VECTORES DE CLONACIN Los vectores son, esencialmente, molculas de DNA transportadoras.

Para servir de vector, una molcula de DNA debe tener unas determinadas caractersticas: 1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que transporta. 2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restriccin, presentes slo una vez en el vector. Estos sitios de restriccin se cortan con una enzima de restriccin y se utilizan para insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima. 3. Debe tener algn marcador de seleccin (normalmente genes de resistencia a antibiticos o genes de enzimas que la clula husped no tiene) para poder distinguir las clulas husped que transportan el vector de las que no lo contienen. 4. El vector de la clula husped debe ser fcil de recuperar. Un fsmido es un tipo de vector empleado en biotecnologa. Bsicamente es un fagmido introducido por sustitucin en un vector de tipo fago lambda. Esto permite usarlo igual que un fago lambda, pero con la posibilidad de excindir el fagmido y poder manejar el inserto como plsmido. Muy utilizados en la construccin de genotecas, en la que es indispensable una alta eficiencia de introduccin de las molculas de ADN recombinante en las clulas para obtener clones de tantos fragmentos del genoma original como sea posible, asegurando as una buena representatividad. La eficiencia de introduccin del DNA mediante fago lambda (por infeccin) es muy superior a cualquier otra tcnica no viral. Sin embargo resulta ms interesante disponer de una genoteca en forma de clones bacterianos en lugar de clones virales, por lo que frecuentemente se purifica el ADN recombinante de un clon viral, se libera el inserto y se clona en un plsmido. Con el empleo de fsmidos esto no es necesario, ya que basta con excindir el fagmido (empleo de un fago auxiliar) y creciendo en medio selectivo tan slo obtendremos bacterias con el fagmido. Los plsmidos son fragmentos extracromosmicos de cidos nuclicos (ADN o ARN) que aparecen en el citoplasma de algunos procariotas. Son de tamao variable aunque menor que el cromosoma principal. De manera natural se encuentran en las bacterias en tamaos que van desde 5,000 hasta 10,000pb y contienen de 2 a 30 genes. Algunos tienen la capacidad para incorporarse o salir del cromosoma bacteriano. Cada bacteria puede tener uno o varios a la vez. Los plsmidos tienen una conformacin circular o con estructura superenrrollada. El control de la replicacin del plsmido depende del tipo de plsmido, existiendo plsmidos cuya replicacin est acoplada con la replicacin del cromosoma bacteriano y plsmidos cuya replicacin no est relacionada con la del cromosoma (generalmente son de este ultimo tipo). El tipo de genes que portan los plsmidos es variado, tratndose generalmente de genes que aportan ventajas adaptativas a la bacteria que los porta: genes de resistencia a antibiticos, genes de produccin de sustancias txicas para otras bacterias o genes que codifican enzimas tiles para degradar sustancias qumicas. Se denomina

episoma a un plsmido incorporado al cromosoma bacteriano. Los plsmidos se replican en manera similar al cromosoma bacteriano. Los plsmidos son herramientas muy tiles en ingeniera gentica para la transformacin gnica y la manipulacin gentica de procariotas y eucariotas. Los plsmidos empleados en ingeniera gentica se llaman vectores. Son muy tiles para sintetizar en grandes cantidades protenas de inters, como la insulina o los antibiticos, mediante un procedimiento conocido como transformacin. El proceso de transformacin comienza con la seleccin de un plsmido adecuado, en el que se introducen los genes que se quieren expresar con protocolos especficos que usan enzimas de restriccin y DNA ligasa. Posteriormente se transforma un tipo de bacteria con el plsmido modificado y se seleccionan las bacterias transformadas que produzcan las sustancias deseadas. Estas bacterias se cultivan en sistemas de tipo biorreactores para su crecimiento en grandes cantidades. En este proceso se eligen plsmidos con caractersticas que permitan seleccionar las bacterias transformadas en un medio de cultivo como por ejemplo plsmidos con genes de resistencia a antibiticos o con genes de enzimas que sinteticen compuestos coloreados. Aunque los plsmidos no pueden sintetizar una envoltura proteica y se transfieren con dificultad de una clula a otra se ha hipotetizado que podran ser los precursores de los primeros virus. Los csmidos son vectores hbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de DNA plasmdico. Los csmidos contienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmdicas de replicacin y de genes de resistencia a antibiticos, que permiten identificar las clulas husped que los contienen. El DNA de los csmidos que contiene insertos de DNA se empaqueta en la cpside proteica de lambda para formar partculas fgicas infectivas. Una vez el csmido entra en la clula husped, se replica como un plsmido. Puesto que la mayora del genoma de lambda se ha delecionado, los csmidos pueden transportar insertos de DNA mucho ms grandes que los que lambda puede llevar. Los csmidos pueden transportar casi 50kb de DNA insertado, mientras que los vectores fgicos pueden acomodar insertos de DNA de unas 15kb y los plsmidos generalmente estn limitados a insertos de 5-10kb. Cromosoma artificial bacteriano (BAC): Es un vector de clonacin generado en el laboratorio que permite insertar segmentos largos de ADN, de 100 000 a 300 000 bases, provenientes de otras especies en el genoma de bacterias. Una vez que este ADN ha sido clonado dentro de la bacteria husped puede replicarse junto con el genoma bacteriano y as se pueden obtener muchas copias de l. Grandes fragmentos de ADN pueden ser clonados en vectores que contengan los componentes necesarios para propagarse como cromosomas artificiales en las bacterias. De esta manera, se pueden clonar fragmentos de ADN que tengan de 100.000 a 200.000 pares de bases, como BACs (por sus siglas en ingls). El ADN clonado en los BACs es por lo general ms pequeo. Sin embargo, los BACs ofrecen ventajas importantes como por ejemplo, son ms manipulables para ciertos tipos de estudios en el laboratorio. Los BACs se usan a gran escala para construir mapas fsicos de alta

resolucin de los cromosomas humanos, con el fin de establecer la secuencia completa del genoma humano. Cromosoma artificial de levadura (YAC): Es un cromosoma artificial que se emplea como vector de clonacin de grandes fragmentos de ADN de otras especies en el genoma de la levadura. Los YACs se propagan junto con los otros cromosomas de la clula de levadura. Cromosomas artificiales en levadura o YAC son grandes pedazos de ADN que contienen los componentes necesarios que le permiten propagarse como cromosomas en la levadura. As, se pueden clonar en la levadura, fragmentos de ADN forneo de hasta un milln de pares de base de longitud o incluso ms. El ADN clonado se propaga entonces como si fuera simplemente otro cromosoma en la clula de la levadura. Cuando uno arma rompecabezas, es ms fcil ensamblar un nmero pequeo de pedazos grandes que un nmero grande de pedazos pequeos, y lo mismo pasa cuando se hacen mapas fsicos de cromosomas. Los YACs proporcionan pedazos ms grandes del cromosoma y por lo tanto se necesitan menos de ellos para ensamblar el mapa fsico de un cromosoma. Por esa razn, los YACs han resultado particularmente tiles en la fase temprana del Proyecto Genoma Humano, donde se han usado para construir mapas fsicos completos de todos los cromosomas humanos.

Referencias Thomas M. Devlin, Bioquimica con aplicaciones clnicas 4Ed., Editorial REVERTE, 2006, pp. 290-307 (DNA recombinante y biotecnologa). http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNArecombinante/Tecnica%20DNA%20reco mbinante.pdf consultado por ultima vez 18/abril/2012.