29-09-2010 Curso de Especializao Tecnolgica em Qualidade Ambiental

Manual de monitorizao microbiolgica ambiental

1.Qualidade microbiolgica do ar e de superfcies
Unidade de formao: Monitorizao ambiental | microbiologia Manuela Abelho

Manuela Abelho

Manual de monitorizao microbiolgica ambiental

1.Qualidade microbiolgica do ar e de superfcies

ndice
1.Noes bsicas de microbiologia prtica ..................................................................... 4 Esterilizao e assepsia ............................................................................................... 4 Meios de cultura .......................................................................................................... 5
Protocolo 1.1 Preparao e distribuio de um meio de cultura ...................................................... 5

Observao de clulas microbianas ............................................................................ 6

Protocolo 1.2 Protocolo 1.3 Elaborao de um esfregao fresco .............................................................................. 7 Elaborao de um esfregao seco e colorao de Gram ............................................. 7

Cultura e isolamento de microrganismos ................................................................... 8

Protocolo 1.4 Protocolo 1.5 Protocolo 1.6 Protocolo 1.7 Diluies decimais sucessivas ...................................................................................... 9 Sementeira por incorporao ..................................................................................... 10 Sementeira por espalhamento em placa .................................................................... 11 Isolamento por riscado em placa ................................................................................ 11

Avaliao quantitativa de populaes .......................................................................12

Protocolo 1.8 Contagem de clulas viveis em placas ..................................................................... 12

2.Qualidade microbiolgica do ar .................................................................................13 Ar ambiente e ar interior ...........................................................................................13 Microrganismos no ar interior...................................................................................13 Legislao aplicvel ....................................................................................................14
Bactrias ................................................................................................................................................ 14 Fungos ................................................................................................................................................... 14 Legionella ............................................................................................................................................. 15

Procedimentos gerais .................................................................................................16 3.Qualidade microbiolgica de superfcies ................................................................... 17

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Procedimentos gerais ................................................................................................. 17 4.Mtodos especficos ................................................................................................... 18 Ar ............................................................................................................................... 18

Protocolo 1.9 Amostragem do ar por sedimentao ........................................................................ 18

Material e mtodos ............................................................................................................................... 18 Protocolo 1.10 Amostragem do ar por filtrao ................................................................................ 19 Material e mtodos ............................................................................................................................... 19

Superfcies ..................................................................................................................19
Protocolo 1.11 Amostragem por zaragatoa ...................................................................................... 19

Referncias citadas ....................................................................................................... 20

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1.Noes bsicas de microbiologia prtica

Esterilizao e assepsia
Para a preparao e cultura de microrganismos em laboratrio deve utilizar-se material e meios de cultura estreis. Para efectuar a esterilizao1 existem vrios mtodos, que devem ser utilizados de acordo com o tipo de material a esterilizar. Para a esterilizao de materiais resistentes a altas temperaturas (e.g., vidro) utiliza-se o calor seco, recorrendo a estufas que atingem temperaturas de 160-180C. Outro tipo de calor seco consiste na incinerao ou queima directa pelo fogo e utiliza-se por exemplo para esterilizar ansas no bico de Bunsen, assim como para a eliminao de lixos slidos dos hospitais (Alcntara et al., 1996). Os materiais como os meios de cultura, ricos em humidade, no podem ser esterilizados pelo calor seco. Para esterilizar meios de cultura e outros lquidos resistentes ao calor utiliza-se o calor hmido recorrendo a um aparelho denominado autoclave. O calor hmido destri rapidamente os microrganismos por coagulao das suas protenas. O tempo de morte trmica, i.e., o intervalo de tempo necessrio para destruir clulas vegetativas ou esporos at ao nvel pretendido inversamente proporcional temperatura. A conjugao dos factores tempo-temperatura depende das caractersticas do produto a esterilizar e da sua estabilidade trmica. Nos autoclaves desenvolve-se uma atmosfera de vapor que permite a subida da temperatura a valores superiores a 100C e portanto a rpida esterilizao de materiais. O calor hmido evita a evaporao excessiva quando se trata de meios lquidos e solues, pelo que o mtodo de esterilizao mais adequado a estes materiais. O tempo de tratamento trmico est relacionado com a temperatura mas tambm com o volume a esterilizar, i.e., com o tempo de penetrao do calor no interior do material. Para a mesma temperatura os tempos de tratamento trmico aumentam com o aumento do volume a esterilizar (Alcntara et al., 1996). Existem outros mtodos de esterilizao que no utilizam calor e que devem ser utilizados quando o material a esterilizar no resiste ou alterado por temperaturas

Esterilizao a destruio ou remoo de todos os microrganismos, patognicos ou no, de um dado material. No confundir com desinfeco, que consiste na remoo ou na inactivao de parte ou de todos os microrganismos patognicos presentes num dado material (Ferreira et al., 2010).

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elevadas: filtrao, radiaes e compostos qumicos. A filtrao utilizada principalmente para a esterilizao de antibiticos e vitaminas e tambm para a esterilizao do ar. Neste processo, os microrganismos so removidos por passagem do lquido ou do ar atravs de uma membrana filtrante de poro inferior ao tamanho mais vulgar dos microrganismos mais pequenos, i.e., 0.2 m2. As radiaes, como os raios gama, os raios x e a radiao ultra-violeta, so utilizadas para a esterilizao de materiais sensveis ao calor. Os principais compostos qumicos (e.g., sabes, sais biliares, fenis, lcoois, cloro, ) normalmente utilizados na esterilizao eliminam as clulas vegetativas mas no so eficazes sobre as formas esporuladas (i.e., formas de resistncia) dos microrganismos. Mesmo utilizando materiais estreis, necessrio manter o local de trabalho isento de contaminaes. A assepsia um conjunto de medidas que permitem manter um ser vivo ou um material inerte isento de contaminaes por microrganismos. As condies mnimas de assepsia incluem a limpeza e desinfeco da bancada, uso de bata limpa (por vezes estril), lavagem e desinfeco das mos, cabelos presos (por vezes cobertos) e mscara quando necessrio. Durante a manipulao de material microbiolgico, as condies de assepsia podem ser mantidas utilizando uma bancada com fluxo e/ou uma chama de um bico de Bunsen. Para as condies de assepsia contribuem tambm a rapidez da execuo sob a zona de influncia da chama, evitar correntes de ar e contaminaes pelo operador (Alcntara et al., 1996).

Meios de cultura
Para cultivar microrganismos em laboratrio necessrio fornecer-lhes as condies mais adequadas para o seu crescimento. Existem diversos tipos de meios de cultura, que contm diferentes quantidades e tipos de nutrientes e que, slidos ou lquidos, tornam possvel a multiplicao de diferentes tipos de microrganismos em laboratrio. Protocolo 1.1 Preparao e distribuio de um meio de cultura 1. Seguindo as instrues da embalagem, pesar a quantidade de p necessria para preparar o volume indicado pelo docente;

O micrmetro (m) a milionsima parte do milmetro (mm), i.e., 1 mm=1000 m e 1 m=0.001 mm.

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2. Medir o volume necessrio de gua destilada numa proveta e transferir para um Erlenmeyer (ou para um frasco prprio com tampa de enroscar) o p pesado e a gua destilada; 3. Colocar um magnete dentro do Erlenmeyer/frasco e agitar numa placa de aquecimento at obter uma soluo lmpida; 4. Ajustar o pH de acordo com as instrues da embalagem, adicionando gota a gota as solues cida ou alcalina; 5. Tapar o Erlenmeyer com a rolha de algodo e papel de alumnio (ou enroscar parcialmente a tampa do frasco); 6. Colocar o Erlenmeyer/frasco com o meio de cultura a esterilizar no autoclave (121C durante 15- 20 minutos); 7. Retirar o Erlenmeyer/frasco da autoclave e deixar arrefecer at atingir uma temperatura que permita o seu manuseamento, mas superior a 42C (a esta temperatura o agar solidifica); 8. Desembrulhar as caixas de Petri esterilizadas e identificar com o nome do meio de cultura e a data da sua elaborao; 9. Verter o meio de cultura nas caixas de Petri em condies de assepsia, fazendo uma camada de aproximadamente 5 mm; 10. Deixar solidificar, inverter e guardar a 4C.

Observao de clulas microbianas

Para a observao de microrganismos vivos pode recorrer-se a preparaes a fresco. Este tipo de preparaes deve ser efectuado imediatamente antes da sua observao e permite por exemplo observar a existncia ou no de mobilidade, o tipo de locomoo, etc. Existem objectivos que tornam conveniente a colorao das preparaes, por exemplo: Aumento do contraste entre as clulas e o meio (o ndice de refraco do protoplasma bacteriano muito semelhante ao do meio circundante, sendo difcil o exame das bactrias em preparaes no coradas, a no ser que se usem mtodos especiais de iluminao como por exemplo a microscopia de contraste de fase); Diferenciao de organismos que reagem de modo diferente ao mesmo corante (coloraes diferenciais); Observao de estruturas particulares (e.g., parede celular, material nucleico, esporos, cpsula, etc.).

A colorao de Gram baseia-se no facto de que quando as bactrias so coradas com certos corantes bsicos, as clulas de Gram-negativo podem ser facilmente

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descoradas com solventes orgnicos (e.g., etanol, acetona), enquanto as clulas das espcies Gram-positivo resistem a esta descolorao. A capacidade das clulas reterem ou perderem o corante reflecte diferenas na estrutura fundamental da parede celular, pelo que a resposta colorao de Gram uma caracterstica taxonmica importante, usada numa fase inicial da identificao das bactrias. Protocolo 1.2 Elaborao de um esfregao fresco 1. Retirar com a pina uma lmina de vidro do recipiente e inflamar chama; 2. Colocar uma gota de gua destilada esterilizada na lmina; 3. Esterilizar uma ansa chama e deixar arrefecer; 4. Tocar na colnia com a ansa e suspender o material na gota de gua; 5. Espalhar o lquido numa rea de aproximadamente 1 cm2, esfregando bem de forma a separar a massa de clulas; 6. Colocar uma lamela, pressionar ligeiramente e observar ao microscpio. Protocolo 1.3 Elaborao de um esfregao seco e colorao de Gram 1. Retirar com a pina uma lmina de vidro do recipiente e inflamar chama; 2. Colocar uma gota de gua destilada esterilizada na lmina; 3. Esterilizar uma ansa chama e deixar arrefecer; 4. Tocar na colnia com a ansa e suspender o material na gota de gua; 5. Espalhar o lquido numa rea de aproximadamente 1 cm2, esfregando bem de forma a separar a massa de clulas; 6. Segurar a lmina com uma pina e passar rapidamente sobre a chama at toda a gua evaporar para fixar o material; 7. Realizar uma colorao de Gram das diferentes colnias (Figura 1.1), da seguinte forma: 8. Inundar o esfregao fixado com violeta de cristal (corante primrio) agitando suavemente durante 60 segundos; 9. Lavar com gua corrente, comeando na extremidade da lmina e deixando escorrer por cima do material fixado; 10. Inundar o esfregao com soluo de Lugol, deixando actuar durante 60 segundos (vai formar um complexo com o violeta de cristal); 11. Lavar com gua corrente e secar com papel de filtro, pressionando suavemente o papel contra a preparao; 12. Inundar o esfregao com lcool iodado (agente descolorante), agitando suavemente durante 60 segundos; 13. Inundar com corante vermelho safranina durante 30 segundos, lavar e secar com papel de filtro;

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14. Observar ao microscpio, verificando se as clulas so Gram-positivas ou Gramnegativas e registando a sua forma e a sua dimenso.

Figura 1.1 A colorao de Gram. Nas bactrias Gram-negativas, o lcool remove os lpidos da membrana externa da parede celular, aumentando a sua permeabilidade; o complexo violeta de cristal-iodo pode assim ser extrado, descorando as bactrias. Nas bactrias Gram-positivas, o tratamento com lcool resulta na sua desidratao, com reduo da permeabilidade da parede e consequente reteno do complexo violeta de cristal-iodo. Fonte: http://www.livronline.com/servicos/gratuitos/mb1504/ (consultado em 29 Junho 2007).

Cultura e isolamento de microrganismos

Os microrganismos esto presentes na natureza em comunidades mais ou menos complexas. No entanto, o estudo das propriedades e caractersticas dos microrganismos tornou necessrio o desenvolvimento de tcnicas que permitissem a obteno de organismos separados (ou isolados) dessas comunidades, em culturas puras. A cultura e o isolamento de microrganismos so duas operaes bsicas em Microbiologia. O crescimento de populaes microbianas em meios de cultura no laboratrio, permite a obteno de culturas puras culturas que contm apenas um tipo de microrganismo ou de culturas mistas culturas que tm mais do que um tipo de microrganismo. O isolamento promove a separao de um microrganismo a partir de populaes mistas. As culturas puras podem ser obtidas atravs dos seguintes mtodos: Mtodo das estrias ou de riscado em placa: um mtodo de isolamento bastante rpido. Consiste na diluio de uma pequena poro de inculo, colhida com uma ansa, a qual sucessivamente riscada na superfcie de um meio de cultura slido. A execuo do riscado pode ser feita por vrios processos.

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Mtodo das diluies sucessivas: consiste na realizao de diluies sucessivas da amostra, em condies de esterilidade, e posterior sementeira de quantidades conhecidas das mesmas em caixas de Petri. A sementeira (operao que consiste em distribuir uniformemente o inculo em meio de cultura apropriado) pode ser feita superfcie (pelo mtodo do espalhamento em placa), em camada dupla e por incorporao.

Em qualquer dos casos visa-se o desenvolvimento de uma populao a partir de uma nica clula inicial e ser importante fazer subculturas a partir de uma colnia isolada, para certificao da pureza das culturas. O crescimento dos microrganismos em meio slido d origem formao de colnias (crescimento macroscopicamente visvel resultante da multiplicao celular). Se as clulas microbianas estiverem completamente dispersas, cada colnia corresponde a uma bactria inicial em estado vivel e cultivvel. Se os microrganismos estiverem agregados ou aderentes a pequenas partculas no h correspondncia entre o nmero de colnias obtido e o nmero inicial de microrganismos. Desta forma, relativamente origem de uma colnia, ou ao teor de microrganismos determinado por contagem de colnias, fala-se em Unidades Formadoras de Colnias (UFC). Aps a obteno de uma cultura pura, a sua manuteno em laboratrio deve garantir que os microrganismos permaneam viveis, geneticamente homogneos e protegidos de posteriores contaminaes. As culturas podem ser mantidas por refrigerao (4C), congelao (-20C, -70C ou em azoto lquido: -180C) ou liofilizadas. Para conservao a longo prazo devero usar-se substncias crioprotectoras (e.g., glicerol). Protocolo 1.4 Diluies decimais sucessivas 1. Identificar os tubos de ensaio, com as referncias 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, ; 2. Com uma pipeta esterilizada retirar em assepsia 1 ml da amostra da populao fornecida; 3. Introduzir a aliquota de 1 ml no primeiro tubo de diluio (tubo com soro fisiolgico); 4. Homogeneizar a suspenso por agitao (vrtex), segurando a rolha para que no salte; 5. Com outra pipeta esterilizada retirar 1 ml da diluio do primeiro tubo (diluio 10-1) e introduzir num segundo tubo de diluio, para obteno da diluio 10-2; 6. Proceder de igual modo at ltima diluio, seguindo o esquema da Figura 1.2;

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7.

Semear imediatamente, de acordo com os mtodos indicados nos pontos seguintes, seguindo a ordem decrescente das diluies e utilizando uma s pipeta para todas as sementeiras da mesma amostra.

Figura 1.2

O mtodo das diluies decimais sucessivas

Protocolo 1.5 Sementeira por incorporao 1. Manter um meio de cultura (slido) liquefeito num banho a 45C (o agar comea a solidificar a 42C); 2. Identificar 5 caixas de Petri esterilizadas com a data, turma e n de aluno e diluio respectiva e marcar uma caixa de Petri extra com a letra C (controlo); 3. Seguindo a ordem decrescente das diluies, retirar 1 ml de cada uma das diluies com uma pipeta esterilizada, depois de a ter enchido e esvaziado pelo menos 6 vezes na suspenso de microrganismos; 4. Entreabrindo apenas o suficiente a tampa da caixa de Petri, colocar o contedo da pipeta no fundo da caixa; 5. Tirar a rolha do tubo de meio slido liquefeito, passar a boca do tubo pela chama e verter, de uma s vez, o seu contedo na caixa de Petri; 6. Incorporar o inculo no meio de cultura: mantendo a caixa assente sobre o tampo na bancada, agite-a (descrever cinco crculos no sentido dos ponteiros do relgio,

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cinco outros em sentido contrrio e movimentos rectilneos segundo duas direces cruzadas, cinco vezes cada tambm) evitando que o agar toque a tampa da placa e deixe repousar at solidificar; 7. Na caixa controlo no se deposita inculo: verter o contedo de um tubo de meio da mesma maneira que anteriormente;

8. Aps solidificao do meio, identificar as caixas com a data de inoculao, diluio e microrganismo inoculados, inverter e incubar a 25C durante dois dias. Protocolo 1.6 Sementeira por espalhamento em placa 1. Identificar convenientemente o material a inocular; 2. A partir de cada uma das diluies pipetar 0.1 ml para a superfcie do meio de cultura solidificado; 3. Com um espalhador de vidro estril espalhar o inculo por toda a superfcie da caixa semeada, rodando-a simultaneamente; 4. Identificar as caixas, colocar em posio invertida e incubar a 25C durante dois dias. Protocolo 1.7 Isolamento por riscado em placa 1. Com uma ansa esterilizada e arrefecida tocar numa colnia isolada; 2. Riscar com a ansa a superfcie do agar, de acordo com um esquema que vise esgotar completamente o material contido na ansa (Figura 1.3); 3. Identificar e colocar a caixa de Petri em posio invertida a incubar a 25C durante uma semana.

Figura 1.3 Exemplo de um riscado em placa, mostrando as quatro direces do riscado. O objectivo do riscado o esgotamento do inculo e a obteno de colnias derivadas de uma nica clula inicial. Para maior eficcia no processo de esgotamento do inculo, pode esterilizar-se a ansa entre os riscados 1, 2, 3 e 4, esperando que arrefea em assepsia antes de iniciar o riscado seguinte.

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Avaliao quantitativa de populaes

A avaliao quantitativa do crescimento microbiano pode ser feita de diversas formas, dependendo das caractersticas do material e da informao pretendida. Os parmetros medidos so normalmente os seguintes: Actividade dos microrganismos que constituem a populao em estudo, por exemplo, reduo de corantes (medida pelo grau de reduo em determinado tempo ou pelo tempo necessrio reduo), libertao de CO2 (pelo volume ou pela massa perdida), consumo de O2 (pela chamada Carncia Biolgica de Oxignio, CBO). Massa celular, uma vez fixadas as condies de observao e conhecida a funo que relaciona a massa celular com o nmero de microrganismos presentes. Nmero de clulas: contagem dos microrganismos, directa ou total (ex. cmaras de contagem e mtodo de Breed) e indirecta ou de viveis (ex. contagem em placas e mtodo do Nmero Mais Provvel - NMP).

O nmero de clulas viveis (clulas com capacidade para se multiplicar) presentes numa populao microbiana pode ser estimado usando tcnicas de contagem em placas. Neste mtodo um volume conhecido de uma suspenso de microrganismos, convenientemente diluda, espalhado na superfcie de um meio de cultura solidificado (sementeira por espalhamento em placa) ou incorporado nesse meio (sementeira por incorporao). As colnias que se desenvolvem, aps incubao adequada, so contadas. Assume-se que cada colnia originada a partir de uma nica clula, o que nem sempre verdade, pelo que os resultados so normalmente expressos em termos de unidades formadoras de colnias (UFC). Para que os resultados sejam significativos as placas contveis devero ter entre 30 a 300 colnias. O nmero total de microrganismos obtm-se multiplicando o nmero de colnias pelo factor de diluio. Protocolo 1.8 Contagem de clulas viveis em placas 1. Observar as caixas de Petri inoculadas, seleccionar apenas as que permitam contar entre 30 a 300 colnias e contar as colnias nas placas seleccionadas; 2. Calcular o nmero mdio das diversas repeties; 3. Calcular o nmero de clulas viveis presentes na suspenso original (UFC/ml), i.e., a abundncia de microrganismos cultivveis.

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2.Qualidade microbiolgica do ar
Ar ambiente e ar interior
A qualidade do ar o termo que se usa, normalmente, para traduzir o grau de poluio no ar que respiramos. A poluio do ar provocada por uma mistura de substncias qumicas, lanadas no ar ou resultantes de reaces qumicas, que alteram o que seria a constituio natural da atmosfera. Estas substncias poluentes podem ter maior ou menor impacte na qualidade do ar, consoante a sua composio qumica, concentrao na massa de ar em causa e condies meteorolgicas. Assim, por exemplo, a existncia de ventos fortes ou chuvas podero dispersar os poluentes, ao passo que a presena de luz solar poder acentuar os seus efeitos negativos. Na legislao no est contemplado o uso de parmetros microbiolgicos na avaliao da qualidade do ar ambiente. A qualidade do ar no interior dos edifcios um dos factores bsicos no conforto dos utilizadores e tambm influencia a sua sade, bem como o rendimento e durao do equipamento e maquinaria existentes na rea de tratamento do ar. A qualidade do ar interior (QAI) deve, assim, ser avaliada peridica e sistematicamente, com o objectivo de garantir nveis mnimos de qualidade. Para alm de vrios compostos considerados poluentes, na legislao est prevista a monitorizao da qualidade microbiolgica do ar interior.

Microrganismos no ar interior
Alm das partculas poluentes no biolgicas, o ar contm bioaerossis, que correspondem a material biolgico transmitido pelo ar. Os contaminantes biolgicos incluem microrganismos (bactrias, fungos, vrus), caros, plen, traas, plo e fezes de animais. As bactrias (e.g., Staphylococcus spp. e Micrococcus spp.) e fungos (e.g., Penicillium spp., Aspergillus spp. e Cladosporium spp.) so os mais frequentemente associados com biocontaminantes e com queixas quanto qualidade de ar de interiores. Entre as principais fontes de contaminao fngica esto os sistemas de ventilao mecnica, em funo do seu funcionamento deficiente e de misturar ar filtrado externo com ar reciclado (Filho et al., 2000). A quantidade e o tipo de microrganismos existentes dentro de um espao fechado esto directamente relacionados com: A existncia de suspenses orgnicas e minerais no ar; A temperatura e a humidade relativa As condies de manuteno dos sistemas de climatizao existentes A higiene das instalaes O nmero e o nvel de higiene dos seus ocupantes.

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Legislao aplicvel
Decreto-Lei 79/2006 | http://www.dre.pt/pdf1sdip/2006/04/067A00/24162468.PDF

Aprova o Regulamento dos Sistemas Energticos de Climatizao em Edifcios, publicado em anexo. Transpe parcialmente para a ordem jurdica nacional a Directiva n 2002/91/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho de 16 de Dezembro, relativa ao desempenho energtico dos edifcios. Define os parmetros microbiolgicos a avaliar e os valores mximos admissveis para cada parmetro (Tabela 1.1).
Tabela 1.1 Parmetros microbiolgicos e valores mximos admissveis a considerar na determinao da qualidade do ar interior (Decreto-Lei 79/2006)

Bactrias Fungos Legionella3

NUFC/m3 500 500 100

Bactrias Grupo muito vasto de microrganismos (organismos microscpicos) composto por seres procariotas (i.e., sem ncleo individualizado e sem organelos intra-celulares) e unicelulares. Podem ter a forma de esferas (i.e., cocos) ou de bastonetes (i.e., bacilos). Fungos Grupo de organismos que inclui as leveduras, os bolores, os cogumelos, etc. Os bolores so fungos filamentosos e as leveduras so fungos unicelulares. As suas clulas so eucariotas (i.e., tm ncleo individualizado e organelos intra-celulares).

Em edifcios com sistemas de climatizao em que haja produo de aerossis (e.g., torres de arrefecimento ou humidificadores por gua lquida), ou com sistemas de gua quente para chuveiros onde a temperatura de armazenamento seja inferior a 60C. Pesquisa em amostras de gua recolhidas nos locais de maior risco (e.g., tanques das torres de arrefecimento, depsitos de gua quente e tabuleiros de condensao).

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Legionella uma bactria Gram-negativa4, mvel, com forma de bastonete (Figura 1.4). Pode causar pneumonia (doena dos legionrios) ou uma doena semelhante gripe (doena de Pontiac). Foi pela primeira vez identificada e reconhecida como causadora de doenas numa conveno da American Legion Convention que teve lugar em Filadlfia (EUA) em 1976. Existem mais de 40 espcies de Legionella, das quais 18 podem causar doenas. Pensa-se que a maioria das infeces devida a espcie Legionella pneumophila. A Legionella um microrganismo fastidioso, i.e., tem necessidades muito especficas para que possa sobreviver e crescer: (1) temperatura > 20C; (2) presena de ferro; (3) presena de cistena5; (4) presena de biofilme6 (principalmente protozorios). Ao contrrio de outras bactrias, pode sobreviver com baixos nveis de oxignio dissolvido e , pelo menos parcialmente, resistente desinfeco com cloro.

A tcnica de Gram ou colorao de Gram uma tcnica de colorao de preparaes histolgicas para observao ao microscpio ptico, utilizada para corar diferencialmente bactrias com base na composio qumica e na integridade da sua parede celular. Consoante a cor que adquirem, so classificadas em Gram-positivas (roxo) ou Gramnegativas (vermelho). O mtodo se deve ao mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram (1853-1938). Geralmente as bactrias Gram-negativas so mais patognicas que as Gram-positivas. Cistena um dos aminocidos codificados pelo cdigo gentico, sendo portanto um dos componentes das protenas dos seres vivos. Os biofilmes so comunidades biolgicas com um elevado grau de organizao, onde os microrganismos formam comunidades estruturadas, coordenadas e funcionais. Estas comunidades biolgicas encontram-se embebidas em matrizes polimricas produzidas por elas prprias. Os biofilmes podem desenvolver-se em qualquer superfcie hmida, seja ela bitica ou abitica. A associao dos organismos em biofilmes constitui uma forma de proteco ao seu desenvolvimento, favorecendo relaes simbiticas e permitindo a sobrevivncia em ambientes hostis.

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Figura 1.4 Fotografia de Legionella sp., mostrando o tamanho do bastonete e o flagelo que lhe permite mobilidade. Fonte: http://mcb.berkeley.edu/labs/vance/legionella.jpg

Procedimentos gerais
Existem dois mtodos principais para a monitorizao dos microrganismos do ar, monitorizao passiva e monitorizao ou amostragem activa. A monitorizao passiva levada a cabo por sedimentao do ar em caixas de Petri standard com meio de cultura generalista, abertas e expostas ao ar durante um perodo de tempo conhecido. Este mtodo no permite, pelo menos directamente, a contabilizao do nmero de colnias por unidade de volume de ar. Para alm disso, as caixas de Petri podem ser contaminadas por microrganismos proveniente de outras fontes de contaminao que no o ar. Por outro lado, um mtodo fcil de usar e com baixos custos. A monitorizao activa necessita de um amostrador de ar, que filtra volumes conhecidos atravs de um filtro que depois incubado em meio apropriado. Embora ambos os mtodos sejam utilizados, na legislao portuguesa est indicado o mtodo da filtrao para a quantificao das bactrias e dos fungos do ar. Para a distino de fungos e leveduras pode recorrer-se observao macroscpica das colnias e observao microscpica das suas clulas. A determinao de Legionella efectuada nas guas e no no ar, pelo que os mtodos de anlise sero abordados noutra seco.

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3.Qualidade microbiolgica de superfcies

A amostragem e a anlise dos microrganismos presentes em superfcies permitem determinar se os mtodos de limpeza e desinfeco utilizados so eficazes.
Tabela 1.2 Parmetros microbiolgicos e valores mximos admissveis a considerar na determinao da qualidade de superfcies.

NUFC/cm2 Bactrias aerbias7 mesfilas8 totais 100

Procedimentos gerais
Para a determinao de bactrias aerbias mesfilas totais utiliza-se o mtodo da zaragatoa (objecto semelhante a um cotonete gigante). Utiliza-se a zaragatoa humedecida para limpar uma superfcie com rea conhecida e inocula-se meio de cultura apropriado em caixa de Petri recorrendo ao mtodo do riscado.

Classificao quanto s necessidades de oxignio. Os microrganismos podem ser aerbios ou anaerbios. Dentro dos aerbios existem os aerbios obrigatrios ou estritos (s conseguem sobreviver na presena de oxignio na concentrao atmosfrica cerca de 20%) e os microaerfilos (necessitam de oxignio mas no toleram a concentrao atmosfrica; necessitam de 2-10%). Dentro dos anaerbios existem os anaerbios obrigatrios ou estritos (morrem na presena de oxignio), os anaerbios facultativos (no necessitam de oxignio para sobreviver mas crescem melhor na sua presena) e os aerotolerantes (crescem igualmente bem na presena ou na ausncia de oxignio; no usam oxignio, ignoram-no). Classificao quanto s necessidades de temperatura. Os microrganismos mesofilos vivem numa gama de temperaturas amenas (a nossa temperatura ambiente); a temperatura mxima que toleram menor que 50C, a temperatura mnima deve ser maior que 15C e a temperatura ptima 35C. Os microrganismos psicrfilos (que vivem a baixas temperaturas) tm temperatura mxima menor que 20C, a temperatura mnima pode ser menor que 0C e a temperatura ptima 5-10C. Os microrganismos termfilos vivem a temperaturas elevadas; temperatura mnima de 45C, temperatura mxima pode ultrapassar 80C e a temperatura ptima 55-65C.

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4.Mtodos especficos
Ar
Protocolo 1.9 Amostragem do ar por sedimentao Os microrganismos presentes no ar sedimentam a taxas variadas dependendo do tipo/tamanho das partculas em suspenso e do movimento do ar da sala. A amostragem por sedimentao no determina directamente o nmero de microrganismos presentes num dado volume de ar, mas possvel transformar os resultados deste mtodo (n de UFC/unidade de rea) em n de UFC/unidade de volume. Para isso, necessrio conhecer a rea da caixa de Petri exposta ao ar e a razo entre o nmero de clulas na superfcie e nmero de clulas no ar (SAR). A SAR para ambientes com sedimentao espontnea, i.e., sem aparelhos que forcem o ar, 23:1 (Morais et al., 2010). O nmero de UFC em cada metro cbico de ar calcula-se de acordo com a seguinte equao (Friberg et al., 1999a; Friberg et al., 1999b):

Existem caixas de Petri de vrios tamanhos. As caixas de Petri utilizadas no nosso laboratrio tm dimetro de 8 cm, pelo que a sua rea aproximadamente 50 cm2 ou seja, 0.0050 m2. Para calcular a rea de uma caixa de Petri, medir o seu dimetro (cm), dividir por 2 para obter o raio (R) e aplicar a frmula para determinar a rea (rea = R2). Para transformar o resultado obtido (cm2) em m2, dividir por 10000. Material e mtodos 1. Elaborar meio de cultura para bactrias (Plate Count Agar, PCA) e para fungos (agar nutritivo); 2. Identificar as caixas com o nome do meio de cultura e a data de elaborao; 3. Deitar o meio nas caixas de Petri, deixar arrefecer e solidificar; 4. Abrir as caixas ao ar no local desejado, tendo o cuidado de utilizar pelo menos duas repeties para cada um dos tipos de microrganismo; 5. Deixar em exposio durante 30 minutos; 6. Fechar as caixas, inverter, identificar e colocar na estufa (30C para as bactrias e 25C para os fungos); 7. Deixar incubar durante 24-48 horas e contabilizar o nmero de UFC em cada caixa; 8. Calcular o nmero de UFC por m3 do ar da sala; 9. Comparar o resultado obtido com a legislao e concluir.

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Protocolo 1.10 Amostragem do ar por filtrao A forma correcta de aplicao deste mtodo consiste na utilizao de um amostrador que permite determinar com exactido o volume de ar filtrado. O mtodo aqui descrito pretende ultrapassar a limitao imposta pela no existncia de um amostrador. Material e mtodos 1. Ligar a bomba de vcuo ao aparelho de filtrao, colocar uma membrana e cronometrar o tempo que o aparelho demora a filtrar um volume conhecido de gua. Utilizar este resultado para fazer uma estimativa do ar filtrado pelo aparelho durante um dado perodo de tempo; 2. Elaborar meio de cultura para bactrias (Plate Count Agar, PCA) e para fungos (agar nutritivo); 3. Identificar as caixas com o nome do meio de cultura e a data de elaborao; 4. Deitar o meio nas caixas de Petri, deixar arrefecer e solidificar; 5. Com uma pina estril, colocar uma membrana estril no aparelho de filtrao, ligar a bomba de vcuo e cronometrar o tempo necessrio para filtrar o volume de ar pretendido; 6. Desligar a bomba de vcuo e, em condies de assepsia, retirar o filtro com uma pina estril, colocar sobre o meio de cultura; 7. Em condies de assepsia e utilizando a pina estril, colocar o filtro sobre o meio de cultura na caixa de Petri; 8. Fazer pelo menos duas repeties para cada um dos tipos de microrganismo; 9. Fechar as caixas, inverter, identificar e colocar na estufa (30C para as bactrias e 25C para os fungos); 10. Deixar incubar durante 24-48 horas e contabilizar o nmero de UFC em cada caixa; 11. Calcular o nmero de UFC por m3 do ar da sala; 12. Comparar o resultado obtido com a legislao e concluir.

Superfcies
Protocolo 1.11 Amostragem por zaragatoa 1. Elaborar meio de cultura Plate Count Agar (PCA); 2. Identificar as caixas com o nome do meio de cultura e a data de elaborao; 3. Deitar o meio nas caixas de Petri, deixar arrefecer e solidificar; 4. Utilizando uma zaragatoa estril, percorrer uma rea de tamanho conhecido na zona a monitorizar;

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5. Em condies de assepsia, riscar todo o meio de cultura com a zaragatoa; 6. Fechar as caixas, inverter, identificar e colocar na estufa a 30C; 7. Deixar incubar durante 24-48 horas e contabilizar o nmero de UFC em cada caixa;

8. Calcular o nmero de UFC por cm2 da superfcie estudada; 9. Comparar o resultado obtido com a legislao e concluir.

Referncias citadas
Alcntara, F., Cunha, M.A. & Almeida, M.A. (1996). Microbiologia: prticas laboratoriais. Edies Universidade de Aveiro. 298 pginas. ISBN 972-8021-178. Ferreira, W.F.C., Sousa, J.C.F. & Lima, N. (2010). Microbiologia. Lidel-Edies tcnicas, Lda. Lisboa. 622 pginas. ISBN 978-972-757-515-2. Filho, P.P.G., Silva, C.R.M. & Kritski, A.L. ( 2000). Ambientes climatizados, portaria 3.523 de 28/8/98 do Ministrio da Sade e padres de qualidade do ar de interiores do Brasil. Jornal de Pneumologia, 26 (5). doi: 10.1590/S010235862000000500006. Disponvel em
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S010235862000000500006&lng=pt&nrm=iso&tlng=pt.

Friberg, B., Friberg, S. & Burman, L.G. (1999a). Correlation between surface and air count of particles carrying aerobic bacteria in operating rooms with turbulent ventilation. Journal of Hospital Infection, 42: 61-68. Friberg, B., Friberg, S. & Burman, L.G. (1999b). Inconsistent correlation between aerobic bacterial surface and air counts in operating rooms with ultra clean laminar air flows: proposal of a new bacteriological standard for surface contamination. Journal of Hospital Infection, 42: 287-293. Morais, G.R., Silva, M.A., Carvalho, M.V. Santos, J.G.S., von Dolinger, E.J.O. & Brito, D.D. (2010). Qualidade do ar interno em uma instituio de ensino superior brasileira. Bioscience Journal, 26 (2): 305-310.

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