Manual - Bioquimica Experimental - Unam

0141 BIOQUIMICA EXPERIMENTAL
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Facultad de Qumica
Departamento de Bioqumica
Manual de prcticas de Bioqumica experimental (0141)
Semestre 2011-1
Elaborado por: Dra. Sobeida Snchez Nieto
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CONTENIDO
Seccin 1 Introduccin al laboratorio de Bioqumica
Reporte cientfico
Seccin 2 Estructura y propiedades de protenas: Purificacin de la enzima lactato
deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino
Parte I. Extraccin y precipitacin por salado.
Parte II. Purificacin por cromatografa de intercambio inico y de afinidad
Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin. A. Determinacin de
concentracin de protenas.
Monitoreo del proceso de purificacin. B. Separacin por
electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS
Seccin 3 Actividad enzimtica
Parte I. Curvas temporales de actividad enzimtica de la lactado
deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino.
Parte II. Factores que modifican la actividad de las enzimas: Efecto de la
concentracin de sustrato y de un inhibidor.
Seccin 4 Gentica
Determinacin del tipo de herencia en base a frecuencias fenotpicas y
genotpicas
Seccin 5 Estructura, propiedades y funcin de cidos nucleicos
Transferencia de material gentico I. Conjugacin
Transferencia de material gentico II: Transformacin
Aislamiento de plsmidos
Ensayos de restriccin de plsmido
Induccin de protena recombinante
Seccin 6 Regulacin del metabolismo
Parte I: Regulacin gentica en el opern lac
Parte II. Regulacin hormonal del metabolismo de la glucosa
Apndice Preparacin de soluciones
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1. INTRODUCCIN AL LABORATORIO DE BIOQUMICA
PARTE I: REPORTE CIENTFICO
Objetivos
Conocer la importancia de realizar un reporte cientfico.
Conocer las caractersticas o partes de un reporte cientfico: Introduccin, hiptesis, objetivo,
mtodos, resultados, discusin y conclusiones, y referencias.
Conocer cmo se formulan las hiptesis.
Plantear hiptesis.
Aprender a realizar un reporte cientfico.
Introduccin
Tanto en la Universidad como fuera de ella, sin importar el tema, tus ideas o argumentos, si no son
expresados de manera clara y fcil de seguir, difcilmente sern tomados en cuenta. Es de gran valor,
tanto para empresas como pare instituciones educativas y de investigacin, contar con personal que
pueda expresar claramente sus ideas de manera escrita y oral.
En el desarrollo de las ciencias, la comunicacin de las observaciones, resultados y propuestas, es
fundamental para continuar avanzando en el conocimiento, y el instrumento principal es el reporte
cientfico. En el reporte cientfico, no slo se informa sobre los resultados de una investigacin, sino
tambin recopila una serie de ideas y propuestas, da cuenta de los errores y avances tecnolgicos
que pueden ayudar a replantear la direccin de una investigacin o llevar a la resolucin de un
problema en particular.
De hecho, uno de los pasos comunes dentro del llamado mtodo cientfico es la de dar respuesta a
las preguntas surgidas de la observacin, a travs de primero investigar la literatura cercana al tema
de estudio (Figura 1.1.). As como en el reporte, en todos los pasos que conforman al mtodo
cientfico debemos esforzarnos en expresar las ideas de manera clara y lgica. Por ejemplo, en el
planteamiento de la hiptesis, tenemos que predecir lo que se espera del experimento propuesto,
estableciendo en una frase corta las variables que se estn manipulando o las mediciones que se
harn, siempre en trminos mensurables. Adicionalmente, la hiptesis incluye aquella informacin
que previamente obtuvimos o conocemos respecto a la investigacin. Para ayudarnos a construir la
hiptesis generalmente se utilizan las preposiciones si y entonces. Examinemos el siguiente
ejemplo:
Si observamos que nuestra garganta nos duele, nos planteamos:
Si tengo dolor de garganta entonces podra deberse a que tengo una infeccin en la
garganta debida a bacterias o virus, o bien porque gritamos mucho el da anterior.
Sin embargo, la anterior hiptesis no toma en cuenta lo que tenemos como conocimiento previo. Al
replantearla podemos decir:
Si s que el resfriado es contagioso y no estuve en contacto con alguien que
estuviera contagiado, y adems fui a un juego de ftbol en donde grite mucho,
entonces es probable que esto ltimo me causar el dolor de garganta.
A pesar de que mejor, la hiptesis no establece como se validar o no la prediccin. Se podra
plantear otra diciendo:
Si no tengo fiebre o sntomas de una infeccin en la garganta, pero s una
inflamacin en la garganta, entonces el cultivo de exudado farngeo y otros estudios
clnicos darn negativo para una infeccin bacteriana o viral, por lo que la
inflamacin se deber a un uso excesivo de las cuerdas vocales.
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La hiptesis es una parte importante en una investigacin y como se mostr, debe ser
cuidadosamente planteada ya que considera el problema que se est investigando, el conocimiento
previo y el diseo del experimento. Adicionalmente, al contrastar la hiptesis con los resultados s
llegan a conclusiones vlidas, que permiten replantear las hiptesis y/o reportar lo encontrado.
Figura 1.1. Diagrama que muestra los pasos del mtodo cientfico. Se observa que las flechas van
hacia delante pero tambin pueden en cualquiera de los puntos regresar. El mtodo cientfico es un
proceso que permite replantearse desde las preguntas hasta la manera en que los datos fueron
analizados.
Reporte cientfico
Como se coment con anterioridad, el principal propsito de escribir un reporte cientfico es el de
comunicar la informacin que ha sido compilada como resultado de la investigacin o
experimentacin y el anlisis de los datos. Los reportes cubren una gran variedad de tpicos pero
usualmente se enfocan en transmitir la informacin con un propsito claro y para una audiencia
especfica. Un buen reporte es un documento que es preciso, objetivo y completo. Debe tambin
estar bien escrito, claramente estructurado y que se exprese de una manera en la que el lector
mantenga la atencin en l. Generalmente, el valor de una investigacin se evala a travs del
reporte, es decir el reporte escrito es el nico producto tangible de cientos de horas de trabajo.
Debido a que se juzga el trabajo a travs de un reporte escrito, ste debe ser de gran calidad.
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Frecuentemente, los reportes presentan las siguientes secciones: resumen del contenido,
introduccin o antecedentes, mtodos, resultados, discusin, conclusiones, recomendaciones o
perspectivas y referencias. La inclusin de recomendaciones generalmente ocurre en reportes para la
industria y son determinantes para la toma de decisiones por parte de los directivos. A continuacin
se da una breve descripcin de cada una de las secciones que conforman un reporte cientfico.
Resumen. Su funcin es presentar un avance del contenido del reporte de una manera en la que el
lector juzgue si debe leer el reporte completo. Se incluyen los antecedentes ms relevantes, una
frase sobre el objetivo del experimento, una descripcin corta del mtodo que se us, los principales
resultados y las conclusiones o implicaciones de los resultados. El resumen normalmente se escribe
como un solo prrafo de 100 a 200 palabras.
Introduccin. Contiene la informacin necesaria para que el lector conozca por qu es importante el
reporte, as como de que trata. La informacin que se utiliza en la introduccin va de lo general a lo
especfico, esto es, se comienza primero desde un contexto amplio del tema, lo que facilita entender
los conceptos y la importancia del tpico de la investigacin en un rea particular de estudio.
Despus, se hace un resumen de investigaciones anteriores, propias o de otros investigadores
(literatura especfica) para ayudar a justificar la presente investigacin.
La introduccin finaliza con un prrafo en el que se plantea la hiptesis.
En algunos casos se requiere que la parte final de la introduccin contenga los objetivos del estudio.
Mtodos. El propsito de est seccin es describir precisamente los materiales y mtodos usados
para realizar el experimento, siempre con suficiente detalle para que alguna otra persona pueda
repetir el mismo procedimiento. Algunas veces se tiene que justificar por qu se us un mtodo en
particular. La seccin de mtodos debe escribirse en pasado, ya que describe lo que se hizo.
Resultados. En esta seccin se describe pero no se explican los resultados; solo presenta los
hechos que van a ser analizados posteriormente. Aunque, se puede explicar algn resultado que es
particularmente importante, y que ayuda a entender los siguientes resultados. La seccin de
resultados debe ser clara y precisa y generalmente contiene figuras. El uso de las figuras como
diagramas, tablas, grficas, cuadros o mapas puede ser muy til para mostrar o enfatizar la
informacin en un reporte. Las figuras deben ser usadas para compilar los datos de una manera
ordenada, son una herramienta til para ayudar a los lectores a entender datos complejos o
numerosos. Es esencial que las figuras estn integradas correctamente en el cuerpo del reporte, que
sean referidas inmediatamente despus de mencionarlas y deben explicarse. Un error comn es
mencionar la figura, colocarla y slo decir que los datos se encuentran en la figura, lo correcto es
decirle al lector en qu dato debe poner atencin en la figura, aquello que es significativo y que podra
utilizarse para comparar datos en figuras separadas o bien en ayudarte a explicar el porque del
siguiente experimento.
Discusin. La seccin de discusin tiene dos principales objetivos, explicar los resultados del estudio
y evaluar si lo encontrado en el estudio tiene un significado prctico, biolgico, y/o causal. Para ello
se necesita: a) interpretar y explicar los resultados; b) evaluar si las preguntas que se plantearon en
la hiptesis han sido contestadas; c) mostrar cmo los resultados de la investigacin se relacionan
con los que han sido reportados anteriormente; d) calificar y evaluar la importancia y significado de
los resultados, esto es, si los resultados son estadsticamente significativos, o si existi algn defecto
en el diseo o en el procedimiento que pudieron afectar el resultado; e) plantear nuevas preguntas o
determinar si se abrieron nuevas reas de inters.
Conclusiones. Est seccin puede ser incluida como parte de la discusin o bien como una seccin
aparte. Establece de manera clara y concisa cul es la relevancia del trabajo y sus implicaciones.
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Referencias. Es necesario incluir una lista de referencias, las cuales deben estar citadas en el cuerpo
del reporte. Las referencias se pueden colocar en una lista por orden alfabtico, o numeradas de
acuerdo a como fueron apareciendo en el texto. Cada referencia debe contener toda la informacin
bibliogrfica. Hay varios formatos para referencias que se pueden utilizar, consulta en internet o libros
los formatos que se utilizan.
Actividades sugeridas
1. El profesor proporcionar al menos un artculo de investigacin, para que identifiquen en ste
las partes de un reporte. Despus cada equipo expondr sus resultados.
2. Asignar un problema a resolver por equipo, permitir que los estudiantes formulen hiptesis y
diseen un experimento. Se podrn realizar al menos dos formas diferentes de reporte: La
primera podra ser un reporte oral al final de esta sesin y la segunda un reporte escrito para
la siguiente sesin.
Cuestionario
1. Qu finalidad persigue el cientfico al escribir y publicar un artculo cientfico?
2. Investiga como se lleva a cabo el diseo de un experimento e incluye cules son las
variables independientes, las dependientes y las control?
3. Qu estructura debe tener una hiptesis?
4. Cules son las secciones de un reporte cientfico?
5. Qu diferencia (s) hay entre la seccin de resultados y la discusin?
6. Qu informacin bibliogrfica deben de contener las referencias, si son libros, artculos o
catlogos o pginas de internet?
Referencias
- Day, Robert A. How to Write and Publish a Scientific Paper. 4th edition. Phoenix, AZ:
Oryx Press, 1994.
- Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace. 6th edition. New York:
Longman,2000.
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2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTENAS.
Purificacin de la enzima lactato deshidrogenasa de msculo
esqueltico de bovino.
PARTE I. EXTRACCIN Y PRECIPITACIN POR SALADO.
Objetivos
- Conocer las propiedades fsicoqumicas de las protenas: carga, punto isoelctrico, masa
molecular y afinidad.
- Conocer las diferentes estrategias utilizadas para aislar protenas a partir de diferentes fuentes
celulares.
- Relacionar las propiedades fisicoqumicas de las protenas con el fundamento de las tcnicas
utilizadas en la purificacin de protenas: Centrifugacin diferencial, precipitacin por salado,
cromatografa en filtracin en gel, cromatografa de intercambio inico y cromatografa de
afinidad.
- Aplicar las tcnicas de centrifugacin y precipitacin por salado como tcnicas iniciales de
purificacin de una protena.
Introduccin
Una condicin esencial para el estudio de la estructura y funcin de una protena es su purificacin,
generalmente de un tejido que contiene miles de protenas que difieren en tamao, forma y carga.
Hay varios aspectos que deben considerarse para realizar un mtodo para purificar una protena,
como por ejemplo, para que se usara la protena, cuales son las caractersticas propias de la protena
(tamao, carga, solubilidad, hidrofilicidad y funcin biolgica), la cantidad que se requiere purificar y el
costo. Por lo tanto, no hay un procedimiento nico para la purificacin de protenas, no obstante, si
hay una forma sistemtica en la que se puede realizar. Una gua bsica para la purificacin de una
protena toma en consideracin lo siguiente:
A. Definir los objetivos de la purificacin. Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad
requeridos.
B. Seleccionar la muestra biolgica de inicio. Depender de la localizacin de la protena
tanto en tejidos como en compartimentos extracelulares o intracelulares.
C. Desarrollar una tcnica de anlisis. Para la determinacin rpida de la pureza, actividad o
contenido total de protena. Un mtodo frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la
separacin de la protena mediante electroforesis.
D. Minimizar la manipulacin de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya que se corre
el riesgo de perder la actividad de la protena o reducir el rendimiento.
E. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes. Como por ejemplo las
proteasas.
F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y
amortiguadores en cada paso, puede llevar a la prdida de la actividad de la enzima y
aumentar los costos de la purificacin. Seleccionar y usar slo lo necesario.
G. Usar una tcnica diferente en cada paso. Para ello tomar en cuenta las propiedades
fisicoqumicas de la protena como tamao, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos.
H. Minimizar el nmero de pasos. En cada paso se pierde protena y tiempo, por lo que hay
que combinar los pasos de manera lgica.
Un protocolo tpico de purificacin de una protena intracelular utiliza varias tcnicas, que pueden
incluir en la primera fase, la ruptura de las membranas celulares, la centrifugacin diferencial o en
gradiente de densidad para separar protenas de las partculas subcelulares o bien de agregados de
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diferente peso molecular. Una purificacin posterior incluir la precipitacin selectiva de protenas por
la adicin de sales o solventes miscibles en agua. En la tercera fase de la purificacin se removern
los contaminantes utilizando la separacin basada en la carga, tamao y afinidad de la protena.
A continuacin se describen brevemente las tres fases del proceso y algunas tcnicas para purificar
una protena.
SELECCIN DE LA FUENTE DE LA PROTENA. Varias pueden ser las fuentes de la protena,
microorganismos, tejidos, cultivos celulares, clulas transformadas
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, entre otras. La eleccin de la
procedencia de la protena debe basarse en criterios tales como la facilidad de obtener cantidades
suficientes de biomasa de la que se asla la protena, la cantidad de la protena de inters en el tejido
o clula, y cualquier propiedad peculiar de la protena escogida, que ayudar en su estabilizacin y su
aislamiento. En algunos casos, el investigador necesita forzosamente utilizar un tejido en particular,
an cuando la cantidad del tejido y de la protena es insuficiente. La recomendacin para estos casos,
es realizar un ensayo piloto con una fuente de protena distinta a la requerida.
PRIMERA FASE. El objetivo inicial es la obtencin del homogeneizado o extracto crudo y su
clarificacin o concentracin. La homogeneizacin es un proceso donde las clulas y los tejidos son
lisados en fragmentos lo suficientemente pequeos para dar lugar a una suspensin uniforme y
estable llamada homogeneizado. Los equipos con los que se realiza la homogeneizacin son
diversos y comprenden desde el mortero hasta las ondas ultrasnicas pasando por la licuadora. El
mtodo a utilizar para obtener el homogeneizado depende de la dificultad que presente el material
biolgico para romperse. Igualmente importante al mtodo de homogeneizacin es la seleccin de la
solucin de homogeneizacin, puesto que ser el medio al que estar expuesta la protena y en el
que se pueden adicionar componentes que ajusten el pH de la solucin, la fuerza inica, inhibidores
de proteasas o algn estabilizador de la protena.
Posteriormente, para eliminar los contaminantes o clarificar la muestra se puede recurrir al proceso
de centrifugacin. La centrifugacin aprovecha las propiedades de tamao, forma y densidad de las
protenas para separarlas de otras molculas que presentan caractersticas distintas. Como resultado,
el efecto de la gravedad para cada protena es diferente. En principio, se pueden separar organelos
de una solucin homognea de partculas, al exponer a la muestra a diferente fuerza gravitatoria.
Despus de la centrifugacin, algunas de las partculas que normalmente permanecan en solucin
se sedimentan. La fuerza centrfuga relativa (RCF) se calcula con la siguiente ecuacin:
Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con una distancia r (expresada en mm). El radio usado es la
distancia del centro del eje del rotor a la posicin intermedia del tubo.
La fuerza centrfuga creada puede ser tan pequea como 600 Xg (600 veces la gravedad)
sedimentando pedazos de tejido, clulas intactas, ncleos, entre otros. El lquido residual o
sobrenadante puede someterse a un paso posterior de centrifugacin, en un proceso denominado
centrifugacin diferencial. Esto es varios pasos secuenciales de centrifugacin a diferentes
velocidades. Por ejemplo, despus de sedimentar lo ms pesado, el sobrenadante se puede
centrifugar a una velocidad intermedia para sedimentar las membranas celulares o velocidades tan
grandes como 300,000 Xg, en donde la mayor parte de las molculas solubles permanecen en
solucin y las molculas ligeras sedimentan.
SEGUNDA FASE. El objetivo principal es remover una cantidad importante de contaminantes que
pueden ser protenas, cidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los mtodos ms utilizados para

1
Clulas que fueron obtenidas a travs de la introduccin de un gene que codifica para una protena distinta a la suya, a travs del uso de tcnicas de
biologa molecular. Ver seccin 5 del manual.
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eliminar protenas contaminantes es el de la precipitacin. Para que una protena precipite debemos
modificar el ambiente que le rodea, debido a que los grupos cargados en la superficie de una protena
pueden interaccionar tanto con las molculas de agua como con los iones que se encuentran en
solucin. Existen varias estrategias para precipitar a las protenas tales como cambio de pH,
incremento en la temperatura, adicin de solventes, molculas cargadas, etc. Pero, el mtodo ms
comnmente empleado es la precipitacin por salado con (NH
4
)
2
SO
4
.
Las protenas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentracin de iones, fenmeno
denominado de salting in. Pero cuando se eleva en exceso la concentracin de iones, disminuye la
solubilidad de las protenas y precipitan (salting out). El mecanismo de salting-out se basa en la
exclusin del cosolvente, en este caso la sal. La mayor parte de las protenas presentan una capa de
agua (capa de solvatacin) que se encuentra asociada y cercana a su superficie. Al incrementar la
concentracin de los iones, la capa de solvatacin disminuye y permite que los iones interaccionen
con los residuos de las protenas. Las interacciones de tipo hidrofbico entre los residuos apolares de
la protena y el solvente, se evitan gracias al plegamiento o bien por la asociacin entre protenas,
produciendo su precipitacin. Debido al uso extensivo de este mtodo, que adems es muy
econmico, se han diseado tablas y frmulas en las que se pueden determinar las cantidades a
aadir de (NH
4
)
2
SO
4
slido o en solucin, a una mezcla de protenas para obtener una concentracin
dada.
Despus de la precipitacin hay que retirar el agente precipitante. Una manera es diluir la solucin
para reducir la concentracin del compuesto, otras formas pueden ser realizar la dilisis, la
ultrafiltracin o bien el paso por una columna de exclusin molecular.
La dilisis suele llevarse a cabo colocando la muestra en un tubo estndar de dilisis, usualmente
una membrana semipermeable de celulosa o celofn con un poro determinado. Se sumerge la bolsa
de dilisis que tiene la muestra en una solucin al menos 30 veces mayor al volumen de la muestra.
La difusin de los materiales hacia adentro y fuera de la bolsa de dilisis permitir reducir la
concentracin de la sal precipitante, disolver a la protena, as como cambiar la solucin en la que
originalmente estaba la protena. Existen dos desventajas de la dilisis: el costo de la membrana de
dilisis y que el proceso puede llevar al menos 12 h.
Por su parte, la filtracin en gel no tiene el problema del tiempo. Una columna empacada con
Sefadex-G25
puede usarse para eliminar molculas de peso molecular menores a 5000 daltones. La
muestra se coloca en la columna, las molculas de menor tamao entran por los poros de la matriz,
mientras que las grandes son excluidas, por lo que al adicionar el amortiguador de elucin, las
protenas de alto peso molecular se mueven con rapidez a travs de la columna y salen primero,
despus eluyen o salen las de peso molecular menor. En un simple paso la muestra se desala,
concentra, cambia de amortiguador y pierde protenas o molculas contaminantes.
TERCERA FASE. El objetivo es obtener una protena pura o con mnimas trazas de contaminantes.
Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinacin de varios mtodos cromatogrficos, como la
cromatografa de exclusin molecular, intercambio inico, interaccin hidrofbica y de afinidad. A
continuacin slo se describen las dos tcnicas que se usarn en el laboratorio.
La cromatografa de intercambio inico es una tcnica que separa las biomolculas en base a sus
caractersticas de carga. Los grupos cargados sobre la superficie de una protena interaccionan con
los grupos con carga opuesta de la fase estacionaria. La carga electrosttica de las protenas
depende del pH en el que se encuentren, cuando se iguala el nmero de cargas positivas a las
negativas se dice que se encuentran en su punto isoelctrico o pI. La carga neta de una protena es
positiva a valores de pH < pI, y se une fuertemente a una resina con cargas negativas o
intercambiador catinico. Mientras que, para que la protena presente carga negativa la solucin debe
encontrarse en valores de pH > pI, y es capaz de unirse a intercambiadores de tipo aninico que
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contienen grupos cargados positivamente (Figura 2.1). Para eluir a la protena de inters se utilizan
soluciones que modifican el pH o la concentracin de sales en la resina. Debido a que la separacin
de las protenas de la matriz ocurre en orden de menor a mayor fuerza de unin, es comn eluir a las
protenas usando un gradiente de concentracin de sales en orden creciente de concentracin.
Figura 2.1. Separacin por cromatografa de intercambio inico. Dependiendo de la carga inica de los soportes o resinas
de cromatografa entonces ocurrir la interaccin con molculas cargadas positiva o negativamente.
Cromatografa de afinidad. Si la protena a purificar tiene una afinidad especfica por un ligando
como su cofactor, un anticuerpo o un in metlico, esa propiedad se puede usar para purificar a la
protena. Por ejemplo, para purificar a una deshidrogenasa es comn usar al cofactor de la enzima, el
NAD
+
o bien a un compuesto que presente alguna similitud a ste (Figura 2.2). Cuando la muestra
atraviesa la columna de afinidad, la protena de inters se unir al ligando, mientras que el resto sale
de la columna. Este tipo de separacin, basada en el reconocimiento biolgico, es muy especfica y
elimina a muchos contaminantes.
Figura 2.2. Comparacin entre las molculas de Cibacrn blue 3GA y el NAD
+
. A) Los colorantes de triazina como el
Cibacrn blue 3GA son comnmente acoplados a resinas de agarosa para utilizarse en ensayos de purificacin por
cromatografa de afinidad. La molcula es estable, fcil de movilizar, barata y varias compaas las tienen disponibles para
realizar purificaciones de protenas que unen nucletidos de piridina como B) el NAD
+
.
En la prctica se purificar a la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de msculo de bovino. En la
primera parte del protocolo de purificacin, se realizar la clarificacin de la muestra mediante
filtracin y centrifugacin y posteriormente se llevarn a cabo dos pasos secuenciales de precipitacin
con (NH
4
)
2
SO
4
. En la siguiente sesin se realizar el desalado de la muestra mediante filtracin en
gel, para al final purificarla mediante una columna de intercambio inico o de afinidad.
Posteriormente, en la tercera parte del protocolo se evaluar el rendimiento, al determinar la
cantidad total de protena y por ltimo en la cuarta parte del protocolo se determinar su pureza al
realizar la separacin de las muestras proteicas y visualizacin en un gel de poliacrilamida-SDS.
Material biolgico
100 g de carne de res preferentemente filete de ternera
A B
11
Materiales y equipo para la extraccin de la enzima (por grupo)
1 Tijeras
1 Esptula
1 Recipiente para hielo
1 Par de guantes de ltex
Gasa
1 Vasos de precipitados de 1L
1 Probeta de 250 mL
1 Probeta de 100 mL
4 Botellas de centrfuga
Licuadora
Balanza granataria
Balanza de dos platos
Materiales y equipo para la precipitacin con sulfato de amonio
2 Tubos para centrfuga con capacidad para 50 mL
2 Vasos de precipitados de 100 mL
1 Esptula
Tubos para microfuga de 1.5 mL
Gradilla para tubos de microfuga
1 Caja con puntas de 200 L (amarillas) para micropipeta.
1 Caja con puntas de 1000 L (azules) para micropipeta.
1 Micropipeta 20-200 L
1 Micropipeta 200-1000 L
1 Bandeja pequea
1 Barra magntica
1 Agitador magntico
Centrfuga (por grupo)
Balanza (por grupo)
Caja para almacenar tubos de microfuga en el congelador (por grupo)
Reactivos
Tris 50 mM pH 7.0
(NH
4
)
2
SO
4
slido.
Desarrollo experimental
Importante. Todo el procedimiento deber realizarse en fro (4C). Mantener las soluciones y
suspensin proteica en bao de hielo. Anotar en su libreta el peso del tejido utilizado, as como el
volumen de la solucin de homogeneizacin y los volmenes resultantes despus de cada uno de los
pasos de purificacin (Figura 2.3). Ya que estos valores son necesarios para calcular el rendimiento,
contenido de protena y actividad enzimtica.
A. Extraccin. Esta primera parte la realizar el profesor con ayuda de un par de voluntarios y
se distribuir el homogeneizado a todos los equipos.
1. Cortar en trozos pequeos 80 g de tejido (eliminar el tejido conectivo y graso que acompaa a
la carne) y colocarlos en un vaso de licuadora previamente enfriado (mantener el vaso en el
cuarto fro hasta su uso).
2. Agregar 3 volmenes de 50 mM Tris/HCl pH 7.0 fro por cada g de tejido (240 mL) y licuar
brevemente, hacerlo en pulsos de 3 seg/3 a 6 veces para evitar que la licuadora se caliente.
3. Filtrar la mezcla sobre dos capas de gasa grandes (previamente humedecidas con agua
destilada). Exprimir suavemente sobre la pared de un embudo y colectar el filtrado en un vaso
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de precipitados de 1L. NOTA. Puede tomarse una alcuota de est fraccin y denominarla
Fraccin 0.
4. Distribuir el filtrado en botellas de centrfuga y centrifugar a 7,000 rpm a 4C durante 10
minutos. Decantar con cuidado el sobrenadante en un vaso de precipitados de 1 L. Al
sobrenadante lo denominamos homogeneizado total (Fraccin 1). Apartar 1 mL de la fraccin
1 en un tubos de microfuga y almacenar a -20C para su posterior uso.
Nota: Tirar el contenido de la gasa en el recipiente preparado para su deshecho.
B. Precipitacin con sulfato de amonio ((NH
4
)
2
SO
4
) por equipo.
5. Tomar 25 mL de la fraccin 1 y colocarlo en un vaso de precipitados.
6. Agitar el sobrenadante de manera continua y suave en un agitador magntico, mientras se
aade lentamente sulfato de amonio slido (8.15g de (NH
4
)
2
SO
4
por 25 mL del sobrenadante).
La agitacin debe ser lo suficientemente vigorosa para evitar la formacin de cmulos de sal
no disueltos, pero no demasiado fuerte porque se puede producir espuma, en ningn
momento utilizar varilla de vidrio o esptula para disolver los grumos. Se recomienda colocar
una bandeja pequea con hielo entre el vaso de pp y la parrilla de agitacin para evitar que la
solucin se caliente.
7. Cuando toda la sal se ha disuelto la solucin se encuentra a una saturacin del 55% con
sulfato de amonio.
8. La mezcla que ahora se encuentra turbia se vaca a un tubo de centrfuga de 50 mL y se
centrfuga a 10,000 rpm 4C por 10 minutos.
9. Colectar el sobrenadante (Fraccin 2) y medir el volumen. Descartar el botn. Tomar 1 mL de
la fraccin 2 y almacenarla en un tubo de microfuga a 20C para su posterior uso.
10. Calcular el peso de (NH
4
)
2
SO
4
para obtener una solucin al 75% de saturacin, (0.125 g de
(NH
4
)
2
SO
4
por cada mL del sobrenadante obtenido). Agitar como se describi anteriormente.
11. Una vez disuelto el (NH
4
)
2
SO
4
, colocar la mezcla turbia en un tubo de centrfuga. Centrifugar a
10,000 rpm a 4C por 10 min y descartar el sobrenadante.
12. Resuspender el botn en 1 mL de agua, el volumen final es de aproximadamente 1.8 mL.
13. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fraccin 3. Uno de los tubos debe
contener 1000 L, ese volumen se usar en el siguiente protocolo experimental. Almacenar a
20C.
SUGERENCIAS:
1. Para evitar la congelacin y descongelacin innecesaria de las muestras es conveniente que
al final de est sesin se almacenen las muestras en alcuotas y que se etiqueten
apropiadamente, se sugiere el uso de la tabla que abajo se muestra.
2. Se recomienda slo descongelar la alcuota una sola vez y despus desecharla.
Nmero Alcuota almacenada para: Volumen
13
de
Fraccin
Determinacin
de protenas.
I
PAGE-SDS
II
Curva
temporal de
actividad
enzimtica.
III
Obtencin de
parmetros
cinticos.
IV
Desalado total
almacenado
0

1

2
3
4*

FPA*

FPB*
* Fracciones que se obtendrn en la siguiente sesin
Notas y clculos:
14
_____g Tejido
______mL 50 mM Tris/HCl pH 7.0
Moler
Homogeneizado
Filtrar con gasa
Homogeneizado
Distribuir en botellas de centrfuga
Centrifugar 7,000 rpm, 10 min, 4C
Botn Sobrenadante (SN) __________mL VOLUMEN TOTAL
(FRACCIN 1; _________mL)
A _______mL SN aadir ________g (NH4)2SO4 (55% saturacin)
Agitar

Distribuir en tubos de centrfuga
Botn Sobrenadante
(FRACCIN 2;_________mL)
Aadir ________g (NH4)2SO4 (75% saturacin)
Agitar
Distribuir en tubos de centrfuga
Botn Sobrenadante
(FRACCIN 3)
Aadir 1 mL de H20;
Volumen total obtenido______mL
Figura 2.3 Esquema de purificacin inicial de la lactato deshidrogenasa mediante precipitaciones sucesivas con sulfato de
amonio. Se sugiere llenar los espacios vacos con las cantidades solicitadas.
Recuerda que ya est al
55% de la sal
15
Cuestionario
1. Mencione cuatro usos que se les puede dar a las protenas purificadas?
2. Dentro de la gua para purificar a una protena se plantea que es importante establecer cul va
a ser el uso final de la protena purificada. Explique por qu.
3. Clasifique los mtodos que se seguirn para la purificacin de la lactato deshidrogenasa, de
acuerdo a las propiedades de las protenas como carga, peso, solubilidad y unin a ligandos.
4. Por qu es importante mantener a la mezcla de protenas a 4C?
5. Investiga cules son las propiedades de la lactato deshidrogenasa, como localizacin
subcelular, secuencia primaria de aminocidos, pI (punto isoelctrico), actividad enzimtica
que cataliza, peso molecular, estructura terciaria y/o cuaternaria.
6. De acuerdo al pI de la lactato deshidrogenasa que encontraste predice cual ser su carga
elctrica cuando la protena se encuentre en un amortiguador de fosfatos pH 7.0. Qu tipo de
columna y eluyente recomiendas para su purificacin y porqu?
7. Existen varios mtodos en la literatura para purificar a la lactato deshidrogenasa, por qu
existe esa variedad si todos purifican a la misma protena?
8. Cules son las protenas que se estn purificando con un fin de uso farmacutico o mdico?
Menciona al menos 2 y para que se usan
Referencias
- Allen T, Mark W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and
ultrafiltration. Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley & Sons Inc, New
York, USA.
- Castle DJ. 2004. Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science 4.1.1-
4.1.9. John Wiley & Sons Inc, New York, USA.
- Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. John
Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4
- Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden.
Code number 18-1132-29 Pp 94.
- Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd.
Pp 1-7. Consultar la pgina www.els.net
- Sheehan D, OSullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences.
John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la pgina www.els.net
- Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York,
USA. Pp 71-104
Sitios recomendados para
1. aprender sobre las caractersticas y propiedades de las protenas
http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.html pgina desarrollada por el Dr. Rogelio
Rodrguez Sotres.
2. calcular la concentracin de sulfato de amonio a aadir a una muestra.
http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm
http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl
3. calcular la fuerza centrfuga de un rotor. Convierte rpm a Xg o vicerversa.
http://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htm
16
PARTE II. PURIFICACIN POR CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO
INICO Y DE AFINIDAD
Objetivos
- Aplicar la cromatografa en filtracin en gel como una de las tcnicas para el desalado y cambio de
la solucin amortiguadora de extractos proteicos.
- Aplicar los mtodos de cromatografa de intercambio inico y de afinidad para purificar una protena
Material biolgico
Fraccin 3 obtenida en la seccin anterior
Material y equipo
1 Columna de cromatografa vaca
1 Columna de Sephadex G-25 empacada con 2.5 mL de resina
1 Probeta de 50 mL
1 Soporte universal
1 pinzas de tres dedos de sujecin con nuez
Micropipeta de 1000 L
Micropipeta de 200 L
1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta
Centrfuga (por grupo)
Balanza (por grupo)
Reactivos
Desalado
2.5 % Sephadex-G25 (p/V). La columna contiene 2.5 mL de volumen de cama de
Sephadex, preparado segn se indica en el Apndice. Se entrega empacada para su uso
inmediato.
Amortiguador Tris--Mercaptoetanol. Contiene 10 mM de Tris/HCl pH 8.8 y 0.5 mM -
Mercaptoetanol. (Ver preparacin en el apndice)
400 mM PMSF
Amortiguador Tris--Mercaptoetanol-PMSF (1 mM). Se prepara poco antes de su uso.
(Se entrega por grupo: Un frasco mbar con 26 mL del amortiguador Tris--Mercaptoetanol,
aadir 65 L de 400 mM PMSF para obtener una concentracin final de 1 mM (agitar
vigorosamente para disolver el PMSF aadido)
Agua destilada estril para el lavado de las columnas.
Purificacin por cromatografa de intercambio inico
Matriz para intercambio catinico, Macro-prep High S de BIORAD (ver Apndice).
Amortiguador de equilibrio I. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0.
Amortiguador de elucin I. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0 y 1 M de
NaCl.
Amortiguador de elucin II. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 3.0.
Purificacin por cromatografa de afinidad
Matriz para purificacin por afinidad. DEAE affi-gel blue gel (ver Apndice).
Amortiguador Tris--Mercaptoetanol-PMSF El mismo que se uso para el desalado
17
Amortiguador de elucin A. Amortiguador Tris--Mercaptoetanol-PMSF-NAD
+
, preparado
al momento segn se indica a continuacin: adicionar la solucin de Tris--Mercaptoetanol-
PMSF al frasco que contiene NAD
+
en polvo, para una concentracin final 5 mM (ver
apndice).
Desalado mediante cromatografa de exclusin molecular
1.- Sujetar a un soporte universal la columna de sefadex, como se muestra en la Figura 2.3.
2.- Tomar 1 mL de la fraccin 3 y aadirlo a la columna.
3.- Adicionar a la columna poco a poco la mezcla de protena y esperar a que entre a la columna por
gravedad (aproximadamente en 1 minuto o menos).
4.- Desechar el primer mL que eluye de la columna (correspondiente al volumen vaco), agregar a la
columna 1 mL de amortiguador Tris--Mercaptoetanol-PMSF y colectar en un tubo de microfuga
fro el segundo mL. Esta fraccin contiene a la LDH (Fraccin 4). Se guardan 100 L para llevar a
cabo la medicin de actividad y determinacin de protena. El resto de la muestra se utilizar en el
siguiente paso.
NOTAS.
1La columna se lava con 10 mL de agua destilada estril y se mantiene hidratada para
reutilizarla, entregarla al profesor.
2No es necesario realizar la operacin en condiciones de esterilidad, pero el usar agua estril
ayuda a disminuir una posible contaminacin de la columna para el uso posterior de otro
grupo de estudiantes.
18
Figura 2.3 Purificacin de protenas por cromatografa lquida. A. Empacado de la columna y B.
Colecta de fracciones de protena despus de aadir la solucin de elucin.
Purificacin por cromatografa de intercambio inico o de afinidad.
La mitad del grupo realizar la purificacin por intercambio inico de la LDH de la fraccin 4 y la otra
parte del grupo se enfocar en la purificacin de la LDH por columna de afinidad, tambin a partir de
la fraccin 4.
A. Empacado de la columna para la fase tres de la purificacin.
Adicionar 1 mL de alguna de las dos matrices que el profesor te proporcionar, para realizar
intercambio catinico o de afinidad. (Dejar drenar hasta obtener 0.5 mL de volumen contenido
inicialmente en la columna). Si es necesario colocar la columna en un tubo de vidrio de 13X100
para centrifugar a 3,000 rpm por 10 min a 4C). Es importante revisar que no se hayan
producido burbujas para que el flujo del lquido sea constante; eliminar el eluato.
B. Purificacin por cromatografa de intercambio inico
1. Se utilizar la columna que se prepar en el paso anterior con la matriz de intercambio inico.
2. Equilibrar la columna adicionando poco a poco en la parte superior de la columna 1.0 mL de
Amortiguador de equilibrio I. Es muy IMPORTANTE adicionar el volumen lentamente, de
manera que el flujo de salida sea gota a gota. Se puede acelerar el proceso centrifugando a
3000 rpm por 5 minutos a 4C.
3. Cuando la ltima gota del amortiguador de equilibrio haya salido, tapar la salida de la columna con
parafilm y adicionar los 900 L de la fraccin 4. Posteriormente tapar la parte superior de la
columna y agitar por inversin entre 5 a 10 veces. Destapar la salida y dejar que pase el lquido
por la columna desechando ste volumen (Este es el volumen muerto y no contiene protena).
Nuevamente, se puede acelerar el proceso centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4C.
4. Realizar un lavado con 1 mL de Amortiguador de equilibrio I (para eliminar la unin no especfica).
Alternativamente se centrfuga como se mencion en los pasos 2 y 3.
5. Solicitar a su profesor el amortiguador de Elucin I o II considerando las caractersticas de
pI de la LDH. Para la elucin se adiciona poco a poco 1.0 mL de amortiguador de elucin y se
recolectan 900 L en al menos 2 fracciones de 450 L cada una (Figura 2.3), las que
denominamos, Fraccin purificada FPIa y FPIb. Alternativamente se centrfuga como se
mencion anteriormente.
6. Estas fracciones se usaran posteriormente para determinarles protena, actividad y realizar el
corrimiento electrofortico.
NOTA. Posteriormente se lava la columna con al menos 10 mL de agua estril y se guarda la
columna lavada para ser reutilizada por otro grupo de estudiantes. Entregar al profesor.
C. Purificacin por cromatografa de afinidad.
1. Se utiliza una columna que se empaca con DEAE Affi-gel Blue (ver apndice)
2. Se equilibra la columna al adicionar poco a poco 1 mL de amortiguador Tris--Mercaptoetanol-
PMSF (preparado al momento, como se indica en Reactivos o Apndice I). El volumen que drena
se desecha. Para acelerar el proceso de paso de las soluciones en la columna se puede
centrifugar a 3000 rpm por 5 min a 4C.
3. Enseguida se adiciona poco a poco 900 L de la Fraccin 4. Se centrfuga a a 3000 rpm por 5 min
a 4C o se deja drenar y se elimina la fraccin no adsorbida (aproximadamente 900 L, este es el
volumen muerto, y no contiene protena.
4. Aadir 1 mL del amortiguador Tris-PMSF para eliminar a las protenas que no se han unido a la
columna.
19
5. Para despegar a la LDH de la columna se adicionan 400 L de Amortiguador de elucin A
(amortiguador adicionado con NAD
+
) y se recolecta el volumen en un tubo de microfuga fro
(Fraccin purificada A o FPA).
6. Se repite el paso 5 para recuperar cualquier cantidad de protena que haya quedado an unida a la
columna (Fraccin purificada B o FPB).
NOTA. Finalmente se lava la columna con al menos 10 mL del agua estril, y entregar la
columna lavada al profesor para ser utilizada nuevamente por otro grupo
Cuestionario
1. Por qu es necesario llevar a cabo el proceso de desalado de la fraccin 3 del protocolo
experimental?
2. Cules otros usos tiene la cromatografa de exclusin molecular que no sea la de ayudar a
desalar una suspensin de protenas?
3. Qu intervalo de fraccionamiento de molculas tiene el Sephadex-G25 y que aplicaciones
tiene?
4. Qu es el volumen vaco en una columna de filtracin en gel?
5. A que se refiere el trmino volumen muerto en una columna cromatogrfica?
6. Investiga la composicin de la matriz de intercambio inico que se uso para purificar a la
LDH?.
7. De acuerdo al pI de la LDH y conociendo el tipo de columna de intercambio inico que ests
utilizando, indica que amortiguador de los que estn enlistados en los reactivos usaras para
su purificacin y fundamenta t respuesta.
8. Qu propiedad de la protena se utiliza para purificar a la protena mediante una columna de
intercambio catinico?
9. Que debe contener el eluyente para la purificacin de la LDH en la cromatografa de
intercambio inico que se propone en este protocolo y porqu?
10. Qu propiedad de la protena ests utilizando para purificarla por cromatografa de afinidad y
cul es el componente clave para la purificacin de la LDH en est columna?
Referencias
- Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden.
Catlogo 18-1132-29 Pp 94.
- Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd.
Pp 1-7. Consultar la pgina www.els.net
- Sheehan D, OSullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life
sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la pgina www.els.net
USA. Pp 71-104.
- Macro-Prep Ion Exchange Supports Instruction manual. 2000. BIORAD www.bio-rad.com
1. Aprender sobre cromatografa
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm
2. Realizar una autoevaluacin sobre los fundamentos de la cromatografa
http://www4.ujaen.es/~acarrera/TBQ_HotPot/T3_TBQ_VF/T3_TBQ_VF.htm
Revisado por los Profesores: Carmen Parra G., Elpidio Garca R y Diana Snchez R.
20
Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin.
A. Determinacin de la concentracin de protenas
Objetivos
Conocer los mtodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificacin de una
protena.
Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificacin de una protena.
Aplicar un mtodo espectrofotomtrico para medir la concentracin de una protena.
Determinar la concentracin mediante la deteccin de la absorbancia a 280nm.
Determinar la concentracin de una protena utilizando un mtodo colorimtrico:
Determinacin de protenas por Bradford.
Analizar el progreso de la purificacin de una protena.
Conocer algunos parmetros que se determinan durante la purificacin de una protena:
rendimiento y pureza.
Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificacin de protenas.
Introduccin
Para evaluar de manera cuantitativa el xito de una purificacin de protenas es necesario conocer
dos parmetros el rendimiento y el grado de pureza en cada paso del proceso de purificacin.
El rendimiento es un parmetro expresado en porcentaje que se obtiene de medir la actividad
biolgica de la protena de inters en cada paso de la purificacin, el 100% corresponde a la actividad
del extracto inicial. Mientras que el grado de pureza se refiere al incremento en pureza, valor que se
obtiene de dividir la actividad especfica de cada paso entre la actividad especfica del paso inicial
de purificacin, este ndice da el valor de 1 para el extracto inicial.
Para obtener el valor de la actividad especfica que se encuentra generalmente expresado en
Unidades/ mg protena
-1
es necesario contar con a) una tcnica que determine la concentracin de
protenas en la muestra, y b) una tcnica que especficamente detecte o mida la cantidad de la
protena blanco (Unidades de actividad). En casos raros, la protena blanco es fcil de detectar,
porque es colorida (mioglobina) o porque es fluorescente (protena verde fluorescente). Cuando la
protena es una enzima, como la lactato deshidrogenasa, se puede realizar un ensayo enzimtico
especfico para determinar si estamos llevando a cabo la purificacin de manera adecuada, actividad
que se realizar y que se encuentra descrita en la seccin 3 del manual. Para las protenas que no
son enzimas, el ensayo se basa en medir la actividad biolgica de la protena.
En est seccin se realizar la determinacin de protenas de cada una de las fracciones obtenidas
durante el protocolo de purificacin de la lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino,
paso necesario para determinar la actividad especfica de la protena de inters. Adems es
necesario conocer la concentracin de protenas ya que llevaremos a cabo el corrimiento
electrofortico de las muestras.
A continuacin se da una breve explicacin de las leyes que rigen la espectrometra para
posteriormente describir el fundamento de la determinacin de protenas por medicin de absorbancia
a 280 nm y por un mtodo colorimtrico como es el mtodo de Bradford.
Leyes que rigen la espectrofotometra
Cuando un haz luminoso de intensidad P
0
pasa a travs de una solucin, parte de ste se absorbe,
por lo tanto la intensidad de la radiacin emergente P es menor al incidente P
0
. La relacin entre
ambos se denomina transmitancia, T:

T= P/P
0
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1)
21
La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero N de iones o molculas capaces de absorber
energa; por lo tanto, T disminuye a medida que la concentracin aumenta.
Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que al dividirse la
disolucin en pequeas secciones, en cada una de ellas se absorber una pequea cantidad de
radiacin AP, que es proporcional a AN. Tomando en cuenta que N es directamente proporcional a la
concentracin y si la longitud por la que pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante,
podemos llegar a la ecuacin general:
-log P/ P
0
= abc . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (2)
donde:
c es la concentracin
b es la longitud de la celda o paso ptico
a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad
La absortividad o coeficiente de extincin es una caracterstica propia de cada especie y depende
de la estructura qumica de sta. El valor de la absortividad para un compuesto vara con la longitud
de onda. Definiendo que la relacin -log P/ P
0
es la absorbancia de la solucin, la ecuacin final que
define a la ley de Beer queda de la siguiente manera:
A
= a
bc . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (3)
Es importante mencionar que la constante de proporcionalidad a depende de la longitud de onda por
ello se le coloca el superndice as como tambin a la absorbancia A (ec. 3). Si la concentracin se
expresa en molaridad, entonces se denomina a la constante de proporcionalidad coeficiente de
absortividad molar o coeficiente de extincin (). Convencionalmente, el paso de la luz es de 1 cm,
por lo que entonces las unidades de son cm
-1
mol
-1
L. Hay que destacar que A es adimensional, ya
que por definicin es un ndice.
Una grfica de absorbancia de una especie en disolucin, a una longitud de onda dada, como una
funcin de su concentracin molar, se le llama curva de calibracin o curva estndar. Es una lnea
recta y de acuerdo a la ecuacin 3 la pendiente es b. Conociendo c y la longitud del paso de la luz b,
la concentracin de la sustancia en cualquier otra muestra puede ser determinada usando la Ley de
Beer. La cuantificacin de la especie debe realizarse a la longitud de mxima absorcin.
Cuantificacin de protenas por medicin de absorbancia a 280 nm.
El uso de la absorbancia en la regin ultravioleta para medir la concentracin de protena es
posiblemente el mtodo ms simple y rpido, aunque puede producir resultados poco exactos, sobre
todo cuando se tiene una mezcla de protenas y la presencia de los cidos nucleicos. Sin embargo,
las ventajas de emplearlo son que la muestra no se destruye durante la determinacin, no es
necesario producir una curva de calibracin, ni tampoco utilizar ms reactivos ni esperar tiempos de
incubacin. Se necesita contar con un espectrofotmetro que mida en el intervalo de longitud de onda
del UV y que se dispongan de cuvetas de cuarzo o metacrilato grado UV o poliestireno grado ptico.
La cuantificacin de protena por la medida de la absorcin a 280 nm, depende de la presencia de
aminocidos aromticos: tirosina (Tyr) y triptfano (Trp). Un alto orden de estructuracin puede
modificar la contribucin de las Tyr y Trp en la absorbitividad molar del pptido o protena y en
consecuencia la absorbancia es sensible a cambios en el pH y fuerza inica del medio. El uso ms
comn del ensayo de absorbancia es para monitorear las fracciones provenientes de las
cromatografas o cuando se requiere una estimacin rpida de la concentracin de protenas an
cuando no sea exacta.
22
Para calcular la concentracin de protenas de la muestra se usar la ecuacin de Lambert y Beer y
el coeficiente de extincin molar de la Albumina de Suero Bovino (BSA) que es 43 824 M
-1
cm
-1
o bien
usando el coeficiente dado en porcentaje que es de 6.6 para una solucin de BSA al 1% (10 mg/mL)
y usando la frmula 4 para determinar la concentracin de la muestra.
10 *
(%)
) / (
280
|
|
.
|
\
|
=

nm
Abs
L g in Concentrac (4)
Cuantificacin de protenas por un mtodo colorimtrico.
La determinacin de protenas por Bradford es ampliamente usada ya que es simple, rpida,
barata y sensible. Es necesario construir una curva de calibracin para determinar la concentracin
de las muestras. El mtodo se basa en la unin especfica del colorante azul de Coomassie brillante
G250 (CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las protenas. El CBBG se une a los
residuos de las protenas produciendo una absorbancia mxima a 595 nm, mientras que el colorante
libre tiene una absorbancia mxima a 470 nm. A diferencia del Lowry (otra tcnica colorimtrica para
determinar protenas) que es muy sensible a la composicin de la solucin que acompaa a las
protenas, el Bradford slo es afectado por algunos detergentes. Una de las desventajas del Bradford
es que el colorante CBBG se une fuertemente a las cuvetas de cuarzo, es por ello que se recomienda
usar vidrio o cuvetas depolipropileno. Al usar cuvetas de polipropileno se facilita su limpieza con un
poco de alcohol.
Determinacin de protenas
Material biolgico.
Fracciones 0 a la 4 y FPA y FPB
Material y equipo
Celdas metacrilato grado UV para espectrofotmetro
Celdas de polipropileno para espectrofotmetro
1 Vrtex
Micropipeta de 200-1000 L
Micropipeta de 5 a 10 L
1 piceta con etanol y una con agua bidestilada.
1 gradilla para tubos de microfuga
Espectrofotmetro
Reactivos
Reactivo de Bradford
Solucin estndar de albmina de suero bovino (BSA) 0.1mg/mL.
Determinacin de protenas por el mtodo Abs 280 nm.
1. Descongelar slo las alcuotas de las fracciones de protena destinadas para este protocolo y
que fueron recolectadas durante la purificacin de la lactato deshidrogenasa.
23
2. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento.
3. Colocar las fracciones en cuvetas de metacrilato grado UV.
4. Leer la absorbancia las fracciones que te indique t profesor a la longitud de 280 nm.
5. Calcular la concentracin de protena usando la frmula 4. Llenar la Tabla 2.1
Tabla 2.1 Concentracin de protena calculada por la Absorbancia a 280nm
Tubo Absorbancia Concentracin (g/L)
F0
F1
F2
F3
F4
FPA
FPB
6. Usar este estimado para determinar las diluciones o alcuotas a usar en la determinacin
colorimtrica de protenas. Recordar que la sensibilidad del Bradford es de 1 a 20 g de
protena con una absorbancia mxima aproximada de 0.6.
Determinacin colorimtrica de protenas por el mtodo de Bradford. Se utilizar una curva
estndar de BSA y las muestras se harn por duplicado, utilizando tubos de microfuga para hacer las
mezclas de ensayo.
Para la curva estndar:
7. Etiquetar los tubos de microfuga segn se indica en la tabla 2.2, despus aadir los reactivos
en el orden mostrado, agitando despus de cada adicin. Precaucin, maneja con
cuidado el reactivo de Bradford, ya que contiene H
3
PO
4
!.
8. Registrar la absorbancia a 595 nm. Importante incubar a temperatura ambiente por al menos
5 minutos. La absorbancia se incrementar con el tiempo por lo que las muestras no deben
incubarse por ms de 1 h a temperatura ambiente.
Tabla 2.2 Orden de adicin de reactivos para la determinacin de protenas del estndar de BSA
Tubo B 1 2 3 4 5
H2O (L) 800 770 760 740 720 700
BSA (L) 0 30 40 60 80 100
Reactivo Bradford (L) 200 200 200 200 200 200
Absorbancia
9. Graficar absorbancia del estndar vs cantidad de protena (g) y obtener los parmetros de
regresin.
Para las muestras:
10. Descongelar slo las alcuotas de las fracciones de protena destinadas para este protocolo y
que fueron recolectadas durante la purificacin de la lactato deshidrogenasa o usar las
muestras que descongelaste para la determinacin de protenas por Abs 280nm.
11. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento.
12. Hacer las diluciones de cada una de las fracciones, segn indicaciones de su profesor. Cada
muestra diluida se determinar por duplicado. Anotar la dilucin empleada en la Tabla
2.2
24
13. Numerar los tubos segn se indica en la Tabla 2.3 y dependiendo de los volmenes de
protena que te indique el profesor, registrarlos y completar la tabla. Una vez llena la
tabla aadir los reactivos segn se indica.
14. Usar el tubo B como blanco
Tabla 2.3. Determinacin de la concentracin de protena de las fracciones obtenidas durante los
diferentes pasos de la purificacin de la LDH de msculo esqueltico de bovino. F corresponde a
Fraccin y conc a que la muestra se usar concentrada.
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
H2O (L)
cbp 800 L
780 760 780 760
F0 ____ (L)
F1 ____ (L)
F2 ____ (L)
F3 ____ (L)
F4 ____ (L)
FPA conc
(L)
20 40
FPB conc
(L)
20 40
Reactivo
Bradford
(L)
200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200
Absorbancia
15. Utilizar los parmetros de regresin obtenidos de la curva estndar, para calcular el
contenido de protena de cada una de las muestras de acuerdo a la siguiente frmula:
F
m
b Abs
g protena de Contenido
nm
* ) (
595
|
.
|
\
|
=

Donde, b es la ordenada al origen, m la pendiente y F es el factor de dilucin de cada muestra.
16. El valor obtenido en 9 dividirlo entre el volumen de muestra que utilizaste en el ensayo,
obteniendo la concentracin de protena en g/L.
17. Posteriormente realizar los promedios por muestra, recuerda que tienes duplicados para
cada fraccin.
18. Determinar la cantidad de protena total que se obtuvo de cada una de las fracciones de los
diferentes pasos de purificacin, para ello multiplicar el volumen total de la fraccin por el
promedio obtenido en el punto 7, colocar los datos en la Tabla 2.4.
Tabla 2.4. Rendimiento proteico durante las diferentes fases de la purificacin de la LDH
Fraccin Promedio
g protena/L
Volumen total en la fraccin
(L)
Protena total en la fraccin
(g o mg )
0
1
2
3
4
FPA
FPB
25
Cuestionario
1. De acuerdo al fundamento de los dos mtodos de cuantificacin de protenas aplicados en
est prctica cules son las principales diferencias entre ambos mtodos?
2. Compara los resultados de concentracin que obtuviste con los dos mtodos empleados en la
prctica.
3. Qu desventajas tiene determinar la concentracin de protena por Abs 280 con respecto al
Bradford en muestras que tienen una cantidad variada y diferente de protenas, como en
nuestras fracciones de la purificacin de la lactato deshidrogenasa?
4. Puedes usar otra protena como estndar que no sea BSA? Si es as porqu y cul?
5. Qu sustancias pueden interferir en cada uno de los mtodos empleados y si se puede como
evitas su interferencia?
6. Investiga el intervalo de concentracin que detectan cada uno de los mtodos.
7. Porqu es necesario construir una curva de calibracin en la determinacin colorimtrica de
protenas por Bradford?
8. Da el fundamento de otro mtodo para determinar protenas.
Referencias
- Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.
- Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69.
Pginas web que se pueden consultar:
Http://www.histosoft.com/services/background/colorimetric-assay-html
26
Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin.
B. Separacin de las protenas en gel de poliacrilamida-SDS
Objetivos
Conocer los mtodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificacin de una
protena.
Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificacin de una protena.
Aplicar la electroforesis como una herramienta para monitorear la pureza de una protena.
Analizar el progreso de la purificacin de una protena.
Conocer algunos parmetros que se determinan durante la purificacin de una protena:
rendimiento y pureza.
Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificacin de protenas.
Introduccin
La electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida es una herramienta analtica indispensable
y rutinaria en un laboratorio de Bioqumica. La electroforesis puede usarse para separar y comparar
una mezcla compleja de protenas, evaluar la pureza de una protena durante el proceso de
aislamiento y provee algunos valores aproximados de las caractersticas fisicoqumicas de las
protenas como la composicin de subunidades, punto isoelctrico, tamao y carga.
En la electroforesis la migracin de las partculas o molculas cargadas ocurre cuando se establece
un campo elctrico. La velocidad de la migracin depende de la fuerza del campo elctrico aplicado y
la carga neta de las molculas a separar. Si el reservorio de la solucin que se encuentra en contacto
con la muestra, generalmente llamada amortiguador de corrida, se encuentra en un pH cercano a
9.0, la mayor parte de las protenas se encontrarn cargadas negativamente, por lo que al aplicar el
campo elctrico migrarn al nodo. La migracin diferencial de las protenas depender no slo de su
tamao sino tambin de su carga, pero cuando se trata de un gel en el que se ha incluido un agente
desnaturalizante como el dodecil-sulfato de sodio (SDS), se pierde la estructura terciaria y cuaternaria
de la protena y se uniforman las cargas de las protenas, llevando a que la migracin slo dependa
de su peso molecular.
Existe una gran variedad en la composicin de los geles, que responde a las necesidades de
separacin de diferentes mezclas de protenas. En este caso se utilizar a la electroforesis en geles
de poliacrilamida-SDS para evaluar el proceso de purificacin de una protena. El gel de
poliacrilamida, se hace a partir de la reacciones entre los radicales libres de los monmeros de la
acrilamida. Las cadenas de poliacrilamida se entrecruzan con la N,N-metilen bisacrilamida para
formar una red. La tetrametilndiamina o TEMED es el agente iniciador de la polimerizacin y el in
persulfato (S
2
O
8
-
) realiza la funcin de catalizador con la formacin de radicales libres. Las protenas
pequeas viajan ms rpido que las de mayor tamao, porque el tamao del poro entorpece el paso
de las protenas de mayor peso molecular.
Material biolgico
Fraccin 0 o 1
Fraccin 2
Fraccin 3
Fraccin PA
Fraccin PB
Material y equipo
2 vasos de precipitados 25 mL
1 Pipeta Pasteur con bulbo
27
1 Micropipeta de 2-10 L
1 Recipiente de plstico/gel para la tincin.
1 Cmara para electroforesis
1 Fuente de poder
1 juego de placas de vidrio
1 Peine
1 juego de separadores
Pinzas para sujetar las placas
Reactivos
Acrilamida. Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% NNmetilen-bisacrilamida.
2 M Tris /HCl pH 8.8
0.5 M Tris/HCl pH 6.8
20% SDS
TEMED
10% Persulfato de amonio
Agua destilada
Isopropanol o butanol
Mezcla de estndares de peso molecular de protenas.
Amortiguador de muestra *
Amortiguador de corrida *
Solucin teidora *
Solucin desteidora *
*La composicin de las soluciones se encuentra en el apndice.
Preparacin del gel de poliacrilamida-SDS.
1. Se lavan perfectamente las placas de vidrio. Ensamblar las dos placas de vidrio con los
separadores. Hay que asegurarse de que queden bien niveladas y fijas las placas con las
pinzas.
2. Se hace una marca a los 2/3 de la capacidad de los vidrios (ver Figura 2.5).
3. Se mezclan los componentes del gel separador que se indican en la Tabla 2.5, aadiendo al
final el persulfato de amonio y el TEMED. Agitar cuidadosamente la solucin (USAR
GUANTES MIENTRAS SE MANIPULE LA ACRILAMIDA).
Tabla 2.5. Minigel en placa al 12 % de acrilamida con SDS.
Reactivos Gel separador Gel concentrador
30% Acrilamida +
0.8% Bisacrilamida
2 mL 0.66 mL
2 M Tris/HCl pH 8.8 1 mL
0.5 M Tris/HCl pH 6.8 0.6 mL
10% SDS 50 L 50 L
H
2
O 1.94 mL 3.67 mL
TEMED* 2 L 2.5 L
10% Persulfato de amonio* 40 L 40 L
Volumen total 5 mL 5 mL
*Aadir justo antes de vaciar entre las placas de vidrio.
28
4. Aadir inmediatamente la mezcla anterior en el espacio entre las dos placas de vidrio.
5. Agregar poco a poco con la ayuda de una pipeta pasteur isopropanol o n-butanol saturado con
agua, con la finalidad de disminuir la tensin superficial y que no se forme un menisco en la
parte superior del gel.
6. Se espera a que polimerice la acrilamida, no ms de 20 minutos.
7. Decantar el isopropanol o butanol y se hace un lavado con agua bidestilada, se elimina el
exceso de agua con papel absorbente cuidando de no tocar el gel
8. Preparar la mezcla del gel concentrador similar al punto 2.
9. Se aade entre las placas de vidrio e inmediatamente se coloca el peine en la parte superior
para formar los depsitos en los que colocaremos la muestra.
10. Se espera a que se forme este segundo gel, el cual tarda aproximadamente 20 min.
11. Remover con cuidado el peine y se fija el gel con las placas de vidrio a la cmara de
electroforesis.
12. Aadir el amortiguador de corrida en ambos reservorios.
Figura 2.5. Pasos a seguir para la preparacin de un gel de poliacrilamida-SDS.
Preparacin de muestras
13. Ya que conoces los g protena/L, calcular cul es el volumen necesario para tener 25 g de
protena. Con los datos llenar la tabla 2.6.
14. Descongelar las muestras y colocar el volumen que se calcul en un tubo de microfuga y a
ese volumen aadirle un volumen igual de amortiguador de muestra. Es recomendable
tambin, si los volmenes resultantes son muy diferentes entre muestra y muestra, que al
aadir el volumen de amortiguador de muestra ajustemos todos a un volumen similar total.
29
Cabe sealar que los pozos tienen una capacidad mxima de 30 L por lo que la mezcla
protena:amortiguador de muestra no debe exceder ese volumen.
15. Realizar tambin una mezcla de estndares de peso molecular. Usar 7 L del estndar y
mezclar con un volumen adecuado de amortiguador de muestra.
Tabla 2.6. Preparacin de muestras para su corrimiento electrofortico.
Fraccin Concentracin de
protena
(g/L)
L para 35 g Amortiguador de
muestra (l)
Estndar
0
1
2
3
4
FPA
FPB
Estndar 23 L 7L
Adicin de muestras y corrida
16. Aplicar las muestras en los pozos del gel concentrador en el orden en el que se obtuvieron las
fracciones y colocando al final el estndar, PREGUNTAR A SU PROFESOR LOS PESOS
MOLECULARES DE LOS ESTNDARES (Figura 2.6).
Figura 2.6 Aplicacin de las muestras en los carriles de un gel de poliacrilamida-SDS.
17. Iniciar la electroforesis de 10 a 15 mA hasta que el frente haya entrado en el gel separador.
Despus incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se caliente el gel.
18. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del el o segn se
desee.
19. Enseguida el gel se desprende de las placas y se realiza la tincin depositando el gel en una
charola que contenga solucin teidora y colocando la bandeja en agitacin constante.
20. Decantar la solucin teidora, lavar el exceso con H
2
O destilada y aadir la solucin
desteidora. Poner a agitar suavemente.
30
21. Tomar una foto al gel teido.
22. De acuerdo a los resultados sealar el o los pasos de purificacin en donde se produjo el
mayor enriquecimiento en la protena de inters, la lactato deshidrogenasa.
Cuestionario
1. Con la informacin de los pesos moleculares utilizados en la electroforesis, realizar la curva de
log. movilidad electrofortica (Rf) vs log. peso molecular.
2. Determinar el Rf en el que se espera se encuentre la lactato deshidrogenasa.
3. De acuerdo a la anterior informacin seale en la foto del gel en donde se localizara la LDH.
4. En cul de los pasos se obtuvo una mayor cantidad de LDH.
5. Cul de los dos mtodos de purificacin cromatogrfica produce una mayor cantidad de LDH,
la cromatografa de afinidad o la de intercambio inico.
6. Usualmente, en una purificacin se utilizan la cromatografa de intercambio inico y la de
afinidad como pasos secuenciales, una despus de otra, pero por costos hemos utilizado slo
una de ellas. Predice con los resultados que obtuvo t equipo y los otros equipos cul sera el
resultado si primero realizan la cromatografa de intercambio catinico y luego la de
cromatografa de afinidad.
7. Qu cantidad de protena enriquecida en LDH se obtuvo en la fraccin purificada de t
columna
8. Cuntos contaminantes se tienen en la mezcla de protenas obtenida en el proceso
cromatogrfico final?
9. Elabora un esquema de purificacin para la protena malato sintasa, utilizando semillas de
girasol.
A) Busca cual es la funcin de la protena
B) En que material biolgico se encuentra
C) En que compartimento subcelular se encuentra
D) Busca la informacin estructural y/o fisicoqumica de la protena.
E) Diagrama de flujo del protocolo de purificacin propuesto, indicando en cada paso en
donde se queda t protena.
Referencias
- Bradley JSCO, Markwell J. 2007. Assay for determination of protein concentration. Current
protocols in protein science 3.4.1-3.4.29.
- Reiner W. 2005. Gel electrophoresis. John Wiley & sons, Ltd. www.els.net
USA. Pp 71-104
-
Problemas resueltos de purificacin de protenas
http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/webprobs/solucion.html
31
3. ACTIVIDAD ENZIMTICA
PARTE I: CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA
LACTATO DESHIDROGENASA DE MSCULO ESQUELTICO DE BOVINO.
Objetivos
- Conocer las caractersticas generales de las enzimas como catalizadores biolgicos.
- Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un mtodo
espectrofotomtrico.
- Relacionar los distintos parmetros asociados a la medicin de la actividad enzimtica que
permiten seguir y evaluar la purificacin de una enzima (actividad especfica, rendimiento y
grado de pureza o enriquecimiento).
Introduccin
Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reaccin y no se
consumen o modifican durante sta. Sin su presencia, muchas de las reacciones bioqumicas
celulares no podran proceder a la velocidad requerida. El incremento en la velocidad de la reaccin
se encuentra entre 10
6
a 10
12
veces con respecto a la reaccin en ausencia del catalizador. Otra
propiedad de las enzimas es su alto grado de especificidad; solamente catalizan la reaccin en la
que participa un sustrato (especificidad absoluta) o un grupo de sustratos con ciertas caractersticas
qumicas y geomtricas comunes (especificidad de grupo).
La enzima, al ser una protena, tiene una estructura geomtrica caracterstica y la porcin de la
enzima que especficamente une o reacciona con el sustrato se denomina centro cataltico o sitio
activo. Para muchas enzimas sus residuos de aminocidos son suficientes para efectuar la catlisis,
para otras es necesario que exista un cofactor, ya que en ausencia de ste no se cataliza la
reaccin. El cofactor es un in metlico como el Fe
2+
, Zn
2+
, Mo
2+
. Para otras reacciones se necesita
una coenzima, es decir una molcula orgnica con caractersticas no proteicas, que generalmente se
sintetiza a partir de vitaminas. La coenzima funciona como un cosustrato cuando se une
transitoriamente al sitio activo de la enzima, de tal forma que se libera al medio durante cada ciclo
cataltico. ste es el caso de las deshidrogenasas que trabajan con el NAD
+
, como la enzima que nos
ocupar en sta seccin experimental. Cuando la coenzima se une fuertemente a la enzima, ya sea
por medio de enlaces covalentes o interacciones no covalentes, se le da el nombre de grupo
prosttico.
Diseo de un ensayo enzimtico
Durante el aislamiento y purificacin de una enzima, es necesario realizar un ensayo para determinar
la cantidad y pureza de la enzima, as como evaluar sus caractersticas cinticas. Para el diseo de
un ensayo enzimtico se requiere conocer la reaccin que se analiza, es decir: A) cuales son las
especies que se requieren (sustrato, la o las coenzimas, el o los cofactores, entre otros); B) la
estequiometra completa, y C) los efectos del pH, temperatura y fuerza inica sobre la actividad de la
enzima.
Adicionalmente a lo anterior, debe de estar disponible un mtodo para identificar y monitorear
cualquier cambio fsico, qumico o biolgico que ocurre durante la conversin del sustrato a producto.
Se pueden utilizar distintas tcnicas para determinar los cambios en las concentraciones de sustrato
o producto como la espectrofotometra, la fluorometra, la titulacin cido-base y el conteo radiactivo.
La eleccin de alguna de ellas depende esencialmente de las caractersticas estructurales del
sustrato y/o producto, as como de la qumica de la reaccin.
32
Si un ensayo enzimtico involucra el seguimiento de la concentracin del sustrato o producto durante
un intervalo de tiempo, el ensayo se denomina cintico. Por otro lado, cuando se realiza la
determinacin de la concentracin del sustrato o producto a un solo tiempo, se denomina ensayo a
tiempo fijo. En lo posible se recomienda realizar ensayos temporales de reaccin, ya que cualquier
desviacin de la linealidad puede detectarse inmediatamente. Los cambios en la linealidad de la
reaccin pueden deberse a una o varias causas, el decremento en la concentracin de sustrato, la
desnaturalizacin de la enzima y a la inhibicin causada por el producto de la reaccin. Pero, hay que
aclarar que la velocidad inicial de una reaccin ocurre en los primeros minutos de la reaccin, una
relacin lineal que se mantiene cuando el consumo de sustrato no va ms all del 5% de la
concentracin inicial. Por tanto, cuando se realiza un estudio sobre la actividad enzimtica, es
fundamental que las velocidades que se obtengan sean las iniciales.
Lactato deshidrogenasa de mamfero.
El nombre cientfico de la lactato deshidrogenasa o LDH es L-lactato: NAD
+
oxidoreductasa (EC
1.1.1.27). Es una enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneracin
del ATP. La actividad de la LDH es alta durante la actividad fsica intensa, cuando la tensin de
oxgeno disminuye y la demanda de ATP es alta. Bajo condiciones aerobias, la enzima cataliza de
manera reversible la conversin de lactato a piruvato (Figura 3.1). Pero lo contrario ocurre cuando
disminuye el O
2
celular o bien el pH es cercano a 7.0, entonces el piruvato es convertido a lactato con
la concomitante conversin de NADH a NAD
+
. La regeneracin del NAD
+
permite que el flujo de la va
glucoltica contine. La actividad de la enzima decrece en el sentido de Piruvato Lactato cuando la
demanda de energa cesa o hasta que los niveles de lactato llegan a ser altos e intolerables.
Figura 3.1. Reaccin que cataliza la lactato deshidrogenasa. La reduccin del piruvato para formar lactato es
reversible y dependiente de la presencia de una coenzima.
La LDH es un tetrmero de subunidades con un peso molecular de 35 kDa cada una. Hay dos tipos
de subunidades, la H que predomina en el corazn y la M que predomina en el msculo y el hgado.
Las subunidades se pueden asociar formando 5 tipos de tetrmeros con estequiometras distintas:
H4, H3M1, H2M2, H1M3 y M4. Todos estos tienen actividad de LDH, pero tienen diferentes
afinidades por el lactato o el piruvato. Las enzimas que catalizan la misma reaccin pero difieren en
su estructura son llamadas isoenzimas.
En la prctica se determinar la actividad de la LDH de msculo esqueltico de bovino, enzima que
contiene casi exclusivamente subunidades M, esto es la isoenzima M4. En est parte del protocolo se
medir a diferentes tiempos la reaccin en el sentido de Piruvato Lactato, utilizando como fuente de
enzima las fracciones que fueron obtenidas durante el protocolo de purificacin de la LDH de la
seccin II del manual.
El ensayo de actividad est basado en la deteccin del cambio de absorcin del NADH y el NAD
+
. El
NADH es una molcula que absorbe a 340 nm, mientras que el NAD
+
no. Entonces, la actividad de la
enzima en las muestras se detectar como una disminucin en la absorbancia a 340 nm, debido a
que en la reaccin el NADH es convertido a su forma oxidada, el NAD
+
.
Material biolgico.
Fracciones obtenidas durante la purificacin de la LDH (seccin 2 del manual)
33
Material y equipo
Celdas de plstico
Tubos de microfuga
Parafilm
1 Vrtex
Espectrofotmetro (por grupo)
Reactivos
1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0
10 mM Piruvato de sodio
4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo, puede usarse el
amortiguador de fosfatos para su disolucin. Verificar que la absorbancia a 340 nm sea mayor de
1.0, si no es as volver a pesar y medir. El NADH no se puede almacenar disuelto, por lo que al final
la sesin experimental se desecha el reactivo.
Desarrollo experimental.
Curvas temporales de actividad de lactato deshidrogenasa.
Se sugiere que todos los equipos midan primero la curva temporal de actividad a la fraccin 3, que es
la fraccin que usarn para obtener los parmetros cinticos de la enzima. Para obtener las curvas de
actividad se determinar la dilucin ptima de enzima para realizar los ensayos. Una vez que
concluyan con esa fraccin y dependiendo del tiempo que hayan consumido de la sesin, realizar
posteriormente las curvas temporales de actividad a la fraccin 1 y/o la fraccin purificada A o B.
Las mezclas de reaccin se realizarn directamente en las celdas de plstico. Se usar agua para
ajustar a 0 el espectrofotmetro.
1. Descongelar la protena y mantenerla a 4C en un recipiente con hielo. Hacer una primera
dilucin de la fraccin 3, se recomienda 1:50.
2. Se etiquetan 5 celdas.
3. A cada una de las celdas se les aadirn los siguientes componentes:
515 L 100 mM Amortiguador de fosfatos
29.3 L 10 mM Piruvato
210.7 L H
2
O
4. Todas las celdas se mantienen en el hielo. Adicionar a una de la celdas 50 L de 4 mM NADH
e inmediatamente agregar 10 L de la muestra de enzima diluida o la cantidad indicada por
los profesores.
5. Se tapa la celda con parafilm y se agita por inversin dos veces y se lee inmediatamente la
absorbancia a una longitud de onda de 340 nm. Consideraciones: si la primera absorbancia
leda una vez que se aadi enzima es menor de 0.4 es posible que la actividad de la enzima
sea muy alta, por lo que se recomienda repetir el ensayo en una de las celdas ya preparadas
y hacer una dilucin mayor de la enzima, si no hay cambio en la absorbancia entonces diluir
menos la muestra.
34
6. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.1).
El ensayo de actividad se realizar a temperatura ambiente, por lo que una vez
adicionada la enzima hay que mantener la celda dentro del espectrofotmetro.
Tabla 3.1. Registro de absorbancia de las fracciones obtenidas de la purificacin de protenas. Anotar la
fraccin y su dilucin.
Tiempo
(min)
F3
dilucin
F__
dilucin
F___
dilucin
F____
Dilucin
F____
Dilucin
F____
Dilucin
F____
Dilucin
F____
Dilucin
F____
Dilucin
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
7. Realizar una grfica de Absorbancia vs Tiempo (minutos) para cada una de las diluciones de
cada una de las fracciones y obtener la pendiente de la recta. Se sugiere colocar todas las
fracciones en una misma grfica.
8. Para calcular la actividad total de la enzima se utiliza la siguiente ecuacin:
( )
( ) ( )
1
1 1
min
*
* . *
min

=
|
.
|
\
|
= mmol
cm b cm M
F mL ensayo Vol
Abs
m
Actividad
Donde:
m: es la pendiente de la recta (AAbs/At) en unidades de abs / min
c: es el coeficiente de extincin molecular para el NADH, 6.22 x 10
3
M
-1
cm
-1
.
b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm
Vensayo: es el volumen total del ensayo.
F: es el factor de dilucin de la protena
9. Con los datos de actividad y los obtenidos en la prctica de purificacin de protenas llena la
Tabla 3.2.
10. Recuerda que para obtener el dato de la actividad especfica hay que dividir la actividad total
entre los mg totales de protena en la fraccin. Para obtener las veces de purificacin o Grado
de pureza se divide la actividad especfica de cada una de las fracciones entre la fraccin
35
inicial. Para la obtencin del rendimiento se considera que el 100% es la actividad total
recuperada en la fraccin inicial en relacin con la actividad total recuperada en cada paso de
purificacin.
Tabla 3.2. Tabla de purificacin de la LDH de msculo esqueltico de bovino.
Procedimiento Protena
total en la
fraccin
(mg)
Actividad total
mmolmin
1
Actividad
enzimtica
especfica
(mmol min
-1
mg
-1
)
Veces de
purificacin
Rendimiento
Homogeneizado
(F1 o F0)
1 100
Sobrenadante de la
precipitacin con
sulfato de amonio
45% (F2)
Botn obtenido de
la pp con sulfato de
amonio 70% (F3)
Primera Fraccin
que sali de la
cromatografa*
(FPA)
Segunda Fraccin
que sali de la
cromatografa*
(FPB)
Anotar cual cromatografa se realiz de intercambio inico o de afinidad.
11. Analizar los resultados.
Cuestionario
1. Por qu se us H
2
O como blanco para calibrar el espectrofotmetro en la prctica?
2. Realiza el anlisis dimensional de la frmula que se propone para calcular la actividad de la
enzima.
3. Cules son las diferentes unidades en que se puede reportar la actividad de una enzima?
4. Proponga un protocolo para determinar la actividad de la enzima que no sea el de realizar una
curva temporal de aparicin de productos.
5. Analizando los resultados que se encuentran en la tabla 3.1 menciona cual fue el paso en el
que la protena se enriqueci ms. Por qu?
6. Al analizar en conjunto los datos obtenidos en la electroforesis y los de actividad en qu
pasos de la purificacin se eliminan ms contaminantes?.
7. Cul es la utilidad de realizar una tabla de purificacin en la que se toma en cuenta la
actividad de la enzima?
Referencias
- Devlin TM. 1992. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Ed. Wiley- Liss, pp. 135-190. Localizacin
QP514.2
- Kopperschlger G, Kirchberger J. 1996. Methods for separation of lactate dehydrogenases and clinical significance
of the enzyme. Journal of chromatography B, 684, 25-49.
- Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localizacin QP514.2
- Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-233. QH345 L43
- Pardo-Vzquez JP. Cap 10. Cintica enzimtica. En Bioqumica de Laguna. El Manual Moderno, SA de CV., 2002,
pP185
- Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S. A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2
36
PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS
ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO Y DE UN
INHIBIDOR.
Objetivos:
- Determinar la concentracin de sustrato en la cual la enzima alcanza su velocidad mxima.
- Entender el significado de los parmetros cinticos Vmax y Km.
- Calcular los parmetros cinticos de la reaccin catalizada por la lactato deshidrogenasa
utilizando diferentes grficos de la ecuacin linealizada de Michaelis-Menten.
- Determinar el efecto de una inhibidor en la actividad de la lactato deshidrogenasa
- Analizar el efecto de un inhibidor sobre los parmetros cinticos de la enzima.
Introduccin
El trmino cintica enzimtica implica el estudio de la velocidad de una reaccin catalizada por una
enzima y los efectos que pueden tener varios factores como los inhibidores. Uno de los principales
estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reaccin cuando se
modifican las concentraciones del sustrato de la enzima y se mantienen constantes la concentracin
de enzima, el pH, la fuerza inica del medio, la temperatura, entre otros.
Curva de velocidad en funcin de la concentracin de sustrato. Tanto en una reaccin catalizada
por una enzima como en una reaccin qumica, se espera que la velocidad de la reaccin de
conversin de sustratos a productos, sea directamente proporcional a la concentracin de los
reactantes que participan en la reaccin, es decir si se duplica la concentracin de cualquiera de los
sustratos la velocidad de la reaccin tambin se duplica. A una reaccin as se denomina reaccin de
segundo orden y se representa como una lnea recta con pendiente positiva y diferente de cero.
Pero en una reaccin que es catalizada por una enzima, slo a concentraciones bajas del o los
sustratos se obtiene una reaccin de segundo orden. A concentraciones altas de sustrato la velocidad
es independiente de la concentracin de sustrato, debido a que no hay ms enzima que lleve a cabo
la reaccin. La reaccin a concentraciones altas de sustrato se llama reaccin de orden cero y
tambin se representa como una lnea recta pero con pendiente casi igual a cero.
En resumen, en una reaccin catalizada por una enzima la variacin en la concentracin del o los
sustratos presenta diferentes rdenes de reaccin. Para un gran nmero de enzimas la grfica que se
produce se puede describir mediante la expresin matemtica de una hiprbola rectangular. Como
en cualquier expresin matemtica se expresan en ella la relacin entre las variables junto a 1 o ms
constantes.
El trabajo pionero de Michaelis y Menten y Bringgs y Haldane llev a describir la ecuacin de la
hiprbola rectangular, ahora conocida como ecuacin de Michaelis-Menten, con ella es posible
predecir el comportamiento de la enzima en condiciones experimentales diferentes. Entonces, la
ecuacin se describe as:
| |
| | s Km
s V
v
+
=
max
Donde las dos variables de la ecuacin son la velocidad (v) y la concentracin de sustrato (s).
Mientras que las dos constantes son la Km y la Vmax. La Km es llamada la constante de Michaelis-
Menten. El valor de Km de una enzima para un sustrato especfico es la concentracin del sustrato a
la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima. La Vmax es la velocidad
terica mxima de una reaccin. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se
aproxima al de la velocidad mxima de la reaccin, pero nunca se llega a sta. Los valores de Km y
37
Vmax son caractersticos de una enzima, aunque dependen de las condiciones en las que se llev a
cabo la reaccin, ya que hay que recordar que la enzima es una protena que responde modificando
su estructura y carga elctrica cuando los componentes de la solucin cambian.
Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima tambin llamados parmetros
cinticos de una enzima, es graficando los valores de velocidad contra la concentracin de sustrato.
Este mtodo tiene la desventaja de que se grafica una curva y no una lnea recta por lo que la
interpolacin es difcil. Otra manera, es la de utilizar alguna de las expresiones matemticas que
producen una lnea recta como son la de Eadie-Hosftie, la de Hanes o la ms popular la de
Lineaweaver-Burk y que es la ecuacin que a continuacin se muestra:
Como se observa en el ejemplo anterior, las formas lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten son
expresiones matemticas simples y aunque cada una tiene sus problemas de interpretacin son tiles
para obtener los valores de Km y Vmax.
Una de las formas de regulacin de la actividad de una enzima es a travs de molculas que
disminuyen su velocidad de reaccin, inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera
natural en las clulas para controlar la velocidad de una reaccin metablica, o bien pueden ser
compuestos sintticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las
reacciones enzimticas. Muchos compuestos txicos como antibiticos, pesticidas o herbicidas son
inhibidores de enzimas que son responsables de reacciones vitales para la clula. La interaccin de
un inhibidor y la enzima no es siempre la misma, ya que depende de la naturaleza qumica del
inhibidor as como de la reaccin qumica que cataliza la enzima. Para dilucidar el tipo de interaccin
entre ambas molculas se recurre a determinar el efecto del inhibidor en las constantes cinticas de
la enzima.
Inhibidores competitivos. Son molculas que tienen una similitud estructural y qumica al sustrato
de la enzima. Debido a lo anterior el inhibidor se puede unir al sitio activo de la enzima. Pero como el
inhibidor no es idntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertir el inhibidor a producto. El
inhibidor simplemente bloquea el sitio activo, por regla no es posible que tanto el inhibidor como el
sustrato se encuentren al mismo tiempo en el sitio activo. Si se adiciona ms sustrato y el inhibidor es
reversible, el aumento en la concentracin de sustrato reduce la inhibicin. El inhibidor afecta
exclusivamente el valor de la Km de la reaccin catalizada por la enzima (Figura 3.2).
Figura 3.2. Efecto de los inhibidores sobre los parmetros cinticos de una enzima.
38
Inhibidor no competitivo. El inhibidor no se une al sitio activo de la enzima sino a un sitio alejado del
sitio activo y ocasiona un cambio conformacional en el sitio activo de la enzima. Un inhibidor no
competitivo puro es aquel en el que slo se altera la capacidad de unir al sustrato. La mayor parte
de los inhibidor son inhibidores mixtos es decir no slo se afecta la unin del sustrato sino tambin
la conversin del sustrato a producto. Debido a lo anterior, los inhibidores mixtos alteran tanto el valor
de la Vmax como el de la Km de la enzima (Figura 3.2).
Inhibidor acompetitivo. Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre, es decir slo se
une al complejo Enzima-Sustrato. Lo anterior puede deberse a que la unin del sustrato expone o
crea sitios de acceso o unin para el inhibidor, en el o fuera del sitio activo. Una vez que el inhibidor
se une la enzima se previene la formacin de producto. El inhibidor acompetitivo altera tanto la Km
como la Vmax de la enzima. Sin embargo, a diferencia de la grfica que se produce con un inhibidor
de tipo no competitivo mixto, las curvas a diferentes concentraciones de inhibidor son paralelas en
este ltimo.
En la prctica se determinarn las constantes cinticas, Km y Vmax, de la lactato deshidrogenasa de
msculo de bovino, para la reaccin en el sentido de piruvato a lactato, manteniendo constante la
concentracin de enzima, el pH y la temperatura de reaccin. Tambin se determinar el tipo de
inhibicin que un cido carboxilico produce en la actividad de la enzima, el oxamato (Figura 3.3) a
travs de medir la actividad de la enzima a diferentes concentraciones de sustrato y a una sola
concentracin de inhibidor su efecto en las constantes cinticas de la reaccin catalizada por la
enzima.
Figura 3.3 Estructuras del piruvato y el inhibidor que se usar en la prctica, el oxamato.
Material biolgico
Fraccin 3 obtenida en la prctica de purificacin.
Materiales y equipo
10 celdas de plstico
Tubos para microfuga
1 Vaso de precipitados de 25 mL
3 Tubos de ensayo 13x100mm
1 Micropipeta de 1000 L
Puntas para micropipeta de diferentes capacidades
1 Vortex
Parafilm
Espectrmetro (por grupo)
Reactivos
1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0
39
10 mM Piruvato de sodio
10 mM Oxamato de sodio
4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo.
Desarrollo experimental.
Efecto de la concentracin de sustrato.
1. Numerar las celdas.
2. En una celda de plstico se adicionan el amortiguador de fosfatos, el agua y el piruvato de
acuerdo a lo que se indica en la tabla 3.3. Justo antes de medir se aaden 50 L de NADH 4
mM y 10 L de la muestra de enzima diluida, fraccin 3 obtenida en la prctica de purificacin.
Tabla 3.3. Efecto de la concentracin de sustrato.
Solucin 1 2 3 4 5 6
*Concentracin final de piruvato (mM) 0.06* 0.09* 0.15* 0.25* 0.36* 0.5*
100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0 515 515 515 515 515 515
H2O c.b.p. 815 L (L) 235.1 232.7 227.8 219.6 210.7 200
10 mM Piruvato (L) 4.9 7.3 12.2 20.4 29.3 40
4 mM NADH (L) 50 50 50 50 50 50
ENZIMA (diluida*) (L) 10 10 10 10 10 10
*Usar la dilucin apropiada de enzima, preguntar a su profesor.
3. Tapar la celda con parafilm y agitar 2 veces por inversin.
4. Ajustar el espectrofotmetro con agua y leer la absorbancia de la muestra a una longitud de
onda de 340 nm.
Tabla 3.4. Lecturas de absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato.
Piruvato (mM) Tiempo
(seg) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
40
6. Obtener la pendiente y calcular la actividad de manera similar al punto 6 de la prctica
anterior.
7. Posteriormente se grafican:
A) Actividad vs concentracin de sustrato (grfica de Michaelis-Menten);
B) La actividad de acuerdo a la ecuacin de Lineweaver-Burk y
C) La curva de acuerdo al mtodo de Hanes-Wolff.
8. Calcular las constantes cinticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres grficos
anteriores.
Efecto de un inhibidor en la actividad de la LDH.
Al igual que en la seccin anterior se mide la actividad de la lactato deshidrogenasa a diferentes
concentraciones de piruvato, pero ahora se adiciona el oxamato de sodio, compuesto que inhibe la
actividad de la LDH (Tabla 3.5).
Tabla 3.5. Composicin de medio de reaccin para medir el efecto del oxamato en la actividad de la lactato
deshidrogenasa.
Solucin 1 2 3 4 5 6
*Concentracin final de piruvato (mM) 0.06* 0.09* 0.15* 0.25* 0.36* 0.5*
100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0 515 515 515 515 515 515
H2O c.b.p. 815L 235.1 232.7 227.8 219.6 210.7 200
10 mM Oxamato (L) 27.2 27.2 27.2 27.2 27.2 27.2
10 mM Piruvato (L) 4.9 7.3 12.2 20.4 29.3 40
4 mM NADH (L) 50 50 50 50 50 50
ENZIMA (diluida) (L) 10 10 10 10 10 10
1. Se adiciona en una celda de plstico los reactivos de acuerdo a los volmenes y el orden que
se encuentra en la Tabla 3.5.
Tabla 3.5. Registro de absorbancias de la actividad de la LDH en presencia de un inhibidor.
Piruvato (mM) + Oxamato 0.35 mM Tiempo
(seg) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
41
3. Obtener la pendiente y calcula la actividad enzimtica por mg de protena.
4. Realizar los siguientes grficos: A) Actividad vs concentracin de sustrato; B) La grfica de
actividad de acuerdo a Lineweaver-Burk y C) La curva de acuerdo al mtodo de Hanes-Wolff.
5. Calcular las constantes cinticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres grficos
anteriores.
6. Determinar el tipo de inhibicin que oxamato ejerce sobre la LDH.
Cuestionario
1. Por qu es importante determinar los valores de Km y Vmax de una enzima?
2. Disea un protocolo diferente al presentado en est seccin para determinar la actividad de la
lactato deshidrogenasa.
3. Cul fue el blanco de la reaccin?
4. En que intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un comportamiento de
primer orden?
orden cero?
orden cero orden mixto?
7. Qu significado tiene?
8. Define Km e indica qu unidades tiene.
9. Define Vmax e indica qu unidades tiene.
10. Qu tipo de inhibidor es el oxamato? Fundamenta tu respuesta.
11. Cules son los inhibidores naturales de la LDH de msculo?
12. En el humano que tejidos contienen LDH?
13. Qu es el ciclo de Cori y como participa la LDH en el ciclo?
Referencias
- Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localizacin
QP514.2
- Nelson D. 2004. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp.
202-233. QH345 L43
- Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S.A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2
1. aprender utilizar los conceptos de Km, Vmax
- http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/aotw3.html en la pgina pulsar la tecla
kinetics_model.xls, despus regresa a la pgina inicial y contesta las preguntas que
se te hacen.
- http://www.mhhe.com/biosci/genbio/biolink/j_explorations/ch07expl.htm
NOTAS Y CLCULOS
42
4. GENTICA
DETERMINACIN DEL TIPO DE HERENCIA EN BASE A FRECUENCIAS
FENOTPICAS Y GENOTPICAS.
Objetivos:
Entender los principios de la transmisin de los caracteres hereditarios.
Explicar y usar la terminologa relevante: dominante, recesivo, portador, mutacin,
heterocigoto, homocigoto, sndrome, alelo y locus.
Resolver problemas aplicando las leyes de Mendel: Determinacin de frecuencias
Distinguir entre enfermedades autosomales y ligadas al sexo.
Introduccin
La descripcin morfolgica o funcional de un organismo vivo en cualquier momento dado de su
desarrollo es el fenotipo de ese organismo. Mientras que el genotipo se define como el conjunto de
instrucciones o genes, contenidos en su material gentico heredable; es decir, la informacin
contenida en las secuencias de su cido desoxirribonucleico (DNA), que se transmite de generacin
en generacin entre los miembros de una especie. Este conjunto de instrucciones es una amplsima,
pero finita, predeterminacin de las posibilidades fenotpicas de un organismo. Por otro lado, existen
los factores epigenticos, tales como las influencias o eventos que no estn escritos en el material
gentico heredable de los seres vivos, pero que modifican los fenotipos. Los fenmenos epigenticos
como por ejemplo el ambiente, pueden determinar, en un momento dado, el modo en que se
expresan las instrucciones genotpicas y por lo tanto, el fenotipo del individuo.
Una caracterstica del genotipo es su heredabilidad. Los mecanismos implicados fueron publicados
por Gregor Johann Mendel en 1866. l identifico ciertos rasgos fenotpicos que se transmiten de
manera predecible en plantas de chcharos y Propuso que estos caracteres estn determinados por
factores genticos que segregan independientemente, es decir, que se heredan de padres a hijos en
forma de unidades de herencia individuales, los genes.
Los estudios de Mendel se basaron realizando cruzas entre individuos de lneas puras que diferan en
un par de caracteres de fcil identificacin fenotpica y la observacin del aspecto de la primera
generacin hbrida (F
1
o primera generacin filial, formada por plantas monohbridas).
Posteriormente, cruz las plantas hbridas entre s y obtuvo la segunda generacin filial (F
2
). Cont el
nmero de individuos de la F
2
, que presentaron cada uno de los caracteres utilizados que podran ser
comparados, tales como color de las flores, el color y textura de la testa de las semillas y la longitud
de los tallos.
Mendel, a partir de sus experimentos, concluy que los chcharos tienen una dotacin gentica doble.
Es decir, que son organismos diploides, en los que existen dos copias o alelos del gen causante de
un rasgo fenotpico. En los organismos diploides cada copia allica proviene de cada uno de los
progenitores. Mendel, tambin postul que, frecuentemente, una de estas copias en particular puede
ser dominante sobre su contraparte heredada del otro progenitor. Cuando en la descendencia se
encuentra un alelo recesivo del gen y uno dominante, el fenotipo observado en esta combinacin
heterocigota, corresponder al tipo dominante. Para la aparicin de un fenotipo recesivo es
indispensable la transmisin, por ambos progenitores, de una combinacin homocigota de alelos
recesivos. Obviamente, la combinacin homocigota de las variantes allicas dominantes resultar en
un fenotipo dominante. Las interpretaciones que Mendel dio a sus observaciones han resultado
correctas para un tipo de herencia que hoy llamamos Mendeliana, precisamente por manifestarse de
la manera en que Mendel lo descubri. En este caso un rasgo fenotpico est determinado por la
combinacin de dos copias allicas de un gen, cada una de ellas en distinto grado de dominancia,
43
combinaciones que se heredan en los miembros de una familia en una forma matemticamente
predecible.
Con los datos que obtuvo, formul una explicacin terica con postulados, que ahora constituyen las
leyes de la herencia. La primera Ley de Mendel o Ley de la segregacin dice que durante la
formacin de los gametos, los pares de factores se separan o segregan al azar, de manera que cada
gameto recibe uno u otro miembro del par con la misma probabilidad. Segunda Ley de Mendel o Ley
de la distribucin independiente postula que la segregacin de diferentes pares de factores se realiza
de manera independiente durante la formacin de los gametos.
Enfermedades genticas y la herencia mendeliana
Se cree que cerca de 400 enfermedades en humanos son resultado de cambios en un solo gene.
Muchas de ellas son enfermedades raras, pero discapacitantes que pueden llevar a la muerte del
individuo. Aunque las enfermedades genticas en un individuo son raras, el nmero total de personas
afectadas es significativo, alrededor del 2% de todos los nacimientos al ao. Actualmente no existen
medios totalmente efectivos de tratamiento o cura para la mayor parte de ellos.
Muchos de los desrdenes genticos pueden ser mantenidos en la poblacin, ya sea por la
transmisin de genes desde los padres hacia los hijos o por la aparicin de mutaciones. Los cambios
en el DNA o en los cromosomas, mutaciones, pueden provenir desde la formacin de las clulas
sexuales (vulos y esperma) o en el estado temprano del desarrollo del feto. Un ejemplo de esto
ltimo es la aparicin del sndrome de Down, el cual causa retardo mental, estatura baja y algunos
otros cambios. Proviene de un error durante la divisin celular (meiosis) llevando a contener 47
cromosomas en el nio en lugar de 46, generalmente causado por la disyuncin o separacin
incompleta del cromosoma de uno de los progenitores (cromosoma 21).
Los humanos presentamos clulas diploides en la mayor parte de nuestras clulas. Con un contenido
de 23 pares de cromosomas, donde slo un par es diferente entre hombres y mujeres y es el que
define el sexo. Las mujeres presentan 2 cromosomas X similares, mientras que los varones un
cromosoma X y otro ms pequeo denominado Y. A los genes que se localizan en el par 23 de
cromosomas son a menudo denominados genes ligados al sexo, mientras que los otros 22 son
denominados genes autosomales.
Todas las enfermedades causadas por el cambio de slo un gene tienen patrones claros de herencia,
lo cual significa que es posible determinar las probabilidades de que alguien herede una condicin
particular. Tres patrones de herencia estn involucrados: Condiciones recesivas, dominantes y
ligadas al sexo.
Condicin recesiva. Para presentar los sntomas de la enfermedad, el individuo debe presentar las
dos copias del gen afectado. Su descendencia presentar la enfermedad slo que el otro padre
tambin sea portador del gen, como en la fibrosis qustica (Figura 4.1).
Condicin dominante. La enfermedad es causada por un alelo dominante, por lo que un individuo
slo tiene que heredar una copia para presentar la enfermedad. Los hijos de padres que presentan la
enfermedad, tienen 50% de probabilidades de presentarla tambin. Un ejemplo grave de est
condicin es la enfermedad de Huntington, la cual se desarrolla entre los 35 a 45 aos, disminuyendo
la movilidad motora y ocasionando demencia.
44
Figura 4.1. Frecuencia fenotpica de la aparicin de la fibrosis qustica cuando ambos padres son portadores (progenitores
heterozigos). La fibrosis qustica es una disfuncin o sndrome producido por la alteracin en un gen presente en el
cromosoma 7. En este ejemplo, la descendencia de progenitores heterozigotos siempre tendr una distribucin de
frecuencias NN=25%, cfcf=25% y Ncf=50%.
Condicin ligada al sexo. Debido a que los varones slo poseen un cromosoma X frente a los dos
que poseen las mujeres, las enfermedades de un solo gen recesivas localizadas en el cromosoma X,
aunque raras, afectan con mayor frecuencia a los hombres que a las mujeres. Como ejemplos
tenemos al daltonismo y a la hemofilia.
Otro tipo de herencia de gran relevancia mdica es la llamada herencia polignica. Un gran nmero
de enfermedades, entre las cuales destacan el asma, la diabetes y la hipertensin, tienen un
componente gentico polignico. Se dice que un rasgo fenotpico es polignico cuando est
determinado por ms de un gen; mientras que los ejemplos discutidos anteriormente, son casos de
herencia monognica.
Existen otros tipos de herencia que no siguen las reglas mendelianas. Esto ocurre cuando los genes
que causan el fenotipo son mviles, es decir que a diferencia de los genes que siguen una
segregacin mendeliana, hay genes que no tienen una residencia o locus fijo en el genoma o
cromosoma, lo cual hace imposible predecir su heredabilidad de acuerdo a las leyes de Mendel.
Actualmente, se han desarrollado tcnicas para la determinacin de mutaciones o modificaciones en
los cromosomas. Sin embargo, slo cubren una gama limitada de alteraciones, por lo que el
diagnstico y la prevencin es difcil. Para aqullos en los que hay protocolos de deteccin de si se es
o no portador de una enfermedad congnita, es posible orientarlos sobre el tratamiento, las
posibilidades de transmitir la enfermedad a sus hijos y las tcnicas de deteccin una vez que se est
esperando a un hijo.
Material y equipo
Computadora conectada a internet, por cada 2 personas.
Resolver los problemas interactivos que les entregarn los profesores
Cuestionario
45
1. Cmo se aplican las Leyes de Mendel a las enfermedades hereditarias en humanos?
2. Cules son las caractersticas principales de la herencia autosmica dominante, autosmica
recesiva, recesiva ligada al X y dominante ligada al X?
3. Es posible determinar todas las caractersticas fenotpicas a travs de las reglas de Mendel?
4. Fundamente su respuesta.
5. D un ejemplo de una enfermedad autosmica diferente a las sealas en la introduccin.
6. Proporcione un ejemplo de una enfermedad ligada al sexo diferente a la indicada en la
introduccin.
7. Cules son los pasos a seguir para la prevencin o tratamiento si se sospecha ser portador
de una enfermedad congnita?
8. Cules son los pasos a seguir si su pareja se encuentra embarazada y usted es portador de
una enfermedad congnita?
9. Qu aplicaciones tienen en su prctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos
adquiridos al realizar esta prctica?
Referencias
- Gardner JE. Garder E. Principios de gentica. 1998, 4a edition Ed. Limusa, pp. 390-407.
Localizacin QH581.2 M 65
- Garvin W, Adley C, Dixon B, Frings J, Madden D, Marcussen L, Turner J, Wymer PEO. Unit
4. Issues in human genetics. European initiative for biotechnology education 1995.
http://www.reading.ac.uk/NCBE
46
5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIN DE CIDOS NUCLEICOS
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO I: CONJUGACIN
Objetivos
Identificar al DNA como portador de la informacin gentica
Conocer los mecanismos por los que una bacteria puede adquirir un plsmido.
Reconocer a la conjugacin bacteriana como un fenmeno de transferencia horizontal de material
gentico.
Entender el mecanismo por el cual se realiza la conjugacin bacteriana.
Introduccin
Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico, covalentemente cerrados y generalmente,
de tamao pequeo que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de
manera independiente del DNA cromosmico. A diferencia de ste, los plsmidos no son necesarios
para la viabilidad general de la clula, pero pueden contener genes que contribuyen a la
sobrevivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibiticos, a metales,
etctera. Algunas clases de plsmidos poseen adems la propiedad conocida como "replicacin
relajada", esto es, estn presentes en muchas copias por clula, lo que facilita enormemente su
aislamiento y su purificacin.
Una bacteria slo puede adquirir un plsmido a partir de otra bacteria que lo contenga, ya sea por
transmisin vertical o por cualquiera de los tres mecanismos conocidos de transferencia horizontal
de material gentico. Estos son: la transformacin, la transduccin y la conjugacin.
En la transformacin, el DNA liberado de una clula bacteriana entra a otra clula, generalmente de la
misma especie. En la transduccin, un virus bacteriano accidentalmente toma DNA del cromosoma o
de un plsmido de la bacteria a la que ha infectado y lo inyecta a otras bacterias.
La conjugacin bacteriana es un proceso de transferencia de material gentico, en el que la
informacin gentica de un plsmido con o sin parte del cromosoma bacteriano es transferido a otra
clula (Figura 5.1). Este proceso, a diferencia de la transduccin, tiene como condicin esencial el
contacto celular. A la clula que aporta el material gentico se le llama donadora y aquella que lo
recibe, receptora. No todos los plsmidos pueden llevar a cabo la conjugacin, es decir ser
conjugativos, solamente aquellos que poseen un grupo de genes denominados genes tra. Dentro
de este grupo de plmidos se encuentra el factor de fertilidad o plsmido F de E. coli. El plsmido
F confiere a la clula bacteriana la capacidad de conjugarse con otra clula que no lo posea. El
plsmido F se presenta en una sola copia por cromosoma bacteriano. Cuando se integra al
cromosoma bacteriano, suprime su sistema de replicacin y se replica como parte del cromosoma
bacteriano.
El plsmido F contiene ms de 40 genes tra, la mayora de los cuales son necesarios para la
construccin de un organelo llamado pili sexual o pili F constituido por una protena, la pilina,
codificada por uno de los genes tra. El Pili F es necesario para promover el contacto entre las
bacterias donadora y receptora y para la formacin de un puente citoplasmtico por donde pasar el
material gentico. La transferencia se inicia a partir de un sitio determinado en el plsmido y que
forma parte de los genes tra, denominado oriT
47
Figura 5.1. Conjugacin bacteriana. Paso del plsmido F de una clula donadora a una receptora a
travs del conducto proteico denominado pili. Al centro se muestra como slo una de las hebras del
DNA del plsmido se inserta en la clula hospedera, por lo que la DNA polimerasa de cada una de las
bacterias se encarga de sintetizar la hebra faltante. Al final ambas clulas presentan al plsmido F.
Algunos plsmidos no son capaces de llevar a cabo la conjugacin por s mismos, pero pueden ser
transferidos (plsmidos movilizables) a otras bacterias cuando coexisten con plsmidos con genes
tra, debido a que contienen un grupo de genes denominados genes mob, los cuales incluyen un sitio
oriT, pero carecen de otros genes necesarios para la conjugacin, incluyendo los que codifican para
la formacin del pili.
En relacin al plsmido F, existen cuatro tipos de cepas bacterianas:
Cepa F
-
. Clula bacteriana que no posee un plsmido F, y que acta como clula receptora en la
conjugacin.
Cepa F
+
. Clula bacteriana que posee un plsmido F independiente del cromosoma bacteriano, acta
como clula donadora en la conjugacin y transfiere al plsmido F a la clula receptora
transformndola en clula F
+
.
Cepa Hfr (High frequency of recombination). Bacteria que posee un plsmido F integrado a su
cromosoma. Las cepas Hfr tienen la capacidad de transferir porciones de su cromosoma (clula
donadora) y por ello confieren alta frecuencia de recombinacin. No transfieren el plsmido F, por lo
que al trmino de la conjugacin de las clulas receptora permanece como F.
Cepa F. Clula bacteriana que posee un plsmido F extracromasmico, pero que antes estuvo
integrado al cromosoma y que se encidi llevando consigo genes bacterianos. Acta como clula
donadora en la conjugacin y transfiere el factor F junto con los genes bacterianos, transformando a
la clula receptora en una clula F', la cual ser un diploide parcial o merocigoto. Es decir, tendr dos
copias de los genes bacterianos que estn presentes en el plsmido F'. A ese tipo de transferencia se
le conoce como sex-duccin.
Una bacteria Hfr transfiere los genes bacterianos a una clula F
-
en un tiempo constante. Se calcula
en aproximadamente 100 minutos la transferencia total del cromosoma de Escherichia coli. Esta
caracterstica ha sido utilizada en el mapeo gentico localizando un determinado marcador gentico
en un tiempo dado.
En esta prctica se comprobar la conjugacin bacteriana mediante la transferencia de un marcador
gentico, la resistencia a la kanamicina. El marcador gentico de seleccin que se utilizar para la
cepa receptora ser la resistencia a la estreptomicina.
48
Material biolgico
Un cultivo de E. coli JM1452Str
R
(cepa receptora), cultivada por una noche en caldo Luria a 37C.
Un cultivo de E. coli W3110/FKmTn3 (cepa donadora), cultivada por una noche en caldo Luria a
37C.
Materiales y equipo
1 tubo 13 X 100 mm con 1 mL de caldo Luria estril
5 cajas Petri con medio Luria-agar-2% estreptomicina (25 g/ml)
2 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 g/ml)
100 palillos de madera estriles
1 asa bacteriolgica
1 propipeta
1 mechero
Incubadora a 37C
Bao Mara a 37C
Refrigerador a 4C
Por grupo para controles de las cepas
1 cajas Petri con medio Luria-agar 2%-estreptomicina (25 g/ml)
1 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 g/ml)
Desarrollo de la prctica
1. En condiciones estriles tomar el tubo de 13X100 con 1 mL de caldo Luria estril y hacer la
siguiente mezcla de conjugacin: 0.5 mL del cultivo de E. coli JM1452Str ms 0.2 mL del cultivo
E. coli W3110/FKmTn3 (Figura 5.2).
2. Incubar el tubo a 37C SIN AGITACIN durante 30 min.
3. Dividir una caja Petri con medio Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina en 3 partes. Marcar la
zona 1 como bacteria receptora, la zona 2 como conjugacin y la zona 3 como bacteria
donadora. Colocar una gota pequea de cada cultivo en el sitio correspondiente y dejar que se
absorba. Nota: Si el profesor lo considera necesario, en lugar de colocar una gota del
cultivo se puede sembrar por estra cada cultivo, lo anterior ofrece la ventaja de adelantar un
da.
4. Incubar a 37C durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento en la zona de conjugacin,
refrigerar a 4C.
5. Testigo por grupo: Dividir una caja petri con Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina y una caja
petri con Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Sembrar por estra las cepas donadora y
receptora en cada mitad respectivamente de las cajas. Incubar a 37C durante 24 h. Al observar
crecimiento refrigerar las cajas.
6. Despus del tiempo de incubacin trabajar con la caja del paso 3. Si no se sembr por estra en
el paso 3 entonces este es el momento de tomar una asada de las zonas receptora y de
conjugacin y sembrar por estra en una caja petri con Luria-agar-2% sulfato de estreptomicina,
cada una en una caja diferente. Incubar a 37C durante 24 h.
7. De las colonias aisladas, parchar colonias de cada caja en una caja Petri con Luria-agar-2%
sulfato de estreptomicina y 50 colonias en otra de Luria-agar 2%-estreptomicina y despus la
replica en la caja de Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Parchar consiste en tomar bacterias
de una colonia aislada al picar con un palillo la colonia y luego picar una caja de medio de cultivo
para as transferir la bacteria. En la prctica una colonia se transferir con el palillo del cultivo de
bacterias aisladas a dos diferentes cajas Petri, empezando por la que contiene el antibitico
estreptomicina. Para facilitar y agilizar el parchado, marcar divisiones por la parte de atrs de las
4 cajas o bien pegar una hoja cuadriculada en el exterior y por debajo de la caja (ver Figura).
8. Incubar a 37C durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento. Observar y analizar los
resultados. Reportar el porcentaje de colonias transconjugantes. Refrigerar las cajas.
49

Incubar 24 h, 37C
Sembrar por estra las cepas receptora y transconjugante
en Agar Luria-estreptomicina
(se necesitan colonias aisladas para el siguiente paso)

Incubar 24 a 37C

Cepa receptora Cepa transconjugante

Marcar las cajas

Figura 5.2. Esquema experimental de conjugacin bacteriana. Produccin de una cepa transconjugante, a partir
de una cepa receptora resistente a estreptomicina, con una cepa que es capaz de proporcionar la informacin
gentica para la resistencia a kanamicina. No olvidar realizar hacer los testigos.
E. coli JM1452Str
cepa receptora
E. coli W3110/FKmTn3
cepa donadora
Mezcla de
conjugacin
Incubar 30 min a 37C
sin agitacin

Luria-
0.2 mL
Luria-Estreptomicina
Luria- Kanamicina Luria-Estreptomicina Luria-Estreptomicina Luria-Kanamicina
Parchar 50 colonias
50
Cuestionario
1. Qu es un plsmido?
2. Cules son los mecanismos de transferencia horizontal de material gentico en bacterias?
3. Qu es la conjugacin?
4. Qu diferencia existe entre la conjugacin y los otros mecanismos de transferencia horizontal
de material gentico?
5. Cules son las principales caractersticas del plsmido F y qu genes contiene?
6. Cules son los genes del plsmido F necesarios para la transferencia de material gentico
por conjugacin y para qu codifican?
7. De acuerdo al plsmido F cuntos tipos de cepas bacterianas se conocen? y qu diferencia
existe entre ellas?
8. Seale que tipo de transconjugantes se obtiene en cada una de las siguientes cruzas:
a) F
+
X F
-
b) F X F
-
c) Hfr X F
-
9. Qu caractersticas tiene las cepas empleadas en la prctica?
10. Por qu tanto la cepa donadora como la receptora tienen un marcador de resistencia?
11. Hubo crecimiento de las cepas empleadas en la prctica en las cajas controles con
antibiticos? Por qu son importantes estas cajas control?
12. Por qu se parchan la cepa receptora y la transconjugante tanto en medio con
estreptomicina como kanamicina? Qu resultados se obtuvieron en esas cajas?
13. Cmo se comprob la conjugacin en la prctica? Qu porcentaje de bacterias
transconjugantes se obtuvo?
14. Cul es el genotipo de la cepa transconjugante obtenida en la prctica?
15. Qu diferencias existen entre que un plsmido sea conjugativo o sea movilizable?
16. La conjugacin puede realizarse entre las bacterias Gram positivas o solo se da en las
bacterias Gram negativas?
17. Con qu frecuencia y dnde se realiza la conjugacin en forma natural?
18. Cul es la importancia biolgica de la conjugacin?
19. Indique los mecanismos por los que se da la resistencia de las bacterias a los antibiticos
utilizados en la prctica.
20. Qu aplicaciones tienen en su prctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos
adquiridos al realizar esta prctica?
Referencias
- Brown T.A. Genetics. A Molecular Approach. 2nd ed. Chapman & Hall. USA. 1992. pp 467.
- Lewin B. Genes V. Oxford University Press. USA. 1994. pp 1272.
- Gentica General, Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en el opern lac.
Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002.
51
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: TRANSFORMACIN
Objetivos
Conocer el fundamento para transformar clulas bacterianas.
Realizar la tcnica de transformacin bacteriana.
Aprender a identificar clulas transformantes mediante su fenotipo.
Conocer la definicin de organismo transgnico.
Conocer las aplicaciones de la transformacin bacteriana: beneficios y riesgos.
Introduccin
Desde pocas antiguas, el hombre ha seleccionado animales y plantas con caractersticas fenotpicas
deseables. La domesticacin ha proporcionado importantes beneficios a la humanidad incrementando
la produccin de insumos para consumo humano, por ejemplo, hace 100 aos una vaca produca en
promedio 2000 a 3000 litros de leche al ao. Actualmente, las vacas Holstein proporcionan un
promedio de 6000 litros al ao, y las mejores vacas son capaces de producir de 8000 a 10,000.
Asimismo, una gallina hace 100 aos produca en promedio 70 huevos al ao, en este siglo las
mejores razas producen cerca de 250 al ao.
Las tcnicas convencionales de reproduccin han llevado a nuevas combinaciones de genes. Sin
embargo, la recombinacin cruzada entre miembros de especies distintas no ha sido exitosa. Por
ejemplo, la cruza entre la yegua y el burro, llev a producir a la mula, organismo estril. As, el
nmero de combinaciones nuevas es limitado, debido a que los genes pueden recombinarse slo
entre los miembros de la misma especie o con organismos muy relacionados.
Las barreras impenetrables entre especies han sido parcialmente superadas con el surgimiento de
tcnicas de manipulacin y de seleccin del material gentico, la ingeniera gentica. Debido a que
el DNA contiene un cdigo gentico esencialmente similar para todos los organismos, en principio se
pueden transferir secuencias de genes de organismos totalmente no relacionados y producir
organismos con caractersticas tiles y particulares, que de otra manera sera imposible de obtener,
los denominados organismos transgnicos.
Un nmero amplio de genes ha sido identificado y caracterizado, conocimiento que abre la posibilidad
de buscar mtodos para introducir o modificar un gene para adquirir una caracterstica deseable,
como por ejemplo, para curar enfermedades. No obstante los posibles beneficios, hay que considerar
que al introducir genes no propios al husped, se pueden ocasionar efectos no deseados, como que
la caracterstica introducida lleve a una respuesta general alterada y, por tanto, modifique la fisiologa
y sobrevivencia del individuo, o bien que se escape la nueva informacin de manera indiscriminada
a otros organismos.
Requisitos para construir un vector de clonacin
An cuando el cdigo gentico es bsicamente el mismo para todos los organismos, los detalles finos
del control gentico difieren. Un gene bacteriano no siempre puede expresarse eficientemente si es
introducido en una clula eucarionte. Para la produccin de un organismo genticamente modificado
se tienen que hacer algunas consideraciones, producir o construir un transgene, es decir el gene de
inters ms una parte extra de DNA que controle correctamente la funcin del gene en el nuevo
husped. Por ejemplo, para que un gen procarionte se pueda expresar en un organismo eucarionte
se le debe agregar una regin promotora en el extremo 5 del gen para que sea reconocido por el
aparato transcripcional del organismo receptor. Asimismo, se debe aadir una secuencia de poli A en
la porcin 3 del gen para que el RNAm pueda ser traducido.
52
Figura 5.3. Vector de clonacin pET-24. Se muestran algunas caractersticas del vector, como el sitio origen de la
transcripcin (ori), el sitio de clonacin mltiple (SCM), el sitio que confiere resistencia a kanamicina, Kan
R
; fl ori,
origen de replicacin fl y el sitio que servir para controlar la expresin del transgene una vez que sea insertado
en el sitio de clonacin mltiple, el sitio de unin al represor lacI.
Los plsmidos poseen un inters singular en la Ingeniera Gentica por ser uno de los sistemas
vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema que permite introducir en una
clula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar (obtener mltiples copias); en esta
clula hospedera el vector se replica y se expresa. La molcula que resulta de la unin de un DNA
vector con el DNA de inters (inserto) se denomina molcula vector recombinante.
Para ser utilizado como vector de clonacin, un plsmido ideal debe poseer al menos tres
caractersticas (Figura 5.3): 1) Debe tener su propio origen de replicacin y, por tanto, la capacidad de
replicacin autnoma e independiente del genoma del hospedero. 2) Debe tener un sitio de clonacin
mltiple (SCM) que permita la apertura del DNA con enzimas de restriccin (enzimas que cortan
secuencias internas de DNA de manera especfica) y hace posible la clonacin de insertos de DNA
en la forma y orientacin deseada. 3) Debe poseer marcadores genticos seleccionables que
permitan aislar a las clulas hospederas que contengan al vector, generalmente resistencia a un
antibitico. La mayora de los plsmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que
una primera tarea de la Ingeniera Gentica ha consistido en la construccin de plsmidos artificiales,
combinando en una misma molcula diversos rasgos tiles procedentes de los plsmidos naturales.
La presencia en el plsmido del gen de resistencia a ampicilina, kanamicina o tetracilina permite
seleccionar las bacterias que portan estos plsmidos, gracias a su capacidad para crecer en
presencia de dicho antibitico.
Adicionalmente, hay que considerar que muchos genes se expresan slo bajo ciertas circunstancias
metablicas y/o en tejidos especficos, por lo que usualmente es necesario sustituir el promotor del
donador por uno que asegure su expresin, denominados promotores fuertes, que tambin pueden
ser inducibles bajo ciertas condiciones de crecimiento.
Transformacin
53
Existen varias tcnicas para la introduccin del transgene en la clula u organismo, como son la
microinyeccin, la infeccin de una clula husped con virus que contenga al vector o bacterias. En
este ltimo caso Agrobacterium tumefaciens es capaz de infectar a plantas y producir tumores, el
factor Ti ocasiona los sntomas. Sin embargo, al removerlos e incluir en ese sitio el transgene, se
conduce a la expresin del transgene en la planta. En el caso de la transformacin de bacterias,
generalmente se introduce el DNA extrao por microelectroporacin o por choque trmico.
En el caso del choque trmico, las bacterias que sern las hospederas son pre-tratadas con agentes
que ocasionan el aumento en su permeabilidad membranal como son un aumento en la temperatura,
as como de iones que se encargan de cambiar la carga elctrica de la membrana al recubrir las
cabezas polares de lpidos (por ejemplo con iones Ca
2+
), lo que disminuye la repulsin de cargas
elctricas entre los fosfatos de los nucletidos y la membrana y adems facilita la entrada del
plsmido al interior celular. A las clulas que han recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo
la introduccin de material gentico se denominan clulas competentes.
Posteriormente a la introduccin del material gentico a las clulas competentes, se disminuye la
temperatura y se diluye el calcio, con lo que se permite que se restaure la permeabilidad membranal.
Al colocarlas en una condicin ptima de crecimiento se obtienen las clulas transformantes.
En la prctica utilizaremos el vector recombinante que se muestra en la Figura 5.4, en donde se
encuentra insertado el gen de la |-lactamasa (transgene). Se realizar la transformacin mediante la
tcnica de choque trmico y la resistencia a kanamicina se utilizar como indicador de que las
clulas son transformantes.
Figura 5.4. Vector recombinante pET-TEM-1-ompA-lactamasa. El vector pET24 (Figura 5.3) fue utilizado para la
construccin del vector pET-TEM-1. Se inserto el gen que codifica para la |-lactamasa (transgene) en el sitio de clonacin
mltiple del vector pET24. El transgene, ompA-|lac, contiene la secuencia completa de la protena TEM-1 |-lactamasa.
Para insertarlo se adiciono el sitio de retriccin BamHI y adicionalmente se coloc hacia la regin 5 del gen, a la secuencia
que codifica para la secuencia seal o de trnsito de una protena que se encuentra en la membrana externa de bacterias,
en este caso la ompA. A diferencia de la protena OmpA, la |-lactamasa es una enzima soluble, por lo que la secuencia
seal permitir que la bacteria transformante secrete a la enzima. Recuerda que al transformar a las clulas con el vector
pET-TEM-1-ompA|-lactamasa pET, la resistencia que confiere a las clulas es a Kanamicina ya que contiene un gene que
confiere la resistencia a ese antibitico en particular.
54
Material biolgico
1 tubo de microcentrifuga con 100 L clulas competentes de E. coli por grupo mantenerlas
congeladas hasta su uso.
1 tubo de microcentrifuga con 100 L clulas competentes de E. coli por equipo mantenerlas
congeladas hasta su uso.
Plsmido PET-TEM-1.
Materiales y equipo
2 cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 g/mL)
Tubos de microfuga de 1.5 mL
Varilla de vidrio en forma de L
Recipiente para hielo
Mechero Bunsen
Micropipeta de 100-1000L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L estriles
Material por grupo
Bao de incubacin a 42C
Incubadora con agitacin a 37C
Reactivos
Medio SOC. Medio Luria adicionado con 20 mM Glucosa. 5 mL por grupo.
Las clulas competentes se proporcionarn congeladas. En el apndice se encuentra el protocolo de
preparacin de las clulas competentes.
Preparativos
1. Revisar y/o equilibrar el bao de incubacin a 42C.
2. Colocar el medio SOC a temperatura ambiente.
3. Se sugiere colocar las placas de Agar-LB-Kanamicina en la incubadora a 37C por 30 min
antes del plaqueo.
Transformacin de clulas competentes con el vector PET-TEM-1 por el mtodo de choque
trmico.
1. Tomar un tubo de clulas competentes del congelador y colocarlas directamente en el hielo.
Descongelar las clulas competentes en el hielo (las clulas competentes son muy sensibles a
los cambios de temperatura).
2. Aadir 1 a 5 L (1 a 50 qg) del plsmido a un microtubo que contiene 100 L de clulas
competentes.
3. Mezclar invirtiendo el tubo.
4. Dejar en hielo por 30 minutos.
5. Dar choque trmico a 42C durante 45 segundos NO AGITAR.
6. Agregar 450 L de medio SOC e incubar por 60 minutos a 37C con agitacin (225 a 250
rpm).
7. Si es necesario, concentrar las clulas por centrifugacin a 14,000 rpm por 1 min. Eliminar el
sobrenadante y resuspender el paquete celular en 100 L de medio SOC.
8. Esparcir los 100 L de las bacterias transformadas, en las cajas con el medio de seleccin
(Agar-LB-kanamicina), ayudados con una varilla de vidrio.
55
9. Incubar a 37C por 24 h. Observar crecimiento y guardar la caja a 4C.
10. Como control negativo incubar 100 L de clulas competentes en una caja con LB-
Kanamicina por 24 h a 37C.
11. Calcular la eficiencia de la transformacin para lo cual se necesita conocer la concentracin
del DNA usado para la transformacin, el volumen aadido a la mezcla de transformacin, el
volumen usado para el plaqueo y el nmero de colonias obtenidas.
Cuestionario
1. Qu es un organismo transgnico?
2. Cules son las principales diferencias entre los mtodos de reproduccin asistida y la de
produccin de organismos transgnicos para la produccin de organismos mejorados?
3. Cules son las consideraciones ticas que consideras se deben de tomar en cuenta para
producir los organismos transgnicos?
4. Qu es un vector de clonacin?
5. Cules son los requisitos que debe cumplir un vector de clonacin para ser utilizado para
transformar a un organismo?
6. Da dos ejemplos de tipos de vectores que son usados para la clonacin de fragmentos de
DNA de alto peso molecular?
7. Qu tipo de vector de clonacin es el pET24?
8. Cul es el mtodo de transformacin que se utilizar en la prctica?
9. Describe al menos otros dos mtodos para transformar clulas ya sea de animales, hongos o
plantas.
10. Para realizar la transformacin de clulas adems del vector de clonacin se necesitan las
clulas receptoras, qu tipo de clulas receptoras son las E. coli DH5 y las clulas E.coli
BL21?
11. Cul es el marcador de seleccin de las cepas transformantes y donde se encuentra
codificado?
12. Despus de obtener un organismo transgnico, cules son los cuidados que se deben tener
para su manipulacin o almacenamiento?
Referencias
- Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. Localizacin QP514.2
- Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003 DNA Science. A first course. 2
nd
edition. Cold spring
Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localizacin QH442.
- Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279-
317. QH345 L43
- Seidman C, Brent R. 1998. Introduction of plasmid DNA into cells. Current protocols in protein
science. A.4D.1-A.4D.2.
- Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium
enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance
methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45.
- Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed. Revert, pp.745-773.
- http://www.colvema.org/PDF/amg1.pdf
- http://www.revista.unam.mx/vol.1/num3/art3/
- http://es.geocities.com/picodelobo/transgenesis.html
- http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes
- http://www.sciencegateway.org/tools/transform.htm (determinacin de eficiencia de la
transformacin)
56
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II:
AISLAMIENTO DE PLSMIDOS
Objetivos
Conocer los fundamentos para la purificacin del DNA plasmdico y su separacin del DNA
genmico.
Realizar el aislamiento del DNA plasmdico.
Introduccin
Desde finales de la dcada de los aos 70 del siglo pasado, se desarroll un gran nmero de
mtodos de aislamiento de plsmidos. La mayora tomando en cuenta las diferencias topolgicas
entre los plsmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, as como el tamao de
ambos. Cuando los puentes de hidrgeno entre las cadenas complementarias del DNA del plsmido
circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas
ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente. En contraste, las
cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente. Si una mezcla de plsmido
desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rpidamente ya sea por enfriamiento o al
restaurar el pH neutro de la solucin, la fidelidad de la reasociacin es substancialmente diferente
para ambas macromolculas. La renaturalizacin de los plsmidos circulares es rpida debido a que
las cadenas estn prximas. Mientras que, las molculas lineales de DNA se renaturalizan menos
precisamente, formando redes de DNA o agregados que pueden ser removidos de la suspensin por
centrifugacin. El plsmido permanece en la solucin y puede ser precipitado con alcohol despus de
que el DNA cromosomal ha sido removido.
Material biolgico
Clulas de E. coli transformante obtenidas en la prctica anterior.
Materiales y equipo
Microcentrifuga
Micropipeta de 0.5-10 L
Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 L
Reactivos
Tubo de ensayo de 16X150 mm con 5 mL de medio Luria-Kanamicina (30 g/mL)
Solucin GTE. 50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y EDTA 10 mM pH 8.0.
3 M Acetato de potasio pH 4.8
70% Etanol
Isopropanol
10 N NaOH
10% SDS
Para preparar 500 L de solucin de lisis (0.2 N NaOH y 1% SDS p/v), tomar 10 L de 10 N
NaOH y 50 L 10% SDS, aforar con agua destilada. De preferencia cada equipo deber
hacerla justo antes de usarla.
57
Desarrollo experimental (Figura 5.5)
Trabajo previo
1. Inocular una colonia de las clulas transformadas en 5 mL de medio Luria que contenga
kanamicina a una concentracin de 30 g/mL, e incubar a 37C por 12 h con agitacin
horizontal constante. Colocar los tubos de preferencia en forma diagonal para que se agiten
bien las clulas y haya buen crecimiento.
Obtencin de plsmido por el mtodo de lisis alcalina
2. Tomar la mitad del cultivo y colocarlo en 1 tubo de microfuga de 1.5 mL y centrifugar a 10,000
rpm por 1 min a 4C. Descartar el sobrenadante eliminando totalmente el medio Luria. Repetir
este paso en el mismo tubo dos veces ms.
3. Eliminar el sobrenadante por decantacin.
4. Resuspender el paquete celular en 300 L de solucin GTE fra, agitando en el vrtex. Incubar
a temperatura ambiente por 5 minutos, preparar la solucin de lisis durante este tiempo de
incubacin.
5. Adicionar 300 L de la solucin de lisis. Mezclar suavemente por inversin del tubo.
IMPORTANTE no agitar en el vrtex. Incubar en hielo por 5 min.
6. Agregar 300 L de la solucin fra de acetato de potasio 3 M, pH 4.8 y mezclar suavemente
por inversin del tubo. Incubar en hielo por 5 min.
7. Centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min a 4C.
8. Colocar el sobrenadante en un tubo limpio y adicionarle un volumen igual de isopropanol fro.
9. Incubar por 20 min a -20C.
10. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min, a 4C.
11. Eliminar el sobrenadante y para lavar el DNA aadir 1 mL de etanol al 70% y centrifugar a
12,000 rpm durante 5 min.
12. Remover el sobrenadante por decantacin y eliminar el etanol residual por evaporacin a
temperatura ambiente (aproximadamente 5 a 10 min).
13. Resuspender el DNA en 30 L de agua estril, guardar a 20C.
Nota. Se recomienda cuantificar el DNA por su absorbancia a 260 nm. Obtener los g/mL
considerando que 1unidad de A
260
nm de DNA de doble cadena es igual a 50 g/mL.
58
Repetir a. y b. en el mismo tubo con el resto del cultivo
Clulas transformantes
Inocular Medio LB +
Kanamicina
Incubar a 37
0
C / agitacin durante 12- 16 h
a. Tomar 1.5 mL del cultivo
y centrifugar
b. Eliminar el sobrenadante
Resuspender el paquete celular con sol. GTE fra.
Adicionar sol. de lisis
Agitar e incubar por 1 a 5 min a Tamb
Mezclar por inversin (no agitar).
Incubar en hielo mximo 5 min.
Adicionar sol. de acetato de potasio fra
Mezclar por inversin (no agitar).
Incubar en hielo mximo 5 min.
Centrifugar y tomar el sobrenadante
Adicionar isopropanol (v/v)
Incubar en hielo por 20 min y centrifugar.
Aadir etanol al 70%, agitar en vrtex
Centrifugar
Resuspender el DNA en 30 L de agua estril.
Eliminar sobrenadante por decantacin y
eliminar el etanol residual por evaporacin
Eliminar el sobrenadante
Figura 5.5. Protocolo de obtencin de DNA plasmdico a partir de las clulas
transformantes que se obtuvieron en la prctica anterior.
5 a 10 uL para la cuantificacin Cuantificar cidos nucleicos (relacin Abs260 nm / Abs 280 nm).
59
Cuestionario
1. Cules son las propiedades del DNA plasmdico que nos permiten separarlos del DNA
cromosomal o genmico?
2. Explica por qu se usa NaOH y SDS, acetato de potasio y etanol en la purificacin de
plsmidos.
3. Cules son los principales contaminantes de una preparacin de plsmidos?
4. Cmo los eliminas?
5. Cules son los usos que se le dan a los plsmidos una vez purificados?
6. Cules son los mtodos utilizados para cuantificar a los cidos nucleicos?
7. Qu experimento realizaras para determinar si el plsmido que obtuviste se encuentra puro?
8. Porqu a veces es necesario utilizar RNAasa para visualizar el DNA plasmdico?
9. Busca el factor de conversin de pares de bases a nmero de aminocidos y de nmero de
aminocidos a peso molecular de protena en kDa.
Referencias
- Tmmler B y Mekus F. Genomic DNA: Purification. Encyclopedia of life sciences & 2005,
John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net.
- Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.745-773.
- Watson JD, Gilman M, Witkowski JA, Zoller M. Recombinant DNA. Segunda edicin, WH
Freeman.
60
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II:
ENSAYOS DE RESTRICCIN DE PLSMIDO.
Objetivos
Conocer el principio de separacin y deteccin de cidos nucleicos en geles de agarosa.
Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar cidos nucleicos.
Determinar el tamao de fragmentos de cidos nucleicos separados en geles de agarosa.
Conocer la utilidad de las enzimas de restriccin en la transformacin gentica y la
biotecnologa.
Introduccin
Las endonucleasas de restriccin se caracterizan por su habilidad de reconocer una secuencia
usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla especficamente en ambas cadenas de la
molcula de DNA. Existen tres tipos de endonucleasas, las de tipo II son las que se utilizan en
biologa molecular, debido a que son capaces de cortar sobre la secuencia que reconocen y a que
han perdido su capacidad de ser metilasas de DNA. Las endonucleasas se denominan enzimas de
restriccin, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasin por
bacteriofagos, es decir, restringen la invasin por el DNA viral.
Las enzimas de restriccin generalmente reconocen secuencias palindrmicas, es decir segmentos
de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha. Algunas enzimas de
restriccin (EcoRI, HindIII) rompen las dos cadenas del DNA en posiciones no simtricas del centro
del palndrome y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena,
denominados extremos cohesivos. Mientras que otras enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre
los dos ejes de simetra, produciendo extremos romos (Figura 5.6).
EcoRI HindIII HaeIII
Figura 5.6. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restriccin en una secuencia de DNA.
Las dos primeras enzimas EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se
muestra y en el ltimo ejemplo, HaeIII produce fragmentos de DNA con extremos romos. Las
primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del gnero y especie de la bacteria de donde
se aisl y se escribe en itlicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de
Escherichia coli.
Las enzimas de restriccin son una herramienta experimental muy importante en el desarrollo de las
tcnicas para el anlisis y la manipulacin de los cidos nucleicos. Han sido utilizadas en la
eliminacin de secuencias genmicas desde un nucletido hasta cientos de bases, as como en la
introduccin de secuencias distintas a un genoma, lo que ha permitido la produccin de protenas
recombinantes.
Diferentes factores afectan la reaccin de restriccin por endonucleasas. Se inhiben usualmente con
los contaminantes que se pueden encontrar en las preparaciones de DNA, tales como otras
protenas, el fenol, el cloroformo, el etanol, el EDTA, el SDS y la alta concentracin de sales. Los
61
efectos de la contaminacin pueden disminuir si se aumenta la cantidad de enzima aadida a la
reaccin, arriba de 10 a 20 U /g DNA, incrementando el volumen de reaccin, lo que diluye a los
inhibidores potenciales, o aumentando la duracin de la incubacin. La digestin del DNA genmico
puede facilitarse por la adicin de policationes como espermidina, la cual acta uniendo
contaminantes cargados negativamente. Cuando un plsmido est superenrollado es necesario
aadir ms enzima o bien desnaturalizarlo.
El tratamiento de una molcula de DNA con enzimas de restriccin permite producir fragmentos
definidos que pueden ser separados mediante electroforesis horizontal. En soluciones alcalinas, los
fosfatos de los nucletidos se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo
elctrico, estas molculas migran hacia el electrodo positivo o nodo. Cuando la migracin toma lugar
en un gel, las molculas de DNA se separan de acuerdo a su tamao, en donde las molculas
pequeas se mueven ms rpidamente a travs del poro del gel que las ms grandes.
Generalmente, un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de restriccin.
Si un fragmento de DNA a analizar es lo suficientemente extenso, se puede cortar con una o varias
enzimas de restriccin, de manera individual o en mezclas. Un diagrama de una molcula de DNA en
donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restriccin se denomina mapa de restriccin.
El anlisis de los mapas de restriccin constituyen una importante herramienta para localizar
secuencias de bases especficas en un cromosoma y para estimar el grado de diferencias entre
cromosomas relacionados.
Existen varias aplicaciones de los mapas de restriccin, como la obtencin de los patrones de RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism) utilizados en las pruebas de paternidad, as como
tambin en la identificacin de individuos a partir de evidencias forenses como saliva, sangre, semen,
cabellos etc.
En la prctica se utilizarn dos enzimas de restriccin en una mezcla, debido a que el vector utilizado
en la transformacin no presenta dos sitios de restriccin para la misma enzima (Figuras 5.3 y 5.4).
De tal manera que slo se podr liberar el fragmento de DNA de inters al cortar por los extremos con
dos enzimas distintas.
Material biolgico
DNA plasmdico purificado de la prctica anterior.
Materiales y equipo
Gradilla para tubos de microfuga
Recipientes para teir el gel.
Micropipeta de 0.5-10 L
Cmara de electroforesis horizontal
Fuente de poder
Vrtex
Horno de microondas
Microfuga
Bao de incubacin a 37C
Bao de incubacin o bloque de calentamiento a 100C
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Transiluminador
Pantalla de acrlico
Cmara fotogrfica
Reactivos
NdeI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a 20C.
BamHI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a 20C.
NOTA. Las enzimas de restriccin son muy sensibles a la temperatura mantenerlas en fro
durante su manipulacin.
Amortiguador TANGO de restriccin. Reactivo que es proporcionado por el proveedor junto
con la enzima NdeI.
TAE 1X. Ver preparacin en el apndice.
Agarosa
Amortiguador de muestra
Estndar de peso molecular. Proporcionado por el laboratorio, se utilizar de acuerdo a las
instrucciones del proveedor.
Bromuro de etidio 10 mg/mL (GIBCO BRL)
Ensayo de restriccin
1. Etiquetar dos tubos de microfuga.
2. Colocar en cada tubo los siguientes reactivos: 10 L de Plsmido y 1 L de Amortiguador
Tango10X
3. Incubar a 100C por 5 min.
4. Transferir al recipiente con hielo e incubar por 5 min.
5. Pasado el tiempo de incubacin aadir al tubo 1 solo una de las dos enzimas de restriccin
que fueron proporcionadas, se sugiere que un par de equipos coloque 1 L BamHI y otro par
de equipos 1 L NdeI. Mezclar suavemente despus de aadir la enzima.
6. Al tubo 2 aadir 1 L de BamHI y 1L de NdeI. Mezclar suavemente con ligeros golpes al
tubo de microfuga.
7. Centrifugar los dos tubos de microfuga por 5 segundos, para que todo el lquido se deposite
en el fondo.
8. Incubar a 37C por 1.5 h.
9. Se sugiere aadir 0,5 l de una solucin de RNasa (1 g/ml) e incubar 30 min a 37C. Este
procedimiento eliminar el RNA y facilitar la visualizacin de los productos de la restriccin
en el gel. Otra opcin para la eliminacin de la RNAasa es aadir 2 l de la solucin de RNA
a los 35 mL de gel poco antes de vaciarlo a la cmara de electroforesis.
10. Al trmino de la incubacin colocar los tubos en hielo.
11. Tomar una alcuota de 10L o todo el ensayo de restriccin de cada tubo para correr en un gel
de agarosa.
Preparacin del gel
Durante el tiempo de incubacin del DNA con las enzimas de restriccin, preparar el gel de agarosa,
se sugiere utilizar 1 gel por cada 2 equipos y utilizar el peine para hacer 8 pozos o carriles en el gel.
Sellar con cinta adhesiva el contorno de la bandeja del gel, colocar el peine (Figura 5.7 A).
Preparar un gel de agarosa al 1.2%. Pesar 0.42 g agarosa en un matraz Erlenmeyer, aadir 35 mL de
amortiguador TAE 1X, tapar con algodn o una servitoalla. Se calienta la mezcla en microondas por 1
a 3 min o hasta que la agarosa se disuelva bien.
Esperar a que la temperatura baje hasta 45-60C, aadir entonces 2 L bromuro de etidio
(MANEJAR CON GUANTES, REACTIVO MUTAGNICO) para obtener una concentracin final de
0.5 g/mL, agitar el matraz para mezclar.
63
Depositar el gel en la bandeja de la cmara (Figura 5.7 B), evitando la formacin de burbujas. Se deja
enfriar hasta que polimerice (aproximadamente 20 min).
Quitar la cinta adhesiva y colocar la bandeja con el gel en la cmara de electroforesis.
Aadir el amortiguador TAE en la cmara. La cmara de electroforesis se llena con aproximadamente
275 mL de TAE 1X o hasta que se cubran los pozos.
Figura 5.7. Preparacin de un gel de agarosa. A. Sellado de la bandeja que contendr el gel y
B. Adicin de la agarosa disuelta en TBE.
Preparacin y cargado de las muestras.
1. Etiquetar 4 tubos de microfuga: E, P, R1, R2
2. Aadir los reactivos como se indica en la tabla 5.1. Usar una punta de micropipeta distinta
para cada tubo, de esta manera se evita la contaminacin cruzada.
Tabla 5.1. Preparacin de muestras para aplicar en el gel de agarosa.
Reactivos Estndar*
(E)
Plsmido sin
digerir
(P)
Plsmido digerido
con una enzima
(R1)
Plsmido digerido
con dos enzimas
(R2)
Muestra 1 L DNA-HindIII 10 L 10 L 10 L
H2O 9 L
Amortiguador de
muestra
2 L (Stop Mix) 3 L 3 L 3 L
El estndar que se usa en el laboratorio lambda DNA digerido con HindIII puede calentarse a 65C por 10
min para separar las bandas de 23130 y 4361. Los pesos moleculares que deben encontrarse en el carril del
estndar son 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027 y 564 pb.
3. Centrifugar por 3 segundos en microfuga, para que se mezcle y deposite el lquido en el
fondo.
4. Se retira el peine de la bandeja. Muy importante, los pozos del gel tienen que estar
orientados hacia el ctodo, generalmente el electrodo se presenta de color negro. Nota:
Procurar colocar la cmara de electroforesis en hielo para evitar que la temperatura se
incremente durante la corrida del gel.
5. Se toman los 13 L de cada una de las muestras y se colocan en los pozos como se muestra
en la Figura.
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Figura 5.8. Cargado de la muestras en los pozos del gel de agarosa.
6. Una vez depositadas las muestras, se coloca la tapa con los electrodos (rojo con rojo y negro
con negro) y se conecta a la corriente. Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que las muestras
migren hacia el lado positivo de la cmara.
7. Al concluir la electroforesis se desconecta el equipo y se retira la bandeja para la observacin
de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado sobre una lmpara de
luz UV para visualizar las bandas de DNA. La radiacin ultravioleta es peligrosa, usar lentes
especiales o colocar una pantalla de acrlico entre el observador y la fuente de luz UV.
8. Tomar la foto del gel. Posteriormente desechar el gel en el recipiente colocado para ese
propsito, los geles sern incinerados, junto con los guantes y puntas si es que estuvieron en
contacto con el bromuro de etidio.
9. Utilizando la foto, medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las bandas de
DNA detectadas. Estimar el tamao aproximado de cada uno de los fragmentos de DNA as
como del vector sin restringir, utilizar para ello los valores del estndar de peso molecular que
se proporcionaran durante la prctica. Llenar la siguiente tabla 5.2.
Tabla 5.2. Valores estimados de peso molecular de las bandas de DNA que se detectaron en las muestras
analizadas.
Estndar de DNA Plsmido sin restringir Plsmido restringido
con 1 enzima de
restriccin
Plsmido restringido
con 2 enzimas de
restriccin
Bandas
Distancia
en mm
Pares de
bases
Distancia
en mm
Pares de
bases
estimado
Distancia
en mm
Pares de
bases
estimado
Distancia
en mm
Pares de
bases
estimado
1
2
3
4
5
6
7
10. Analizar los resultados.
Cuestionario
1. Qu parte de la molcula de DNA le confiere la carga negativa?
2. Cul es el papel de cada componente del amortiguador de carga, en particular de los dos
colorantes que contiene?
3. A que se le denomina topoismeros?
4. En la prctica se pudieron observar topoismeros?
5. Qu peso molecular tienen los topoismeros?
65
6. Qu tipo de extremos producen las enzimas utilizadas en la prctica, romos o cohesivos?
7. Cuntos fragmentos de DNA o restriccin se obtuvieron al utilizar las dos enzimas NdeI y
BamH1?
8. Cuntos fragmentos se obtuvieron al utilizar slo una de las enzimas de restriccin? Por
qu?
9. Cul fue el peso molecular del DNA liberado y del plsmido o vector?
10. Cules son las aplicaciones de rutina de las enzimas de restriccin?
Referencias
- Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. QP514.2
- Kenneth D. Digestion of DNA with Restriction Endonucleases. Current Protocols in Protein
Science (1998) A.4I.1-A.4I.3.
- Mitsis P, Exonucleases. Encyclopedia of life sciences 2001, John Wiley & Sons, Ltd.
www.els.net.
- Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003. DNA Science. A first course. 2
nd
edition. Cold spring
Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localizacin QH442
- Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279-
317. Localizacin QH345 L43
- Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold
spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA.
- Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da.
Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp848-914.
66
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: INDUCCIN DE
PROTENA RECOMBINANTE.
Objetivos
Conocer el fundamento de la induccin de la sntesis de protenas recombinantes en E. coli.
Realizar la induccin de una protena recombinante (|-lactamasa)
Obtener la curva temporal de induccin de una protena recombinante.
Interpretar el patrn electrofortico de produccin de una protena recombinante
Conocer las aplicaciones biotecnolgicas de las protenas recombinantes
Introduccin
La necesidad de producir protenas heterlogas o recombinantes para varias aplicaciones cientficas
como comerciales ha influido en el desarrollo de diversas herramientas para purificar y manipular
protenas. Los sistemas bacterianos han sido los sistemas ms utilizados para este fin, debido a que
son fcilmente manipulables genticamente, se propagan en periodos de tiempo corto, son
econmicos y se requiere slo un entrenamiento mnimo para su manejo. Adems, muchas de las
caractersticas inherentes a los sistemas bacterianos permiten que los sistemas se automaticen en
proyectos de produccin a gran escala, donde se requiere la produccin y muestreo de cientos de
clonas.
A pesar de lo anterior, los sistemas bacterianos tienen sus limitantes, las protenas de eucariotes o
las protenas de membrana, generalmente no se expresan o no son funcionales. El carcter qumico
del citoplasma de las bacterias y de sus chaperonas, as como las enzimas que se encargan de las
modificaciones post-transduccionales son muy diferentes entre los organismos eucariotes. Por
ejemplo, los sistemas de expresin de bacterias no glicosilan a las protenas. Otros sistemas de
expresin como los sistemas de clulas de mamfero o de insecto o levadura, tienen la capacidad de
procesar las protenas eucariotes de manera correcta y son utilizados cuando la funcionalidad de las
protenas es crtica, aunque el costo de stos sistemas es considerablemente ms alto y la tecnologa
que se necesita es ms complicada. Adicionalmente, la produccin de grandes cantidades de
protenas como algunos productos teraputicos, se pueden lograr tanto en plantas como en sistemas
animales.
Muchas compaas ofrecen una serie de diferentes vectores con capacidades de expresin muy
variadas, con o sin protenas de fusin que funcionan como etiquetas para la deteccin y/o
purificacin de la protena deseada. La presencia de marcadores selectivos de la cepa transformante
y con promotores distintos. Los vectores de expresin como el pET son usados comnmente para la
expresin de protenas heterlogas.
En los sistemas pET, los plsmidos son clonados bajo las seales de expresin fuerte del
bacteriofago T7, la expresin de la protena es inducida cuando la clula hospedera provee una
cantidad de RNA polimerasa T7. En unas pocas horas de induccin, la formacin del producto puede
llegar a ser ms del 50% de la protena total en la clula. Otro beneficio importante es que en
ausencia del inductor la transcripcin del transgene no se lleva a cabo. Adicionalmente, los sistemas
pET cuentan con una copia del gen cromosomal de la RNA polimerasa T7 bajo el control del operador
de la lactosa, sistema que se estudiar con ms detalle en el siguiente protocolo experimental del
curso. Basta mencionar ahora, que para que se exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a
cabo la expresin de nuestra protena de inters, se tiene que introducir lactosa o un anlogo de sta,
el ms utilizado es el Isopropil-D tiogalactosido (IPTG), anlogo no hidrolizable de la lactosa que
sirve como un inductor artificial o gratuito del opern de la lactosa.
La produccin de la protena recombinante en una organismo no relacionado, como se mencion
anteriormente, puede llevar a que la protena no sea funcional, ya sea porque no presenta las
67
modificaciones postraduccionales necesarias o bien porque adquiri un plegamiento inadecuado.
Cuando las protenas se aglomeran formando agregados que slo pueden solubilizarse a travs del
uso de soluciones de detergentes, se dice que estn formando cuerpos de inclusin. Una protena
que no se encuentra soluble aumenta los costos en su produccin y/o recuperacin.
En la prctica se llevar a cabo el monitoreo de la induccin de la |-lactamasa, en clulas completas
de E. coli transformadas con el vector pET-TEM-1-ompA-lactamasa (Figura 5.4), vector que fue
producido a partir del vector pET-24a-d(+) que se mostr en la Figura 5.3.
Material biolgico por grupo
1 matraz de 150 mL con 25 mL cultivo lquido saturado de clulas transformadas de E. coli (crecidas
por 12 a 16 horas con agitacin vigorosa).
Material y equipo
1 mechero
1 recipiente para hielo
2 vasos de precipitados 25 mL
1 Pipeta Pasteur con bulbo
Recipiente de plstico para la tincin.
Placas de vidrio
Peine
Separadores
Pinzas para sujetar las placas
Cmara para electroforesis
Fuente de poder
Vrtex
Incubadora a 37C con agitacin
Cmara fotogrfica
Reactivos
1 tubo de 50 mL con 15 mL de medio LB-kanamicina (30 g/mL)
100 mM IPTG
Estndar de peso molecular de protenas
8 mL de LB por grupo para ajustar a cero el espectrofotmetro.
Induccin de protena recombinante, -lactamasa (Figura 5.8).
1. Tomar 2.5 mL de un cultivo saturado de clulas de E. coli transformadas con el vector PET-
TEM-1-ompA-lactamasa, y aadirlos a 15 mL de medio LB-kanamicina, tomar una alquota
de 1 mL y leerla en el espectrofotmetro a 600 qm contra un blanco de medio Luria la
absorbancia debe ser menor a 0.3, incubarlos con agitacin vigorosa a 37C (colocarlos en
posicin diagonal para que se mezcle bien el medio). El cultivo celular debe llegar a una
absorbancia entre 0.6 a 0.8.
68
2. Para verificar que se lleg a la absorbancia indicada, tomar una alquota de 1 mL y leerla en el
espectrofotmetro a 600 qm contra un blanco de medio Luria. Si an no llega volver a incubar
el matraz con agitacin vigorosa.
3. Al llegar a la absorbancia apropiada, tomar una alcuota a la que llamaremos tiempo 0
(mantener en hielo el tubo de microfuga).
4.
5. Despus agregar el IPTG para tener una concentracin final en el tubo de 0.5 mM. El volumen
del medio con clulas puede variar, dependiendo del nmero de alcuotas que se hayan
tomado para determinar que la absorbancia corresponde a 0.6-0.8. Hacer el clculo tomando
en cuenta el volumen final de medio con clulas.
6. Incubar nuevamente a 37C con agitacin horizontal y tomar alcuotas de 1 mL cada 30 min
por 1.5 o 2 h.
7. Guardar todas las alcuotas en tubos de microfuga y a 4C.
Preparacin de un gel de poliacrilamida-SDS
Durante el tiempo de incubacin e induccin de la protena recombinante, preparar un gel de
poliacrilamida-SDS por cada dos equipos, utilizar un peine que genera 10 carriles o pozos. Las
instrucciones de elaboracin se encuentran en la seccin II, parte III del manual.
Preparacin de las muestras y separacin en un gel de poliacrilamida-SDS
1. Directamente de cada una de las alcuotas que fueron recolectadas se toman 15 L y se
mezclan con 10 L de amortiguador de muestra en un tubo de microfuga. Tambin hacer una
mezcla apropiada de estndares de peso molecular, se sugiere 7 L de los estndares de
peso molecular ms 18 L de amortiguador de muestra.
2. Ensamblar el gel en la cmara de electroforesis.
3. Aplicar las muestras en el gel.
4. Iniciar la electroforesis aplicando una corriente de 10 a 15 mA y hasta que el frente del
colorante haya entrado en el gel separador. Despus incrementar el amperaje a 25 mA,
siempre y cuando no se caliente el gel.
5. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del gel.
6. Enseguida el gel se desprende de las placas y se realiza la tincin depositando el gel en una
charola que contenga solucin teidora y colocando la bandeja en agitacin constante.
7. Decantar la solucin teidora, lavar el exceso con H
2
O destilada y aadir la solucin
desteidora. Poner a agitar suavemente.
8. Tomar la foto del gel.
9. Analizar los resultados. La protena tiene un peso molecular aproximado de 32 kDa si tiene el
pptido seal de la protena ompA y de 29 kDa sin pptido seal.
69
Clulas del cultivo saturado
Incubar a 37
0
C / agitacin vigorosa
durante 2 h
Incubar a 37
0
C / agitacin.
Tomar una alcuota cada 30 min
1 mL
t = 30 min
Medio LB-kanamicina
1.5 ml
Leer a 600 qm.
hasta obtener 0.6-0.8 Abs.
Agregar__________L 100mM IPTG
(concentracin final 0.5 mM)
1 mL
t = 60 min
1 mL
t = 90 min
Aplicar 4 de las fracciones a un gel de poliacrilamida-SDS.
t = 0
Figura 5.8. Proceso de induccin de protena recombinante en E. coli.
1 mL
t = 0
1 mL
t = 120 min
Elegir entre incubar
hasta 90 o 120 min,
ya que slo hay 5
pozos
disponibles/equipo.
RECORDAR QUE
uno de los pozos
contendr al estndar
de peso molecular.
70
Cuestionario
1. Qu es una protena recombinante?
2. Por qu el cultivo de clulas debe de llegar a una densidad ptica de 0.6 a 0.8 antes de
comenzar el proceso de induccin de la protena recombinante?
3. Cul es la funcin del IPTG?
4. Cul fue el tiempo en el que produjo la mxima cantidad de protena recombinante?
5. Qu otros parmetros se podran modificar para obtener el mayor rendimiento de la
protena?
6. Qu son los cuerpos de inclusin?
7. Qu experimento realizaras para determinar si la protena se encuentra en forma soluble o
en forma agregada?
8. Qu mtodo propondra para purificar a la protena recombinante obtenida?
9. Describe tres ejemplos de protenas recombinantes que se producen actualmente de manera
comercial, explicando sus usos.
Referencias
- Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning
vectors in Escherichia coli. The EMBO Journal 3, 2437-2442.
- Hammlev D, Madden D, Nrby S, Turner J. Unit 2. DNA profiling. European initiative for
biotechnology education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE.
- LaVallie E. 1995. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Current Protocols in
Protein Science 5.1.1-5.1.8.
- Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold
spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA.
- Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium
enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance
methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45.
- Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da.
71
6. REGULACIN DEL METABOLISMO
PARTE I: REGULACIN GENTICA EN EL OPERN lac
Objetivos
- Comprender la importancia de la regulacin gentica como mecanismo para controlar los
niveles de enzimas en la clula.
- Conocer los elementos que integran el opern de la lactosa.
- Entender el funcionamiento del opern de la lactosa en presencia y ausencia de este
carbohidrato.
- Conocer el concepto de represin catablica y cmo se lleva a cabo.
Introduccin
La regulacin metablica es el incremento o el decremento de una reaccin enzimtica o de toda una
secuencia de reacciones enzimticas de las rutas metablicas. Esto surge de la necesidad de la
clula de estar en equilibrio normal, distinto al equilibrio que tiene en un estado de enfermedad.
La clula logra el equilibrio entre sus reacciones enzimticas, a travs, principalmente, de la
modificacin de la actividad simultnea de sus enzimas presentes. Dado que el nmero de enzimas
es alto, lo logra a travs de algunos mecanismos globales de regulacin metablica.
Una de las modalidades de regulacin es la que involucra la expresin diferencial en aumento o
disminucin de la concentracin de enzima, la regulacin de la expresin gentica.
El DNA de una clula puede contener miles de genes dependiendo de su complejidad. Sin embargo,
slo una parte de esta conformacin gentica es requerida por la clula en todo momento (expresin
constitutiva). Adems, existen genes con una funcin ms especializada y cuya participacin slo es
requerida por la clula bajo ciertas circunstancias. Por ello, todos los organismos son capaces de
regular la expresin de sus genes. En el caso de las bacterias, la regulacin de la expresin gentica
les permite responder metablicamente a los cambios en su ambiente de manera rpida y precisa.
Las bases de nuestro entendimiento sobre la regulacin de la expresin gnica en bacterias fueron
propuestas por Francois Jacob y Jacques Monod en 1961. Ambos, junto con Andr Lwoff,
compartieron el Premio Nobel de 1965 por su teora del opern.
El opern de la lactosa est formado por los genes estructurales lacZ, lacY y lacA, que codifican
para las enzimas |-galactosidasa, permeasa y transcetilasa respectivamente. Todos ellos se
transcriben en una molcula de RNA mensajero (RNA policistrnico), a partir de un promotor
localizado ro arriba de lacZ. Tambin descubrieron el gen lacI, que no se encuentra adyacente al
opern, pero cuyo producto proteico es un represor que se une al operador, localizado entre el
promotor y lacZ. De hecho, el operador y el promotor estn traslapados, de manera que cuando el
represor esta unido al operador la RNA polimerasa no puede unirse al promotor y por lo tanto no hay
transcripcin de los genes estructurales.
Cuando hay lactosa presente, la bacteria toma unas pocas molculas de ellas y las convierte en
alolactosa que es capaz de unirse al represor, impidiendo que ste se pegue al operador. La
subsecuente unin de la RNA polimerasa al promotor ocasiona la transcripcin de los genes
estructurales y la posterior traduccin en las enzimas necesarias para la utilizacin de la lactosa como
fuente de carbono y energa. Cuando se termina la lactosa, el represor se vuelve a unir al operador
bloqueando la expresin de los genes estructurales.
72
La presencia o ausencia de la lactosa no es el nico factor que influye sobre la expresin del opern
de la lactosa. Si la clula tiene una fuente de glucosa suficiente para sus requerimientos energticos,
no necesita metabolizar lactosa an cuando est presente. El proceso por el cual esto ocurre se
denomina represin catablica e involucra una segunda protena reguladora, CAP (protena
activadora de catabolito), y un segundo sitio de unin, el sitio CAP, adyacente al promotor.
La CAP se une al sitio CAP slo en presencia de AMP cclico (AMPc), un nucletido modificado
derivado del ATP por la adenilato ciclasa. La cantidad de AMPc en la clula depende de la
concentracin de glucosa, y por ende de ATP, que inhibe a la adenilato ciclasa. Si los niveles de
glucosa son altos (nivel de ATP alto) hay poco AMPc y si son bajos hay mucho AMPc (niveles de ATP
bajos). Al controlar la cantidad de AMPc en la clula, la glucosa indirectamente regula la unin del
complejo CAP-AMPc al sitio CAP. Esto es muy importante porque cuando el complejo CAP-AMPc
est unido, se estimula la unin de la RNA polimerasa al promotor (regulacin positiva), lo que
ocasiona la transcripcin de los genes estructurales del opern de lactosa.
Material biolgico
Cultivo de E. coli W3110 en medio M9-glicerol.
Material y equipo de laboratorio
5 Tubos para microfuga de 1.5 mL (estriles)
1 gradilla para microtubos
1 mechero
1 Micropipeta con capacidad de 200-1000 L
1 Micropipeta con capacidad de 50-200 L
1 Micropipeta con capacidad de 10 a 50 L
1 Caja de puntas para micropipeta de 200 L
1 Caja de puntas para micropipeta de 1000 L
Centrfuga clnica
Incubadora a 37C
Reactivos
1 tubo con medio M9-glicerol estril
Solucin de glucosa al 2% estril
Solucin de lactosa al 2% estril
Solucin de glucosa 2% + lactosa 2% estril
Amortiguador Z (Na
2
HPO
4
-7H
2
O 60 mM, NaH
2
PO
4
-H
2
O 40 mM, KCl 10 mM, MgSO
4
-7H
2
O
1mM, |-mercaptoetanol 50 mM, pH 7.0).
Reactivo ONPG (Orto-Nitrofenil Galactosa). El reactivo es incoloro y debe prepararse justo
antes de usarse para mejores resultados.
SDS al 0.1%
Na
2
CO
3
1M
Cloroformo
Desarrollo de la prctica (Figura 6.1)
Slo los pasos 1 al 4 requieren condiciones de esterilidad.
1. Coloca 1 mL del cultivo de E.coli W3110 en cada uno de los 4 microtubos estriles y rotlalos
de la A a la D. El tubo E no contendr clulas pero si 1 mL de medio M9-glicerol como E
(blanco).
2. Aadir a cada tubo lo siguiente:
Tubo A 250 L de glucosa 2%
73
Tubo B 250 L de lactosa 2%
Tubo C 250 L de glucosa 2% + lactosa 2%
Tubo D 250 L de glucosa 2%
Tubo E 250 L de glucosa 2% + lactosa 2%
3. Incubar los tubos a 37C con agitacin ocasional. A los 7.5 minutos de incubacin aadir,
nicamente al tubo D, 250 L de lactosa 2% y reintegrarlo a la incubadora a 37C.
4. Cuando hayan transcurrido 15 minutos de incubacin, centrifugar los microtubos en la
Microfuga durante a 10,000 rpm 1 minuto..
5. Decantar y resuspender cada paquete celular en 250 L de amortiguador Z.
6. Aadir a cada tubo 25 L de cloroformo y 12.5 L de SDS 0.1%. Agitar durante 10 segundos.
7. Aadir a cada tubo 50 L de reactivo ONPG y agitar.
8. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos o hasta el desarrollo de color amarillo.
Nota: monitorear la aparicin del color amarillo y no dejar que el color se iguale en
todos los tubos.
9. Parar la reaccin con 125 L de Na
2
CO
3
1M.
10. Anotar que tubos desarrollan color amarillo y con qu intensidad.
11. Para un resultado cuantitativo se puede leer la absorbencia de la solucin a 420 nm.
12. Analizar y reportar los resultados obtenidos.
74

Colocar 1 mL / Tubo
Cultivo E. coli
Incubar a 37
0
C / 15 min
(*A los 7.5 min de incubacin aadir 250 L de lactosa 2% al tubo D)
Centrifugar a 10,000 rpm / 1 min
Decantar el sobrenadante
Resuspender el paquete celular en 250 L
amortiguador Z
Aadir 25 L de CHCl3 + 12.5 L SDS 0.1%
Agitar suavemente 10 seg
Aadir 50 L de reactivo ONPG
Agitar
Incubar a Tamb / 2 min
Aadir 125 L Na2CO3 1 M
Observar la intensidad de color amarillo o leer la Abs 420 nm
Figura 6.1. Protocolo de induccin
de expresin de los genes
involucrados en la utilizacin de
lactosa
250 L 250 L 250 L 250 L 250 L
Glucosa 2% Lactosa 2% Glucosa 2% Glucosa 2% Glucosa 2%
Lactosa 2% Lactosa 2%
75
Cuestionario
1. Qu es la regulacin gentica?
2. Cules son las diferencias entre la expresin gentica constitutiva, la inducible y la
represible?
3. Cmo funcionan los mecanismos de control positivos de la expresin gentica?
4. Cmo funcionan los mecanismos de control negativos de la expresin gentica?
5. Qu son un activador y un inductor?
6. Qu son un represor y un co-represor?
7. Qu es un opern y cules son sus componentes?
8. Cul es la estructura del opern de lactosa de E.coli?
9. Cmo funciona este opern en ausencia y en presencia de lactosa?
10. Qu es la represin catablica y como se ejerce este proceso sobre el opern de
lactosa?
11. Por qu la bacteria utilizada en la prctica fue cultivada inicialmente en medio M9-
glicerol?
12. Para qu se utiliza cada reactivo de la prctica?
13. Explique que ocurre en los tubos A-E en la prctica.
14. Qu reaccin es responsable del color amarillo observado en los tubos?
15. Qu ocurrira si a los tubos B y C se agregara ATP?
16. Cul ser el fenotipo en ausencia y en presencia de lactosa de cada uno de los
siguientes mutantes del opern lac: i
-
, i
s
, z
-
, y
-
, a
-
, p
-
, y o
c
? Explique por qu.
17. Qu diferencias existen en la regulacin de una va metablica como la de la
degradacin de la lactosa y una va anablica, como la de la sntesis de triptfano?
18. Qu importancia tiene la regulacin de la expresin gentica en procariontes?
19. Cules son las principales diferencias en la regulacin gentica entre procariontes y
eucariontes?
20. Qu aplicaciones tienen en su prctica profesional o en su vida cotidiana los
conceptos adquiridos al realizar esta prctica?
Referencias
- Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Regulation of gene
expression. Ed John Wiley & Sons, INC, New York, 1997. Pp. 20-52. Localizacin
QP514.2
- Gardner JE. Garder E. Principios de gentica. 1998, 4a edition Ed. Limusa, pp. 390-
407. Localizacin QH581.2 M 65
- Gentica General. Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en el
opern lac. Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002.
- Klug SW, Cummings RM. Conceptos de gentica. Ed. Prentice Hall. Madrid 1999. Pp.
51-71.
- Lodish H, Molecular Cell Biology, 2003, Ed. Freeman and company, pp. 115-125.
Localizacin QH581.2 M 65
- Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.868-873.
76
PARTE II: REGULACIN HORMONAL DEL METABOLISMO DE LA
GLUCOSA
Objetivos
- Conocer la definicin de hormonas.
- Conocer que las hormonas participan en la regulacin del metabolismo.
- Conocer los mecanismos de accin y transduccin de la seal por insulina: activacin de
protenas cinasas y de protenas involucradas en transporte y metabolismo.
- Manejar un modelo experimental animal para medir el efecto de insulina sobre la toma de
glucosa por diferentes tejidos.
- Analizar el efecto de un inhibidor de la cascada de transduccin de seales en el transporte de
glucosa.
Introduccin
Los seres vivos coordinamos los eventos intracelulares a travs de complejos sistemas de seales
qumicas. La comunicacin intracelular mantiene la sntesis o modifica la concentracin de una gran
variedad de molculas, por tanto controla la actividad de las vas metablicas. Las hormonas, los
factores de crecimiento y los neurotransmisores, son las seales qumicas que alteran o regulan la
actividad celular. Una gran variedad de molculas mensajeras (primeros mensajeros) no entran a la
clula para iniciar sus acciones biolgicas, sino que interaccionan con diferentes receptores en la
superficie de stas. La unin de los ligandos con sus receptores induce un cambio conformacional en
el receptor que lo convierte en una forma activa, capaz de interaccionar directa o indirectamente
sobre diversas molculas, tales como factores de acoplamiento. La asociacin con otras protenas
activan o inhiben una cascada de sucesos moleculares (proceso de transduccin de seales) que
llevan a una respuesta biolgica especfica y determinada de acuerdo al ligando que se uni al
receptor.
La insulina es una hormona polipeptdica que al interaccionar con su receptor estimula una compleja
cascada intracelular de eventos dependientes de la fosforilacin o defosforilacin especfica de
protenas y culmina con una variada respuesta celular. Ocurren cuatro cambios principales por la
presencia de la insulina: la activacin del receptor, el control del transporte de la glucosa, la
estimulacin del metabolismo como la gluclisis y el almacenamiento de lpidos y la regulacin de la
transcripcin de genes.
La insulina tiene un papel importante en la regulacin de la homeostasis de la glucosa en sangre,
debido a que incrementa el transporte y utilizacin (metabolismo) de glucosa en ciertos tejidos. La
insulina incrementa la toma de la glucosa en las clulas de msculo y de tejido adiposo de
mamferos. La principal causa es la movilizacin del transportador de glucosa, GLUT4, desde el
interior celular hacia la membrana celular. El incremento en molculas de GLUT4 en la membrana
plasmtica causa un incremento de 10 a 40 veces en la toma de glucosa.
El mecanismo que lleva a la translocacin de GLUT4 hacia la membrana celular no se ha descrito
totalmente, pero se conoce que una vez que la insulina se une a su receptor, ste se autofosforila en
un residuo de tirosina, lo que desencadena la fosforilacin de protenas como IRS-1 y Shc, las cuales
se asocian a protenas que contienen residuos -SH
2
(Cys) como p85, SYP o GRb. La formacin del
complejo IR-1-p85 activa a una cinasa denominada PI3 cinasa, protena clave involucrada en la
movilizacin hacia la superficie celular de las vesculas de membrana que contienen al transportador
GLUT4 (Figura 6.2).
77
Figura 6.2. Va de transduccin de seales por insulina. P, residuos de tyr fosforilados; GSK-3, glucgeno
sintasa cinasa-3; PP1, protena fosfatasa tipo 1; GluT, transportador de glucosa; PI3-K, fosfatidil inositol 3-cinasa
subunidad cataltica; p85, PI3-K subunidad regulatoria; PKB, protena cinasa B; IRS, substrato del receptor de
insulina; MAPK, protena cinasa activada por mitgenos. Las vas conocidas se muestran con lneas continuas y
las vas que an no se demuestran pero que podran encontrarse relacionadas a insulina se indican con lneas
discontinuas. Tomado de Bradey y Saltiel, 2001.
Una de los enfoques experimentales que ha ayudado a encontrar los blancos moleculares de la
accin de insulina y as describir la va de transduccin de seales implicada, es el uso de
inhibidores de protenas cinasas o fosfatasas. Existen inhibidores especficos de algunas cinasas
como las MAPK, p70S6 cinasas y PI3-cinasas. Un defecto en alguna de las respuestas celulares por
el uso del inhibidor, nos permite asociar a la protena inhibida como parte de los intermediarios dentro
de la va de transduccin de seales encendida en este caso por insulina.
Material biolgico
Hgado, msculo y tejido adiposo de rata.
Material y equipo
7 Tubos falcn 50 mL
1 Micropipeta con capacidad de 200-1000L
1 Caja de puntas para micropipeta de 1000L
1 Probeta de 50 mL
1 Piceta con agua destilada
1 Pinzas de diseccin
78
1 Tijeras
1 Vaso de precipitados
1 Caja Petri
1 Cmara para el sacrificio de las ratas (por grupo)
1 Tanque de CO
2
(por grupo)
Bao de agua con agitacin (por grupo)
Reactivos
Solucin Krebs-Ringer-Glucosa-Hepes (130mM NaCl, 5mM KCl, 1.2 mM KH
2
PO
4
, 2mM
MgSO
4
7 H
2
O, 10 mM Glucosa, 1 mM CaCl
2
2 H
2
O, 0.2% BSA y 20 mM HEPES pH 7.0)
0.9% NaCl
Solucin de insulina 2000 U/mL
4 M Wormanina

Se ha dividido est seccin en tres partes, la extraccin de los tejidos de las ratas, la induccin de la
toma de glucosa por insulina en los tejidos y tercero la cuantificacin de glucosa residual en los tubos
en donde se incub el tejido. Debido a que el procedimiento es largo, se sugiere realizar el
experimento en dos sesiones, sin embargo lo pueden realizar en una sola sesin.
Aislamiento de tejidos.
Las instrucciones para el manejo de los animales del laboratorio y el sacrificio de las ratas sern
proporcionadas por un profesional en el rea. En nuestro caso, ser el jefe del bioterio de la Facultad
de Qumica. No obstante, a continuacin se enlistan algunas recomendaciones que les pueden ser
tiles en el manejo de las ratas.
Manejo y sacrificio de las ratas.
Recuerden mantener la calma, los animales perciben el miedo.
Para capturar a las ratas dentro de la jaula, la manera ms prctica es tomarla con una mano
de la cola y con la otra sujetar la piel del cuello, con esto no puede atacar y queda
inmovilizada. Tambin es posible sujetar a la rata con una sola mano, rodeando el cuello con
el pulgar y el ndice, cuidando de no ejercer mucha presin.
El mtodo de sacrificio ser el qumico, utilizando una cmara saturada con CO
2
por 5 min.
Posteriormente se realiza la dislocacin cervical, sujetando la base de la cola del animal y
jalando firmemente, al hacer presin sobre la regin cervical debe producirse un espacio de 2
a 4 mm entre el crneo y las primeras vrtebras cervicales.
Una vez realizado lo anterior, colocar al animal en posicin decbito dorsal (boca arriba) sobre
la mesa previamente cubierta con un papel. Se sujetan los miembros con el fin de que el
animal se encuentre firme a la manipulacin. Para tener acceso a la cavidad torcica y
abdominal se debe sujetar y levantar la piel con unas pinzas de dientes de ratn y hacer una
incisin a lo largo de la lnea media con unas tijeras y posteriormente abrir la piel a cada lado.
Una vez expuestas estas cavidades se puede proceder a la recoleccin de los rganos que se
requieran utilizando unas pinzas rectas y tijeras (Figura 6.3).
79

Figura 6.4. Localizacin de algunos rganos de la rata.
Obtencin de hgado
- Antes de cortar el tejido realizar el procedimiento de perfusin. El hgado contiene sangre que
normalmente era bombeada por el corazn, entonces para eliminar la sangre del hgado hay
que introducir una aguja de jeringa (llena con solucin solucin salina isotnica o la solucin
0.9% NaCl fra) por la vena porta del corazn. Una vez que el hgado tome su color natural, de
rosa a rojo, extraerlo.
- Cortar un hgado en 7 fragmentos de aproximadamente el mismo tamao y distribuirlos en 7
tubos que contienen concentraciones de insulina similares al del tejido adiposo
Obtencin de tejido adiposo
- Abrir el abdomen ampliamente haciendo una ligera presin en la cavidad abdominal para
desplazar los testculos, levantar hacia arriba el testculo izquierdo y de un solo corte separar
el tejido adiposo de tal manera que no lleve sangre, en caso contrario, quitar la sangre con
solucin de NaCl 0.9%
- Sujetar el tejido adiposo con pinzas por la parte ms angosta procurando manejarlo lo menos
posible.
- Hacer lo mismo con el tejido adiposo que cubre el testculo del lado derecho y repetir la
operacin con cada una de las 2 ratas.
- Cortar rpidamente 7 fragmentos de tejido adiposo por rata, de aproximadamente el mismo
tamao y depositarlos en cada uno de los 7 tubos falcn previamente pesados.
.
Obtencin de msculo
- Cortar el msculo de las patas y de la regin ventral. Lavar el tejido en solucin 0.9% NaCl.
- Cortar en 7 segmentos, pesar y distribuir en los tubos indicados en el protocolo anterior.
80
Induccin de toma de glucosa por insulina (Figura 6.4)
Se recomienda que por grupo midan el efecto de insulina sobre la captacin de glucosa en tres
tejidos distintos: hgado, msculo y tejido adiposo. A continuacin se describe el protocolo
experimental a seguir en un tejido.
Preincubacin del tejido con wormanina y posteriormente la incubacin con insulina.
1. Colocar 2 mL de solucin Krebs-Ringer-Hepes-Glucosa (KRH-Glu) en un tubo falcn de 50 mL
marcado como W. Adicionarle 50 L wormanina para una concentracin final de 100 nM.
2. Pesar el tubo con el lquido.
3. Aadir un trozo del tejido. Volver a pesar el tubo. Es necesario conocer la cantidad de tejido
que se coloca en el tubo.
4. Incubar por 30 min a 37C. Este paso es la preincubacin del tejido con wormanina.
5. Al finalizar la incubacin aadir 0.5 mL de la solucin de insulina 2000 U/mL y 0.5 mL de
NaCl 0.9%.
6. Mezclar e Incubar en bao de agua con agitacin moderada a 37C por 30 min. CUIDAR DE
QUE LA TEMPERATURA DEL BAO NO EXCEDA LA RECOMENDADA.
7. Aadir 47 mL de agua.
8. Filtrar el tejido..
9. Si no se determina la concentracin de glucosa inmediatamente, entonces guardar en un tubo
de microfuga 1.2 mL del sobrenadante. Rotular el tubo con una W, el nmero de equipo y el
grupo. Almacenar a 20C hasta su uso.
10. Se determinar el contenido de glucosa segn se describe en la siguiente fase del protocolo.
Incubacin del tejido con insulina.
12. Etiquetar 6 tubos falcn de 50 mL de la siguiente manera:
I. 1000 U
II. 500 U
III. 250 U
IV. 125 U
V. 62 U
VI. 0 U
13. Aadir a cada tubo 1 mL de NaCl 0.9%.
14. Aadir al tubo 1, 1 mL de la disolucin de insulina. Agitar bien.
15. Tomar 1 mL de la solucin de insulina del tubo I y pasarlo al tubo II. Agitar.
16. Tomar ahora 1 mL del tubo II y pasarlo al tubo III. Agitar y continuar de esa manera hasta el
tubo V.
17. Tomar 1 mL del tubo V y desecharlo.
18. El tubo 6 no deber contener insulina.
19. Aadir a cada matraz 2 mL de solucin de KRH-Glu.
20. Pesar los tubos en balanza analtica y ponerlos en hielo.
21. Sacrificar las ratas una por una y aislar el hgado y el tejido adiposo de las testculos (ver
descripcin del procedimiento).
22. Mantener los tejidos en 0.9% NaCl y a 4C una vez aislados.
23. Adicionar a cada tubo un fragmento de tejido de aproximadamente del mismo tamao. Para
exponer la mayor superficie posible del tejido al medio se sugiere cortar en pedazos el
trozo de tejido seleccionado.
24. Volver a pesar los tubos, pero ahora con los tejidos.
25. Colocar los tubos en un bao de incubacin con agitacin moderada a 37C y se incuba por
30 min.
26. Aadir 47 mL de agua al tubo, mezclar y filtrar cada tubo. Se pesa el tejido que queda en el
filtro y el sobrenadante se utilizar para determinar la cantidad de glucosa residual.
81
27. Debido a que slo se necesita una pequea fraccin del volumen para medir el contenido de
glucosa residual, se puede tomar 1.2 mL de cada uno de los sobrenadantes y guardarlo en un
tubo de microfuga. Rotular los tubos y almacenar congelado hasta su uso, siempre y cuando
no se vaya a utilizar para la determinacin de glucosa en esa sesin.
28. Se determinar la cantidad de glucosa en la siguiente fase experimental.
82
Etiquetar tubos
Aadir a cada tubo 1 mL 0.9% NaCl, excepto al W
Realizar diluciones seriadas de insulina
(Excepto los tubos VI y W)
Aadir a todos 2 mL Krebs Ringer-Glucosa
Aadir a W _________L de wormanina
Sacrificar las ratas una por una y aislar tejido.

Incubar todos los tubos a 37C/30 min
Tubos I al VI Tubo W
Aadir 0.5 mL Insulina 2000 U/mL
+ 0.5 mL 0.9% NaCl
Incubar a 37C/30 min
Tomar el tejido y pesarlo
Ajustar el volumen del sobrenadante aadiendo 47 mL de H2O
Guardar 1.2 a 1.5 mL sobrenadante en tubo de microfuga
Congelar
(Solamente si no se puede hacer en esa sesin la determinacin de glucosa)
Determinar contenido de glucosa
-Distribuir en todos los tubos
-Pesar tejido
Figura 6.3. Protocolo de induccin de la toma de glucosa por insulina y determinacin del efecto de wormanina en el
proceso de transduccin de seales iniciado por insulina.
83
Determinacin del contenido de glucosa transportada.
Objetivos
Conocer el fundamento de la determinacin de glucosa, mtodo de Nelson-Somogyi.
Determinar de manera indirecta la toma de glucosa por un tejido.
Introduccin
Los carbohidratos son una de las fuentes principales de carbono y de energa en las clulas y los
podemos encontrar en alimentos y en bebidas, as como tambin en la sangre. Dada la importancia
de los carbohidratos, se han desarrollado varios mtodos para su determinacin: Fehling, Benedict,
Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio.
Todos los carbohidratos con un grupo aldehdo libre o un grupo cetnico se clasifican como azcares
reductores y se transforman fcilmente en enedioles al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos
enedioles son altamente reactivos y se oxidan fcilmente en presencia de oxgeno u otros agentes
oxidantes. Por lo tanto, los carbohidratos en solucin alcalina rpidamente reducen iones oxidantes
como Ag
+
, Hg
+
, Cu
2+
y Fe(CN)
6
3-
, el carbohidrato oxidado forma mezclas complejas de cidos. Esta
accin reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.
Tcnica de Nelson-Somogyi empleada desde 1952 para la determinacin de actividad de enzimas
que degradan polisacridos, es la que se usar en el protocolo. El mtodo utiliza como reactivos al
Cu
2+
y al arsenomolibdato, est ltimo un complejo formado cuando se hacen reaccionar al (NH
4
)
6
Mo
7
O
24
, con el arsenato de sodio, Na
2
HAsO
7
. El Cu
2+
es reducido a C
1+
por el carbohidrato y luego el
C
1+
es reoxidado a Cu
2+
en la reaccin con el arsenomolibdato, ste ltimo al reducirse cambia de
color de amarillo a azul.
Material biolgico
Los sobrenadantes obtenidos anteriormente
Material y equipo
Tubos de microfuga
1 Mechero
1 tela de alambre
1 tripi
15 tubos de 16X150
13 Canicas
1 Gradilla para tubos de vidrio
1 Propipeta
1 Micropipeta de capacidad 200-1000 L
Caja de puntas para micropipeta 1000 L
6 Celdas de plstico
Vrtex
Espectrofotmetro
Reactivos
- Solucin patrn de glucosa, 200 g/mL.
- Solucin A para determinacin de glucosa. Contiene Na
2
CO
3
, tartrato de sodio y potasio,
NaHCO
3
y Na
2
SO
4
, ver apndice.
- Solucin B para determinacin de glucosa. CuSO
4
y H
2
SO
4
, ver preparacin en el apndice.
- Reactivo de cobre mezclado (RCuM): 24 partes de solucin A + 1 parte de solucin B.
Prepararlo justo antes de usarlo.
84
- Reactivo de arsenomolibdato ((NH
4
)
6
Mo
7
O
24
, Na
2
HAsO
4
y H
2
SO
4
). Ver preparacin en el
apndice.
1. Numerar los tubos de ensayo segn se indica en la tabla 6.1.
2. Descongelar los sobrenadantes y agitar.
3. Aadir los reactivos en la cantidad y orden sealados.
Tabla 6.1. Cantidades y orden en el que se realiza la cuantificacin de carbohidratos
T
u
b
o
200ug/mL
Glucosa
(mL)
Sobrenadantes H2O
(mL)
RCuM NH4(AsMoO4)2
(mL)
H2O
(mL)
Abs
520nm
1 - - 2.0 2.0 2.0 4.0
2 0.1 - 1.9 2.0 2.0 4.0
3 0.2 - 1.8 2.0 2.0 4.0
4 0.3 - 1.7 2.0 2.0 4.0
5 0.4 - 1.6 2.0 2.0 4.0
C
u
r
v
a

p
a
t
r
n
6 0.5 - 1.5 2.0 2.0 4.0
I - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
II - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
III - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
IV - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
V - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
VI - 1.0 - 2.0 2.0 4.0
T
e
j
i
d
o
W - 1.0 - 2.0
M
e
z
c
l
a
r

b
i
e
n

y

c
o
l
o
c
a
r

l
o
s

t
u
b
o
s

e
n

a
g
u
a

e
n

e
b
u
l
l
i
c
i
n

p
o
r

1
0

m
i
n

(
t
a
p
a
r

c
o
n

c
a
n
i
c
a
s

d
u
r
a
n
t
e

l
a

e
b
u
l
l
i
c
i
n
)
,

e
n
f
r
i
a
r

e
n

h
i
e
l
o

y

m
e
z
c
l
a
r

b
i
e
n
.
2.0 4.0
Clculo de la toma de glucosa por el tejido.
a) Elaborar la curva patrn de la glucosa.
- Graficar absorbancia vs contenido de glucosa en g.
- Obtener los valores de ajuste o regresin lineal de la curva.
b) Determinar el contenido inicial de glucosa. Recuerda la solucin Krebs-Ringer tiene una
cantidad inicial de glucosa.
c) Glucosa incorporada en los tejidos.
- Calcular el contenido de glucosa de cada uno de los sobrenadantes, utilizando los valores
de regresin lineal obtenidos en el inciso a).
- Calcular la diferencia entre el valor de la glucosa inicial (valor obtenido en el inciso b) y la
determinada para cada muestra problema.
- El resultado se divide entre el peso en gramos del tejido que se coloco en cada matraz
correspondiente para obtener lo g de glucosa transportada por gramo de tejido.
d) Realizar la grfica de toma de glucosa (g de glucosa incorporada/ g tejido) vs concentracin
de insulina y aadir en la misma grfica el resultado de insulina ms wormanina.
e) Interpretar los resultados.
85
Cuestionario
1. Cul es la funcin de la solucin de Krebs-Ringer-Hepes en el experimento?
2. Por qu el aislamiento del tejido debe ser rpido?
3. Qu se esta removiendo al lavar el hgado con solucin salina?
4. En el sistema experimental que utilizamos, qu componente representa la sangre?
5. Cules son los procesos celulares que se estn evaluando en el tejido incubado o no con
insulina?
6. Cul es el metabolito que se debe cuantificar para la determinar si la insulina tiene o no
efecto en el transporte?
7. Dnde se cuantifica este metabolito?
8. Describa la reaccin qumica que utiliza para cuantificarlo.
9. Qu efecto produce la wormanina en la toma de glucosa por los tejidos?
10. Elabore una grfica comparativa del efecto de insulina en la captacin de glucosa por los
diferentes tejidos.
11. Analice la grfica anterior.
Referencias
- Brady MJ, Saltiel AR. 2001. Insulin and glucagon. Encyclopedia of Life Science. John Wiley &
Sons, Ltd. DOI: 10.1038/npg.els.0000638
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- Voet y JG Voet Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da.
86
7. APNDICE. PREPARACIN DE REACTIVOS.
SECCIN I. INTRODUCCIN AL LABORATORIO DE BIOQUMICA
Determinacin de concentracin de protenas por Lowry y Absorbancia a 280 nm
Solucin Mtodo de preparacin Comentarios
Solucin de carbonato-tartrato y
cobre (CTC)
Pesar y disolver 10 g de Na2CO3 en un volumen
aproximado de 60 mL, todava en agitacin aadir 0.1
g de CuSO4 y 0.2 g de tartrato de Na
+
y K
+
, aadir
H2O cuanto baste para 100 mL
Es estable 2 meses a temperatura
ambiente.
10% Dodecil sulfato de sodio (SDS
o tambin llamado lauril sulfato de
sodio)
10 g de SDS y disolver con H2O Usar cubrebocas para su preparacin.
No almacenar en fro ya que se precipita
a temperaturas menores de 17C, pero
se redisuelve si la temperatura se eleva.
0.8 NaOH 3.2 g NaOH para 1000 mL
Reactivo A Mezclar con partes iguales de CTC, 10% SDS, NaOH,
0.8 N y H2O
Se prepara antes de usarse
Reactivo B Dilucin del reactivo Folin Ciocalteau.
1 Folin Ciocalteau + 5 H2O
Solucin estndar de albmina de
suero bovino 1mg/mL
Pesar 100 mg y disolver en 100 mL de agua destilada. Guardar la solucin en alcuotas a 20C
SECCIN II. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTENAS.
Purificacin de la enzima lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino.
Parte I. Extraccin y precipitacin por salado
0.03M KOH Pesar 1.6833 g de KOH para 1L Solucin por grupo
Guardar a 4C.
Parte II. Desalado y purificacin por cromatografa de intercambio inico y de afinidad
2.5 % Sephadex-G25 (p/V) Hidratar 10 g Sefadex-G-25 con 160 mL de agua
estril durante 24 h a 4C. Cantidad que alcanza
como para 50 columnas.
El sefadex hidratado se puede
almacenar a 4C por al menos un mes.
Los laboratoristas entregarn una
columna empacada con sefadex/equipo.
Enpacado de la columna con
Sephadex G-25
A una columna de cromatografa se le
adicionan 2.0 mL de la suspensin de
Sephadex-G25. Centrifugar a 3,000 rpm
durante 5 min, o esperar a que el lquido
drene de la columna. Repetir la operacin
hasta que la columna llegue a un volumen
final de 1 mL.
1. Cada vez que se centrifuga la
columna, es importante revisar que
no se hayan producido burbujas y
que el flujo del lquido sea
constante.
2. Las columnas se pueden reusar
varias veces, mantenerlas
hmedas, tapadas con parafilm y a
4C. Lavarlas antes de usar.
Amortiguador Tris-|-mercaptoetanol
(10 mM de Tris/HCl pH 8.8; 0.5 mM
|-Mercaptoetanol)
Para 104 mL disolver 0.126 g Tris en un poco menos
de 90 mL de agua destilada, ajustar el pH a 8.8 con
HCl, despus adicionar 3.6 L de |-Mercaptoetanol
y ajustar el volumen a 104 mL con agua destilada.
Se usar para preparar dos soluciones
distintas ver abajo.
400mM PMSF Disolver 0.209 g de PMSF en 3 mL de etanol,
mezclar bien y almacenar en microtubos de
centrfuga a -20C.
1. El PMSF; se aade justo antes de
usarse.
2. Proporcionar por grupo 250 L de 400
mM PMSF.
Amortiguador Tris-|-
mercaptoetanol-PMSF (10 mM de
Tris/HCl pH 8.8; 0.5 mM |-
Mercaptoetanol y 1 mM PMSF).
84 mL / grupo
A 4 equipos entregarles alcuotas de 13 mL de Tris-
|-mercaptoetanol a los otros 4 equipos darles 8 mL a
cada uno y adems proporcionar una solucin stock
Para 13 mL de amortiguador los
estudiantes aadirn 32.5 L de 400 mM
PMSF. Para 8 mL aadir 20 L de 400
mM PMSF.
87
de PMSF/grupo para aadirle al amortiguador.
Macro-Prep High S support
(BIORAD)
Lavar la matriz con 2 a 3 volmenes del amortiguador
de equilibrio (de preferencia esterilizar antes el
amortiguador). Guardar a 4C.
Proporcionar lavada a los estudiantes
Amortiguador de equilibrio (50 mM
de fosfatos pH 7.0)
8 mL/ equipo
Mezclar 30.75 mL 1M K2HPO4 y 19.25 mL de 1M
NaH2PO4 y ajustar el volumen a 1 L (solucin
suficiente para 8 grupos y para lavar la matriz).
Se sugiere hacer los stocks de 1 M
K2HPO4 y 1M NaH2PO4, ya que tambin
se utilizar amortiguador de fosfatos en
la parte de cintica enzimtica. Se
almacenan por al menos 1 mes a 4C.
1M NaH2PO4H2O, para preparar 100 mL
pesar 13.79 g
1M K2HPO4 pesar 17.41 y ajustar a 100
mL
Matriz Cibacrn-blue agarosa
presentacin en suspensin
(SIGMA C1535)
Lavar la matriz con 2 a 3 volmenes del amortiguador
Tris-|-mercaptoetanol (de preferencia esterilizar antes
el amortiguador).
Guardar a 4C.
Entregar en un frasco al profesor 16-20
mL de matriz ya lavada.
Amortiguador de elucin I 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0 y 1 M de
NaCl.
Mezclar 7.7 mL 1M K2HPO4 y 3.85 mL de 1M
NaH2PO4 en un volumen menor 200 mL, aadir 11.7 g
de NaCl, disolver y ajustar el volumen a 200 mL.
Almacenar a 4C.
Amortiguador de elucin II 50 mM de amortiguador de fosfatos ajustado con
H3PO4 a pH 3.0
Amortiguador de NAD
+
(10 mM de Tris-HCl pH 8.8, 0.5 mM
de |-mercaptoetanol y 5 mM de
NAD
+
).
20mL/ 4 equipos (solucin que se entrega por grupo)
Repartir 20 mL de Tris-|-mercaptoetanol y
proporcionar 0.0018 g de NAD
+
Disolver el NAD
+
justo antes de
usarse.
Parte III. Determinacin de concentracin de protenas y separacin por electroforesis en gel de poliacrilamida- SDS
Reactivo de Bradford Reactivo preparado (SIGMA) Guardar a 4C.
Solucin estndar de albmina de
suero bovino (BSA) 0.1mg/mL.
pesar 0.1g de BSA en un tubo microfuga, y disolverla
en 1 mL de H2O bidestilada. Tomar 100 L de la
solucin de BSA 100 mg/mL colocarla en un tubo
para microfuga y aadirle 900 L de H2O bidestilada,
la solucin quedo 10 mg/mL. Volver ha hacer una
dilucin 1:10 para obtener una solucin de 1 mg/mL
de BSA. Por ltimo volver ha hacer una dilucin 1:10
para obtener una solucin de 0.1 mg/mL de BSA. Esta
es la solucin de referencia.
Guardar a 20C
Separacin de las protenas en gel de poliacrilamida-SDS
Acrilamida. Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% NNmetilen-
bisacrilamida, disuelto en agua.
Precaucin. La acrilamida es un
neurotxico y es absorbido por la piel.
Usar guantes al manipularlo.
2 M Tris /HCl pH 8.8 Para 200 mL pesar 48.45 g de Tris. Ajustar el pH con
HCl.
Almacenar a temperatura ambiente.
0.5 M Tris/HCl pH 6.8 Para 200 mL pesar 12.114 g de Tris. Ajustar el pH con
HCl.
10% SDS 1 g de SDS para 10 mL de agua destilada Pesar usando cubrebocas.
No colocar en fro.
Amortiguador de muestra 350 L de 1M Tris base.
250 L al 20% SDS.
Almacenar a 20
0
C
88
160 L de 1 M ditiotreitol (DTT).
150L al 50% Glicerol.
20 L de azul de bromofenol (20%).
70 L de H2O.
Hacerlo y almacenarlo en tubos de microfuga de 1.5
mL.
Amortiguador de corrida -Preparar un stock a 5X
0.25N Tris Base, 1.9M Glicina, 0.5 % SDS (30.285 g
Tris; 142.62 g Glicina, 5 g SDS para 1L)
-Tomar 200mL del amortiguador 5X y llevarlo a 1L.
Almacenar a 4
0
C, el reactivo dura al
menos un ao en stock al 5X y en la
solucin de trabajo (1X) se puede
reutilizar hasta que la solucin cambie a
un color amarillo.
Solucin teidora 0.125% (p/v) azul de Coomasie Blue R250.
50% (v/v) metanol.
10% (v/v) cido actico
Solucin reutilizable
Solucin desteidora 45% Metanol.
10% cido actico
SECCIN III. ACTIVIDAD ENZIMTICA
Parte I: Curvas temporales de actividad enzimtica de la lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino.
1 M Amortiguador de fosfatos pH
7.0
Mezclar 30.75 mL de K2HPO4 1M y 19.25 mL de
NaH2PO4 1M y aforar a 500 mL. Solucin suficiente
para todo un semestre.
Guardar a 4C.
10 mM Piruvato de sodio Para un volumen de 2 mL, pesar 0.0022g de piruvato
de sodio.
Reactivo que debe ser preparado justo
antes de usarlo.
4 mM NADH. Para un volumen de 2 mL, pesar 0.0054g de NADH. Reactivo que debe de disolverse justo
antes de usarlo.
SECCIN V: ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIN DE CIDOS NUCLEICOS
Transferencia de material gentico I: Conjugacin
Cultivo de E. coli JM1452Str
R
(cepa receptora)
Cultivada por una noche en caldo Luria a 37C. Proporcionada por el cepario.
Se solicitan al inicio del semestre. Se
intercambian tubos por los tubos por
cultivo de bacterias.
Cultivo de E. coli W3110/FKmTn3
(cepa donadora)
Cultivada por una noche en caldo Luria a 37C. Proporcionada por el cepario.
intercambian tubos por los tubos por
cultivo de bacterias.
Luria lquido Medio Luria lquido en tubos para realizar conjugacin Almacenar a 4C.
5 cajas Petri con medio Luria-agar-
2% estreptomicina (25 g/ml)
Una vez esterilizado el medio lquido o en agar en
autoclave a 121C, dejar enfriar a 50-55C antes de
adicionar el antibitico par evitar que sea inactivado
por el calor.
Preparar una solucin de 20 mg/mL de sulfato de
estreptomicina en agua. Esterilizar por filtracin y
guardar en alcuotas a 20C. Adicionar al medio
estril enfriado a 50-55C para tener una
concentracin final de 25 g/mL
Almacenar a 4C.
2 cajas Petri con medio Luria-agar-
2% sulfato de kanamicina (30
g/ml)
Una vez esterilizado el medio lquido o en agar en
autoclave a 121C, dejar enfriar a 50-55C antes de
adicionar el antibitico par evitar que sea inactivado
por el calor.
Preparar una solucin de 25 mg/mL de sulfato de
kanamicina en agua. Esterilizar por filtracin y guardar
en alcuotas a 20C. Adicionar al medio estril
Almacenar a 4C.
89
enfriado a 50-55C para tener una concentracin final
de 30 g/mL
Transferencia de material gentico II: Transformacin
Clulas competentes de E. coli Se describe la tcnica para preparar 200 L de las
clulas competentes:
Inocular 3 mL de medio Luria con E. coli
BL21 y se deja crecer en agitacin toda la
noche a 37C.
Tomar 0.2 mL del precultivo y agregrselo a
10 mL de medio Luria. Las bacterias se
dejan crecer hasta llegar a una absorbencia
de 0.6 a 0.8 (lectura a 600 nm).
Centrifugar la suspensin de clulas a 5000
rpm durante 5 min a 4C. Descartar
sobrenadante
Resuspender el paquete celular muy bien
en 3 mL de NaCl 10 mm isotnico fro.
Centrifugar a 5000 rpm durante 5 min a
4C. Descartar el sobrenadante y
resuspender el precipitado en 5 mL de
CaCl2 30 mm fro.
Dejar incubando en hielo por 20 min con
agitacin ocasional suave y centrifugar a
2500 rpm por 7 min. El precipitado debe ser
de forma anular.
Resuspender el precipitado en 0.5mL de
CaCl2 30 mM fro. Tomar 0.2 mL y pasarlo a
un tubo microfuga.
Los laboratoristas entregaran los tubos
de microfuga con las clulas
competentes congeladas.
Plsmido PET-TEM-1 Se prepara de acuerdo al protocolo que se encuentra
en la seccin V, Parte II: Obtencin del plsmido.
Se entregar la preparacin de plsmido
aislada de un cultivo reciente.
Entregar en alcuotas en tubos de
Microfuga
Medio LB/Kanamicina
(30 g/mL)
Para 200 mL de medio lquido se adicionan el
volumen necesario de un stock 25 mg/mL
Kanamicina
Guardar el stock de Kanamicina a 20C
Medio SOC. Medio Luria adicionado con 20 mM Glucosa. Guardar a 4C
Transferencia de material gentico II: Aislamiento de plsmidos
Solucin GTE 50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y EDTA 10
mM pH 8.0.
Mantener a 4C
3 M Acetato de potasio
pH 4.8
Para una solucin 3M de acetato de potasio; A 60 mL
de acetato de potasio adicionar 11.5 mL de cido
actico y 28.5 mL de H2O
Mantener a -20C
70% Etanol Para 100mL de solucin de etanol al 70%, se mezclan
70 mL de etanol y 30 mL de agua
Mantener a -20C
10 N NaOH Para 10 mL de solucin NaOH 10 N, se pesan 0.4 g
de NaOH.
10% SDS Disolver 10 g de SDS en 100 mL de agua destilada Utilizar cubre bocas para su preparacin.
No almacenar en fro
Solucin de lisis (0.2 N NaOH y 1%
SDS p/v)
Tomar 10 L de 10 N NaOH y 50 L 10% SDS, aforar
con agua destilada.
Los alumnos la preparan justo antes de
usarla.
90
500 L
Transferencia de material gentico II: Ensayos de restriccin de plsmido.
NdeI 100U/L Marca Fermenta. Viene acompaada la
enzima con un vial que contiene el amortiguador
TANGO.
Guardar a 20C.
Ser proporcionada por el laboratorio
BamH1 10U/L Marca Fermenta Guardar a 20C.
Ser proporcionada por el laboratorio
TAE 1X Preparacin para TAE 50X, pesar 242 g Tris base,
57.1 mL cido actico glaciar y 100 mL de 0.5 M de
EDTA (pH 8). Aforar a 1L
Diluir y proporcionar a los alumnos el
TAE 1X.
Bromuro de etidio 10 mg/mL Marca Gibco BRL. Ya viene preparado a la concentracin
sugerida.
Manejar con mucho cuidado, reactivo
mutagnico
Transferencia de material gentico II: Induccin de protena recombinante.
IPTG Para 1 mL de solucin 100 mM de IPTG, se pesan
0.0238 g de IPTG.
Almacenar a 20C
SECCIN VI: REGULACIN DEL METABOLISMO
Parte I: Opern de la lactosa
Cultivo de E. coli W3110 en medio
M9-glicerol.
Proporcionado por el cepario.
intercambian tubos limpios por los tubos
con cultivo de bacterias.
4 mL medio M9-glicerol estril Preparacin de Sales M9 10X 60g
Na2HPO4 30 g
KH2PO4 5 g
NaCl 5 g
NH4Cl 10 g
H2O cuanto baste para 1L, esterilizar la solucin en
autoclave a 121C, dejar enfria a 50-55C antes de
adicionar el resto de soluciones.
Sales M9 10X 100 mL
Glicerol 20% 10 mL
MgSO4 0.1M 10 mL
CaCl2 0.01M 10 mL
H2O estril c.b.p. 1L.
Cada una de las soluciones deber
esterilizarse por separado por filtracin.
La mezcla deber hacerse en
condiciones de esterilidad.
Solucin de glucosa al 2% estril Preparar las soluciones y luego filtrar
para esterilizar.
No esterilizar en autoclave.
Solucin de lactosa al 2% estril Preparar las soluciones y luego filtrar
para esterilizar.
Solucin de glucosa 2% + lactosa
2% estril
Preparar las soluciones y luego filtrar
para esterilizar.
Amortiguador Z (Na2HPO4-7H2O 60
mM, NaH2PO4-H2O 40 mM, KCl 10
mM, MgSO4-7H2O 1mM, |-
mercaptoetanol 50 mM, pH 7.0)
Na2HPO4-7H2O 16.1g, NaH2PO4-H2O 5.5 g, KCl 0.75
g, MgSO4-7H2O 0.264 g, |-mercaptoetanol 2.7 mL,
disolver en menos de 1 L de agua, ajustar el pH 7.0 y
aforar a 1 L.
91
Reactivo ONPG (0.1% de o-
nitrofenil-|-galactsido)
Disolver 0.2 g en 50 ml de solucin amortiguadora Z
SDS al 0.1% Disolver 0.1 g en 100 mL de agua destilado Usar cubrebocas al preparar el reactivo.
Na2CO3 1M
Parte II: Regulacin hormonal del metabolismo de la glucosa
Solucin Krebs-Ringer-Glucosa-
Hepes (130mM NaCl, 5mM KCl, 1.2
mM KH2PO4, 2mM MgSO4
.
7 H2O,
10 mM Glucosa, 1 mM CaCl2
.
2
H2O, 0.2% BSA y 20 mM HEPES).
Para 250 mL disolver 1.89 g NaCl, 0.093g KCl, 0.040g
KH2PO4, 0.122g MgSO4
.
7 H2O, 0.45 g glucosa,
0.036g CaCl2
.
2 H2O, 0.5 g de BSA y 10 mL de
HEPES de un stock de 500 mM ( o bien calcular el
peso para 20 mM y disolver) ajustar a pH 7.0
Almacenar a 4C
Solucin de insulina 2000 U/mL Dependiendo de la presentacin habr que calcular la
dilucin.
Depende de la presentacin, se
almacena a 4C o 20C.
Solucin patrn de glucosa, 200
g/mL.
Pesar 0.02 g de glucosa y disolverlo en 100 mL de
agua destilada, guardar en alcuotas.
Almacenar a 20C.
Solucin A para determinacin de
glucosa
12.5 g carbonato de sodio anhidro + 12.5 g tartrato de
sodio y potasio +10 g bicarbonato de sodio +100 g
sulfato de sodio anhidro y se lleva a 500 mL con agua
destilada
Proporcionado en alcuotas por el
laboratorio.
Solucin B para determinacin de
glucosa
7.5 g sulfato de cobre en 50 mL de agua destilada +
50 L H2SO4 concentrado
Proporcionado en alcuotas por el
laboratorio.
el Reactivo de cobre mezclado
(RCuM):
24 partes de solucin A + 1 parte de solucin B. Los estudiantes lo prepararan en el
momento
Reactivo de arsenomolibdato - Disolver 25 g de (NH4)6Mo7O24 en 450 mL
de agua destilada aadir 21 mL de cido
H2SO4 concentrado.
- Disolver por separado 3 g de
Na2HAsO47H2O en 25 mL de agua
destilada.
Mezclar ambos reactivos y colocar en un frasco
mbar, incubar a 37C durante 24 h, no agitar.
La solucin debe presentar una
coloracin amarilla, de lo contrario
desechar.
Repartir por equipo 28 mL
4 M Wormanina Se recomienda disolver el contenido total de un vial
que contiene 0.25 mg en 1 mL de DMSO. Despus de
esa solucin que queda a 583.8 M tomar 34 L y
aadrselos a 5 mL DMSO, as la solucin final queda
a 4 M. Por grupo usaran 450 L de 4 M wormanina
Almacenar a 20C.

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