Ion-exchange chromatography Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai penukar ion.

Senyawaan yang mempunyai ion-ion dengan afinitas yang berbeda terhadap resin yang digunakan dapat dipisahkan. Analisa asam-asam amino adalah yang umum dilakukan dengan cara ini. Contoh lain adalah asam-asam nukleat dan analisis garam-garam anorganik. Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase). Analisis dengan kromatografi dapat digunakan untuk analisis kualitatif & kuantitatif. Berbagai jenis kromatografi berdasarkan : a. Mekanisme pemisahannya : Kromatografi adsorbs Kromatografi partisi Kromatografi pasangan ion Kromatografi penukar ion Kromatografi eksklusi ukuran b. Alat yang di gunakan : Kromatografi kertas Kromatografi lapis tipis (KLT) Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Kromatografi Gas Nilai Rf adalah nilai yang menyatakan perbandingan jarak yang di tempuh solute dengan jarak yang ditempuh oleh fase gerak. Rf = Jarak yang ditempuh solute / Jarak yang ditempuh fase gerak Proses Sorpsi Meliputi 4 mekanisme, yaitu :

1. Adsopsi ( tidak sama dengan absorpsi) Interaksi antara sampel dengan fase diam, dimana solute akan berasaing dengan fase gerak untuk berikatan dengan sisi-sisi polar permukaan adsorben. 2. Partisi Merupakan proses sorpsi yang analog dengan ekstraksi pelarut. Solut akan terdistribusi antara fase diam dan fase gerak sesuai dengan kekuatan relative diantaranya. 3. Pertukaran ion Proses dimana solut solut ion dalam fase gerak dapat bertukar dengan ion-ion yang bermuatan sama yang terikat secara kimiawi pada fase diam. 4. Eksklusi (berbeda dari proses sorpsi yang lain) Tidak ada interaksi spesifik antara solute dan fase diam. Perbedaan bentuk struktur & ukuran molekul sangat mempengaruhi jenis kromatografi ini. Kromatografi Pertukaran Ion (Ion-Exchange Chromatography) Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digunakan untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein. Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar (planar). Terdapat dua tipe pertukaran ion, yaitu pertukaran kation (cation exchange) dan pertukaran anion (anion exchange). Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif; sedangkan pada pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang berada pada fase cair akan melewati kolom. Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan terelusi. Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom, makan molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan kolom. Untuk mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu. Pemisahan dengan metode ini sangat selektif dan karena biaya untuk menjalankan metode ini murah serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada awal proses keseluruhan. Kromatografi pertukaran ion merupakan metode kromatografi utama yang paling banyak digunakan dalam produksi makromolekul biologis. Dibandingkan dengan resin konvensional, maka tentakel penukar ion Merck Fractogel dan Fractoprep meningkatkan efisiensi proses pemisahan. Media tentakel memberikan sejumlah manfaat seperti kapasitas tinggi pada tingkat laju tinggi,

selektivitas tinggi, efisiensi tinggi, dan pemulihan tinggi. Keduanya memertahankan aktivitas biologi selama pemurnian dan mendapatkan hasil yang tinggi. Semua penukar ion Merck menunjukkan kapasitas pengikat protein yang luar biasa pada tingkat laju tinggi dan menawarkan berbagai fitur yang bermanfaat untuk banyak proses produk KROMATOGRAFI PASANGAN-ION Kromatografi pasangan-ion merupakan bagian dari kromatografi ion berkenaan dengan metode yang lebih efisien dan modern mengenai penetapan dan pemisahan ion dengan memanfaatkan HPLC. Alat-alat yang digunkan pada kromatografi ion hampir sama dengan kromatografi cair, yang digunakan untuk menetapkan ion-ion yang belum diketahui. Merupakan bidang khusus kromatografi cairancairan. Seperti namanya, system ini khusus digunakan untuk spesies ion. Penemuan resin sintetik dengan sifat penukar ion sebelum perang Dunia II telah dapat mengatasi pemisahan rumit dari logam tanah jarang dan asam amino. Kemasan kolom untuk kromatografi ion mempunyai muatan yang mempertegas gugus fungsional yang melekat pada suatu senyawa polimer dengan ukuran yang relatif sama. Salah satu hal yang dimaksud adalah surface agglomeration aglomerasi permukaan, yang digunakan untuk memperjelas pelekatan ion-ion koloidal yang bertukar dengan ion lain yang lebih besar dari partikel substrat koloidal tersebut. Dominasi mekanisme pemisahan pada kromatografi pasangan-ion adalah adsorpsi. Fase diam yang mengandung ion netral dari resin divinilbenzen mempunyai polaritas yang rendah tetapi spesifitas permukaan yang tinggi. Kemungkinan secara kimia ikatan fase diam, yaitu silika, dengan polaritas yang rendah dapat digunakan. Selektivitas dari kolom pemisah dapat ditetapkan melalui fase gerak. Di samping senyawa anorganik, reagen pasangan-ion yang dapat ditambahkan ke eluen (seperti air atau larutan buffer) bergantung pada sifat kimia dari analit tersebut. Yang terpenting dari kromatografi pasangan ion adalah kecocokan dari pemisahan permukaan-anion aktif-dan kation, senyawa sulfur, amina, dan senyawa kompleks. Kromatografi pasangan ion menggunakan senyawa netral nonpolar sebagai fase diam dan elektrolit lipofil sebagai fase gerak. Hal ini hampir sama dengan fase kolom yang biasa digunakan pada kromatografi cair. Tipe fase diam yang biasa digunakan adalah silika berpori. Pada analisis kation, agen interaksi ion yang digunakan adalah asam sulfonat heptana, sementara untuk pemisahan anion biasanya digunakan tetrabutilamonium hidrogen sulfat (atau fosfat).

Eluen mengandung pengubah ion ionic modifier, yang merupakan sisi pertukaran-ion yang bergerak yang dapat diserap oleh kolom, baik berpasangan maupun tidak berpasangan dengan ion sampel. INSTRUMEN Kromatografi pasangan ion memiliki instrumen berupa kolom fase berkebalikan dengan efisiensi tinggi yang sama dengan yang digunakan pada kromatografi cair. Fase diam yang digunakan adalah silika berpori, dimana permukaannya disesuaikan dengan melekatkan gugus alkil yang panjang (seperti C8 atau C18) dan macroporous styrene-DVB polymer. Untuk analisis kation, tipe agen interaksi ion yang digunakan adalah asam sulfonat heptana, dan untuk pemisahan anion biasanya digunakan tetrabutilamonium hidrogen sulfat TBA (atau fosfat). (n-Butyl)4N+HSO4- [(n-Butyl)4N+ HSO4-] (TBA) Eluen yang digunakan mengandung pengubah ionik, yang berperan sebagai tempat pertukaran-ion yang bebas bergerak yang dapat diserap oleh kemasan kolom, baik berpasangan ataupun tidak berpasangan dengan ion sampel. Reagen pasangan-ion (berupa senyawa organik counter ion berukuran besar yang terionosasi) ditambahkan pada konsentrasi rendah (biasanya 0,005 M) pada fase gerak. Fase diam berupa suatu monolayer octadecyl atau kemasan fase yang berikatan dengan oktil. Reagen yang biasa digunakan adalah trietilalkil amina kuaterner (dibuat asimetris untuk menghasilkan asosiasi rantai alkil yang lebih baik dengan permukaan parafin fase diam milik octadecyl) dan alkil sulfonat. PEMILIHAN REAGEN IPC YANG TEPAT Jika yang tersedia adalah analit ionik dan nonionik disarankan memulai dengan optimasi komponen nonionik. Kemudian pillih reagen IPC yang sesuai untuk menyediakan counter ion yang diperlukan. Alkil sulfonat merupakan solut dasar yang baik, dimana amina kuarterner sangat penting untuk analit yang bersifat asam. Reagen IPC golongan halogen hanya sesuai digunakan pada aplikasi isokratik dan tidak boleh digunakan pada sistem gradien. Setelah memilih reagen IPC yang sesuai optimasi dapat dilanjutkan dengan menyesuaikan pH dan konsentrasi. Untuk reagen IPC dengan panjang rantai karbon pendek atau medium, larutan 0,005 M sesuai untuk proses pemisahan. Sedangkan konsentrasi optimum untuk reagen IPC dengan rantai karbon panjang bervariasi antara 0,0005 M-0,002 M. Selektivitas metode ini ditentukan melalui fase gerak: eluen organik ditambahkan bersama dengan reagen yang spesifik. Reagen IPC merupakan molekul ionik berukuran besar yang mempunyai

muatan yang berlawanan dengan analit sampel, seperti permukaan hidrofobik yag berinteraksi dengan fase diam. Counter ion bergabung dengan ion dari eluen, menjadi pasangan ion pada fase diam. Hal ini mendukung pemisahan analit. MEKANISME Tidak ada mekanisme spesifik yang ditetapkan dari kromatografi pasangan-ion, baik molekul solut membentuk kompleks pasangan-ion yang bersifat reversible, dimana terjadi pembagian pada fase diam nonpolar, atau counter ion diisi ke dalam kemasan melalui alkil dengan gugus ioniknya diletakkan pada permukaan dan mampu mengikuti pembentukan kompleks pasangan-ion. Ion sampel didorong ke bawah sepanjang kolom oleh ion lain yang bermuatan sama dalam eluen, entah positif atau negatif. Kromatografi pasangan-ion hampir sama dengan kromatografi penukar-ion kecuali bahwa pengubah harus diperbaharui secara teratur dengan penggabungan eluen. Campuran air-metanol adalah fase gerak yang umum digunakan. Larutan Buffer yang diperlukan harus 0,001 M-0,005 M dan harus memiliki kelarutan yang baik namun sifat pasangan-ion yang buruk. Faktor-faktor yang mempengaruhi retensi antara lain: 1. Kontrol pH Menjaga pH sekitar 2,0 memastikan bahwa basa kuat dan lemah ada dalam bentuk protonasi. Dalam hal ini basa lemah secara umum akan berbentuk nonionik. Pada pH sekitar 7,5 asam kuat dan lemah akan berada pada bentuk nonionik. 2. Panjang rantai alkil Makin panjang rantai alkil pada counter ion, pengembangan yang lebih luas akan dihasilkan dari ion. Misalnya antara Na pentanasulfonat dibandingkan dengan Na oktanasulfonat. 3. Konsentrasi counter ion Meningkatkan konsentrasi counter ion akan menaikkan retensi hingga batasan yang ditentukan oleh kelarutan counter ion pada fase gerak. Jika dilakukan pemisahan senyawa ionik dan nonionic dalam sampel yang sama, maka langkahlangkah yang harus diikuti adalah: 1. Mengoptimasi pemisahan solut nonionik 2. Memilih dan menambah counter ion pada fase gerak 3. Menyiapkan pemisahan dengan menukar panjang rantai counter ion atau menggunakan kombinasi dari dua counter ion, dapat juga dengan mengubah konsentrasi counter ion

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN Kromatografi pasangan ion digunakan untuk mengatasi masalah ionisasi dimana spesi ion tersebut sangat polar, ionisasi ganda, dan basa kuat. Manfaat utama dari kromatografi ini adalah adanya fase kebalikan dari kromatografi cair yang bertahap atau pertukaran-ion HPLC yang dapat memfasilitasi analisis dari sampel yang mengandung ion sekaligus molekul. Tidak seperti pertukaran ion yang konvensional, kromatografi pasangan ion dapat memisahkan senyawa ionik dan nonionik dalam sampel yang sama. Kelebihan dari metode kromatografi pasangan-ion: Waktu pengerjaan relatif singkat Memberikan hasil yang reproducible Menghasilkan bentuk peak yang tajam Dapat langsung memperoleh hasil pemisahan analit terionisasi dan tidak terionisasi Pemilihan zat tambahan (berupa reagen tau larutan buffer) lebih beragam untuk meningkatkan proses pemisahan. Kemurnian zat tambahan pada eluen mempengaruhi reprodusibilitas dan keakuratan hasil percobaan. Zat ini dapat menghasilkan peak yang tidak murni jika kualitasnya tidak memadai. Jika dibandingkan dengan kromatograti cair, teknik ini mempunyai kelebihan untuk medukung pemisahan spesies ion dan molekul. Dapat memisahkan senyawa ionik dan nonionik dalam sampel yang sama Kekurangan metode kromatografi pasangan-ion: Larutan ionik seringkali bersifat korosif dan mengakibatkan kolom tidak bertahan lama Beberapa larutan ionik mengabsorbsi pada panjang gelombang UV tetapi membatasi detektor UV Bahan berdasar silika terbatas pada pH di bawah 7,5 Fase gerak tidak boleh dibiarkan semalaman tetapi diganti dengan air