Estudio la estabilidad del glbulo rojo frente a soluciones con distinta tonicidad (transporte de agua y fragilidad de la membrana) Universidad

Austral de Chile, Facultad de Ciencias, Instituto de Bioqumica. Esteban Corales Nstor Corro Carolina Ehrenfeld

Introduccin Para poder estudiar como distintas soluciones afectan la integridad de la membrana, es necesario tener ciertas variables controladas. Adems de la temperatura, un factor importante es la concentracin de solutos tanto dentro como fuera de una clula, conocido como equilibrio osmtico. El presente protocolo tiene por finalidad demostrar el efecto de dos soluciones, una hipotnica y otra hipertnica, a base de concentraciones de NaCl, en la integridad de la membrana de glbulos rojos, llegando como efecto a hemolisis y crenacin respectivamente. Adems una tercera solucin, isoosmotica de sacarosa, intentar demostrar que la permeabilidad y transporte de agua a travs membrana puede ser demostrada en esta condicin. La sacarosa, a la mnima posibilidad de atravesar la membrana (por ser un compuesto apolar pequeo), comienza a ingresar, con el consiguiente ingreso de agua (debido a el desequilibrio osmtico que genera el ingreso de soluto a la clula) y el glbulo rojo debera, comenzar una hemolisis, debido a la permeabilidad de la membrana a este compuesto. Midiendo este ingreso a travs del tiempo se puede calcular el valor de permeabilidad.

1. Recoleccin Los glbulos rojos humanos en solucin de preservacin del banco de sangre se proceden a centrifugar en tubos de centrfuga plsticos a 2000 rpm durante 10 min a 4C. El sobrenadante de la centrifugacin se desecha y el precipitado que contiene los eritrocitos se resuspende en 0,770 ul corresponden de tampn fosfato-sodio 0.5 M pH 7.4 y agua hasta completar 5ml, agitando suavemente y se centrifuga nuevamente. Esta operacin se repite hasta que el sobrenadante sea traslcido. 2. Someter a Soluciones de Diferente Tonicidad. Se usaran 2 soluciones de diferente tonicidad para evaluar tanto la estabilidad de la membrana: -Solucin Hipertonica: Los glbulos rojos sern sometidos a una solucin 1Osm de NaCl. Para eso agregamos en un tubo de ensayo, 2,5ml de NaCl 1M (NaCl 2 osmoles por litro) y rellenamos con agua destilada hasta el volumen de 5ml.

-Solucin Hipotonica: Glbulos rojos sern sometidos a una solucin 50mOsm de NaCl. Para esto agregamos a un tubo de ensayo, 125l de NaCl 1M y rellenamos con agua destilada hasta el volumen de 5ml. 3. Efecto de la Sacarosa en medio Isoosmtico. Se usara una solucin Isoosmtica de Sacarosa, para estudiar la permeabilidad de la membrana a compuestos no polares pequeos. -Solucin Isoosmotica de Sacarosa: Los glbulos rojos sern sometidos a una solucin Isotnica de Sacarosa en agua. Para esto, agregamos a un tubo de ensayo, 1,28ml de Solucin de Sacarosa 40%p/v y rellenamos hasta el volumen de 5ml con agua destilada. De esta manera tendremos 308mOsm de sacarosa en el medio. A estas tres soluciones, se le agregaran entre 2 a 3 gotas de la re suspensin de glbulos rojos obtenidos previamente. Se debe anotar la apariencia de cada tubo en estado inicial, y luego mantener los tubos por 30 minutos, pero agitando vigorosamente cada 5 minutos. Luego de 30 minutos, mezclar bien cada tubo. Se comparar la apariencia de cada uno de ellos contra un fondo blanco. Una solucin transparente indica que la hemlisis ah ocurrido, mientras que si aun esta turbia quiere decir que la hemolisis no ocurri. 4. Visualizacin Para visualizar los efectos de cada solucin, se prepara un portaobjeto con gotas por cada solucin, bien mezcladas y se cubre con un cubreobjetos. Se debe examinar a los glbulos rojos bajo un aumento de 100X (con aceite de inmersin) y dar nfasis tanto a la apariencia de los glbulos rojos en cada muestra y tamao de estos.