Sistema Web para Projeto de PCR

Abstract. This paper describes a web system that help the work of molecular biologists, automatizating the steps necessary for preparing a PCR experiment. This system will search for genomic sequences in public databases, will do the design and analysis of primers that will be used in the reaction, will analyze the amplified product (considering restriction enzimes), and, at last step, will simulate the electrophoresis gel, showing the final result of the PCR. Resumo. Este artigo descreve um sistema web que auxilia o trabalho dos pesquisadores de cincias biolgicas, automatizando as etapas necessrias para a realizao de um experimento de PCR. O software far a busca de seqncias genmicas em bancos de dados pblicos, far o projeto e anlise de primers que sero usados na reao, a anlise do produto amplificado (considerando enzimas de restrio) e, por fim, far a simulao do gel de eletroforese, apresentando o resultado final da PCR.

1. Conceituao Terica
1.1. Bancos de Dados Biolgicos Pblicos Com o aumento do nmero de pesquisas na rea de bioinformtica tornou-se indispensvel a criao de bancos de dados para o armazenamento de informaes relevantes sobre tal rea. Esses bancos de dados possuem seqncias de DNA, RNA, protenas, genes, ESTs (Expressed Sequence Tags), revistas e artigos de cincias biolgicas e mdicas, entre outras informaes. Um dos principais trabalhos realizados na rea de biologia molecular o seqenciamento de um trecho de DNA. Assim, para que os trechos seqenciados fiquem disponveis ao mundo todo, foram criados bancos de dados biolgicos pblicos. Esses bancos de dados esto disponveis em sites da internet e podem ser acessados por pesquisadores do mundo todo. Os sites mais conhecidos so: o NCBI (National Center for Biotechnology Information), o GenBank e o Expasy. Uma das grandes vantagens da existncia desses repositrios a estruturao dos dados, que facilita o desenvolvimento de algoritmos para tratar os dados armazenados e evita que dados sejam armazenados duplicados.

1.2. Reao de PCR A PCR uma tcnica que possibilita a reproduo de milhares de cpias de um determinado fragmento de DNA. Atravs dessa tcnica, uma seqncia particular de interesse pode ser amplificada (replicada), tornando-se majoritria na amostra de DNA, e assim a seqncia amplificada pode ser utilizada para outros fins (TRIUNFOL, 2003).

PCR til em diagnsticos para DNA para verificar a presena de um gene ou um estado mutacional de um gene especfico, ou simplesmente na amplificao de um segmento especfico (GRIFFITHS et al, 2002). Depois que uma seqncia amplificada, ela pode ser utilizada em um experimento de eletroforese, por exemplo. Aps a reao de PCR, normalmente a seqncia analisada em outra ferramenta. O processo de PCR utiliza mltiplos ciclos de desnaturao, anelamento com primers e alongamento da seqncia por ao da polimerase (LIFE TECHNOLOGY, ca. 2000). Esses primers so pequenos fragmentos de DNA complementares a cada uma das extremidades da seqncia de DNA de interesse. A Figura 1 mostra uma representao da tcnica de PCR.

Figura 1. Reao em cadeia da polimerase PCR Fonte: Triunfol (2003)

H alguns tipos de reaes de PCR com processos e finalidades diferentes. Entre eles, destacam-se no contexto deste trabalho: Nested PCR, Multiplex PCR, Universal Primers e Degenerate Primers (SINGH e KUMAR, 2003). Alm dos tipos de PCR, existem parmetros que afetam a eficincia da PCR, como a: temperatura de anelamento (Ta) e tempo de anelamento, temperatura de desnaturao (Tm) e tempo de desnaturao, concentrao e seleo das enzimas de restrio, concentrao e projeto de primer.

1.3. Primers Primer uma pequena cadeia de DNA de fita simples, onde, a partir da posio 3, a enzima DNA polimerase iniciar a incorporao de nucleotdeos, formando a fita dupla do DNA. Os primers so produzidos in vivo ou in vitro. Na forma natural, os primers so produzidos por uma RNA polimerase especial chamada Primase (SILVA, 2001). Primers so utilizados para reaes de PCR e para seqenciamento. O projeto de primer uma das mais importantes etapas para que se tenha uma reao de PCR bem sucedida (ALKAMI, 1999). Existem muitos pontos que devem considerados para se projetar um primer de boa qualidade. Os principais so: tamanho da seqncia do primer, temperatura de anelamento do primer, quantidade de nucleotdeos G e C no primer, potencial do primer para formar estruturas secundrias (primers que se anelam entre si ou se anelam a outros primers).

Existem vrias ferramentas computacionais que projetam primers. Um exemplo de ferramenta disponvel na internet Web Primer (WEB PRIMER, 2003), e outra ferramenta, tambm gratuita, Gene Runner. A ferramenta Web Primer prov primers para duas finalidades distintas: seqenciamento ou PCR. A ferramenta Gene Runner para Windows est disponvel para download gratuitamente em Gene Runner (2003). Essa ferramenta prov vrios servios. Para o projeto de primers essa ferramenta no muito eficiente, pois no restringe os primers de acordo com os parmetros de entrada.

1.4. Enzimas de Restrio Segundo De Robertis e Hib (2001), enzimas de restrio so enzimas que reconhecem seqncias especficas de nucleotdeos nas molculas de DNA, e promovem um corte nesses pontos. As enzimas atuam como tesouras, cortando o DNA. As enzimas no cortam aleatoriamente. Elas cortam em locais especficos (GRIFFITHS et al, 2002). Cada enzima reconhece um trecho especfico de uma seqncia de DNA. As enzimas de restrio so utilizadas em reaes de PCR, tcnica de DNA recombinante e clonagem de genes. Geralmente, aps a reao de PCR faz-se necessrio comprovar se uma seqncia contm um determinado trecho ou no. Ento a seqncia submetida ao de enzimas. Se for verificado atravs da eletroforese que o trecho foi cortado, ento o trecho procurado est presente na seqncia. Mas se a seqncia continuar inteira, o trecho procurado no foi amplificado. Um exemplo de enzima de restrio muito utilizada a enzima EcoRI. Ela reconhece a seqncia GAATTC. Essa seqncia um palndromo, porque a fita complementar a ela CTTAAG, que exatamente a mesma seqncia, mas em orientao antiparalela. Quando a enzima corta essa seqncia ela deixa duas pontas adesivas, que podem se unir a qualquer outra seqncia que foi cortada pela mesma enzima, como pode ser visto na Figura 2 (GRIFFITHS et al, 2002). Existem enzimas que fazem um corte preciso, no deixando as pontas adesivas.

Figura 2. Stio-Alvo da Enzima EcoRI Fonte: Biomania (2003)

A digesto de DNA por enzimas de restrio ocorre de forma simples. A enzima em contato com a seqncia, a uma temperatura ideal (em geral 370 C), corta a seqncia em trechos definidos. O nmero de trechos estabelecido pelo nmero de stios de restrio reconhecidos pela enzima (TRIUNFOL, 2003). 1.5. Eletroforese Eletroforese a tcnica pela qual, fragmentos de DNA de diferentes tamanhos so separados por peso molecular. As seqncias de DNA so colocadas em um equipamento que contm canais preenchidos de gel, e elas percorrem esse gel, movidos por uma diferena de potencial eltrico. Se o peso molecular de uma seqncia maior que o de outra, o primeiro percorre o gel mais lentamente que o segundo (TRIUNFOL, 2003). A Figura 3 mostra um gel de eletroforese. Nas colunas de 1 a 14 h poos contendo diferentes seqncias de DNA. Pode-se ver os tamanhos dos fragmentos separados no gel no lado esquerdo da Figura.

Figura 3 Exemplo de gel de eletroforese Fonte: Threlfall et al (2003)

Trechos de DNA, depois de amplificados por PCR, e possivelmente cortados por enzimas de restrio, podem ser separados pela eletroforese e comparados a outras seqncias, para verificar se duas seqncias possuem o mesmo gene, por exemplo. Existem softwares disponveis na web que simulam a eletroforese. Um exemplo o Gel Electrophoresis Simulator (COWAN, 2003), que pode ser visto na Figura 4. Ele tem a possibilidade de ter no mximo oito fragmentos de DNA e o gel utilizado

agarose. O maior problema desse simulador que ele no mostra o tempo de corrida dos fragmentos no gel. Mas podem ser alterados o potencial de eletricidade e a concentrao do gel de agarose.

Figura 4. Tela do software Gel Electrophoresis Simulator Fonte: Cowan (2003)

Outra ferramenta disponvel na web Simulation of Electrophoresis & Sequence Building of DNA (CRAIG, 2003). A tela desse software pode ser vista na Figura 5.

Figura 5. Tela do software Simulation of Electrophoresis & Sequence Building of DNA Fonte: Craig (2003)

1.6. Bioinformtica A bioinformtica uma ferramenta recente e em pleno desenvolvimento. Imagina-se que ser a nova cincia do sculo XXI, e seus primeiros resultados j so visveis, como a identificao de genes para inmeras doenas, como o cncer de mama. A bioinformtica uma nova ferramenta cientfica que une a bioqumica com a informtica. Criada nas ltimas dcadas para tratar a imensa massa de dados que vem sendo gerada pelos vrios projetos de genoma ao redor do mundo, a bioinformtica permite explorar informaes nunca antes disponveis, e pode gerar resultados nunca antes imaginados. A bioinformtica inicia logo aps o seqenciamento de DNA. Com essa etapa concluda, a bioinformtica utilizada para extrair informaes importantes a respeito das seqncias, fazer novas descobertas, como, por exemplo, quais trechos de DNA correspondem aos genes. A bioinformtica poder num futuro breve auxiliar na produo de frmacos com base na estrutura das protenas. A bioinformtica pode simular situaes para minimizar custos e tempo, que caso da simulao da eletroforese.

2. Descrio do Problema
O projeto de PCR inclui basicamente quatro etapas: a busca de seqncias de interesse, o projeto e a anlise de primers, a anlise do produto amplificado, e a revelao do gel de eletroforese. Neste trabalho, so executadas as etapas acima, para que minimize os esforos do pesquisador. O sistema proposto serve para auxiliar bilogos e outros profissionais. Atualmente, o pesquisador precisa procurar pelas seqncias a serem amplificadas em sites como o NCBI; depois ele precisa usar ferramentas para projetar primers, o que geralmente trabalhoso e demorado; ento ele deve fazer um alinhamento local para saber se o primer especfico para a seqncia que ele quer; depois ele faz uma anlise com as enzimas de restrio em outra ferramenta/site; e finalmente, vai ao laboratrio aplicar sua amostra eletroforese para verificar se algo foi amplificado. As etapas podem ser ainda mais trabalhosas se o mesmo primer for projetado para alinhar em mais de uma seqncia.

3. Desenvolvimento da Pesquisa
Cada uma das fases do projeto permite a interveno do pesquisador para melhor ajuste. Para cada fase so necessrias uma ou mais telas para a entrada de parmetros e a sada dos resultados. O usurio pode escolher uma opo entre as que o sistema permite: Projeto de PCR (completo), Anlise de Primers (anlise de caractersticas de primers prontos definidos pelo usurio), Anlise do Produto Amplificado (anlise com enzimas de restrio para uma seqncia fornecida pelo usurio) e Simulao de Eletroforese (apenas simula a eletroforese de seqncia(s) fornecida(s) pelo usurio).

3.1. Fase 1 Busca de seqncias Esta etapa permite ao pesquisador digitar parmetros de busca de seqncias no sistema. Assim, automaticamente, o sistema procura no site do NCBI as seqncias encontradas e monta uma pgina dinmica com os resultados. O sistema permite ao pesquisador especificar a(s) seqncia(s) de interesse, ou realizar automaticamente uma busca em banco de dados pblicos com base em palavras-chave especificadas pelo pesquisador. Tambm permite especificar quais seqncias deseja-se anelamento dos primers, e para quais os primers no devem se anelar. Para isso h ferramentas de alinhamento mltiplo e rvores filogenticas que permitem que seja feita uma anlise das seqncias para determinar em quais seqncias o primer deve anelar. Como a busca resultar em seqncias que no faro parte da anlise de primers, h a opo, para cada seqncia, do pesquisador especificar se a seqncia ser considerada na anlise ou no. Para a busca so usadas classes do BioPerl (bibliotecas implementadas em Perl que tratam de assuntos biolgicos, seqncias de DNA, ...) que permitem a busca de seqncias, e um estudo aprofundado para montar uma string de pesquisa eficiente para que no haja muitos resultados indesejados. H a opo do pesquisador guardar em banco de dados as seqncias que ele pesquisou, visualizar a rvore filogentica e o alinhamento mltiplo (essas duas ltimas opes so feitas atravs de ferramentas j disponveis na internet).

3.2. Fase 2 Projeto e Anlise de Primers Esta etapa feita com base nas seqncias escolhidas e em parmetros de primers especificados pelo pesquisador. O sistema projeta primers mais adequados reao de PCR, sendo esta etapa o enfoque deste trabalho. A anlise das caractersticas dos primers encontrados permite apresentar ao pesquisador uma relao ordenada pela qualidade dos mesmos. Os primers selecionados tambm so testados quanto a sua especificidade, onde o sistema realiza automaticamente alinhamento par-a-par com outras seqncias em banco de dados pblicos. Atravs de uma tela de parmetros de entrada, o usurio define qual o tipo de PCR e quais as caractersticas desejadas. Existem vrios tipos de PCR e vrias caractersticas diferentes. Com esses valores, so projetados primers especficos de acordo com as caractersticas. As regies para fazer primers so pontuadas e mostradas em ordem decrescente de pontuao, para que o pesquisador possa escolher as melhores regies para projetar primers. Este tipo de anlise diminui o trabalho do pesquisador, por que o sistema j deixa definido quais as melhores e piores regies. Aps terem sido definidas as regies para os primers, o sistema gera os primers, e mostra caractersticas de cada um. A etapa de gerar os primers exaustiva: primeiramente projeta-se primers de menor tamanho possvel (dentro dos limites estabelecidos pelo usurio) que se anelem a seqncia. Depois, para cada um dos primers gerados, verifica-se se est dentro dos outros limites estabelecidos pelo usurio, como temperatura de anelamento. Para cada primer gerado h uma pontuao especfica. A pontuao difere pelo tipo de reao de PCR escolhida. Para alguns tipos

de PCR, no importa de o primer forma estruturas secundrias, mas para outros tipos de PCR, este parmetro de fundamental importncia. Nesta mesma etapa, feito um alinhamento par-a-par (com a ferramenta Blast (BLAST, 2003)) de cada um dos primers escolhidos pelo usurio com o banco de dados pblico. Isso faz a anlise de especificidade de primer, para que o mesmo primer no se anele em outras seqncias do banco. Se o pesquisador quer um primer para verificar se um indivduo possui um determinado gene de doena, esse mesmo primer no deve se anelar a seqncias que normalmente o individuo possui.

3.3. Fase 3 Anlise do Produto Amplificado Esta etapa permite ao pesquisador obter caractersticas do amplicon (trecho da seqncia que foi amplificada) e aplicar a ao das enzimas de restrio, obtendo tambm informaes sobre as enzimas possveis de serem usadas, os cortes e os pesos moleculares dos produtos resultantes. Com isso, o pesquisador pode estar mais certo da identidade do produto amplificado pela PCR. O pesquisador pode escolher quais as enzimas de restrio que devem fazer parte da anlise. Geralmente, o pesquisador no dispe de todas as enzimas existentes, ento ele s seleciona as que ele tem acesso. Ele escolhe quais os parmetros de entrada, como tamanho do amplicon, nmero mnimo e mximo de cortes, etc. O pesquisador tambm pode incluir no banco de dados do sistema enzimas que no esto cadastradas. Para esta etapa, so utilizados recursos da linguagem Perl para tratamento de strings. As caractersticas de cada enzima so obtidas na internet, em sites de dados biolgicos.

3.4. Fase 4 Simulao do Gel de Eletroforese Por ltimo, para poder identificar com sucesso o resultado da PCR com gel de eletroforese, o sistema permite ao pesquisador informar os parmetros da mesma e prever a aparncia do gel e a separao das bandas esperadas. A eletroforese importante para comprovar se a seqncia foi amplificada pelo(s) primer(s) escolhido(s) e se a ao das enzimas escolhidas foi a esperada. Como o objetivo da reao de PCR amplificar um trecho de seqncia, importante comprovar os resultados. Se uma seqncia foi amplificada corretamente, e foi usada uma enzima de restrio correta, no momento da simulao da eletroforese, aparece bandas de tamanhos diferentes no gel. Outra grande vantagem da simulao determinar quanto tempo a seqncia leva para percorrer o gel, qual a melhor concentrao do gel, qual o tipo de gel utilizado. Se o gel for simulado com alguns parmetros, e no foi obtido o melhor resultado, interessante alterar os parmetros e verificar o resultado novamente. Quando os parmetros estiverem corretos, pode-se efetuar o experimento em um laboratrio. Para que esta etapa seja feita so utilizadas frmulas que calculam o tempo, qual a melhor concentrao do gel, o melhor tipo de gel, etc...

5. Concluses
O sistema est sendo feito em parceria com o Laboratrio de Biologia Molecular da UNIVALI e o Laboratrio de Virologia da UEL (Universidade Estadual de Londrina). Ele ficar pronto e disponvel na internet at a metade do ano corrente. O sistema ter grande utilidade para bilogos e outros profissionais da rea. Ele diminuir o tempo de projetar primers, e diminuir custos de experimentos. Para a etapa de anlise do produto amplificado e a simulao do gel de eletroforese provavelmente no ser dispensado muito tempo. Para a anlise do produto amplificado feito um trabalho de tratamento de strings, e para a simulao so usadas frmulas de fsica. Provavelmente para as etapas de busca de seqncia e projeto de primers, maior tempo ser consumido. Durante o desenvolvimento da etapa de busca de seqncias, problemas foram j observados, como falta de classes do BioPerl ou classes com poucas opes de busca de seqncias. A busca de seqncias e outras etapas talvez se tornem lentas. Ento seria necessrio fazer os algoritmos rodarem em maquinas paralelas. E a etapa de projeto de primers, que o grande objetivo do sistema, dever ter algoritmos rpidos, e talvez ser necessrio analisar outros critrios ainda a serem definidos. A pontuao dos primers uma tarefa que exige muita dedicao, por que vrios so os tipos de PCR. As classes do BioPerl so de difcil compreenso, e isso pode se tornar um problema de relevncia.

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