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Matriels Appareillage : -Agitateur magntique -Bain marie agitateur -Centrifugeuse rfrigre -Conglateur (-80C et -20C) -Etuve -Nphlemtre -PH

H mtre -Pipette lectronique -Spectrophotomtre -Vortex Les quipements : -Balance. -Chronomtre. -Cupules. -Embouts. -Eppendorfs. -Gants usage unique. -Glace pile. -Micropipettes rglables de 0,5 1000l. -Portoirs. -Tubes coniques. -Tubes en verre et en plastique de 5ml. La Verrerie : -Bcher. -Eprouvettes gradues de 1ml 1000ml. -Erlenmeyer. -Pipettes pasteur. -Pissette. -Tube essai. -Tube visse.

Mthodes : 1- Recrutement des patients : Les patients ont t recruts au niveau : du service de gastro-entrologie de lhpital Mohamed Lamine DEBAGHINE, et de lhpital Mustapha BACHA, service de nphrologie de lhpital Parnet, dhmodialyse de Rouiba ainsi que le centre de transfusion sanguine de Ain-Taya ainsi qu linstitut pasteur.

Aprs trois mois de recrutement, 70 chantillons sanguins de patients infects par le virus de lhpatite C avec en parallle trente individus sains servant de temoin ont pu tre rcolt. Tous les participants de ltude ont sign un consentement aprs avoir t inform du but de la recherche et du devenir des prlvements.

2- Collecte du sang et sparation des plasmas et srums : Le sang est rcolt dans un tube Falcon et dans un tube sec. Les tubes Falcon contiennent de lanticoagulant EDTA qui est un chlateur dions (Ca2+), afin dempcher linactivation spontane du complment ; pour la technique du CH50. Les tubes sont maintenus +4C jusqu lacheminement vers le laboratoire. Les tubes EDTA sont centrifug 2000 rpm pendant 10 minutes +4C, le plasma obtenu est aliquot dans des Eppendorfs laide dune micropipette ; et stock -80C afin de conserver lactivit du complment. Le srum est rcupr partir des tubes secs aprs dcantations puis centrifugation 2000 Rpm/min pendant 10min +4C, et conserv -20C.

3- Dosage du complexe hmolytique (CH50) : Principe : Le test CH50 est un dosage hmolytique fonctionnel, qui consiste utiliser des rythrocytes de mouton sensibiliss par des anticorps de lapin anti-rythrocytes (hmolysine). Le complexe immun form active la voie classique du complment. On dfinit alors le CH50 comme la quantit de srum donnant 50% dhmolyse, et on lexprime en pourcentage dun tmoin constitu dun pool de srums normaux qui est le plasma humain normal (PHN). Mode opratoire : A-Prparation des globules rouges sensibiliss : -Des globules rouges de mouton (GRM) sont successivement lavs avec un tampon de lavage GVB-EDTA et centrifug 2000 Rpm/min 10minutes +4C. -Une suspension 5% de ces GRM dans le mme tampon est ensuite prpare (v/v). -La concentration des cellules est quilibre 109/ml, en ajustant la concentration de 100l de ces derniers dans 2900 ml deau distill sur une longueur donde de 541 nm pour une densit optique de 0,37. -La suspension est sensibilis avec un volume de GVB-EDTA, en ajoutant 2V dhmolysine (Ac de lapin anti-hmaties de mouton) dans un bain marie agitateur pendant 30 minutes.

-Des lavages des GRM sensibiliss sont effectus avec du GVB-EDTA puis du GVB++, qui est un tampon riche en Ca2+ et Mg2+, afin dactiv la voie classique du complment. -Le culot est resuspendu dans un volume de GVB++ gale au volume de la premire suspension avec le GVB-EDTA. B-Dilution et rpartition des plasmas : -Les plasmas des patients et le PHN sont dilus au 1/30me, puis la srie de dilution suivante est effectue : Tube 1 400 Tube 2 350 100 300 Tube 3 300 150 300 Tube 4 250 200 300 Tube 5 200 250 300 Tube 6 150 300 300 Tube 7 100 350 300 T0 450 0 300 T100 450 0 300 BLANC 450 300 0

GVB++ (l) Plasma 50 dilu (l) EA (l) 300

*T0= lyse spontane des hmaties *T100= lyse totale des hmaties -Les dilutions sont ensuite dposs pendant 30 minutes dans le bain marie agitateur. -La raction est stoppe avec 1,7 ml deau physiologique, sauf pour le T 100 larrt de la raction se fait par leau distille, afin davoir un maximum de lyse. -Aprs une centrifugation de 1500 Rpm/min, pendant 5minutes, on peut voir une dgradation de couleur a lil nue.

Figure : Schma gnrale de la technique du CH50

Le pourcentage de lyse est exprim en fonction de la quantit de srum ajoute quon mesure par lecture spectrophotomtrique de la D.O 541nm du surnageant et qui sera proportionnelle la quantit dhmaties lyses.

Calcul du titre du CH50 :


-Une courbe avec en abscisse les concentrations du srum et en ordonne le pourcentage de lyse (Y) est trace. Y = [(DO Echantillon - DO T0)/ (DO T100 - DO T0)] x 100 -La concentration donnant 50% dhmolyse est extraite du graphe afin de calculer le titre du CH50 CH50 (Units /ml) =1/ Volume de srum donnant 50% dhmolyse

Figure : Courbe reprsentant le dosage du CH50. (Daprs Gorochov et Papo ; IMMUNOLOGIE, INTER MED)

4- Dosage des fractions C3 et C4 du complment par nphlmtrie: Principe: Le dosage antignique des protines du complment C3 et C4 par la mthode immunochimique est base sur limmunoprcipitation en milieu liquide de complexes immuns afin de dterminer la concentration dun Ag soluble. Un faisceau lumineux est dvi par les complexes immuns forms par les antignes recherchs avec des anticorps monoclonaux spcifiques. La quantit de lumire difracte est proportionnelle la quantit de protine recherche. Mode opratoire:

- Les srums des patients sont dilus au 1/11me avec un tampon de raction. 40l de la dilution est dpos dans une cuvette contenant un barreau magntique. -La cupule est place dans le nphlmtre. Puis laide dune pipette lectronique on rajoute respectivement 400l de tampon et 40l danti srum spcifique la fraction recherche (C3 ou C4). -La concentration de la fraction prsente dans lchantillon est alors indique sur lappareil.

Figure : courbe de variation de la quantit de prcipit en fonction du rapport Ag/Ac (Daprs Audigi, Dupont et Zonszain, Principes des mthodes dAnalyse biochimique)

5-Technique dimmunodiffusion radiale Principe

Le dosage par immunodiffusion radiale est appliqu pour la quantification dAc solubles dans les liquides biologiques. Cest une technique dimmunoprcipitation sur un milieu glifi. Elle est base sur la diffusion dun Ag partir dun puits cylindrique creus dans un gel dagarose contenant des Ac spcifiques. Au cours de la diffusion, des anneaux de prcipitations sont forms autour des puits correspondant des complexes Ag-Ac. Au point final de diffusion une courbe de calibration linaire est tablie en reportant les diamtres carres des annaux de prcipitation en fonction de la concentration de chacun des 3 calibrateurs. partir de la courbe de calibration, la concentration en Ag dun chantillon sera directement obtenue par extrapolation du diamtre au carre de lanneau de diffusion.

Figure : Courbe de calibration linaire des diamtres au carres des calibrateurs en fonction de leurs concentrations. (Daprs Gene Mayer; IMMUNOGLOBULINS- ANTIGEN-ANTIBODY REACTIONS AND SELECTED TESTS). A. Dosage de la protine C1q : (ELISA, EUROIMMUN, Germany) Le dosage de C1q ncessite : -Des calibrateurs avec diffrentes concentrations (Haut, Moyen, Bas) lyophilis, sont reconstitus avec un volume deau distille. -Les srums des patients et le contrle sont dilus au avec du BSA 7%. Aprs homognisation, 10L de chaque composant est dpos dans un puits de la plaque IDR, contenant des Ac monospcifiques dirigs contre la protine C1q. Au bout de 96 heures dincubation 20C, les diamtres des anneaux de diffusion sont mesurs, et partir de la courbe de calibration tablie, la concentration de C1q pour chaque patient est extrapole. B. Dosage du Facteur B : (ELISA, EUROIMMUN, Germany) -Un calibrateur lyophilis est reconstitu avec de leau distill. Ce dernier est dilu 60% et 10% avec du BSA7% afin dobtenir 3 calibrateurs : pure (haut), diluer 60 %(moyen) 10% (bas). et un contrle

-Les srums des patients ne ncessitent pas de dilution. 5l de chaque composant est alors dpos dans un puits, de la plaque IDR, contenant des Ac monospcifiques dirigs contre le facteur B. Au bout de 72 heures dincubation 20C, aprs avoir tablie une courbe de calibration linaire, la concentration en Facteur B de chaque chantillon est alors obtenue aprs mesure des diamtres.

5- Extraction de lADN par la mthode phnol chloroforme Principe Cette mthode consiste extraire les acides nucliques partir du sang total prlev dans un anticoagulant, en utilisant le couple phnol/chloroforme .Dans un premier temps le culot leucocytaire est prpar, en liminant les globules rouges par une solution de lyse. Puis dans un deuxime temps la libration de lADN des leucocytes dans le milieu, et la digestion des protines qui lui taient associes. Cette technique ncessite lextraction phnolique qui est base sur la solubilit diffrentielle des acides nucliques entre deux phases non miscibles, et lextraction chloroformique qui complte laction du phnol en dnaturant les protines insolubles et en sparant la phase aqueuse de la phase organique. Mode opratoire

A- Lyse des globules rouges Dans un tube Falcon, 45ml de la solution de lyse des globules rouges (SLR) est ajoute 10ml du sang prlev dans de lEDTA. Le mlange est ensuite agit et dpos -20C pendant 20minutes en agitant toutes les 5min pour acclrer la lyse. Aprs centrifugation 4000 Rpm/min pendant 20minutes et limination du surnagent, lopration est refaite avec des lavages successifs jusqu lobtention dun culot blanc qui peut tre soit conserv - 20C, soit directement extraire lADN. B- Lyse des globules blancs Ajouter au culot blanc obtenu 3ml de solution de lyse (SLB), 600l de SDS 10% et 35l de protinase K (10mg/ml), homogniser et incuber la suspension une nuit 37C. C- Prcipitation de lADN Aprs une nuit dincubation, un volume de phnol, et de chloroforme est ajout au culot cellulaire. Le mlange est ensuite agiter par retournement pendant 5minutes, et cenrifuger 4000 Rpm/min pendant 20 min Par la suite, la phase aqueuse est rcuprer dans un tube, puis ajouter 300l de NaCl et 2V dthanol pur, afin de prcipiter lADN, et agiter dlicatement par retournement jusqu' apparition de la mduse dADN.

Transfrer la mduse dans un Eppendorf et liminer compltement lalcool sous une hotte. Resuspendre lADN dans 500l de tampon (TE 10/1), et faire dissoudre lADN sous un agitateur rotatif temprature ambiante jusqu dissolution complte de la mduse et enfin conserver 4C.

Figure : Les principales tapes de lextraction dADN par la mthode phnol chloroforme.

D- Estimation de la concentration dADN La quantit dADN extraite est dtermine par spectromtrie, en mesurant labsorbance 260 nm sachant quune unit de DO 260 nm est quivalente 50 g/ml dADN monobrin. Il est indispensable de mesurer la DO 280 galement afin destimer le degr de puret dADN, en calculant le rapport R = DO 260/ DO 280 et qui est compris entre: 1,5<R< 2. Par la suite la quantit de lADN dun chantillon est calculer par la formule suivante : Facteur de dilution X 50 X (DO 260nm DO 280nm) *Si R< 1,8 => Prsence de protines, ce qui ncessite un nouveau traitement la protinase K et au phnol chloroforme. *Si R> 2 => Prsence dARN.

ANNEXES 1. Les produits et tampons utilises pour le dosage du CH50 : Produit utiliss : -NaCl (Chlorure de sodium). -NaOH. -MgCl2. -CaCl2. -Diethy barbital sodique. -Barbitone. -Glatine. -EDTA (Acide ethylne diamine ttractique) dissodique 2H2O. Ractifs : -Globules rouges du mouton. -Hmolysine (Ac de lapin anti globule rouge du mouton). -Pool de plasma humain normal. Tampons utilises : o EDTA anti-coagulant : -NaOH (5g/125ml de lED)...35,5ml -EDTA..22,25g -EDqsp. 500ml o Solution du CaCl2 0,03M -CaCl2 441g -ED...qsp...1l o Solution du MgCl2 0,1M -MgCl2 (4,9mol/l)2ml -ED ..96ml o Solution EDTA 0,086M pH=7,5 Dissoudre chaud -EDTA disodique 2H2O ......64,01g -ED1,5l -Ajuster le PH 7,5 avec du NaOH (environ 15ml). Puis complter 2L avec de lED. o Glatine 10% Dissoudre chaud -Glatine ...1g -EDqsp10ml o VBS 5X Dissoudre froid -ED .1l -NaCl 85g

-Diethy barbital sodique 3,75g -Dissoudre chaud -Barbital acide 5,75g -Les 2 solutions sont ensuite mlanges, et compltes jusqu' 2l avec de lED, le PH compris entre 7,4 et 7,6. o VBS1X -Dilution du VBS 5X au 1/5me avec de lED. o GVB - VBS 1X 500ml -Glatine 10%...................................................................................................................5ml o GVB++ - GVB ...250ml - CaCL2 0,03M 1,25ml -MgCl2 0,1M 1,25ml o GVB-EDTA 0,01M - GVB 250ml -Enlever un volume de 28,75ml de GVB -EDTA28,75ml

2. Les solutions et ractifs utilises pour le dosage C1q, facteur B, C3 et C4 le dosage de C1q et facteur B :

-Plaques IDR dirige contre C1q (14 puits). -Plaques IDR dirige contre facteur B (14 puits). -1 flacon deau distille. -1 flacon de solution de srum albumine bovine (BSA) 7%. -3 flacons de calibrateurs lyophiliss pour C1q. -1 flacon de calibrateur lyophilis de facteur B. -1 flacon de contrle lyophilis. le dosage de la protine C3 et C4 : -Tampon de dilution -Antisrum minineph dirig contre C3. -Antisrum minineph dirig contre C4. -Tampon minineph C3. -Tampon minineph C4. -Carte magntique minineph C3. -Carte magntique minineph C4. (Elles contiennent des dtails de la courbe de calibration spcifique de chaque lot dantisrum). 3. Les produits et solutions phnol/chloroforme): Les produits utiliss : utilises pour lextraction dADN (Mthode

-EDTA 5%. -NaCl 3M. -NaOH. -SDS 10% (Dodcylsulfate de sodium). -Tris 1M pH=8 (Tris hydroxy mthylamino mthane). Solution EDTA (0,5M pH=8) -EDTA..186,12g -ED.qsp1000ml Solution NaCl (3M) -NaCl.175,32g -ED..qsp 1000ml Solution Tris -Tris..121g -EDqsp 1000ml Solution de lyse des globules rouges (SLB) : Tris-EDTA (1/2) -Tris 10ml -EDTA 20ml -H2O. 1000ml Solution de lyse des globules blancs (SLR): Tris-EDTA (1/1) -Tris 10ml -EDTA 10ml -H2O. 1000ml Solution de solubilisation de lADN : EDTA (TE 10/1) -Tris 10ml -EDTA 1ml -H2O. 1000ml Solution SDS 10% -SDS5g
-ED.qsp 50ml