Contribuciones del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares al avance de la Ciencia y la Tecnologa en Mxico

Edicin conmemorativa 2010

Estrategia para el tratamiento de lesiones por seccin completa de mdula espinal basada en implantes de polmeros sintetizados por plasma
Guillermo J. Cruz Cruz, Ma. Guadalupe Olayo Gonzlez
Departamento de Fsica, Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares

Hermelinda Salgado Ceballos

Unidad de Investigacin Mdica en Enfermedades Neurolgicas, Hospital de Especialidades, Centro Mdico Nacional Siglo XXI del Instituto Mexicano del Seguro Social y Proyecto Camina A.C.

Araceli Daz Ruiz, Luis Camilo Ros Castaeda

Departamento de Neuroqumica, Instituto Nacional de Neurologa y Neurociruga

Roberto Olayo Gonzlez, Juan Morales Corona

Departamento de Fsica, Universidad Autnoma Metropolitana Iztapalapa

Ana Laura lvarez Meja, Rodrigo Mondragn Lozano, Axaycatl Morales Guadarrama
Departamento de Ingeniera Elctrica, Universidad Autnoma Metropolitana Iztapalapa guillermo.cruz@inin.gob.mx

1. Introduccin
Las lesiones de mdula espinal son en su mayora el resultado de golpes, compresin, desgarramiento o seccin del tejido medular, que producen afectacin parcial o total de las funciones motoras, sensitivas y autonmicas (control de temperatura, funciones viscerales, etc.) en las personas que las padecen. Este tipo de lesiones tiene su principal origen en accidentes vehiculares, deportivos y de trabajo, cadas y lesiones con armas. Debido a que el cerebro se comunica con el resto del cuerpo a travs de la mdula espinal, las lesiones en ella causan la interrupcin de dicha comunicacin en el segmento posterior al sitio de la lesin. Todos los nervios cuya ubicacin es anterior a la lesin continan funcionando normalmente, pero los posteriores a ella dejan de recibir las seales del cerebro, lo que produce disfunciones y parlisis de diversa magnitud en las extremidades y rganos afectados. Por lo tanto, mientras ms cerca del cerebro sea la lesin, mayor porcentaje del cuerpo quedar paralizado. Cada lesin de mdula espinal es diferente y depende del mecanismo de lesin, del nivel medular afectado, de la severidad del dao y de la respuesta del individuo a este proceso patolgico. Hay lesiones parciales que disminuyen las sensaciones, pero mantienen algunas funciones motoras; otras preservan algunas sensaciones y algo de movimiento. Hay tambin lesiones totales que suprimen tanto sensaciones como movimiento. Se han realizado grandes esfuerzos por parte de la comunidad cientfica internacional en el rea de salud para aminorar las devastadoras consecuencias de esta patologa. No obstante, hasta ahora no se cuenta con una estrategia mdica exitosa para revertir sus efectos. Para entender globalmente el problema de las lesiones de mdula espinal y la estrategia de tratamiento que se presenta en este trabajo, se describen a continuacin las partes ms importantes de los sistemas biolgicos relacionados con la mdula espinal y algunos de los biomateriales estudiados.

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2. Sistema nervioso central

La mdula espinal y el encfalo constituyen el sistema nervioso central del cuerpo humano (figura 1). La mdula espinal es un tejido en forma de cordn ubicado dentro de la columna vertebral, y el encfalo es un tejido semiesfrico situado en el extremo superior de la mdula, en el interior del crneo. Ambos estn fuertemente protegidos por los huesos del crneo y de la columna. El encfalo es el responsable del procesamiento de la informacin y coordina todas las funciones del organismo. Sin embargo, al estar aislado, protegido y confinado en el crneo, necesita un medio que lo comunique con el resto del cuerpo y es la mdula espinal la responsable de esa funcin. Durante nuestros primeros aos de vida la mdula espinal crece con una longitud proporcional a la de la columna vertebral, pero conforme pasa el tiempo, el crecimiento de la columna rebasa al de la mdula a tal grado que en la edad adulta, la longitud de la mdula es aproximadamente el 70% del de la columna vertebral, iniciando en el encfalo y terminando entre las vrtebras lumbares 1 y 2.

(a)

(b)

Figura 1. a) Imagen de resonancia magntica que muestra el sistema nervioso central en un humano. b) Radiografa lateral de una lesin traumtica de mdula espinal por desplazamiento y fractura de la columna vertebral.

La mdula espinal est integrada por varios conjuntos y subconjuntos de tejidos que transportan los mensajes entre el cerebro y el cuerpo va pulsos qumico-inicos. Los mensajes pueden relacionarse con el movimiento de huesos y msculos, o sensaciones como dolor, calor o fro. Si hacemos un corte transversal a la mdula espinal veremos que en el centro se encuentran los cuerpos neuronales dispuestos en forma de alas de mariposa, llamada substancia gris; en la parte dorsal de esta estructura se localizan los cuerpos de las neuronas sensitivas; en la parte ventral los de las neuronas motoras, y alrededor se localizan organizadas las fibras nerviosas llamadas axones, lo que en su conjunto se denomina substancia blanca. En el centro de la mdula se encuentra una estructura cilndrica que es el canal ependimario por el que circula lquido cefalorraqudeo. Toda la mdula espinal est protegida por tres capas de tejido llamadas meninges: duramadre, aracnoides y piamadre.

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Captulo 1. Estrategia para el tratamiento de lesiones por seccin completa de mdula espinal basada en implantes de polmeros sintetizados por plasma

3. Columna vertebral
La columna vertebral es un conjunto de 24 huesos llamados vrtebras que, alineados adecuadamente, son el soporte principal del cuerpo. Es una estructura sea en la que se distinguen tres curvaturas. En la superior se encuentra la zona cervical, formada por siete vrtebras pequeas; en la curvatura media se encuentra la zona torcica, formada por 12 vrtebras medianas; en la tercera curvatura se encuentra la zona lumbar, la cual tiene las cinco vrtebras ms grandes de la columna. Existen adems dos huesos adicionales en el extremo inferior llamados sacro y cccix. Las vrtebras estn formadas por un cuerpo central y un anillo lateral, llamado canal espinal, que aloja a la mdula, la cual tiene ramificaciones llamadas races nerviosas que emergen a travs de dos aperturas laterales localizadas entre vrtebras adyacentes, comunicando a la mdula espinal con los diferentes rganos y tejidos del cuerpo. Entre el cuerpo central de una y otra vrtebra se encuentra un tejido blando y suave en forma de disco cuya funcin es reducir la friccin entre los huesos, evitando el contacto intervertebral al absorber las fuerzas generadas entre ellos. Los discos intervertebrales estn constituidos por dos partes, un ncleo pulposo elstico que se deforma cuando una vrtebra presiona a otra al transmitir las fuerzas de la columna, y un anillo fibroso externo mucho ms fuerte que el ncleo. La columna mantiene cada una de las vrtebras en su posicin utilizando msculos, ligamentos y tendones. Todo este complejo sistema est hecho para que la mdula se aloje en el espacio interior de las vrtebras y se comunique con los diferentes rganos del cuerpo sin sufrir dao debido al constante movimiento de la columna vertebral. Si alguna vrtebra se deslizara fuera de su lugar, ms all de la tolerancia del movimiento normal, presionara a la mdula espinal causndole dao. El desgaste o presin excesiva en los discos intervertebrales tambin puede ocasionar que parte del disco se deslice hacia el canal espinal, formando una hernia que presione alguna de las races nerviosas produciendo dolor, adormecimiento o debilidad en la zona afectada. Este tipo de hernia discal puede ocurrir en cualquier parte de la columna, pero es ms frecuente en las zonas cervical y lumbar (figura 2). Este tipo de lesiones son muy dolorosas y pueden tener graves consecuencias.

Figura 2. Imagen de resonancia magntica de una hernia en disco lumbar.

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4. Neuronas
La unidad anatmica y funcional bsica del sistema nervioso es una clula muy especializada llamada neurona. Esta clula est formada por un cuerpo central rodeado por conjuntos de pequeas terminales delgadas, dendritas, de las cuales emergen pequeas estructuras, espinas, y una extensin, axn. La transmisin de informacin de una neurona a otra es un fenmeno complejo llamado sinapsis en forma de pulsos qumico-inicos que se desarrolla por el contacto especializado de las diferentes partes de una neurona con otra. Los niveles de voltaje de estos pulsos inicos son apenas de algunas decenas de milivoltios. Las sinapsis requieren para su comunicacin de sustancias qumicas denominadas neurotransmisores. La comunicacin se puede efectuar en combinaciones complejas entre dendritas, espinas y axones. Debido a que todas las sinapsis son funcionales, la prolongacin de una clula glial, astrocito, ocupa el espacio en donde no debe haber comunicacin entre una neurona y otra, evitando el contacto interneuronal. La complejidad anatmica y funcional del sistema nervioso central est dada por el nmero de neuronas que lo constituyen, que en el cerebro de un adulto joven oscila entre 30,000 a 100,000 millones de neuronas, as como por las complicadas redes sinpticas que se pueden establecer, llegando a formar del orden de 100 trillones de interconexiones. Una vez que el cuerpo cre las neuronas durante las primeras etapas de la vida, su nmero prcticamente no se incrementa, ya que estas clulas no proliferan en condiciones normales. Por lo tanto, cualquier lesin que implique muerte neuronal reducir ese nmero produciendo un dao permanente. La situacin se complica todava ms, ya que la muerte neuronal produce en s misma tal cantidad de reacciones en el entorno, que debilitan y matan tambin a muchas de las neuronas sanas vecinas. As, una lesin que implique un pequeo dao neuronal puede magnificarse en varios rdenes de magnitud a travs del dao secundario a las neuronas vecinas. Prevenir el dao neuronal secundario es una de las estrategias teraputicas para reducir las consecuencias negativas de las lesiones de mdula espinal [1]. El cuerpo humano cuenta con las neuronas necesarias para realizar todas las funciones corporales y un excedente suficiente como para substituirlas varias veces por lo que, una vez que el cuerpo controla el dao secundario despus de una lesin, las funciones de las neuronas perdidas pueden ser substituidas por otras neuronas sanas, hasta que el nmero sea insuficiente o la actividad de ellas se sature. Esto no quiere decir que haya neuronas inactivas esperando pacientemente sustituir a las lesionadas, sino que todas estn en actividad, la cual puede incrementarse produciendo nuevas sinapsis en caso de ser necesario.

5. Lesiones de mdula espinal

Cuando la mdula espinal se daa por efecto de una lesin traumtica, se desencadenan varios mecanismos para intentar reparar el dao. Las neuronas que sobreviven anteriores al sitio de lesin tratan de comunicarse con las que sobrevivieron posteriores a ese sitio y viceversa, pero si no lo logran en cierto tiempo, se inician procesos de cicatrizacin que aslan a los dos extremos. Adicionalmente, se forman quistes con fluidos en la zona de lesin que actan como barreras fsicas que dificultan la futura reconexin de la mdula (figura 3). Desde que nos formamos en el vientre materno, el encfalo y la mdula espinal crecen con poco contacto con el resto del cuerpo, ya que estn semiaislados por los huesos del crneo y de la columna vertebral, y por barreras formadas por vasos sanguneos y tejido nervioso que seleccionan el paso de sustancias qumicas y de las clulas del sistema inmunolgico. Por lo tanto, los sistemas de defensa del cuerpo contra agresiones externas que reconocen cada parte del organismo, slo reconocen parcialmente al sistema nervioso central, ya que ste tiene sus propios sistemas de defensa. Esta parece ser la causa de que, en caso de que una lesin rompa la barrera entre el sistema nervioso central y el resto del cuerpo, los sistemas de defensa confundan a este ltimo como invasor y por ende lo ataquen y lo traten de aislar. Este proceso es parte del dao neuronal secundario previamente descrito y es responsable del agravamiento de las lesiones medulares [2].

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Captulo 1. Estrategia para el tratamiento de lesiones por seccin completa de mdula espinal basada en implantes de polmeros sintetizados por plasma

(a)

(b)

Figura 3. Imgenes que muestran el dao irreversible de la mdula espinal. a) Corte longitudinal de una mdula espinal de rata sana, b) Corte longitudinal de la mdula espinal de rata dos meses despus de la lesin donde se muestra la evolucin de la destruccin del tejido nervioso, la formacin de cicatriz glial y de quistes en las zonas donde ya no existe tejido viable. Tcnica histolgica Luxol Fast Blue.

6. Tratamiento de lesiones traumticas de mdula espinal

Como se coment previamente, existen diferentes mecanismos que pueden lesionar la mdula espinal, como son golpes, compresin, desgarramiento y seccin del tejido nervioso. Este trabajo se enfoca en el problema de lesin por seccin completa de la mdula espinal, que es uno de los casos ms severos de lesiones medulares. En este tipo de lesin se estudian experimentalmente muchas estrategias de aplicacin inmediata con el objetivo de proteger el tejido sano e inhibir o disminuir el dao secundario. A estas estrategias se les denomina de manera genrica como neuroproteccin. El siguiente paso en el tratamiento de estas lesiones se basa fundamentalmente en reactivar las funciones perdidas, implantando clulas y/o biomateriales en la zona de la lesin que ayuden en la comunicacin neuronal y la regeneracin del tejido nervioso perdido. A este conjunto de estrategias se le denomina neurorregeneracin. En este rubro, los biomateriales ms estudiados han sido polmeros compatibles con el sistema nervioso central. sta no es una tarea fcil, ya que cualquier lesin de tipo traumtico rompe el equilibrio fisicoqumico de la mdula espinal. Un material compatible implantado en esas nuevas condiciones podra retardar los indeseados procesos de cicatrizacin y, por otra parte, proveer un medio de comunicacin entre los pulsos quimico-inicos de uno y otro lado de la lesin. Desde este punto de vista, un polmero qumicamente biocompatible y con capacidad para transferir cargas elctricas parece una buena eleccin de entre los materiales a estudiar. Se han probado muchos materiales en este contexto, algunos con la intencin de proveer estructuras donde las clulas crezcan para unir los dos extremos de la mdula espinal seccionados, mientras que otros han sido empleados para estimular el crecimiento axonal o celular en combinacin con clulas del propio cuerpo [3-4], o con el fin de responder a los impulsos inicos de las neuronas [5]. Algunos biomateriales aplicados hasta la fecha en lesiones de la mdula espinal son: Implantes de filamentos de carbn empleados como puentes para el crecimiento de los axones. Polmeros solubles en agua con capacidad para adherirse al tejido nervioso. Microesferas de polmeros biodegradables conteniendo factor de crecimiento nervioso. Hidrogeles biocompatibles. Mezcla de polmeros y oligmeros reabsorbibles de policido lctico. Polmeros semiconductores derivados de polipirrol, politiofeno y policido lctico. Polmeros semiconductores de polipirrol dopado con halgenos, sintetizados por plasma. Estos estudios han sido realizados por los autores de este trabajo [6]

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7. Polmeros semiconductores
La mayor parte de los polmeros conocidos son aislantes elctricos. Sin embargo, se pueden preparar polmeros con caractersticas estructurales que faciliten el transporte de cargas elctricas, para lo cual una condicin importante es combinar enlaces sencillos y mltiples alternados a lo largo de las cadenas. El ejemplo ms sencillo es la combinacin de tomos de carbono unidos por enlaces dobles y sencillos del poliacetileno (CH=CH-CH=CH) [7,8]. Una estructura conjugada de esa manera podra transferir cargas elctricas, lo que no significa que los electrones recorran toda la zona conjugada, sino que una perturbacin en la conjugacin en un extremo podra viajar a lo largo de la cadena bajo la influencia de campos elctricos. Sin embargo, si la conjugacin se rompe en algn sitio por la repeticin consecutiva de enlaces sencillos o mltiples (CCC o C=C=C), el transporte de cargas tambin se interrumpe. Otra manera de promover el transporte de cargas elctricas en los polmeros es agregar materiales con densidad electrnica diferente a la de la cadena principal [9]. Por ejemplo, los halgenos tienen una gran densidad electrnica, ya que cuentan con siete electrones en su ltima capa y estn disponibles para agregar un electrn externo que complete su octeto. tomos de este tipo repartidos a lo largo de una cadena de carbonos producen sitios polares que estimulan el transporte de cargas elctricas. Tanto el cloro como el yodo son halgenos con estas caractersticas que podran ser agregados a los polmeros para facilitar el movimiento de cargas [10-11]. Ambas tcnicas, la de enlaces conjugados y la de elementos polares, pueden ser combinadas para producir polmeros biocompatibles con diferente habilidad en el transporte de cargas elctricas. El polipirrol (PPy) ha sido estudiado previamente como biomaterial promotor del crecimiento, proliferacin y diferenciacin celular en tejidos hepticos y como material de soporte para la fabricacin de msculos artificiales [12,13]. Por su parte, el yodo es un elemento que ha sido usado en medicina desde hace muchos aos con el propsito de desinfectar heridas. Con estos antecedentes, polipirrol y yodo fueron seleccionados para sintetizar polmeros semiconductores biocompatibles con el tejido nervioso de la mdula espinal, con la finalidad de implantarlos en ella para promover la neuroproteccin despus de una lesin severa. La estructura del pirrol est formada por un anillo heteroaromtico de cinco miembros, cuatro carbonos y un nitrgeno rodeado por hidrgenos (CH=CHCH=CHNH). El grupo NH es conocido como amina y se encuentra en muchos de los fluidos del cuerpo humano, particularmente en los de la mdula espinal. Desde un punto de vista espacial, el anillo de pirrol forma un plano con enlaces dobles y sencillos interrumpidos por el tomo de nitrgeno de la amina. Al formar el polmero, los anillos pierden hidrgenos y se unen en los puntos reactivos dejados por su ausencia (figura 4). Dependiendo del punto de unin, se pueden formar grandes secuencias de anillos con enlaces conjugados, dobles y sencillos, a lo largo de la cadena y construir as polmeros semiconductores.

Pirrol

Polipirrol Lineal

Polipirrol altamente entrecruzado

Figura 4. Modelos estructurales de pirrol y polipirroles en configuracin lineal y entrecruzada.

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8. Sntesis de polmeros por plasma

El mtodo de sntesis es fundamental en la construccin de polmeros semiconductores compatibles con el sistema nervioso central, ya que aunque se formen grandes secuencias de enlaces conjugados durante la polimerizacin, si en el proceso intervienen compuestos nocivos para los tejidos medulares, el polmero puede resultar no compatible con la qumica de esos tejidos por la cantidad de residuos dejados por aceleradores, solventes o productos intermedios, propios de las reacciones qumicas. Por tanto, se tiene que emplear algn mtodo de polimerizacin que prcticamente no use ningn compuesto diferente del monmero base, a fin de reducir reacciones indeseables o adversas en el organismo con el implante. Una tcnica que rene estas caractersticas es la polimerizacin por plasma, donde las reacciones de polimerizacin se llevan a cabo en medio de descargas elctricas y son promovidas por las constantes colisiones entre el monmero y electrones e iones acelerados por campos elctricos. La energa cintica que alcanzan los electrones en las reacciones de polimerizacin es equivalente en la temperatura termodinmica que conocemos a decenas de miles de grados Celsius [14]. Sin embargo, como su masa es muy pequea, al hacer el promedio de temperatura con los dems agentes qumicos, que son mucho ms pesados, la temperatura durante las reacciones qumicas puede no rebasar 60 0C. En estas condiciones, se hace coincidir la energa de los electrones en el plasma con la energa de enlace de los monmeros que se desee polimerizar para que se perturben los enlaces qumicos y se forme el polmero [15]. Los iniciadores y aceleradores de las reacciones qumicas no son agentes qumicos sino potenciales elctricos y flujos de electrones e iones que ocurren durante descargas elctricas. Los nicos compuestos qumicos participantes en estos procesos son molculas reactivas y polmeros con diferente crecimiento, todos derivados del o los monmeros base. Como la estructura electrnica del pirrol es muy homognea, las colisiones con las partculas reactivas del plasma se llevan a cabo en prcticamente todos los tomos del anillo. Esto genera que el crecimiento de las cadenas tenga lugar en cualquiera de sus tomos, lo que puede resultar en estructuras tridimensionales de polmeros entrecruzados y no necesariamente en cadenas lineales. Con estas caractersticas, una vez implantados en la mdula espinal, el tejido y sus fluidos interaccionaran con partculas polimricas entrecruzadas hinchndolas en sistemas slido-lquido. Sin embargo, una consecuencia de estas condiciones de sntesis es que las propiedades elctricas de los polmeros por plasma pueden resultar reducidas comparadas con los mismos polmeros sintetizados por otros mtodos. Para superar un poco esta desventaja se combinan estos polmeros con otros compuestos para crear sitios polares que ayuden en el transporte de cargas elctricas. A este proceso se le conoce como dopaje. Al igual que con la polimerizacin por plasma, el dopaje por plasma se promueve por la ionizacin y las colisiones de las partculas aceleradas en el plasma y, dependiendo de la energa aplicada al sistema, se pueden producir enlaces qumicos entre el dopante y las cadenas del polmero. Al final de este proceso simultneo polimerizacin-dopaje por plasma, los polmeros dopados presentan mayor conductividad elctrica que sus similares sin dopar. Tomando en cuenta todo lo anterior, se realizaron varias sntesis de polmeros y copolmeros derivados de pirrol con dopaje de yodo para utilizarlos como implantes en la mdula espinal de roedores con lesin por seccin completa. La sntesis se llev a cabo en fase gaseosa por plasmas producidos con descargas de resplandor en modo resistivo a radiofrecuencia (figura 5).

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Figura 5. Imgenes de la sntesis de polipirrol por plasma. A la izquierda se muestra el reactor donde se realiza la sntesis y a la derecha la pelcula delgada que se obtiene al final de la reaccin.

Se sintetizaron tambin copolmeros de pirrol-polietilenglicol (PPy-PEG) en donde se combinaron las aminas del pirrol y los grupos oxigenados de los glicoles. Aunque la estructura del etilenglicol (HOCH2CH2OH) no tiene dobles enlaces que faciliten el transporte de cargas elctricas, el objetivo era aumentar la hidrofilicidad de los materiales a travs de los grupos OH que son hidroflicos, ya que tambin forman parte de la estructura del agua [16]. Para sintetizar estos copolmeros se usaron polietilenglicol con peso molecular de 600 uma, y pirrol. Los polmeros se formaron en pelcula delgada con espesores de entre 1 y 20 mm con morfologa rugosa, cuyas protuberancias se incrementan con el dopaje con yodo. La morfologa de los polmeros es importante, ya que la rugosidad incrementa la superficie de contacto del material con los fluidos y el tejido de la mdula espinal (figura 6).

PPy

PPy-PEG.

PPy-I

Figura 6. Micrografas de microscopia electrnica de barrido donde se muestra la morfologa de pelculas de polipirrol (PPy), polipirrol-polietilenglicol (PPy-PEG) y polipirrol dopado con yodo (PPy-I). Ntese la diferencia en la rugosidad de las superficies.

Los anlisis de espectroscopia infrarroja y fotoelectrones de rayos X realizados a los polmeros indican que hay enlaces dobles (C=C) y triples (CN) en su estructura. Estos enlaces pueden originarse por las partculas energticas del plasma que producen rompimientos en los grupos CH de las molculas, y los radicales generados se recombinan para formar enlaces mltiples en los materiales. Sin embargo, esas mismas partculas energticas tambin producen otros rompimientos en las molculas de pirrol que originan fragmentos alifticos que se incorporan a las redes polimricas. Esto se nota en el contenido atmico de carbono y nitrgeno en los polipirroles por plasma, cuya relacin estequiomtrica debera ser C/N=4, pero cuya relacin real es de aproximadamente 8. Desde un punto de vista global, esto significa que la mitad del material podra estar hecha de anillos de pirrol y la otra mitad de sus derivados y compuestos oxigenados.

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Como parte de la caracterizacin del material se calcul la conductividad elctrica en funcin de la humedad relativa en PPy, la que result en el intervalo de 1012 a 1010 S/cm, incrementndose paulatinamente dos rdenes de magnitud al contacto del material con la humedad ambiental (figura 7). Estos valores ubican al PPy en la zona de los materiales aislantes. Sin embargo, cuando el PPy se combin con yodo, PPy-I, su conductividad se increment para ubicarse en el intervalo 1010-104 S/cm en dos regiones con tendencia diferente. A baja humedad relativa, de 10 a 75%, la conductividad vara poco, con magnitud en 1010 S/cm, similar a los valores ms altos de PPy. Sin embargo, a partir de 75% de humedad relativa, la conductividad se incrementa aceleradamente hasta en seis rdenes de magnitud alcanzando 104 S/cm [17-19]. Debido a que la polimerizacin se lleva a cabo en fase gaseosa, se puede considerar que el yodo est homogneamente repartido en PPy-I. En promedio hay un tomo de yodo por cada siete u ocho anillos de pirrol. Esta cantidad indica que ambos polmeros son esencialmente polipirroles, pero que esa pequea cantidad de yodo es suficiente para incrementar la conductividad a los niveles descritos slo cuando haya una gran cantidad de agua en el ambiente. Este comportamiento sugiere que al contacto con los fluidos de la mdula espinal, que contienen agua y sales, la conductividad del material se incrementar en varios rdenes de magnitud, facilitando el transporte de cargas en el material una vez implantado.

Figura 7. Conductividad elctrica de PPy y PPy-I en funcin de la humedad relativa.

9. Implante de polmeros semiconductores en mdulas espinales lesionadas

Para el estudio biolgico se emplearon ratas hembras de la cepa Long Evans de 250 a 300 g de peso corporal de dos meses de edad. Las ratas se anestesiaron y se les produjo una lesin por seccin completa de la mdula espinal (figura 8). Para ello, se realiz un corte longitudinal en la regin torcica sobre la piel, se disecaron los msculos paravertebrales, se localiz y extirp la apfisis espinosa de la vertebra torcica nueve y se rompi la lmina sea que cubre la mdula espinal a ese nivel. Se abrieron las meninges en forma longitudinal y se realiz un corte transversal en la mdula espinal seccionando todas las fibras nerviosas que la conectan a ese nivel. Con esta maniobra se produjo una lesin que paraliz las patas traseras de las ratas. Se formaron varios grupos de ratas a las que se les implantaron polmeros de PPy, PPy-I o PPy-PEG en el sitio de lesin con el fin de estudiar la respuesta de la mdula espinal a cada uno de los materiales. A otro grupo de ratas no se les implant nada, slo se les produjo la lesin para que sirvieran como control. Los grupos de ratas fueron formados con conjuntos de tres a seis animales. Despus de la operacin, a todas las ratas se les administraron analgsicos y antibiticos y se les coloc en una unidad de cuidados intensivos para animales pequeos con control de temperatura y humedad. Una vez que se recuperaron de la anestesia, los animales se colocaron en cajas individuales y se llevaron a un bioterio especializado en el que se mantuvieron durante dos meses.

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Figura 8. Imgenes que muestran la etapa inicial de la ciruga para realizar la lesin por seccin completa de la mdula espinal y el implante de los polmeros.

10. Respuesta del organismo al implante

Cuando se implanta un material en el cuerpo, la primera respuesta biolgica es la formacin de una capa de protenas alrededor del material extrao, lo cual inicia en los primeros minutos posteriores al implante. En las siguientes horas proliferan y migran las clulas del sistema de defensa del cuerpo, como neutrfilos y macrfagos, responsables de evaluar y actuar si el material extrao implica algn dao potencial. En los das posteriores, los fibroblastos llegan para sintetizar colgena, envolviendo al material extrao y aislndolo de las otras clulas. Para cuando esto sucede, dependiendo de la respuesta particular del individuo, han transcurrido ya varios das de la lesin. Es una carrera contra el tiempo en la que las clulas tratan de aislar lo ms rpidamente posible al material extrao, siendo el periodo que transcurre entre la implantacin y el aislamiento el tiempo mximo de vida til que tiene el material para realizar su funcin. Despus, dependiendo de su tamao y naturaleza, su efecto es neutralizado y reducido a la zona delimitada por la colgena que lo rodea. En el caso de los polmeros implantados en la mdula espinal, este periodo es fundamental, ya que es justo cuando se sucede una cascada de procesos simultneos a causa de la lesin medular y a la respuesta del organismo al implante. Los animales lesionados pero que no recibieron implante polimrico presentan la formacin de quistes y cicatrices que aslan los dos segmentos de la mdula espinal lesionada. Por otra parte, es de esperarse que estos procesos sean modificados en los animales lesionados e implantados con polmeros, disminuyendo la respuesta inflamatoria, o cambiando parcialmente las reacciones qumicas en el sitio de la lesin. Estos cambios pueden dar oportunidad a que los extremos seccionados de la mdula espinal se reconecten, al menos en algunos puntos. Por eso es muy importante que el implante no produzca inflamacin adicional (figura 9) y que pueda transmitir de alguna manera parte de los pulsos elctricos entre las dos secciones de la mdula espinal.
(a) (b)

Figura 9. (a) Imagen en la que se muestra un corte histolgico de una mdula implantada con PPy con ocho semanas de evolucin. Los polmeros muestran poca respuesta inflamatoria en el sitio de implante. Amplificacin 20X. Tcnica histolgica hematoxilina-eosina. (b) Imagen de resonancia magntica que muestra la medula implantada desde una perspectiva longitudinal, donde se observa la migracin del polmero.

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11. Evaluacin de la recuperacin motora

Los procesos que se llevan a cabo durante la evolucin de las lesiones y la influencia de los polmeros en ellas son muy complejos y no se conocen lo suficiente como para discutirlos extensamente en este trabajo. Sin embargo, lo que s se puede estudiar es el resultado de los procesos de recuperacin motriz y funcional en las ratas. Existe una escala cualitativa para medir el movimiento voluntario de las articulaciones de las extremidades posteriores de roedores en la que se evalan y califican los movimientos de tobillo, rodilla y cadera. A esta escala se le conoce como BBB por las iniciales de los apellidos de sus creadores, Basso, Beattie y Bresnahan [20]. La escala consta de 22 grados, donde 0 representa ausencia de movimiento y progresivamente va incrementando la calificacin con el movimiento de las articulaciones hasta llegar a 21, nivel que refleja una marcha normal (Anexo 1). En una recuperacin hipottica progresiva desde parlisis total de las extremidades posteriores, BBB=0, un animal de prueba recorrera la escala hasta llegar a un nivel de equilibrio. El tiempo que le lleve esto y el nivel de movimiento alcanzado es funcin de su capacidad de recuperacin. Hay que resaltar que las recuperaciones reales no abarcan toda la escala, sino que avanzan por periodos a diferentes velocidades hasta que prcticamente se detienen en algn punto de la escala. La calificacin BBB promedio en funcin del tiempo de las ratas lesionadas estudiadas en este trabajo, durante los primeros 56 das posteriores a la lesin se muestra en la figura 10 [21]. Se presentan cuatro grupos: Control, que son las ratas lesionadas sin implante; PPy, son las ratas lesionadas e implantadas con polipirrol; PPy-PEG, son las ratas lesionadas e implantadas con el copolmero formado con pirrol y polietilenglicol y, finalmente, PPy-I, que son ratas lesionadas e implantadas con polipirrol dopado con yodo. Desde un punto de vista global y tomando en cuenta las caractersticas particulares de la lesin e implante, la recuperacin del movimiento de las patas traseras tiene tendencia lineal creciente en funcin de la escala BBB y del tiempo de recuperacin. La variable r mostrada en la grfica es la pendiente de la recta promedio, que desde un punto de vista fsico representa a la velocidad de recuperacin del animal en funcin de la evolucin BBB diaria, r=BBB/da. Los resultados indican que la evolucin de todas las ratas, con o sin implante, es muy similar durante las primeras tres semanas despus de la lesin, que se manifiesta por valores BBB en el intervalo de 0 a 1.5. Es muy posible que las consecuencias fisiolgicas de la ciruga y las de la lesin misma dominen durante este periodo y por eso la recuperacin sea muy similar. Sin embargo, a partir de la semana 4, se empieza a manifestar la respuesta del organismo a los implantes polimricos. La menor tendencia de recuperacin la tiene el grupo Control, r=0.051 con BBB mxima de 3, mientras que la mayor se encuentra en el grupo PPy-I, con r=0.1 y BBB mxima de 4.7. Esto quiere decir que el grupo Control tardara aproximadamente 411 das en recuperarse totalmente, si se mantuviera la misma tendencia. La recuperacin de este grupo establece la evolucin natural sin implante de este tipo de lesiones y puede servir como lnea de referencia. El grupo PPy-I necesitara la mitad del tiempo de recuperacin del grupo Control, ya que su velocidad es de aproximadamente el doble. Por su parte, los grupos PPy y PPyPEG tienen una velocidad de recuperacin muy similar, r=0.078 y r=0.069, respectivamente, con valores aproximadamente a la mitad de los grupos Control y PPy-I, con BBB mximas de 4 y 3.6, respectivamente. La diferencia en la recuperacin de los grupos de estudio puede deberse a la estructura de los implantes polimricos. La desviacin de los puntos de la recta promedio ejemplifica algunos periodos de aceleracin y recesin en la recuperacin de las ratas de estudio. Hasta donde se puede observar, en las primeras ocho semanas no se manifiesta claramente una reduccin en la tendencia que indique que la recuperacin se est estabilizando en algn punto de la escala BBB. La recuperacin de los grupos PPy y PPy-PEG indica que la respuesta biolgica a los polmeros es muy similar y que sus estructuras promueven una recuperacin adicional sobre la lnea de referencia de los controles. Una diferencia qumica entre estos dos polmeros es que el PPy-PEG tiene mayor proporcin de oxgeno.

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G. J. Cruz Cruz | Ma. G. Olayo Gonzlez | H. Salgado Ceballos | A. Daz Ruiz | L. C. Ros Castaeda | R. Olayo Gonzlez J. Morales Corona | A. L. lvarez Meja | R. Mondragn Lozano | A. Morales Guadarrama

La estructura de PPy-I indica que es ms reactiva en el tejido medular, favorablemente, ya que la recuperacin del movimiento es mucho mayor que la obtenida con los polmeros anteriores. Una variable importante del PPy-I es que el dopado con yodo incrementa su conductividad elctrica y esa puede ser una actividad importante del material en la interaccin con los pulsos inicos de la mdula espinal que incrementa su recuperacin.

Figura 10. Valores promedio de la escala BBB de grupos de animales sometidos a una seccin completa de mdula espinal sin implante (Control), o con implantes de PPy, PPy-PEG o PPyI. La recuperacin motora fue evaluada durante los 56 das posteriores a la lesin.

12. Movimiento en las patas traseras de las ratas implantadas con polmeros
Los resultados en este rubro muestran que las ratas lesionadas del grupo Control evolucionan de manera diferente en las primeras tres semanas posteriores a la lesin al compararlas con las ratas que s fueron implantadas con algn polmero. Los animales fueron sacrificados despus de diferentes periodos de evolucin para estudios histolgicos. Los resultados muestran que la mayora de las mdulas en este grupo de animales presenta una gran cantidad de tejido de cicatrizacin y quistes que impiden la reconexin axonal y por ende la comunicacin neuronal. Las patas traseras de estos animales se encuentran prcticamente paralizadas, slo presentan movimientos involuntarios espordicos y son incapaces de colocar la planta de las patas sobre el piso, por lo que slo las arrastran. En promedio, las ratas del grupo Control alcanzaron una calificacin mxima de BBB=2.7 en la semana 8, lo que significa que tenan movimiento limitado en las articulaciones (figura 11). En contraste con lo anterior, algunas ratas del mismo grupo Control presentaron evidencias histolgicas de reconexin entre los dos extremos de la mdula espinal seccionados que se manifest en pequeos movimientos en las extremidades posteriores de dichos animales. Sin embargo, slo una pequea parte de los animales estudiados evolucion en estas condiciones.

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Figura 11. Imgenes que muestran una rata con seccin completa de la mdula espinal que no recibi implante, evaluada ocho semanas despus del dao. Ntese como la posicin de las patas delanteras es normal, mientras que las patas traseras muestran falta de soporte del tren posterior y apoyo plantar.

Por otro lado, los animales que recibieron implantes con PPy y PPy-PEG evolucionaron histolgicamente con menos quistes en comparacin con los animales del grupo Control; presentaron algunos segmentos de tejido conectado, lo que permite una pequea fraccin de las comunicaciones neuronales. Esto se refleja en la actividad motriz de las extremidades afectadas, que se desarroll un poco mejor que en el grupo Control, ya que los animales pudieron colocar en el piso la planta de una pata y moverla, aunque con dificultad. Su calificacin promedio en la octava semana posterior a la lesin en la escala BBB fue de 3.7, lo que significa que tenan movimiento en las articulaciones de una pata (figura 12).

Figura 12. Imgenes que muestran una rata con seccin completa de la mdula espinal con implante de PPy-PEG, evaluada ocho semanas despus del dao. Una de las patas traseras tiene apoyo plantar y la otra muestra falta de soporte del tren posterior. Este tipo de respuesta indica que el animal tiene movimientos voluntarios de las extremidades inferiores, aunque limitados.

El grupo de animales que recibi implantes de PPy-I present una mayor proporcin de tejido conectado que en el caso anterior y por lo tanto las funciones afectadas tuvieron una mejor recuperacin. Muchos animales de este grupo fueron capaces de colocar en el piso las plantas de las dos patas traseras y algunos pudieron escalar obstculos apoyados en ellas, aunque ayudados por las extremidades delanteras, por lo que en trminos generales las funciones perdidas se recuperaron en mayor proporcin. Su calificacin BBB promedio despus de ocho semanas fue de 4.7, lo que significa que podan mover tres articulaciones de ambas patas traseras (figura 13).

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Figura 13. Imgenes que muestran una rata con seccin completa de la mdula espinal con implante de PPy/I, evaluada ocho semanas despus del dao. Se puede observar que el animal es capaz de colocar ambas patas traseras en posicin plantar sobre el piso, mover tres articulaciones e incluso apoyarse en ambas patas traseras para escalar obstculos. Este tipo de respuesta indica que el animal tiene movimientos amplios y voluntarios de las extremidades inferiores.

Es conveniente remarcar que, aunque se menciona la existencia de reconexin de tejido en la zona de lesin, su proporcin en el resto de la mdula es muy pequea y puede estar ligado a un efecto neuroprotector del implante. Este efecto se manifest en mayor grado en los grupos de ratas que recibieron implantes de PPy y PPy-I y se caracteriz por disminucin de la respuesta inflamatoria, as como en una menor cantidad de clulas del sistema inmunolgico en la zona de la lesin, menor cantidad de tejido cicatricial y menor nmero de quistes [22-24].

13. Conclusiones
Las lesiones de la mdula espinal causan incapacidad parcial o total en las personas que las sufren y hasta ahora no se ha desarrollado un tratamiento exitoso para revertir sus efectos, probablemente debido a su complejidad y a que este problema tiene que ser abordado desde diferentes perspectivas cientficas. En este trabajo se reporta el estudio de lesiones por seccin completa de la mdula espinal desde una perspectiva multidisciplinaria que comprende medicina, biologa, qumica, fsica, ciencias de los materiales y binica. La seccin completa de la mdula espinal es probablemente el caso ms severo de lesin medular conocido. Debido a que parte de la comunicacin neuronal se lleva a cabo por pulsos qumico-inicos, se disearon polmeros biocompatibles con capacidad para transferir cargas elctricas al interaccionar con humedad y que en su sntesis no intervinieran agentes qumicos potencialmente nocivos para la mdula espinal. Los materiales as sintetizados formaron redes de polmeros derivados de pirrol y polietilenglicol con dopaje de yodo en descargas elctricas resistivas de resplandor a radiofrecuencia. Los nicos agentes qumicos que intervienen en este tipo de procesos son los monmeros y sus derivados intermedios en el proceso de polimerizacin. Los polmeros as sintetizados son biocompatibles y tienen baja conductividad elctrica, al grado que pueden considerarse aislantes, pero al contacto con fluidos similares a los de la mdula espinal incrementan su conductividad en varios rdenes de magnitud. Los polmeros se implantaron en ratas de la cepa Long Evans a las que se les realiz quirrgicamente una lesin por seccin completa de la mdula espinal a nivel torcico 9, con lo que se produjo parlisis en ambas extremidades posteriores. Inmediatamente despus de la lesin se implantaron los polmeros de prueba y se proporcionaron los cuidados posoperatorios correspondientes. Se estudi la recuperacin motriz de las ratas durante las ocho semanas posteriores a la lesin. Los resultados muestran que las ratas lesionadas y que no recibieron ningn tipo de implante tuvieron las extremidades posteriores paralizadas, con marcha impulsada slo por las extremidades delanteras. Las ratas con implante de copolmeros y polmeros de pirrol presentaron movimiento limitado en alguna de

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las extremidades posteriores, su marcha era impulsada por las tres extremidades con movimiento y su desplazamiento era lento. Finalmente, las ratas que recibieron implante de PPy-I tuvieron movimiento amplio en ambas extremidades posteriores, siendo su desplazamiento mucho ms rpido y coordinado que en los casos anteriores. Estos resultados indican que la aplicacin de implantes de polipirroles sintetizados por plasma en ratas con lesin por seccin completa de la mdula espinal, promueve la recuperacin motriz y funcional en los animales implantados. El nivel de recuperacin alcanzado significa un gran avance en el campo de lesiones medulares, ya que no ha habido hasta el momento recuperacin similar reportada en lesiones de esta severidad, que usualmente producen parlisis total e irreversible.

14. Perspectivas
En el trayecto hacia la aplicacin de estos resultados en pacientes humanos con lesiones medulares falta an mucho camino por recorrer. El prximo paso es implantar los biopolmeros en primates. Si se logran resultados suficientemente exitosos, la siguiente etapa sera estudiar la respuesta en humanos. Sin embargo, esta es slo una parte del trabajo, ya que otra tarea pendiente ser abordar el caso de lesiones de mdula espinal por contusin, las cuales representan el tipo de lesin traumtica de mdula espinal ms frecuente en seres humanos y requieren de estrategias teraputicas diferentes. La aplicacin de polmeros sintetizados por plasma con potencial para transferir cargas elctricas en lesiones de mdula espinal se encuentra en su etapa inicial. A partir de este punto seguramente se desarrollar una nueva generacin de biomateriales y de tcnicas de implante que mejorar la recuperacin de las funciones perdidas a consecuencia de este tipo de lesiones. Una observacin final es destacar la necesidad de la colaboracin entre diferentes disciplinas cientficas para encontrar una solucin al complejo problema de salud que representa la lesin traumtica de mdula espinal.

Agradecimientos
A las instituciones participantes en este proyecto: Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares; Universidad Autnoma Metropolitana Iztapalapa; Instituto Nacional de Neurologa y Neurociruga; Hospital de Especialidades, Centro Mdico Nacional Siglo XXI del Instituto Mexicano del Seguro Social, y al Proyecto Camina A.C. Todas estas instituciones han colaborado activamente en el desarrollo de este proyecto con apoyo humano, financiero y logstico. Adicionalmente se agradece al Conacyt por el apoyo financiero otorgado mediante los proyectos 80735 y 47467.

Referencias
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Anexo 1. Escala motora BBB

Grado
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Descripcin
No se observan movimientos en patas traseras. Movimiento limitado (arco<50%) de una o dos articulaciones, usualmente cadera y/o rodilla. Movimiento amplio (arco>50%) de una articulacin con o sin movimiento limitado de la otra. Movimiento amplio de dos articulaciones. Movimiento limitado de las tres articulaciones, cadera, rodilla y tobillo. Movimiento limitado de dos articulaciones y amplio de la tercera. Movimiento amplio de dos articulaciones y limitado de la tercera. Movimiento amplio de las tres articulaciones, cadera, rodilla y tobillo. Movimientos coordinados de ambas patas traseras sin soporte del peso o colocacin de la planta pero sin soportar peso. Colocacin plantar con soporte de peso cuando no est caminando o pasos ocasionales (< 0 = al 50%), frecuentes (51% a 94%) o constantes (95% a 100%) con soporte de peso dorsal, sin apoyo plantar. Pasos ocasionales con soporte de peso plantar, sin coordinacin entre patas delanteras y traseras. Pasos frecuentes o constantes con soporte de peso plantar, sin coordinacin entre patas delanteras y traseras. Pasos frecuentes o constantes con soporte de peso plantar y coordinacin ocasional entre patas delanteras y traseras. Pasos frecuentes o constantes con soporte de peso plantar y coordinacin frecuente entre patas delanteras y traseras. Pasos constantes con soporte de peso plantar, coordinacin constante entre patas delanteras y traseras. Rotacin interna o externa de patas, principalmente al hacer contacto con el piso o al despegar. Tambin pasos plantares frecuentes, coordinacin constante entre patas delanteras y traseras y pasos dorsales ocasionales. Pasos plantares constantes y coordinados entre patas delanteras y traseras. No separa los dedos o slo ocasionalmente cuando avanza la pata hacia delante. Predominio de la alineacin paralela de la pata al cuerpo al hacer contacto con el piso. Pasos plantares y coordinados entre patas traseras y delanteras constantes durante la marcha. La separacin de los dedos ocurre frecuentemente cuando avanza la pata hacia adelante. Al hacer contacto con el piso hay predominio de la alineacin paralela de la pata al cuerpo, pero la rota al levantarla. Pasos plantares y coordinados entre patas traseras y delanteras constantes durante la marcha. La separacin de los dedos ocurre frecuentemente cuando avanza la pata hacia adelante. Al hacer contacto con el piso hay predominio de la alineacin paralela de la pata al cuerpo, pero al levantar la pata la mantiene alineada sin rotar. La separacin de los dedos es constante durante la marcha. Al hacer contacto con el piso predominio de la alineacin paralela de la pata al cuerpo, pero la rota al levantarla. Pasos plantares coordinados entre patas traseras y delanteras constantes durante la marcha. La separacin de los dedos ocurre constantemente durante la marcha. Al hacer contacto con el piso y levantar, predominio de la alineacin paralela de la pata al cuerpo. Arrastra la cola parte o todo el tiempo. Pasos plantares, marcha coordinada y separacin constante de dedos. Al hacer contacto con el piso y levantar hay predominio de la alineacin paralela de la pata al cuerpo, la cola levantada constantemente e inestabilidad del tronco. Igual pero tronco constantemente estable.

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