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DOCUMENTS AFFRENTS

TRAVAUX PRATIQUES DE BACTRIOLOGIE VTRINAIRE

Dans la cadre du cours dInfectiologie vtrinaire DMV 2120

FACULT DE MDECINE VTRINAIRE UNIVERSIT DE MONTRAL C.P. 5000, SAINT-HYACINTHE, QU.

TABLES DES MATIRES


PAGE

Rgles suivre au laboratoire Prlvements de spcimens Guide abrg didentification bactriologique Description des tests microbiologiques Charte dinterprtation des antibiogrammes Coloration de GRAM Les milieux de culture spciaux Mthodes de travail

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RGLES SUIVRE AU LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE


Le laboratoire de microbiologie exige une tenue exemplaire. Les manipulations doivent y tre effectues avec grand soin, gardant l'esprit le danger toujours prsent qu'entrane l'utilisation de cultures microbiennes. Voici quelques rgles que tout(e) tudiant(e) srieux(se) devrait suivre, dans son intrt, comme dans celui de ses confrres et consoeurs. 1. Le port du sarrau est de rigueur. Il devra toujours tre propre et autant que possible, n'tre utilis qu'au laboratoire de microbiologie. Ne jamais oublier de se laver les mains avant et aprs chaque sance de laboratoire. Dsinfecter les tables avant et aprs chaque priode de travaux pratiques. L'tudiant(e) aux cheveux longs verra les attacher surtout lors d'un travail exigeant l'emploi d'un bec gaz. viter de porter ses doigts ou tout objet sa bouche. Ne pas manger ou fumer au laboratoire. Aviser immdiatement le professeur de tout accident (bris de verre, blessures, etc.). Les instruments de travail contamins ne seront dposs sur la table qu'aprs avoir t striliss par un flambage adquat. viter de laisser les brleurs allums inutilement afin de conserver une temprature ambiante confortable. Afin d'viter les contaminations extrieures, ne rien transporter hors du laboratoire (local 2964) sans autorisation. Pendant les travaux pratiques, viter de parler, notamment lorsque des ensemencements sont faits; viter galement de se dplacer inutilement. Dposer tout matriel qui n'est plus utile, dans les rcipients destins cette fin. tiqueter soigneusement les cultures avant de les porter l'tuve.

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PRLVEMENTS DE SPCIMENS

RGLES SUIVRE LORS DE PRLVEMENTS DE SPCIMENS

-Les spcimens doivent tre prlevs du site (priphrie) de la lsion le plus tt possible aprs le dbut de la maladie;

-Les spcimens doivent provenir dun animal vivant sinon le plus tt possible aprs sa mort;

-Il est important de prlever les spcimens aussi aseptiquement que possible pour viter que des contaminants masquent la prsence dun pathogne significatif;

-Il faut toujours effectuer le prlvement avant de dbuter le traitement aux antibiotiques;

-Les spcimens doivent tre mis dans des contenants individuels impermables, bien identifis et avec la date du prlvement;

-Lorsque le dlai entre le prlvement et la rception du spcimen au laboratoire se prolongera, il faut prvenir la dessication du spcimen soit en utilisant un milieu de transport dans le cas dun couvillon, soit en prlevant une plus grande quantit de matriel pathologique ou en envoyant un morceau de tissu dau moins 4cc; de plus, le spcimen devra tre gard 4C mais non congel.

Guide abrg d'identification bactriologique

ISOLEMENT DE BACTRIES USUELLES PARTIR DE SPCIMENS

Dlai

Procdure

Jour 0

Soumission des spcimens Frottis direct color au Gram, Ensemencement sur glose au sang (et McConkey si ncessaire)

Lecture

Jour 1

Culture pure Coloration au Gram (colonies )

Culture mixte Coloration au Gram (colonies)

Jour 2

Identification et antibiogramme si ncessaire

Repiquage sur sang glose au sang et/ou MacConkey

Jour 3 ou plus

Identification et antibiogramme si ncessaire

ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DE SALMONELLA


Dlai
Jour 0

Procdure
Soumission des spcimens (fces, tissus, ...) Milieu d'enrichissement (bouillon slnite) (24 heures 37C) Milieu slectif (glose SS)

Jour 1ou 2 colonies lactose colonies lactose + (Salmonella spp.) TSI autres patrons (Salmonella spp.) TSI suspect pente: alcaline culot: acide seulement H2S: + gaz: + hydrolyse de l'ure + (Salmonella spp.) agglutination au srum anti-Salmonelle

Jour 2 ou 3

}
utilisation du glucose

test supplmentaires (Salmonella spp.)

Jour 3 ou 4 ou 5

Identification avec le systme d'identification API 20E et antibiogramme (si ncessaire)

ISOLEMENT DE BACTRIES ANAROBIES


Dlai Procdure

Jour 0

Soumission des spcimens Frottis direct color au Gram Ensemencement de glose rduite en oxygne Anarobiose, 37C (peut varier) pendant 48 heures

Jour 2

Lecture et repiquage en arobiose, en anarobiose et en CO2 24 - 48 heures

Jour 3 - 4 Jour 4

liminer les anarobies facultatifs Identification des anarobies stricts . coloration de Gram . bile . indole . sensibilit aux agents antibactriens . micro-systme d'identification pour les anarobies (API 20A) Rsultats

Jour 6 - 8

CL D'IDENTIFICATION DE BACILLES GRAM POSITIF

Croissance arobie

SPORE

SPORE

Clostridium spp.

Lactobacillus spp. Eubacterium spp. Propionibacterium spp.

Bacillus spp.

Corynebacterium spp. Erysipelothrix spp. Listeria spp. Mycobacterium spp. Actinomyces spp. Lactobacillus spp. Dermatophilus spp. Rhodococcus spp. Arcanobacterium spp.

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CL D'IDENTIFICATION DES BTONNETS GRAM NGATIF, AROBIES ET ANAROBIES FACULTATIFS

TEST D'OXYDASE

Enterobacteriaceae Acinetobacter spp.

Utilisation du glucose (TSI et/ou tube O/F)

Oxydation

Fermentation

Inerte

Pseudomonas spp.

Mobile

Non-mobile

Alcaligenes faecalis Moraxella spp. Bordetella spp.

Aeromonas spp .Pasteurella spp.* Vibrio spp. Actinobacillus spp.*

* fermentation faible

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OBTENTION DE RSULTATS LA CULTURE APRES SOUMISSION D'UN SPECIMEN (jour 0) AU LABORATOIRE DE DIAGNOSTIC BACTRIOLOGIQUE
La recherche de ces micro-organismes doit tre indique sur le rapport de bactriologie

Temps minimum Moisissures Leptospires Mycoplasmes Urplasmes Brachyspira hyodysenteriae Anarobies "Haemophilus somnus " Haemophilus spp. Actinobacillus pleuropneumoniae Salmonella spp. Listeria spp. Yersinia spp. Campylobacter spp. Hmoculture
a

Temps maximuma 3 sem. 4 sem. 2 sem. 1 sem. 6 jours 8 jours 1 sem. 1 sem. 3 jours 5 jours 6 sem. 6 sem. 5 jours 1 sem.

5 jours 5 jours 5 jours 2 jours 2 jours 2a jours 2 jours 2 jours 1 jour 3 jours 2 jours 3 jours 2 jours 2 jours

____________________ absence de croissance

Pour certaines espces bactriennes (Actinobacillus pleuropneumoniae, Escherichia coli, Salmonella spp. et Streptococcus suis) on peut effectuer galement des analyses additionnelles de typage. Ces rsultats sont obtenus de 7 14 jours partir de la date d'envoi de l'isolat au laboratoire de rfrence.

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Description des tests microbiologiques

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TESTS MICROBIOLOGIQUES POUR IDENTIFICATION BACTRIOLOGIQUE 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Agglutination rapide sur lame Test de CAMP Catalase Citrate Test d'agglutination au latex (PathoDxTM) Coagulase a. en tube b. sur lame Esculine Fermentation des sucres Indole Mobilit Oxydase Oxydation-Fermentation (OF) Phnylalanine Dsaminase (PD) Triple Sugar Iron (TSI) Urase

1. Agglutination rapide sur lame (pour confirmation de l'identification d'un Salmonella) L'agglutination est une raction entre des cellules entires de micro-organismes et des agglutinines. Les agglutinines sont des anticorps pouvant provoquer des agglomrations de cellules. Se fixant la surface des bactries ou des cellules qui ont induit leur production, elles agissent comme agents de pontage entre celles-ci et les agglutinent. Les agglutinations ainsi produites se voient l'oeil nu. Technique A partir d'une colonie, transfrer, l'aide d'anse de platine, un inoculum deux endroits sur une mme lame de verre. Sur l'un d'eux ajouter une goutte de saline et sur l'autre ajouter l'antisrum. A l'aide d'un bout de btonnet de bois, bien mlanger la saline et l'inoculum. Si cette suspension bactrienne est bien homogne, non auto-agglutinante, bien mlanger l'antisrum et l'inoculum et observer la prsence d'agglutination.

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2. Test de CAMP Principe Dterminer si un organisme synthtise le facteur CAMP qui agit en synergie avec l'hmolysine B du staphylocoque, ce qui produit une lyse complte des rythrocytes la jonction des deux organismes. Technique Sur une glose au sang, faire une strie de Staphylococcus aureus avec le fil de platine. Faire une deuxime strie avec la culture identifier, de faon ce qu'elle soit perpendiculaire celle du Staph. aureus. Cette deuxime strie ne doit pas toucher la premire, tout en tant trs proche. Plusieurs cultures peuvent tre soumises l'preuve sur la mme glose. Incuber 37C jusqu'au lendemain.

Rsultats Raction positive: zone typique d'hmolyse complte en forme de pointe de flche, la jonction des deux stries. Raction ngative: aucune augmentation de l'hmolyse la jonction des deux stries. 3. Catalase Principe Dmontrer la prsence de l'enzyme catalase. Technique A l'aide d'une anse de platine, transfrer partir d'une glose au sang, une partie d'une colonie si les colonies sont moyennes et plus d'une colonie si les colonies sont petites. Il faut parfois en prendre plus qu'une (sans glose au sang car le sang contient de la catalase et donne une raction positive) sur une lame de verre propre. Ajouter une goutte de peroxyde d'hydrogne (H2O2, 30%) sur la colonie place sur la lame.

Interprtation Raction positive: effervescence (bulles de gaz) immdiate dans le peroxyde.

Raction ngative: absence d'effervescence dans le peroxyde. 15

4. Citrate Principe Dterminer si la bactrie peut utiliser le citrate comme seule source de carbone. Technique (milieu de Simmons) A partir d'une croissance sur glose, l'aide d'une anse de platine, faire un prlvement peu abondant afin d'inoculer en zigzaguant la surface de la pente du milieu glos. Incuber 37C pendant 18-24 heures. Rsultats Raction positive: croissance accompagne d'un bleuissement du milieu.

Raction ngative: pas de croissance, le milieu reste vert. 5. Test d'agglutination avec particules de latex (PathoDxTm)

Principe La technique de coagglutination et d'agglutination avec particules de latex sont similaires. Le principe est le suivant: des anticorps de lapin, spcifiques des groupes de Lancefield A, B, C, D, F et G sont lis des particules microscopiques de latex (PathoDxTm). Losqu'on mlange un chantillon contenant des streptocoques appartenant l'un de ces groupes au ractif du groupe correspondant, les antignes spcifiques se trouvant la surface des streptocoques se lient aux anticorps spcifiques correspondants. Un rseau de coagglutination se forme, visible l'oeil nu.

Technique sur colonies Ajouter 2 gouttes de Ractif 1 et de Ractif 2 dans un tube. Prlever de 1 4 colonies sur une glose avec une anse ou un couvillon. Placer l'anse ou l'couvillon dans le tube contenant les ractifs. Mlanger avec les ractifs. Retirer immdiatement l'anse ou l'couvillon. 16

Ajouter 4 gouttes de Ractif 3. Mlanger en tapant lgrement avec son doigt sur le tube. l'aide d'une pipette Pasteur ajouter pour chaque groupe tester 2 gouttes de l'extrait bactrien par ovale. Ajouter une goutte de Strep B latex dans le premier ovale. Ajouter une goutte de Strep C latex dans le deuxime ovale. Ajouter une goutte de Strep. G latex dans le troisime ovale. Mlanger et bercer la carte pour un maximum de 60 secondes.

6. Coagulase Principe Ce test sert dterminer si la bactrie est capable de coaguler le plasma par l'action de l'enzyme coagulase. a. en tube Technique Dans un tube contenant 0,5 mL de plasma de lapin dilu, faire une suspension de la culture bactrienne en prenant, l'aide d'une anse de platine, quelques colonies sur la glose au sang. Incuber 37C. La raction se produit en dedans de 3 4 heures. Dans le cadre des T.P. de bactriologie, la lecture se fera le lendemain.

Rsultats Raction positive: Raction ngative: b. sur lame Technique Sur une lame propre, mettre une goutte d'eau distille ou de saline. Suspendre un fort inoculum du micro-organisme identifier (1 colonie d'une culture pure de 18-24 heures) dans la goutte d'eau ou de saline (vrifier l'autoagglutination). 17 plasma coagul. plasma liquide.

Si non autoagglutin, mlanger le tout avec une anse de plasma de lapin. Raction positive: Raction ngative: formation d'un prcipit blanc (5 20 secondes) aucune coagulation (prcipit) entre 3 et 4 minutes.

Tout test de coagulase sur lame ngatif doit tre confirm par un test de coagulase en tube.

7. Esculine Principe Ce test sert dterminer l'habilit d'un micro-organisme hydrolyser l'esculine en esculetin et glucose.

Technique A l'aide d'un fil de platine, inoculer une glose sang-esculine en faisant une strie. Incuber 37C.

Rsultats Raction positive: Raction ngative: noircissement de la glose autour de l'inoculum. aucun changement.

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8. Fermentation des sucres Principe Dterminer la capacit de la bactrie dgrader un sucre donn mis dans un milieu de base, et ce, en produisant de l'acide. Technique A partir d'un bouillon de culture, ensemencer des tubes contenant diffrents sucres et un indicateur de pH. Incuber 37C pendant un minimum de 24 heures.

Interprtation Raction positive: Raction ngative: pH acide. pH alcalin.

La couleur du milieu dpend de l'indicateur de pH.

9. Indole Principe Dterminer la capacit de la bactrie former de l'indole partir du tryptophane. Technique Milieu SIM ou Gillies ou MRP (pour les Pasteurella spp. et Actinobacillus spp.) Inoculer en piquant le fil droit au centre une profondeur de 1,5 cm ou simplement inoculer le milieu si liquide. Incuber 37C pendant 18-24 heures. Aprs incubation, ajouter 4-5 gouttes de ractif de Kovacs et agiter lgrement s'il s'agit du test en milieu liquide.

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Rsultats Raction positive: anneau rouge la surface du milieu.

Raction ngative: anneau jaune (couleur du ractif). 10. Mobilit Principe Dterminer si la bactrie est mobile et si elle est mobile, conclure qu'elle est flagelle. a.Technique de Gillies Technique Inoculer en piquant le fil droit au centre en une profondeur de 1,5 cm. Incuber 37C pendant 18-24 heures.

Rsultats Test positif: une culture de bactries mobiles s'loignera de la ligne d'inoculation et se diffusera dans le milieu qui deviendra alors rose. Test ngatif: la croissance reste limite au point d'inoculation.

b.

Technique l'tat frais

Technique Mettre une goutte de suspension bactrienne (phase exponentielle) sur une lame ou mettre une goutte de saline sur une lame et transfrer une colonie (culture de 18 heures), l'aide d'une anse de platine, pour crer une suspension bactrienne homogne.

Rsultats Observer la suspension bactrienne au microscope optique en dplaant le condensateur au plus bas et en diminuant le diaphragme de moiti. Attention : ne pas confondre la mobilit bactrienne et le mouvement Brownien des particules.

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11. Oxydase Principe Ce test permet de dterminer si un micro-organisme possde le systme enzymatique (cytochrome c) lui permettant d'utiliser l'oxygne libre (O2) comme accepteur final d'lectron dans la chane respiratoire. Technique (API) Dgager lecarr de carton imprgn du ractif de son emballage (papier en aluminium); A partir d'une colonie, l'aide d'un btonnet en bois, transfrer par rotation l'inoculum sur un coin dun des quadrants (4 tests par quadrant); Attendre 20 secondes avant de dterminer s'il y a ou non changement de couleur. Toute raction aprs 20 secondes ne doit pas tre considre.

Interprtation Raction positive: couleur pourpre

Raction ngative: pas de couleur pourpre.

12. Oxydation-Fermentation (OF) Principe Ce test sert dterminer si un micro-organisme utilise les sucres par mtabolisme oxydatif ou fermentaire ou s'il ne l'utilise pas. Technique A partir d'une culture sur glose et l'aide d'un fil de platine droit, inoculer en enfonant votre fil jusqu' 1 mm du fond dans le milieu OF (tube trangl contenant un sucre donn, gnralement du glucose). Incuber 37C pendant 18-24 heures.

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Interprtation Tube avec tranglement Rsultat Fermentation Oxydation Inerte


a b

Partie suprieure Jaunea Jaune Vert ou bleub

Partie infrieure Jaune Vert Vert

Jaune: utilisation du sucre (acidification du milieu) Vert ou bleu: non utilisation du sucre

13. Phnylalanine dsaminase (PD) Principe Dterminer la capacit de la bactrie de dsaminer la phnylalanine en acide phnylpyruvique (A.P.P.); ceci produit l'acidification du milieu. Ce test permet de distinguer des autres genres bactriens, les membres de la tribu des Proteeae. Technique A partir de la croissance sur glose, recueillir un inoculum concentr pour ensemencer la pente du milieu en tube. Incuber 37C jusqu'au lendemain. Pour la lecture du rsultat, ajouter 4-5 gouttes de ractif (solution de chlorure ferrique) et osciller le tube lentement pour rpandre le ractif sur toute la surface de la pente.

Rsultats Raction positive: verdissement de la pente et du liquide.

Raction ngative: pas de changement de couleur, demeure jaune comme la couleur du ractif.

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14. Triple Sugar Iron (TSI) Principe Dterminer la capacit de la bactrie d'utiliser plus d'un des sucres (glucose, lactose ou sucrose), avec ou sans production de gaz, et de produire du sulfure d'hydrogne (H2S). Technique En partant d'une colonie, inoculer le culot en piquant avec un fil droit au centre puis inoculer la pente en effectuant une strie sinueuse. Incuber 37C jusqu'au lendemain.

Rsultats Fermentation du glucose seulement: culot jaune et pente rouge. Fermentation du glucose et un des deux autres sucres (lactose ou sucrose): culot et pente jaune. Aucun sucre dgrad: pente rouge et culot rouge ou orange. Production de gaz: bulle(s) de gaz, milieu compltement spar ou soulev. Production de H2S: prcipit noirtre plus ou moins abondant. 15. Urase Principe Dterminer si un micro-organisme a la capacit d'hydrolyser l'ure et ainsi former de l'ammoniaque, ce qui cause l'alcalinisation du milieu. Technique (milieu de Christensen) A partir de la croissance sur glose, recueillir un inoculum abondant l'aide d'une anse de platine et ensemencer la surface de la glose en pente en formant une strie sinueuse. Incuber 37C pendant 18-24 heures. Rsultats Raction positive: couleur rose intense. Raction ngative: couleur inchange (lgrement jaune).

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Charte d'interprtation des antibiogrammes

CHARTE D'INTERPRTATION DES ANTIBIOGRAMMES


Diamtre de la zone d'inhibition (mm) Agent antibactrien Ident. des disques AMP Bat G entriques Actino. pleuropneumoniae Staphylocoques Strept. non-entrocoques Entrocoques Chloramphnicol1 Autres que streptocoques streptocoques C
-

Charge du disque (g)

Rsistant

Limite

Sensible

Ampicilline

10 10 10 10 10 30 12 17

13 21 28 18 16

14-16 22-24 19-25 -

17 25 29 28 17

13 - 17 18-20

18 21

Erythromycine Gentamicine Kanamycine Pnicilline Staphylocoques Strept. non-entrocoques Entrocoques Autres (Btonnets Gram ngatif) Streptomycine Sulfamides Ttracycline Actino. pleuropneumoniae Trimthoprimesulfamthoxazole

E CN K P

15 10 30

13 12 13

14 - 22 13 - 14 14-17 18

23 15

10* 10* 10* 10* S S3 TE SXT 10 250 ou 300 30 30 1.25/23.75

28 19 14 11 11 12 14 25 10

20 - 27

29 28 15

12 - 21 12 - 14 13 - 16 15 - 18 26 - 28 11 - 15

22 15 17 19 29 16

* Units internationales au lieu de 1 Usage interdit chez les animaux destins la consommation humaine.

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Coloration de GRAM

COLORATION DE GRAM MODIFIE PAR REED COLORANTS: 1. 2. 3. Crystal violet Bicarbonate de sodium Iode Hydroxide de sodium (solution 1 M) Dissoudre l'iode dans l'hydroxide de sodium avant d'ajouter l'eau distille Eau distille Alcool thylique 95% Actone Fuchsine basique (solution sature dans alcool thylique 95%) Eau distille 2,5 g/L 12,5 g/L 20,0 g/L 100 mL

900 mL 750 mL 250 mL

4.

5.

100 mL 900 mL

TECHNIQUE : 1. 2. Prparer un frottis sur lame de verre. Fixer la chaleur. Couvrir le frottis avec une quantit gale de crystal violet et de bicarbonate de sodium. Souffler lgrement sur la lame pour bien mlanger. Laisser en contact pendant 30 secondes. Couvrir la lame avec la solution d'iode et laisser en contact pendant 30 secondes. Laver soigneusement avec l'eau du robinet. Dcolorer la lame avec le mlange d'alcool-actone jusqu' ce que l'alcool-actone n'entrane plus de colorant (5 10 secondes). Laver immdiatement l'eau du robinet. Couvrir le frottis avec la fuchsine basique (2 3 secondes). Laver l'eau et scher. Examiner le frottis un grossissement de 1000X.

3.

4.

5.

6.

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Les milieux spciaux

28

Milieu slectif pour les staphylocoques: Mannitol Salt Agar (MSA) But: Principe: Pour l'isolement des staphylocoques. 1. Ce milieu contient une concentration en sel de 7,5%, ce qui inhibe la croissance de la majorit des bactries autres que les staphylocoques. 2. Ce milieu contient du rouge de phnol et du mannitol. Si le staphylocoque fermente le mannitol, le changement de pH provoquera un jaunissement du milieu. Cette information aidera l'identification l'espce en cause (Staphylococcus aureus). Milieu slectif pour les streptocoques: COLUMBIA (C) But: Principe: Pour l'isolement des streptocoques. 1. Ce milieu contient de l'acide oxolinique, de la colistine, de la nomycine et de la polymyxine B qui permettent l'isolement de streptocoques partir de spcimens du tractus respiratoire suprieure. Les bactries Gram ngatif sont totalement inhibes ainsi que presque toutes les bactries Gram positif autres que les streptocoques.

Milieu slectif pour les bactries Gram ngatif: MacConkey (McC) But: Isolement des Enterobacteriaceae et autres micro-organismes Gram ngatif. 1. La prsence de sels biliaires inhibe la croissance des bactries Gram positif. 2. La prsente concentration de cristal violet est toxique pour certaines bactries Gram ngatif et bactriostatique pour les bactries Gram positif. 3. Ce milieu contient aussi du lactose et du rouge neutre. Les germes, qui dgradent le lactose, forment des colonies qui intgrent le colorant. Cette raction est due l'action des acides, produits par la fermentation du lactose sur les sels biliaires.

Principe:

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Milieu slectif pour les salmonelles: Salmonella-Shigella (SS) But: Principe: Favoriser lisolement de Salmonella spp et de Shigella spp. 1. Ce milieu contient des sels biliaires et du vert brillant qui inhibent totalement la croissance des bactries Gram positif et, un degr moindre, les certaines bactries Gram ngatif. 2. Ce milieu contient du lactose et du rouge neutre. Les germes qui dgradent le lactose forment des colonies qui intgrent le colorant. 3. Ce milieu contient un sel de fer qui ragit avec le H2S produit par certaines bactries. Ces dernires donnent alors des colonies avec un centre noir. N.B. Les salmonelles ne dgradent pas le lactose et donnent des colonies incolores avec ou sans un centre noirtre.

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Mthodes de travail*

__________________ * Tir de: Cahier

de

T.P.

en

Microbiologie

gnrale

PTM

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