.9).o en una dimensin (Histograma) (Figura 17.10) en las que se distinguen las diferentes poblaciones celulares marcadas.
Figura 17.9

La puesta a punto de las tcnicas de citofluorometra, en las que se conjugan los avances de informtica, rayos lser y anticuerpos monoclonales permite el anlisis fenotpico y funcional de las clulas T, B y de todas aquellas clulas de las que se disponga de un antisuero que las identifique. En la tabla 17.3 se recogen los valores normales obtenidos en clulas de sangre perifrica.

Figura 17.10

TABLA 17.3 Niveles en suero de las inmunoglobulinas (mg/dl) IgG IgA IgM R.N. 1-3 meses 4-6 meses 6-12 meses 1 a 2 aos 2 a 3 aos. 3 a 4 aos 4 a 7 aos 7 a 10 aos Adultos 500-1000 300-500 300-500 500-700 600-1200 750-1500 750-1800 800-1800 800-1800 800-1800 0-5 2-16 15-30 30-60 30-175 70-250 90-390 90-450 90-450 90-450 0-10 15-30 35-60 60-180 60-220 60-250 60-280 60-280 60-280 60-280

Marcadores de linfocitos B. Para cuantificar los linfocitos B totales se utiliza el marcador CD19. Por otro lado, en los linfocitos B activados se pierde la expresin de las molculas CD21, CD22 y CD24, hay un incremento en la expresin de molculas HLA-DR y de receptores de linfocinas (por ejemplo el receptor de la IL-2) y aparecen marcadores nuevos, como el CD23, ausente en linfocitos B en reposo. Marcadores de linfocitos T. En este caso se utilizan los marcadores CD3, CD4 y CD8 presentes de forma especfica en linfocitos T totales y en la subpoblaciones de clulas T de colaboracin y citotxicas/supresoras respectivamente. En el proceso de activacin celular T se expresan nuevas molculas de superficie, son principalmente receptores para factores de crecimiento y proliferacin celular. Entre estos nuevos antgenos de activacin expresados en la superficie celular se incluyen: a) receptores de interleucinas (como la molcula CD25 que corresponde a la cadena p55 del receptor de la IL-2); b) receptores de la insulina y de la

transferrina (CD71); c) antgenos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) clase II, que no estn presentes en linfocitos T en reposo; y d) una gran variedad de molculas de superficie, cuya funcin no es totalmente conocida (por ejemplo, CD26, CD29, VLA-2, CD69). n(Ac)+c(Ag) + m(Ag*) <---> h(Ag-Ac)+j(Ag*-Ac)+K(Ag*)+I(Ag)

En donde: Ac: Anticuerpo; Ag: Antgeno (sustancia a cuantificar); Ag*: Antgeno marcado con un istopo; Ag-Ac: Complejos de anticuerpos y antgenos no marcados y Ag*-Ac: Complejos de anticuerpos y antgenos marcados

TCNICA DE RADIOINMUNOENSAYO
Figura17.11

El radioinmunoensayo (RIA) se basa en la competencia que se establece, para unirse a anticuerpos especficos, entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con un istopo. Al establecerse esta competicin resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuantificar, menor ser la cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa (ver esquema anexo). Este tipo de reaccin se encuentra esquematizado en la Figura 17.11. Los resultados se obtienen al medir la radiactividad de la hormona marcada unida al anticuerpo y la de la hormona marcada libre mediante un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre queda en solucin y la hormona unida al anticuerpo forma agregados fcilmente precipitables. Una vez medida la radiactividad se construye una curva con los resultados obtenidos con cantidades conocidas de hormona sin marcar y marcada. A esta curva se llevan los valores obtenidos de los sueros problema y se obtiene la concentracin de la hormona no marcada a investigar. En el RIA directo, a la fase slida se une una cantidad conocida de Ac. Diferentes concentraciones conocidas de antgeno marcado se incuban con una concentracin constante de la muestra de la que se desea conocer la concentracin del antgeno en cuestin.

El fundamento y la deteccin no sufriran cambios respecto lo anteriormente comentado. El RIA de inhibicin tambin sera una tcnica competitiva de anlisis pero lo que se une a la fase slida es una cantidad fija de antgeno. Para el proceso de inhibicin se incuba una concentracin fija de anticuerpo marcado frente a una serie de diluciones de la muestra que contiene el antgeno. Existe una tcnica no competitiva que es el denominado sandwich: Se une un Ac en cantidades constantes a la fase slida. Una vez realizado el bloqueo, se aade el antgeno en concentraciones variables. Posteriormente se aade un segundo anticuerpo contra el antgeno, pero esta vez marcado. Adems del radioinmunoensayo antes descrito hemos de considerar que, en la actualidad, es cada vez ms frecuente el empleo de inmunoglobulinas marcadas con istopos radiactivos para su posterior aplicacin en diferentes campos: trazador en determinaciones in vitro de antgenos especficos, en tcnicas inmunorradiohistolgicas y tcnicas de anlisis no competitivo que pueden ser una alternativa al RIA en la determinacin de algunas molculas que no pueden ser marcadas directamente con radioyodo, en la deteccin de tumores primarios o metastsicos (inmunoescintografa) e incluso la posibilidad de irradiacin local de clulas neoplsicas (inmunorradioterapia). Todas las posibilidades anteriormente indicadas se basan en la posibilidad de marcar el anticuerpo con radioyodo sin mermar su inmunorreactividad. El marcaje de protenas o pptidos con yodo radiactivo I125 I132 puede realizarse por diferentes mtodos. La incorporacin del yodo a la molcula se realiza en los aminocidos aromticos que forman parte de la estructura de la cadena peptdica: tiroxina, fenilalanina, triptfano o histidina. La tcnica del radioinmunoensayo posee algunos inconvenientes que derivan de la necesidad de utilizar istopos. Adems de su peligrosidad y la obligatoriedad de disponer de instalaciones adecuadas para su utilizacin, existen istopos que tienen el inconveniente de su pronta caducidad.

TCNICA DE ENZIMOINMUNOENSAYO. Esta tcnica, tambin se conoce como test de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). La identificacin de los complejos Ag-Ac, se hace mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antgeno, o bien unidas al anticuerpo. El test de ELISA puede ser directo o no competitivo, constando de los siguientes pasos: a) Se tapiza la placa con el anticuerpo especfico frente al antgeno a determinar. b) Se aade la muestra con el antgeno. c) Se adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima que en presencia de su sustrato da un producto coloreado soluble, este producto es cuantificado mediante el lector de ELISA (Figura 17.12) e indirecto o competitivo, se diferencia del caso anterior en que se aaden los anticuerpos, previamente incubados con la muestra, los anticuerpos que no se han unido a los antgenos de la muestra lo harn a los antgenos de los pocillos (Figura 17.13) Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la galactosidasa o la glucosa oxidasa.

Figura 17.12

Esta tcnica se utiliza para la medida de hormonas, antgenos de la hepatitis y otras muchas sustancias que se encuentran a muy bajas concentraciones.
Figura 17.13

Una variante de esta tcnica de gran utilidad se conoce como test en fase slida y est orientada a la determinacin de anticuerpos frente a un determinado antgeno. Para ello el antgeno se encuentra fijo a un soporte (por ejemplo tubo de plstico). Al aadir la muestra con el posible anticuerpo se unir y podr ser detectado aadiendo anti-inmunoglobulinas marcadas con el enzima. Otra variante de las aplicaciones inmunoenzimticas es cuando el antgeno se encuentra fijo en clulas o tejidos. Al igual que hemos visto en el apartado de inmunofluorescencia indirecta, en este caso tambin se emplean dos anticuerpos. El primero, con actividad frente a los antgenos a estudiar, y el segundo, que va dirigido frente al primero y

que acta de puente con el complejo portador de la enzima. Cuando la enzima es la peroxidasa, este complejo suele ser una peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) (Figura 17.14).
Figura 17.4

La diferencia principal entre las tcnicas de RIA y ELISA es que la primera utiliza como marcador un istopo y la segunda la actividad de un enzima, as el RIA directo y el ELISA competitivo seran equivalentes, y tambin existira ELISA de inhibicin y ELISA en Sandwich. Existen inmunoensayos que se denominan homogneos en los cuales no es necesario la separacin de los inmunocomplejos de los reactivos libres. Son tcnicas muchas de ellas patentadas por diferentes

firmas comerciales. TCNICAS NEFELOMTRICAS Estas tcnicas se basan en la deteccin de los complejos Ag-Ac, por la refraccin que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antgeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos lser y se establece una relacin entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados (Figura 17.15). Este procedimiento es rpido y sensible y se est utilizando en la actualidad, sobre todo, para la cuantificacin de protenas en suero y en otros lquidos biolgicos.
Figura 17.5

SELECCIN DE CLULAS UNIDAS A UN ANTICUERPO En la actualidad disponemos de varios mtodos para seleccionar clulas a las que previamente se ha unido un anticuerpo. La adicin de complemento elimina dicha poblacin celular (seleccin negativa), es la denominada tcnica de inmunotoxicidad.

La separacin inmunomagntica se basa en la interaccin entre antgenos celulares superficiales y anticuerpos unidos a bolas magnticas (Figura 17.16). La aplicacin de un campo magntico permite separar las clulas unidas a las bolas (seleccin positiva) de las clulas no unidas (seleccin negativa).
Figura 17.16

Es un mtodo fcil, rpido y no muy costoso. Este mtodo presenta muchas aplicaciones no slo en Inmunologa sino tambin en Microbiologa, utilizando bolas unidas a anticuerpos frente a un determinado microorganismo; en Biologa Molecular para aislamiento de DNA y mRNA utilizando bolas a las que se adsorbe el DNA y bolas unidas a una secuencia de oligonucletidos respectivamente. Tambin se pueden usar para la purificacin de protenas si se unen las bolas a anticuerpos especficos. La separacin de clulas puede realizarse mediante el FACS (Fluorescence activated cell sorting) en la que adems de los dispositivos de citometra ya mencionados se dispone de mecanismos de separacin celular en funcin de la fluorescencia emitida por las clulas marcadas con anticuerpos. Esta es la tcnica que actualmente ofrece mejores resultados. TCNICAS USADAS EN EL AISLAMIENTO DE ANTICUERPOS O ANTGENOS PUROS. Esta tcnica es ampliamente utilizada en Bioqumica e Inmunologa. Puede aplicarse en el aislamiento de una poblacin pura de anticuerpos. Para ello se prepara un inmunoabsorbente en fase slida, que es un antgeno unido covalentemente a un soporte inerte, como por ejemplo bolitas de dextrano entrecruzadas. El inmunoabsorbente, se coloca en una columna y la mezcla de anticuerpos se hace pasar a travs de l bajo condiciones fisiolgicas. Los anticuerpos especficos para el antgeno permanecen unidos a la columna, y aquellos que no se unen son eliminados mediante lavado. En el segundo paso, se eluye la columna, usando un tampn de elucin que disocia la unin antgeno-anticuerpo (por ej., acetato a pH 3.0) para obtener el anticuerpo que se uni al inmunoabsorbente. A la inversa, colocando anticuerpos en la columna se tendr antgeno puro. Esta tcnica permite obtener otros tipos de molculas. As una columna de lectina absorber todas las molculas con determinados residuos azcar, que pueden eluirse en un tampn con el azcar libre, ya que ste compite con la protena ligada por los sitios de unin a la lectina.

INMUNOPRECIPITACIN E INMUNOBLOTTING La inmunoprecipitacin es una de las tcnicas inmunolgicas ms tiles cuando se asocia a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. De este modo se pueden determinar la presencia y cantidad de un antgeno, el peso molecular relativo de una cadena polipeptdica, su sntesis y degradacin, la interaccin con protenas, cidos nucleicos u otros ligandos. La tcnica de inmunoprecipitacin se divide en cuatro pasos (Figura 17.17):

Figura 17.17

1. 2. 3. 4.

Marcaje del antgeno (opcional) Lisis de las clulas para liberar el Ag Formacin del complejo Ag-Ac Purificacin de los inmunocomplejos

En la mayora de los casos el antgeno se marca incubndolo con un precursor radiactivo aunque muchos antgenos se pueden detectar por medios que no requieren marcaje directo. El antgeno se extrae de las clulas mediante lisis. Despus, los anticuerpos se aaden al lisado y se forman los inmunocomplejos Ag-Ac. Estos se unen por adsorcin a una fase slida que contiene protena A. Los inmunocomplejos se analizan generalmente por electroforesis en gel pero tambin pueden ser usados en diferentes tcnicas incluyendo estudios enzimticos, unin a ligandos, inmunizaciones, inmunoblotting, etc. Una de estas tcnicas es el Western blot que combina la resolucin de la electroforesis en gel con la especificidad de la deteccin inmunoqumica. Se utiliza para determinar la presencia y cantidad de antgenos y de anticuerpos especficos. En la actualidad es el test confirmatorio ms empleado para el diagnstico del SIDA. Se emplean antgenos virales obtenidos por cultivo celular. Mediante electroforesis se separan las diferentes protenas vricas por su diferente peso molecular. Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y secundariamente se incuban con el suero problema. Los anticuerpos se detectan aadiendo una anti-IgG humana marcada con una enzima (peroxidasa) que produce una banda coloreada al aadir un sustrato. Esta tcnica identifica anticuerpos especficos frente a las distintas protenas del VIH. OTRAS TCNICAS BASADAS EN LA UNION ANTGENO-ANTICUERPO Hay otros modos para detectar el complejo antgeno-anticuerpo una vez que ste se ha formado, adems de los descritos en los apartados anteriores. Son, por ejemplo, las tcnicas basadas en el marcaje de anticuerpos con ferritina u oro coloidad, de gran utilidad en microscopa electrnica. La tcnica de anticuerpos marcados con ferritina se basa en el hecho de que casi el 25% de esta molcula est formada por hierro que, al ser opaco a los electrones, puede ser detectado en microscopa electrnica. Los anticuerpos pueden ser combinados a la ferritina (u

otras protenas) mediante ligandos bivalentes como el 1,3-difluoro-4,6-dinitrobenceno o la bencidina bidiazoica entre otros. La tcnica basada en el marcaje de anticuerpos con oro coloidal y su uso en microscopa electrnica se basa, al igual que en el caso anterior, en la opacidad de estas molculas a los electrones. Estas tcnicas son de gran utilidad en inmunohistologa e inmunocitologa humana, animal y vegetal. Tambin estn tomando cada vez mayor auge las tcnicas quimioluminiscentes. La quimioluminiscencia consiste en trminos generales en la produccin qumica de la luz. Los marcadores quimioluminiscentes son sustancias capaces de emitir luz cuando, al absorber la energa de una reaccin qumica oxidativa, son colocadas en un estado de excitacin electrnica. La emisin de luz se produce al volver a su estado inicial y la energa qumica absorbida se cede en forma de fotones fcilmente cuantificables con un fotodetector. Los marcadores quimioluminiscentes constituyen una alternativa al uso de istopos radiactivos en el inmunoanlisis, pues los compuestos quimioluminiscentes son de gran estabilidad y la emisin de luz slo se produce cuando se provoca la reaccin oxidativa siendo posible almacenar largo tiempo los compuestos luminiscentes. Las tcnicas anteriores as como las de inmunofluorescencia, radioinmunoanlisis e enzimoinmunoensayo pueden realizarse utilizando un sistema de ampliacin de las seales empleando el complejo avidina-biotina. La biotina es una vitamina de bajo peso molecular, y la avidina es una glicoprotena, contenida en la clara del huevo. La biotina se une covalentemente al anticuerpo a travs de un grupo amina, carboxilo sulfhidrilo o tiosil. Varias molculas de biotina, pueden unirse a una de anticuerpo y dada la afinidad biotina-avidina resulta que, cada molcula proteica, se vera unida, a travs de la biotina, con varias molculas de avidina a su vez unidas al marcador correspondiente. TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR UTILES EN INMUNOLOGA.
Figura 17.8

Otro grupo de tcnicas ampliamente utilizadas en inmunologa son de biologa molecular. Una de las ms utilizadas es la Southern Blot. Esta tcnica consiste en la separacin de fragmentos de DNA previamente obtenidos por digestin con enzimas de restriccin. La separacin se hace mediante electroforesis y despus este DNA es transferido a membranas de nylon o nitrocelulosa (blot). Despus, para la identificacin de la banda que

interesa se realiza un proceso llamado hibrizacin, en el que la membrana es "incubada" con un fragmento de DNA complementario al gen de inters (sonda) previamente marcada, generalmente con un istopo, lo que permite posteriormente visualizar mediante autoradiografa la banda en la cual se ha producido unin (Figura 17.18),

BIBLIOGRAFA 1. 2. Bloisi, R.M. 1988. Principles of Immunology and Inmunodiagnostic. Ed. Lea/Tebiger. Johnstone, A. and Thorpe, R. 1987. Immunochemistry in Practice. 2nd ed.

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