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P.

BACCHIN L2 CBPS Biotechnologies et Bioprocds Universit Toulouse III L2 CBPS

CHIMIE

PHYSIQUE

Biotechnologies et bioprocds
Introduction

SANTE

BIOLOGIE

Patrice BACCHIN
Enseignant Chercheur Procds de Sparation et Membranes
Universit Paul Sabatier Laboratoire de gnie Chimique 31 062 TOULOUSE Cedex 9 Tel : 05 61 55 81 63 Fax : 05 61 55 61 39 Email : bacchin@chimie.ups-tlse.fr Web : http://lgc.inp-toulouse.fr http://www.patricebacchin.fr

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Partie 1 : Biotechnologies
Quoi ? Pourquoi ? Comment ? Avec quoi ? Dfinition Enjeux Dmarche Matriel biologique

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Gnralits : Quoi ?
Dfinition OCDE : lapplication de la science et de la technologie aux organismes vivants et dautres matriaux vivants ou non vivants, pour la production de savoir, biens et services
volution naturelle de la biologie et de lingnierie possible grce aux nouvelles techniques (chromatographie, lectrophorse, mthodes optiques, ) et lexplosion de connaissances sur le fonctionnement de la cellule et du matriel biologique
OCDE : Organisation de coopration et de dveloppement conomiques

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Gnralits : Pourquoi ?
Pour rechercher les causes des maladies, concevoir, tester et produire des mdicaments spcifiques ou des dispositifs bio-mdicaux Pour mettre au point des procds, de traitement ou de recyclage innovants (techniques de bioremdiation) Pour mettre au point des capteurs de ltat de lenvironnement, de sa pollution par des substances chimiques. Pour produire dans le domaine de l'agriculture, au travers en particulier des OGM Pour dvelopper des alternatives nergtiques notamment par la production de biogaz et dalcool
Mthode de production douce plus conome en nergie et moins polluante

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Gnralits : Comment ?
Des moyens matriels : Systme de production grande chelle de produit dintrt : mtiers de la recherche, du dveloppement et de la production

Des connaissances : un socle pluridisciplinaire : biologie, microbiologie, biologie molculaire, chimie, biochimie, physique biophysique, gntique, l'informatique.

CHIMIE

PHYSIQUE

SANTE

BIOLOGIE

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Avec quoi ? le matriel biologique

Levures
10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 1 mm eucaryotes 1 m procaryotes virus protines molcules atomes

Bactries (0,1-5 m)

1 nm

Enzyme ADN

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Avec quoi : des chanes dinformations


Les polynuclotides
stockage de lnergie ATP Coenzymes (NAD, ) Synthse de polyosides ADN : support de linformation gntique et agents pour lexpression de cette information

ADN -> ARN -> Protines


transcription traduction ADN : Lacide dsoxyribonuclique ARN Lacide ribonuclique NAD : Nicotinamide adnine dinuclotide (aide les enzymes transfrer les e-)

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Avec quoi : des macromolcules au travail


Protines activit catalytique (enzymes)
Jouent un rle de catalyseur (acclration de raction) sans tre consommes. Certaines enzymes ont besoin dune co-enzyme pour catalyser la raction. Enzymes solubles (enzyme-substrat en phase homogne) ou insolubiliss (enzyme immobilis-substrat en phase htrogne) : enzymes solubles plus actives mais moins stables que les enzymes immobiliss Enzymes utiliss dans des bioracteurs batch (enzymes solubles) ou des bioracteurs continus (bioracteurs lit fixe ou lit fluidis) Utilisation denzymes l'chelle industrielle : la xylose isomrase (ex glucose isomrase isomrisant le glucose en fructose (isoglucose ou HFCS)), les L amino-acylases (production d'acides amins), ...

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Enzyme : A quelle vitesse ?


La cintique enzymatique
k1 Modle de Michalis Menten

E+S
K-1

ES

k2

E+P

d [P ] vmax [S ]0 v= = [S ]0 + K m dt
Si Km >> [S] Si Km << [S] -> raction dordre 1 -> raction dordre 0

vmax = k 2[E ]0
k 1 + k 2 Km = k1

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Exercices
Si vmax=100 mol.ml-1.s-1 et Km = 2mM, quelle est la vitesse de la raction quand [S]=20 mM ?
V=91mol.ml-1.s-1

On trouve les vitesses de raction suivantes pour diffrentes concentrations en substrat : 1 2 4 8 [S]0 (mM) v (mol.ml-1.s-1) 12 20 29 35 Dterminer les constantes de raction de Michalis-Menten
Vmax=51 mol.ml-1.s-1 et Km=3,2 mM

12 40

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Avec quoi : Une usine naturelle


Les cellules : microorganismes ou cellules d'eucaryotes suprieurs.

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Avec quoi : des microorganismes comme usine


Microorganismes (virus, bactries, protistes, levures)
Microorganisme recherch (utilisation du gnie gntique) et cultiv pour la synthse de mtabolites ou la dgradation dun substrat Conditions de culture peu exigeantes par rapport des cellules animales

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Avec quoi : des virus comme usine


Le virus : un combattant en sommeil
Le virus nest pas une vrai cellule mais un amas de matriau gntique entour dune enveloppe protiques. Sans activit en dehors dune cellule dont il utilise lADN pour se reproduire.

Virus de la grippe Influenza

Les virus bactriophages sattaquent aux bactries (il existe un phage pour un type de bactrie) : vecteurs de clonage pour insrer de l'ADN dans les bactries. Un agent antimicrobien performant (pourra terme remplacer les antibiotiques)

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Avec quoi : des bactries comme usine


La bactrie : un organisme vivant unicellulaire procaryote
Trs nombreuses : dix fois plus de cellules bactriennes que de cellules humaines dans le corps humain La plupart sont inoffensives mais certaines sont pathognes (cholra, tuberculose ) : avant la dcouverte des antibiotiques, ces maladies taient parmi les plus meurtrires Mobile, communicante

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Levures (champignon unicellulaire eucaryote)


apte provoquer la fermentation (Saccharomyces cerevisiae) de 5 microns 50 microns peuvent tre pathogne (candida > mycoses)

Saccharomyces cerevisiae

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Avec quoi ? Des cellules animales


La cellule humaine
Taille de 5 20 microns Assemblage de cellule de mme type -> organe -> fonction Conditions de culture plus exigeantes

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Avec quoi ? De lnergie


Processus nergtique
Mtabolisme respiratoire : dgradation complte du substrat
La rfrence loxydation du glucose : C6H12O6 + 6 O2 -> 6CO2 + 6H2O + 688 Kcal Respiration arobie -> 38 ATP -> 277 Kcal rdt 40%

Fermentation alcoolique (levure)


C6H12O6 -> 2CO2 + 2 CH3-CH2-OH + 54 Kcal 2 ATP -> Rdt 2 %

Fermentation lactique (bactrie)


C6H12O6 -> 2 CH3-CHOH-COOH + 22,5 Kcal Acide lactique 2 ATP - > Rdt 2%

Respiration anarobie
C6H12O6 + 12 KNO3 -> 6 CO2 + 6 H20 + KNO2 + 429 Kcal 25 ATP - > Rdt 1 ATP = 7,3 Kcal 1 cal = 4,186 J (SI)

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Exercice

On dispose de 100L de jus de fruit dont la concentration massique en glucose est gale 53.2 g/L .
Quel est le volume de CO2 libr lors de la fermentation alcoolique de ce jus de fruit ? Calculer le degr dalcool obtenu aprs fermentation ?

Degr dalcool : titre volumique qui est le rapport entre le volume d'alcool pur contenu dans le liquide et le volume total (la densit 20 C de lthanol est de 0,791)

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Des Biotechnologies
Quoi ? Pourquoi ? Comment ? Avec quoi ? Dfinition Enjeux Dmarche Matriel biologique + Des bioprocds

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Bioprocds
Le principe de lusine cellulaire Une histoire dans le temps Une implantation dans lespace Un cur : le bioracteur De la qualit grande chelle Une usine dans un environnement Quelques exemples de bioprocds

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Le principe de lusine cellulaire


Le biocatalyseur qui permet de faire dans des conditions douces des ractions (ncessitant des conditions extrmes ou ayant des rendements faibles ex-vivo)
Mtabolites primaires (issus des voies mtabolites ncessaires la survie : la respiration) Usine cellulaire Mtabolites secondaires (souvent produit lorsque le milieu sappauvrit)

Substrat

Le bioprocd permet de faire fonctionner le biocatalyseur avec un contrle fin des conditions

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Lutilisation de lusine cellulaire


Ingnierie tissulaire Culture cellulaire Organe bioartificiel Source alimentaire Biomdical Mtabolites primaires

Substrat Dgradation de la matire organique biormdiation Environnement Conversion biomasse Energie

Usine cellulaire

Alcool Agroalimentaire CO2

Mtabolites secondaires Produit actif Pharmacie

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Une histoire de temps et de volume


Dcouverte en laboratoire dans un mini-procd Pilote de dveloppement Procd industriel

10-100 mL

10-100 L

10-100 m3

Recherche Dveloppement Industrialisation 0 Production 15 ans

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Une srie doprations

Un procd se dcompose en diverses tapes, puis chaque tape en oprations lmentaires.

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Un cur : le bioracteur
Impurets Produits

Purifier Matires premires

Bioracteur

Concentrer Extraire Fractionner sous produit

Effluents Recycler Epurer Rejet

Dchets

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Le cur : Le bioracteur
Bioracteur : terme gnrique driv du vocabulaire du gnie chimique dsignant des rcipients dans lesquels se droulent une raction (bio)-chimique. Ce terme de bioracteur regroupe les fermenteurs (terme ancien) et cytoculteur (terme plus rcent).

B
BioCatalyseur

Dgradation du Substrat Multiplication des cellules -> formation de la Biomasse Production de Produits mtabolites

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Un cur batch
les bioracteur fonctionnant en discontinu ou en batch ne sont pas aliments en continu en substrat : le substrat (solide ou liquide) est introduit au dbut de la raction : traitement par lot ("batch " en anglais)

inoculum

Substrat

Formation de la Biomasse

Produits mtabolites temps

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Un cur continu
Le bioracteur fonctionnant en continu est aliment en continu en substrat : le substrat (en solution) est introduit tout au long de la raction avantages : la transformation des substrats
peut se poursuivre indfiniment et l'appareillage est utilis plein temps (intrt conomique) Substrat

Produits

en pratique :
alimentation en substrat et un soutirage du milieu un mme dbit (pour que le volume reste constant) est utilis durant des priodes plus ou moins longues : un fonctionnement sur des temps longs peut engendrer la modification du matriel biologique (mutation de microorganismes, dnaturation donc inactivation des protines, ...)

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Un cur semi-continu
Le bioracteur fonctionnant en semicontinu (ou en batch aliment ou fed batch) sont partiellement aliments : le substrat est introduit tout au long de la raction mais sans qu'il y ait soutirage du milieu -> le volume augmente Avantages : permet daugmenter le volume
au fur et mesure de la croissance de la biomasse

En pratique : Arrt de lalimentation lorsque


le volume atteint une certaine valeur

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Biomasse : quelle vitesse ?


n Nbre de gnrations 0 X Nbre de cellules 1 20 1 2 21 2 4 22 3 8 23 4 16 24 5 32 25

X=X0 2n Si G est le temps de gnration (temps ncessaire au doublement de la population) : n=t/G X=X0 2t/G
Ln(X) = ln(X0) + ln(2).t G taux de croissance (nprien) (h-1) ou vitesse spcifique de croissance t Ln X Croissance exponentielle de la biomasse

(h-1)

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Exercice
Le temps de gnration est de 20 minutes pour Escherichia coli. On place une bactrie dans des conditions idales de culture.
Calculer le nombre de bactries prsentes au bout de 12h Calculer le taux de croissance nprien

On place 5 L dune suspension de bactries (linoculum) dans un fermenteur de 100 m3.


En considrant le taux de croissance dtermin ci-dessus (on ne tiendra pas compte dune ventuelle phase de latence), dterminer le temps ncessaire pour atteindre une suspension concentration identique dans le fermenteur.

Sol : t=4,7 h

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Culture submerge : un peu dhistoire

conditions d'obtention de cultures pures. Le suivi des conditions de culture est essentiellement empirique : Dbut de la microbiologie industrielle. Clostridium (anarobiose stricte) de l'actone et du butanol utiliss pour la fabrication d'explosifs.

1822-1895 : Les travaux de Pasteur et de Koch dfinissent la notion et les

1915 : durant la premire guerre mondiale Weizman russit faire produire par un

1942 : tude de la culture en milieu liquide, pour la premire fois au laboratoire,


par Jacques Monod (1910 - 1976) dans sa thse soutenue en 1942 consacre Bacillus coli (qui deviendra Escherichia coli en 1954) ;
dfinition de conditions exprimentales de culture prcise permettant l'obtention de rsultats reproductibles dfinition des paramtres de croissance (taux de croissance, rendement de transformation d'un substrat en biomasse ou en un produit, ....)

1945 : premire ralisation industrielle de culture submerge ralise par Florey et


Chain aux USA pour la production de pnicilline, premier antibiotique dont les pouvoirs thrapeutiques ont t mis en vidence. Naissance de lindustrie des antibiotiques. rpandue.

De nos jours : La culture submerge en milieu liquide est ta technique la plus

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De la qualit grande chelle


Il y a des spcificits lies une culture de microorganismes grande chelle :
ncessit d'utiliser des cuves en acier inoxydable de forme bien prcise, ncessit du maintien de la strilit, importance de l'aration. ncessit du contrle et rgulation des paramtres physico-chimiques : la temprature, le pH, l'aration (taux doxygne dissous), lanalyse chimique de composs. Des paramtres constants permettent damliorer la culture et
dans les cas les plus favorables, orientation de la culture par le contrle des paramtres

6m

L? 200 m3

contrle du pH en ligne rgulation PID des paramtres Des modles de bioraction servent de guide pour le suivi et le pilotage du bioracteur et permettent de dtecter des dviations du comportement normal.

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De la qualit grande chelle


Une lgislation
Mise sur le march de nouveaux produits, soumise une Autorisation de Mise sur le March (AMM) : document officiel dont la dlivrance nest effectue quaprs un certain nombre dinvestigations afin de sassurer, par exemple dans le cas dun produit usage pharmaceutique, de sa puret, de sa non toxicit et de son efficacit. Pour lexportation aux tats-unis, la production doit satisfaire la lgislation exigeante de la Food and Drug Administration (FDA).
Plusieurs dizaines de tonnes de dossier !

AMM

Mais aussi de lthique.


Les biotechnologies mettent en uvre de nouveaux produits avec des effets rels ou supposs, volontaires ou involontaires. Une question thique A-t-on raison de faire ce que lon fait ? doit traverser tout travail sur les biotechnologies afin de mettre au premier plan la valeur de la scurit lors de cette mise en uvre. (Ex : problmes lis la libration dans lenvironnement et la nature dOGM)

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Une usine dans son environnement


Une usine
=

bioprocds
+

procds
(mlange, sparation) +

services
(fourniture dnergie, deau de refroidissement, stockage) +

station dpuration
+

administration
Une culture industrielle : la qualit du travail industriel accompli (prvention des accidents, suivi qualit, respect de lenvironnement) peut tre atteste par la certification de linstallation aux normes ISO 9000.

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Bioprocds : quelques exemples


La fermentation :
Depuis trs longtemps, Les bactries comme Lactobacillus, Lactococcus ou Streptococcus, combines aux levures et moisissures interviennent dans llaboration daliments ferments comme les fromages, les yaourts, la bire, le vin, la sauce de soja, le vinaigre, la choucroute.
Grce cette longue paille plonge dans une jarre, il y a 6000 ans, un sumrien gote aux premiers bienfaits de la fermentation : l'orge et le froment ont macr dans l'eau du Tigre. La bire est apparue

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Bioprocds : quelques exemples


Production dacide
Les bactries actiques (Acetobacter, Gluconobacter) peuvent produire de l'acide actique partir de l'thanol. Elles sont rencontres dans les jus alcooliss et sont utilises dans la production du vinaigre. Elles sont galement exploites pour la production d'acide ascorbique (vitamine C) partir du sorbitol transforme en sorbose.

La bactrie bactrie actique (acetobacter aceti) est aussi responsable de la piqure actique des vins
www.itv-midipyrenees.com/.../piqure-acetique.php

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Bioprocds : quelques exemples


Dgradation de composs organiques
La capacit des bactries htrotrophes dgrader une large varit de composs organiques est exploite dans des processus de traitement des dchets comme la bioremdiation ou le traitement des eaux uses. Des bactries sont galement utilises dans les fosses septiques pour en assurer l'puration. Des bactries, capables de dgrader des hydrocarbures du ptrole, peuvent tre utilises lors du nettoyage d'une mare noire. Le processus de nettoyage de milieux pollus par des micro-organismes est la bioremdiation.
complexe bactrien contenant 4 6 bactries du type bacillus. Des microbilles librent pendant 6 mois les bactries. Les diverses bactries produisent des enzymes non OGM (protase, lipase, amylase, cellulase) assurant ainsi le phnomne de liqufaction.

http://acces.inrp.fr/eduterreusages/nappe/html/Ressources/les%20stationsdepuration/lesstationsdepuration

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Bioprocds : quelques exemples


Lutte biologique
Des bactries peuvent tre utilises la place de pesticides en lutte biologique pour combattre des parasites des plantes. Par exemple, Bacillus thuringiensis produit une protine Bt qui est toxique pour certains insectes. Cette toxine est utilise en agriculture biologique pour combattre des insectes qui se nourrissent de plantes.
Un mme remde (les bactries) mais des modes dactions et des consquences trs diffrentes

Il est aussi possible de produire des plantes transgniques (OGM) dite Bt produisant la toxine dans leurs tissus ariens (feuilles et tige). -> Problme daccumulation de Bt dans le milieu naturel

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Bioprocds : quelques exemples


Procds enzymatiques
De nombreuses enzymes utilises dans divers processus industriels ont t isoles de micro-organismes.
Les enzymes des dtergents sont des protases de certaines souches de Bacillus. Des amylases capables dhydrolyser lamidon sont trs utilises dans lindustrie alimentaire. La Taq polymrase utilise dans Scrtion extracellulaire denzymes (marques par un colorant fluorescent) par des bactries les ractions de polymrisation en chane (PCR) pour lamplification de lADN provient dune bactrie thermophile Thermus aquaticus.

La voie enzymatique est une voie possible et prometteuse pour laborer des bio-carburants partir de la biomasse.

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Bioprocds : quelques exemples


Production pharmaceutique
Les bactries gntiquement modifies sont trs utilises pour la production de produits pharmaceutiques : biomdicaments. Cest le cas par exemple de linsuline, lhormone de croissance, certains vaccins, des interfrons Certaines bactries comme Streptomyces sont trs employes pour la production dantibiotiques.

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Organisation de lUE

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Organisation gnrale
Equipe pdagogique
P. Bacchin, C. Causserand, P. Gros, JP. Souchard, T. Tzedakis, P. Vicendo

12 h cours 18 h TD
Cours/TD tudes de cas

18 h TP
Projet Comment produit-on ?

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Cours/TD tude de cas


Semaine 2 (27 et 28 Janvier) : Mardi : Patrice Bacchin (Introduction gnrale de l'UE) Mercredi : Patrice Bacchin (Prsentation du projet -dfinition du travail attendu, rpartition en groupes-) Semaine 3 (3 et 4 Fvrier): Mardi : Patrice Bacchin Les procds de culture de micro-organismes : application la production de principe actif pharmaceutique Mercredi: Patricia Vicendo, Les procds de culture de cellule sur matriaux : application lingnierie tissulaire Semaine 4 (10 et 11 Fvrier) Mardi : Jean Pierre Souchard (La vinification et les procds de fermentation en agroalimentaire) Mercredi : Patricia Vicendo (Les procds de culture de cellule sur matriaux : application lingnierie tissulaire) Semaine 5 (17 et 18 Fvrier) Mardi : Christel Causserand (Les sparations membranaires : applications en agroalimentaire) Mercredi : Suivi du projet 1 Semaine 6 (24 et 25 Fvrier) Mardi : Suivi du projet 2 Mercredi : Christel Causserand (Les sparations membranaires : applications en agroalimentaire)

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Cours/TD tude de cas


Semaine 7 (3 et 4 mars) Mardi : Christel Causserand : Le traitement biologique de l'eau pour lassainissement des eaux uses Mercredi : Jean Pierre Souchard (La vinification et les procds de fermentation en agroalimentaire) Semaine 8 (10 et 11 mars) Mardi : Tho Tzdakis : Bioprocds pour lnergie : de la bio-pile la mthanisation de la biomasse Mercredi : suivi du projet 3 Semaine 9 (17 et 18 Mars) Mardi : suivi du projet 4 Mercredi : Christel Causserand : Le traitement biologique de l'eau pour lassainissement des eaux uses Semaine 10 (24 et 25 Mars) Mardi : Pierre Gros : Les biocapteurs : techniques analytiques pour le contrle des procds et processus biologiques Mercredi : Tho Tzdakis : Bioprocds pour lnergie : de la bio-pile la mthanisation de la biomasse Semaine 11 (31 Mars et 1er Avril) Mardi : Suivi du projet 5 Mercredi : Pierre Gros : Les biocapteurs : techniques analytiques pour le contrle des procds et processus biologiques Semaine 12 (21 et 22 Avril) Suivi des projets Examen du 6 au 20 mai examen crit + prsentation du travail ralis au cours du projet

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Projet Comment produit-on ?


Objectif scientifique : Dcouvrir le monde des biotechnologies en faisant des recherches sur les bioprocds utiliss pour la production de produits dintrt (produit actif pharmaceutique, produits alimentaires vin, pain, bire, quorn-, biocarburant, peau et organes bio-artificiels, biocapteur, eau traite partir deau use, ...) Objectifs dapprentissage :
Rechercher de linformation (en privilgiant les sources sures ) Traiter linformation (en vitant de se noyer dedans) Savoir communiquer : rdiger un diaporama et le prsenter oralement

Outils :
Guide mthodologique de recherche et de traitement de l'information scientifique et technique http://sup.ups-tlse.fr/abcdoc/rechercher-traiterinformation/index2.html Fiche : Recherche en bibliothque, Mthode du classeur, Raliser un diaporama Bibliothque Outil informatique pour les diaporamas

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Projet Comment produit-on ?


28 Janvier Sance 0 : Prsentation des objectifs du projet Constitution des groupes et choix du sujet Premier travail personnel de recherche pour dlimiter le sujet 18 Fvrier Sance 1 : Restitution de la premire recherche et prcision du sujet une rorientation partielle du sujet pourra tre envisage si les informations semblent difficiles trouver24 Fvrier Sance 2 : Prsentation des techniques de recherche la bibliothque et de la technique du classeur pour le traitement de linformation Travail personnel de recherche et de traitement de linformation la bibliothque 11 Mars Sance 3 : Travail tutor de recherche et de traitement de linformation la bibliothque (sance la bibliothque) Travail personnel de recherche et de traitement de linformation la bibliothque 17 Mars Sance 4 : Restitution de la recherche et du traitement de linformation en prsentant le classeur Rendre

le classeur en fin de sance


31 Mars Sance 5 : Prsentation de conseils pour la ralisation du diaporama Travail tutor sur la rdaction des diapositives (les classeurs seront rendu aux tudiants en dbut de sance) Travail personnel de prparation du diaporama 21 Avril Sance 6 : Restitution du travail de prparation du diaporama 22 Avril Sance 7 : Travail sur la prsentation orale Travail personnel de prparation de la prsentation

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Projet Comment produit-on ?


Soutenance du projet : PRESENTATION ORALE DU TRAVAIL (10 de prsentation et 5 minutes de questions) DEVANT LENSEMBLE DE LA PROMOTION Evaluation du projet : 1/3 Note sur le classeur (recherche et traitement de linformation) 2/3 Note sur la prsentation finale (prsentation de linformation) Contact : bacchin@chimie.ups-tlse.fr

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Rfrences
Ren Scriban, Biotechnologie, Tec&Doc Lavosier, 1999 Grard Coutouly, Biotechnologies : la part industrielle, Dossier CRDP Alsace, 2005 (tlchargeable sur http://www.crdpstrasbourg.fr/sciences/biotech/

Colin Ratledge, Bjorn Kristiansen, Basic biotechnology, Cambridge University Press, 2006

Crdits http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr pour les films et animations wikipedia