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Captulo 19

Inter Simple Sequence Repeats (ISSRs)

Andrea Gonzlez y Xitlali Aguirre

Los ISSRs son un tipo de marcador gentico que nos permite obtener los niveles de variacin en las regiones microsatlite que se encuentran dispersas en varios genomas, particularmente el nuclear. Estas regiones consisten en repeticiones en tandem de motivos simples como (CT)n (CA)n, ubicadas entre secuencias no repetitivas del genoma nuclear eucarionte. Los motivos repetidos, llamados tambin SSRs (simple sequence repeats) pueden ser penta-, tetra-, tri- y dinucletidos. La longitud de las secuencias de microsatlites tiende a ser altamente variable entre individuos debido a las altas tasas de mutacin que experimentan, ya que cuando el DNA se replica durante la meiosis, la DNA polimerasa puede tartamudear hacia adelante o hacia atrs en las unidades repetidas, eliminando o agregando unidades a la cadena. Las cadenas resultantes pueden entonces presentar menos o ms unidades de repeticin (o pares de bases) que las cadenas parentales (Zietkiewicz et al., 1994; Wolfe, 2000). Los ISSRs son marcadores semiarbitrarios amplificados por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de la presencia de un oligonucletido o primer complementario a un microsatlite, diseado para unirse a los motivos repetidos de di y trinucletidos (evitando los mononucletidos presentes en el cloroplasto). Los primers de ISSRs consisten en un motivo repetido de di- o trinucletidos complementario a la secuencia del microsatlite. En ocasiones es posible agregar a esta secuencia un par de nucletidos extras arbitrarios en
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el extremo 3 o en el 5, que jugarn el papel de anclas asegurando as que la amplificacin inicie siempre en el extremo 5 o en el 3 del microsatlite, respectivamente (Zietkiewicz et al., 1994; Bornet y Branchard, 2001; Pradeep, 2002). Cuando dos secuencias repetidas se presentan dentro de una distancia amplificable y con una orientacin invertida, el primer complementario a ellas (uno por reaccin de PCR; vase el captulo 17 de este libro) puede inducir la amplificacin del segmento de ADN intermedio. La molcula generada, con un tamao particular (peso molecular), se considera un locus, que representa el segmento de ADN entre los microsatlites. Y se ha visto que los ISSRs frecuentemente amplifican de 25 a 50 bandas en una sola reaccin. Este patrn caracterstico de productos de PCR se considera la huella digital gentica de cada uno de los individuos analizados. El polimorfismo entre individuos de la misma poblacin puede detectarse, ya que el anlisis es sensible a la presencia/ausencia del elemento genmico reconocido por el primer y a la longitud de la secuencia intermedia amplificada (Zietkiewicz et al., 1994).
Figura 1. Amplificacin con un primer (CA)n anclado en el extremo 5 con tres nucletidos extras. Se amplifica el segmento intermedio entre dos secuencias de microsatlite en orientacin invertida

Las bandas de ISSRs son consideradas marcadores dominantes. La presencia de la banda representa el genotipo dominante (homcigo o hetercigo), mientras que su ausencia representa el genotipo homcigo recesivo. Se asume que existen dos alelos por locus. La ausencia de una banda puede deberse a varios factores: 1) La no existencia de un sitio de unin completo al primer debido a una mutacin, 2) Rearreglos estructurales en el cromosoma durante la meiosis, 3) Inserciones o deleciones suficientemente grandes como para aumentar o

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disminuir el tamao de la banda, de manera que se identifica como un locus diferente.

Ventajas y desventajas
Las ventajas que ofrece esta tcnica se centran principalmente en la alta variacin que detecta, as como en su reproducibilidad debida principalmente a las altas temperaturas de alineacin utilizadas en la PCR. Asimismo, no son necesarias altas concentraciones de ADN. Por otro lado, para disear los primers no es necesario conocer la secuencia del genoma del organismo en estudio. Pueden visualizarse tanto en geles de agarosa como de acrilamida. Finalmente, son sencillos de montar, rpidos, eficientes y poco costosos. En cuanto a las desventajas, la homologa de las bandas es incierta. Y dado que son marcadores dominantes, no permiten el clculo de ciertos parmetros que exigen distinguir a los hetercigos de los homcigos dominantes (como FIS y FIT; Wright, 1965). Asimismo, para estimar la heterocigosis poblacional es necesario asumir a priori que la poblacin se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg, por lo que las estimaciones de heterocigosis y estructuracin gentica pueden sesgarse un poco, aunque existen correcciones estadsticas (Lynch y Milligan, 1994).

Aplicaciones
Los ISSRs pueden ser utilizados como marcadores en la resolucin de mltiples problemas biolgicos. Los polimorfismos que presentan, adems de su heredabilidad, permiten aplicarlos en la identificacin de individuos, distincin de variedades intraespecficas (particularmente en especies con importancia econmica), identificacin de paternidad y maternidad, mapeo gentico, evaluacin de diversidad y subdivisin gentica en poblaciones, reconstrucciones filogenticas, introgresin e hibridizacin, y distincin de individuos con origen clonal y sexual (Zietkiewicz et al., 1994; Wolfe, 2000; Pradeep et al., 2002). Ejemplo Al empezar a trabajar con ISSRs es recomendable probar diferentes primers en una condicin estndar y despus optimizar aquellos que dieron resultados positivos. Esta optimizacin incluye modificar las condiciones iniciales de

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la PCR, particularmente la temperatura y tiempo de alineacin, as como la concentracin de MgCl2. Por ejemplo, en algunos estudios de gentica de poblaciones con especies del gnero Agave (Aguirre, 2004; Gonzlez, 2004) se amplificaron ISSRs con los siguientes primers: 841 842 846 857 GAG AGA GAG AGA GAG AYC GAG AGA GAG AGA GAG AYG CAC ACA CAC ACA CAC ART ACA CAC ACA CAC ACA CYT Y=C o T R=A o G

Para una reaccin de 25 l se agregaron 2.5 l de amortiguador para PCR 10X, 0.5 l de dNTP mix (mezcla de los 4 dideoxinucletidos a 10 mM), 0.2 l de Taq polimerasa a 5 U/l; 2 l de DNA a 15 ng/l; el volumen de MgCl2 (concentracin inicial de 30 mM) depende de la concentracin ptima para cada primer y para completar los 25 l de la reaccin, se agreg el volumen necesario de agua ultrapura correspondiente (tabla 1)
Tabla 1. Condiciones ptimas de amplificacin para algunos primers.
Primer 841 842 846 857 Temperatura de alineacin Tiempo de Alineacin [MgCl2] (mM) 60 C 60 C 52 C 52 C 45 35 45 45 2.1 2.3 0.96 1.5 No. de ciclos 30 35 30 30

Una vez que se visualizaron las bandas en geles de agarosa al 2% teidos con bromuro de etidio, se hizo un listado de todas las bandas o loci ampificados en la poblacin. Con estos datos se elabor una matriz de presencia/ausencia de las bandas por individuo. Esto puede hacerse a mano, o bien por medio de programas como el 1D 3.5 de Kodak. Una vez obtenida la matriz, los datos permitieron obtener frecuencias allicas, y parmetros clsicos de la gentica de poblaciones como heterocigosis poblacional, por especie, estimaciones de la estructuracin, distancias genticas, rboles de similitud y anlisis jerrquicos de la varianza molecular. Estos clculos pueden realizarse con diversos programas como el TFPGA (Miller, 1997) o el Arlequin (Schneider et al., 2000).

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Bibliografa
Aguirre X. 2004. Gentica de poblaciones de Agave cupreata y Agave potatorum: aportaciones para el manejo y la conservacin de dos especies mezcaleras. Tesis de licenciatura, Facultad de Ciencias, UNAM. 73 pp. Bornet B. y Branchard M. 2001. Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Molecular Biology Reporter 19:209-215 Gonzlez A. 2004. Biologa reproductiva y gentica de poblaciones del Agave garciaemendozae. Tesis de licenciatura, Facultad de Ciencias, UNAM. 88 pp. Lynch M. y Milligan B.G., 1994. Analysis of population genetic structure with RAPDs markers. Molecular Ecology 3:91-99 Miller M.P., 1997. Tools For Population Genetic Analyses (TFPGA) 1.3: A Windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data. Computer software distributed by author. Pradeep R., Sarla N. y Siddiq E.A., 2002. Inter simple sequence repeats (ISSR) polymorphism and its aplication in plant breeding. Euphytica 128(1):9-17 Schneider S., Roessli D., y Excoffier L., 2000. Arlequin ver. 2.000. A software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland. Wright S., 1965. The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to systems of mating. Evolution 19:395-420 Wolfe A., 2000. ISSR Resource Website. http://www.biosci.ohio-state.edu/~awolfe/ ISSR/ISSR.html Zietkiewicz E., Rafalski A. y Labuda D., 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeats (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20:176-183