CROMATOGRAFIA CLASICA

Objetivo:
Conocer el fundamento de la cromatografa y diferenciar los tipos de cromatografa en funcin de la estructura mecnica de los recorridos de separacin, la naturaleza y el estado fsico de las fases y el fenmeno responsable de la distribucin entre las mismas.

Definicin
Puede definirse como una tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (lquida o gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser lquida o slida.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA
Naturaleza de fase estacionaria Naturaleza de fase estacionaria Slido Adsorcin Exclusin Cambio inico Afinidad Lquido Naturaleza de fase mvil Liquido Particin Lquido-lquido ((particin) Lquidoslido)adsorcin, cambio inico, exclusin,Afinida d. Gas Gas-lquido (CGL) Gas-slido (CGS)

CLASIFICACION DE LOS MTODOS CROMATOGRAFICOS

SON DE DOS TIPOS: CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
La fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto La fase mvil es forzada a pasar a travs del tubo bajo presin o gravedad

CROMATOGRAFIA PLANAR
La fase estacionaria est sostenida por una placa plana o papel La fase mvil se mueve por accin capilar o gravedad

Segn el dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase mvil y la estacionaria, se distinguen dos tcnicas:

Columna

Se usa un tubo cilndrico Capa fina Papel (particin)

Plana: El soporte es una placa plana o los intersticios de un papel

Simbologa de las diferentes formas de cromatografa

Criterio de Clasificacin Tcnica
Plana Cromatografa En columna*

Fase mvil

Liquido

Liquido (CP Cromatografa en papel)

Fase estacionaria

Slido (CCF Cromatografa en capa Fina)

Fase Ligada (CCF- Cromatografa en capa fina)

Criterio de Clasificacin Tcnica Fase mvil

Gs

Cromatografa En columna

Fluido Supercrtico

Lquido

Lquido (CGL) c. gaseosa liquida)

Slido (CSS) C. Supercritica Solida

Liquido (CLL) C. Liquido liquido

Fase estacionaria

Slido (CGS) C. Gaseosa slida

Fase Enlazada (CSFL) C. Supercrtica de fase enlazada

Slido

Fase Enlazada (CGFL)

CLS C. Liquido Slido

CE C. Exclusin

Fase Enlazada

CLFE Liquida de Fase Enlazada

CII Intercambio Ionico

CB Bioafinidad

CLASIFICACION
H De acuerdo al medio o soporte de contacto :
Cromatografa en Columna Por presin Por gravedad Cromatografa Planar Por capilaridad Por gravedad

H De acuerdo a la naturaleza de la fase mvil :

Cromatografa de Gases

Cromatografa de Lquidos

Cromatografa de Fluidos Supercrticos

Cromatografia preparativas
La cromatografa preparativa comprende un amplio campo de aplicaciones, desde el aislamiento de 1 g. de muestra para identificacin espectroscpica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g.

Cromatografia preparativas
Cromatografa Frontal:
Procedimiento en el que la muestra (lquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatogrfico. No se utiliza ninguna fase mvil adicional.

Cromatografa de Desplazamiento:
Procedimiento en el cual la fase mvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido ms fuertemente que los componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta, como una pequea cantidad en un intervalo breve.

Cromatografa de Elusin:
Procedimiento en el que la fase mvil se pasa de forma continua a travs o a lo largo del lecho cromatogrfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequea cantidad en un tiempo breve.

Cromatografia Planar Cromatografia papel Cromatografia TLC Cromatografia HPTLC

Cromatografia en columna
Cromatografa d e intercambio inico
La Fase Estacionaria es una resina de intercambio inico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Mvil es generalmente una solucin amortiguadora de pH. En protenas la cromatografa de intercambio inico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga elctrica neta de las protenas a un valor de pH determinado.

Cromatografia en columna
Cromatografia de afinidad
Se trata de un tipo especial de cromatografa de adsorcin slido-lquido en la que la sustancia de naturaleza bioqumica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimticos, lectinas y otras molculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados qumicamente en soportes slidos adecuados, retienen a los solutos (analitos), tambin de naturaleza bioqumica, de manera reversible y selectiva. Las separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la biologa molecular.

Cromatografia en columna
Cromatografa de exclusin molecular Las molculas se separan en solucin segn su peso molecular, o ms precisamente, segn su radio de Stokes. En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa.
A los fines prcticos, la columnas se empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas por esos polmeros entrecruzados.

En consecuencia, estas partculas son porosas, y el tamao de los poros es tal que algunas molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeas) podrn pasar libremente.
Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las molculas que acceden al interior de esta.

Cromatografia en columna
Cromatografia de adsorcin

Mtodos Cromatogrficos. Definiciones.

Cromatografa gas - slido. Se basa en la diferente adsorcin de las sustancias en fase gaseosa sobre superficies slidas. Los coeficientes de distribucin son generalmente mucho mayores que en cromatografa gas lquido. La CSG se lleva a cabo tanto en columnas empacadas como en columnas capilares. En stas se fija en las paredes del capilar una delgada capa de adsorbente; a veces se denominan columnas tubulares abiertas de capa porosa o columnas PLOT. Se encuentran dos tipos de adsorbentes : los tamices moleculares y los polmeros porosos. Cromatografa gas - lquido. Se basa en la distribucin diferencial de los analitos entre una fase gaseosa y una lquida inmovilizada sobre la superficie de un slido inerte.

Cromatografa lquido - slido. Se basa en la adsorcin de sustancias sobre superficies slidas (almina, slica). Factores tales como tamao de partcula, rea de superficie, geometra, esfrica, irregular, porosa o pelicular) son de fundamental importancia. Cromatografa lquido - lquido. Se basa en la interaccin y distribucin diferencial de las sustancias entre una fase mvil lquida y una fase estacionaria lquida presente sobre un soporte slido, adherida o depositada mecnicamente (inmiscible). Cromatografa lquida Fase enlazada- Fase Normal. Es una clase de cromatografa lquido - lquido en la cual la fase mvil es no polar y la fase estacionaria es polar. Los componentes polares sern entonces ms retenidas en la columna que los menos ( o no ) polares.

Cromatografa lquido Fase enlazada Fase Inversa. Clase de cromatografa lquido - lquido en la cual la fase mvil es polar mientras que la fase estacionaria es no polar. Entre menos polar sea el material, su retencin ser mayor. Algunas veces la fase mvil puede modificarse para cambiar su polaridad. En fase normal esto se logra agregando un solvente ms polar mientras que en fase inversa, el aditivo es una sustancia menos polar. Cromatografa de Intercambio Inico. En esta modalidad, la fase estacionaria presenta una superficie inica de carga opuesta a la de la muestra. Esta tcnica se usa casi exclusivamente con muestras inicas o ionizables. A mayor carga de la muestra, la atraccin de la muestra hacia la superficie inica ser mayor y tardar ms tiempo en ser eluda. La fase mvil es un buffer acuoso y el control de la elusin se hace variando el pH y la polaridad.

Cromatografa de Exclusin. En este tipo de cromatografa, la columna se empaca con un material que tiene tamaos de poro precisamente controlados. La muestra se ve sometida a una especie de tamizado y la separacin se logra por diferencias en los tamaos moleculares de los componentes de la muestra. Se conoce como filtracin por gel. Cromatografa de Par Inico. Se basa en la obtencin de un complejo formado a partir de la sustancia inica y una segunda sustancia de naturaleza contraria (contrain) con lo cual se anulan las cargas. El producto de la asociacin estar balanceado elctricamente. Cromatografa de Afinidad . En esta clase de cromatografa la sustancia que se quiere determina se adsorbe covalentemente dentro de una columna a un reactivo especfco para su posterior elucin con un solvente adecuado. Cromatografa de Intercambio Quiral. Se basa en la interaccin selectiva de los enantimeros de una sustancia con un selector quiral presente como fase estacionaria o bien adicionado a la fase mvil.

A tener en cuenta:
La cromatografa lquida puede tener lugar en columnas y sobre superficies planas La cromatografa gaseosa est restringida a procedimientos en columnas.

AQUI NOS QUEDAMOS EL JUEVES 1/10/09

CROMATOGRAFIA DE ELUSIN
Elusin: es un proceso en el cual los solutos son lavados a travs de una fase estacionaria por el movimiento de una fase mvil Eluyente: es un disolvente que se usa para llevar los componentes de una mezcla a travs de una fase estacionaria

Secuencias de la Separacin Cromatogrfica

CROMATOGRAMA
Es una grafica de alguna funcin de concentracin de soluto contra el tiempo o volumen de elusin

 Este grafico es til tanto para anlisis cualitativo como cuantitativo. Las posiciones se pueden emplear para identificar los componentes de la muestra Las reas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada especie

VELOCIDAD DE MIGRACIN
La efectividad de una columna cromatogrfica para la separacin de dos solutos depende en parte de las velocidades relativas a las cuales las dos especies son eluidas. Estas velocidades son determinadas, a su vez, por las relaciones de particin de los solutos entre las dos fases.
C o n c e n t r a c i n

B B A A

Distancia de migracin

Variables fsicas y qumicas que influyen en las separaciones

Se pueden obtener con mayor facilidad separaciones mejoradas mediante el control de variables que 1. Aumenten la velocidad de separacin de bandas 2. Disminuyan la velocidad de ensanchamiento de bandas

a) Cromatografa original con sobreposicin de picos b) la mejora produjo un incremento en la separacin de las bandas c) produjo un decremento en la anchura de las bandas

Tiempo -------

Todas las separaciones cromatogrficas se basan en diferencias en el grado al cual los solutos se reparten entre la fase mvil y la estacionaria.

A mvil A estacionaria
La constante de equilibrio para esta reaccin se llama relacin de particin o coeficiente de particin y se define:

Cs
A mvil A estacionaria

K= Cm

Cs Cm

K = Coeficiente de particin Cs= Concentracin soluto en fase estacionaria Cm= Concentracin en fase movil

Tiempo de retencin
El tiempo de retencin Tr es el tiempo entre la inyeccin de una muestra y la aparicin de un pico de soluto en el detector de una columna cromatogrfica Tiempo muerto Tm es el tiempo que toma para que una especie no retenida pase a travs de una columna

Cromatograma tpico

tr

y
h

to
Wb Wb

Fase estacionaria

Fase mvil

Temperatura

 Los factores de capacidad en la cromatografa se puede variar cambiando la temperatura y el empaque de la columna. En la cromatografa liquida, los factores de capacidad se pueden manipular frecuentemente para dar mejores separaciones variando la composicin de la fase mvil y de la fase estacionaria

EFICIENCIA DE LAS COLUMNAS

Se refiere a la magnitud del ensanchamiento de banda que ocurre cuando un compuesto pasa a travs de la columna

Parmetros Cromatogrficos
Factor de Capacidad. Se relaciona con el tiempo de elusin de un componente de la muestra no retenido relacionado con el de un compuesto no retenido. Se emplea ampliamente para describir las velocidades de migracin de solutos en columnas. El factor de capacidad (KA) depende del tR y del tM tR - tM KA = -------------------tM Cuando el factor de capacidad para un soluto es mucho menor que la unidad, tiene lugar la elusin tan rpidamente que la determinacin de los tiempos de retencin es difcil. Cuando el factor de capacidad quizs sea mayor que 20 a 30, los tiempos de elusin se convierten en excepcionalmente largos. Favorable: entre 1 a 5

Parmetros Cromatogrficos .
Factor de Selectividad (). La selectividad de una columna es una medida del factor de capacidad de un componente de la muestra relativo al de un segundo componente.
KB = ---------KA En donde KB es la proporcin de particin para las especies B retenidas con mas fuerza, y KA es la constante para las especies mantenidas menos fuerte, o sea las eluidas mas rpidamente (A). es siempre mayor que la unidad

Parmetros Cromatogrficos .
Eficiencia . Para definir la eficacia se utiliza el concepto de piso terico, y se define ste como la seccin terico-transversal en la cual se realiza el equilibrio de particin durante el flujo de fase mvil.
Cuanto mayor se el nmero de platos terico (N) mayor ser la eficiencia de la columna.

El nmero de platos tericos mide la capacidad de la columna para separar los componentes, no la retencin de los mismos.
La eficiencia o el nmero de platos se puede observa directamente a partir del cromatograma, observando la agudeza de los picos.

Donde N es el nmero de platos tericos, L es la longitud de la columna, H es la altura de cada plato, t'R es el tiempo corregido de retencin de un componente y ai es la anchura del pico cromatogrfico.

 Si H tiene un valor pequeo, la distancia entre platos es menor y por tanto la eficiencia ser mayor. Por el contrario, si H es grande la columna es poco eficiente para separar ese componente ya que sus molculas estarn muy difundidas. La velocidad de la fase mvil influye en la eficiencia del sistema cromatogrfico, ya que si la velocidad es pequea los componentes tendrn ms tiempo parta que se pueda realizar el equilibrio de reparto, por lo que el nmero de platos ser mayor y la altura de los platos menor.

Parmetros Cromatogrficos .

Altura de plato . Se denomina generalmente como altura equivalente de plato terico. El valor de la altura del plato se calcula fcilmente dividiendo la longitud de la columna por la eficiencia de la misma.

Resolucin : Es una medida de la separacin relativa de dos compuestos en una mezcla.

Resolucin (R o Rs).
Es el parmetro que expresa el grado de separacin que se puede obtener en un sistema cromatogrfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatogrfico para dos componentes. Se define como:

Donde Rs es la resolucin, tRA y tRB son los tiempos de retencin de los componentes A y B, y aA y aB son las anchuras de los picos del cromatograma de los anteriores componentes.

 La resolucin puede observarse directamente sobre el cromatograma de picos.

Se tendr una buena resolucin si los picos no se solapan, y est perfectamente delimitado cada pico, sin que coincida el final de uno con el principio del siguiente.

Si el valor de la resolucin est prximo a 0,7 se obtendr una mala resolucin quedando los picos solapados, de forma que se distinguen las crestas, pero no la base, Si el valor de la resolucin est prximo a 1,5 se obtendrn unos picos bien delimitados por lo que se obtendr una buena resolucin. Una pobre resolucin es debida principalmente a:
Hay demasiada muestra en la columna. La columna o placa es corta. La fase mvil no discrimina entre los componentes. La columna es demasiado gruesa.

Influencia de la forma de la seal sobre la eficiencia

Factores que afectan la eficiencia

Calidad del empaque de la columna Distribucin del tamao de partcula Tamao de las partculas Tipo de estructura del soporte Calidad del material del empaque

Como se puede aumentar:

Aumentando la longitud Aumentando el flujo Disminuyendo la viscosidad Disminuyendo el dimetro Disminuyendo el recubrimiento

 HASTA AQUI EL 3ER PARCIAL Suerte!! http://groups.google.com/group/analisisinstrumental