PROTEOMA

PESQUISA
Ilustraes cedidas pelas autoras

Avanos Recentes em Tcnicas de Eletroforese Bidimensional e Espectrometria de Massa

Luciana Di Ciero
Doutora, Pesquisadora, Esalq USP ldctleme@terra.com.br

Cludia de Mattos Bellato, Ph.D

Pesquisadora, CENA USP bellato@cena.usp.br

roteoma indica as PROTEnas expressas em um genOMA ou tecido. Enquanto o genoma representa a soma de todos os genes de um indivduo, o proteoma no uma caracterstica fixa de um organismo. O proteoma altera com o estado de desenvolvimento, do tecido ou mesmo sob as condies nas quais o indivduo se encontra. Portanto, h muito mais protenas no proteoma do que genes no genoma, especialmente para eucaritos. Isto porque h vrias maneiras do gene expresso, o RNA total, sofrer reduo (splicing) para construir o RNA maduro. Este ento vai servir de molde para a traduo de uma protena, a qual sofre modificao ps-traduo. Investigar diretamente os produtos dos genes uma forma de estudar doenas e qualquer problema biolgico complexo. Por exemplo, para entender molecularmente como uma clula funciona em um indivduo doente e em um sadio preciso ter conhecimento das protenas e de outros componentes celulares que esto presentes, como eles interagem e o resultado de suas interaes. Portanto, anlise ao nvel de protena necessria, pois o estudo dos genes atravs do sequenciamento dos genes, ou seja, o estudo genmica, no pode adequadamente prever a estrutura dinmica das protenas, uma vez que ao nvel das protenas que muitos dos processos de uma clula ocorrem, onde processos de doenas inicialmente acontecem e aonde muitas das drogas medicinais atuam. Sendo assim, protemica o mtodo direto

para identificar, quantificar e estudar as modificaes ps-traducionais das protenas em uma clula, tecido ou mesmo oragnismos. O termo protemica foi introduzido em 1995 para descrever todas as protenas que so expressas em um genoma (Anderson et al., 1996; Wilkins et al., 1996). Definir todos os aspectos da protemica difcil, pois atualmente este termo mais um conceito do que uma cincia bem definida. Protemica pode ser vista como uma metodologia de seleo da biologia molecular, a qual tem como objetivo documentar a distribuio geral de protenas da clula, identificar e caracterizar protenas individuais de interesse e principalmente elucidar as suas associaes e funes. Sendo assim, protemica fundamenta-se em princpios bioqumicos, biofsicos e de bioinformtica para quantificar e identificar as protenas expressas, pois elas se alteram conforme o desenvolvimento de um organismo assim como em resposta aos fatores do ambiente (Anderson & Anderson, 1996; Celis et al., 1996; Wilkins et al., 1996; Wilkins et al., 1997). H uma forte e sinergstica correlao entre os estudos protemicos e genmicos uma vez que ambas reas de estudo investigam a organizao celular ao nvel complementar, protenas e genes, e cada rea fornece informao que aumenta a eficincia da outra. Por exemplo, protemica conecta as descobertas da genmica com o desenvolvimento das drogas que as companhias farmacuticas in-

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tecido a estresses externos. Atravs da protemica pode-se fazer uma comparao do perfil protico de uma clula cancerosa com o de uma clula sadia, ou de uma clula cancerosa cujo portador est sob tratamento mdico. Vrias pesquisas j foram ou esto sendo conduzidas no mundo na rea da sade como o proteoma do fgado, rim, e para diferentes organismos, como Mycobacterium tuberculosis (agente causal da tuberculose), Plasmodium falciparum (agente causal da malria), Helycobacter pylori (agente causal da lcera e gastrite). Na rea agronmica, h estudos protemicos de milho, arroz, trigo, cana-de-acar, eucalipto entre outras, e de organismos que causam imapcto econmico, como aquele que fixa nitrognio atmosfrico para as leguminosas, Rhizobium spp., ou que causam doenas em em feijoerio e citros como Xanthomonas spp. Aqui no Brasil, pesquisas protemicas esto sendo realizadas com sucesso. No Estado de So Paulo, graas ao apoio da Fundao de Amparo a Pesquisa (FAPESP), estudos protemicos esto sendo conduzidos para entender o processo da interao entre a bactria patognica, Xylella fastidiosa, de citros variedade laranja doce. Tcnica aplicada ao Estudo Protemica A eletroforese de duas dimenses em gel de poliacrilamida (2DE) em conjunto com a espectrometria de massa so as duas tecnologias mais usadas atualmente para anlise de proteoma. A primeira aplicada para separao, deteco e quantificao das protenas e a espectrometria de massa para identificao das protenas graas aos grandes avanos da bioinformtica. Eletroforese Bidimensional (2DE) A tcnica de eletroforese bidimensional foi introduzida na dcada de 70. Entretanto foi nos ltimos 10 anos que ocorreram os grandes avanos nos mtodos que possibilitaram identificar protenas separadas atravs de 2DE de forma sensvel, rpida e conclusiva. Desde a introduo da tcnica de
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Figura 1. Esquema de procedimento de eletroforese bidimensional (A) Preparao de amostra: rompimento celular seguido de extrao e solubilizao de protenas das clulas (ou tecidos) (B) Separao na primeira dimenso por IEF, onde as protenas so separadas pelo seu ponto isoeltrico. (C) Separao na segunda dimenso SDS-PAGE, que separa protenas pela massa molecular aparente. (D) colorao das protenas separadas, resultando num mapa de pontos (spots). Digitalizao da imagem e anlise densitomtrica por programas de computador vestigam. Sendo assim, protenas de uma forma geral controlam a vida e a sade, ou seja, preciso entender as protenas e como elas operam celularmente para assim entender como regular os mecanismos da doena para um posterior tratamento. A Protemica pode ser aplicada em diversas reas de interesse como por exemplo na investigao de marcadores moleculares em determinadas doenas indicando a resposta da clula ou

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Figura 2. Perfil da protena total (150 ug) de Xylella fastidiosa, bactria patognica de citros var. laranja doce. IEF ocorreu entre pH3-10 e a 2DE em gel gradiente (9-18%) de poliacrilamida. Gel corado com nitrato de prata. Projeto financiado pela FAPESP

Figura 3. Esquema de Peptide mass fingerpriting (PMF) Os spots so recortados do gel 2DE e submetidos a digesto enzmtica, geralmente usando-se tripsina. Os peptdeos resultantes so incorporados a uma matriz e identificados por espectrometria de massa (MALDI-TOF). A massa dos peptdios so comparadas a um banco de dados para identificar sequncias de amoncidos, cujas massas previstas batem com a massa dos peptdios obtidos
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2DE, diversas modificaes foram feitas, principalmente na primeira dimenso. Utilizava-se os anflitos para estabelecer o gradiente de pH para a separao das protenas pelo ponto isoeltrico. Entretanto, o uso de anflitos com esta finalidade tem diversos problemas incluindo a incapacidade de correr grandes quantidades de protenas necessrias para a micro seqncia, pouca estabilidade do gradiente de pH durante a eletroforese e freqente falta de reprodutibilidade dos gis entre os laboratrios. O uso dos gradientes de pH imobilizados (IPG) para a separao por cargas na 2DE solucionou muitos dos problemas. Encontra-se no mercado fitas de gis IPG desidratadas (Amersham Biosciences) feitas de uma matriz de poliacrilamida, a qual modificada covalentemente com grupos cidos e bsicos que formam o gradiente de pH imobilizado em toda a extenso do gel. H diversas faixas de pH, desde ampla (3-10), como faixas estreitas, como por exemplo de 4,5-5,5 ou 7,0-11,0. Esta flexibilidade na escolha das faixas de pH a serem utilizadas de grande utilidade para separar eficientemente o maior nmero de protenas possvel. A 2DE combina duas tcnicas de separao: a primeira separao (primeira dimenso) a focalizao isoeltrica (IEF), e a segunda dimenso (2DE) a eletroforese em gel de poliacrilamida, chamada de SDS-PAGE. No IEF as protenas so separadas, atravs de uma alta tenso, em um gradiente de pH imobilizado em um gel de acrilamida at alcanarem a posio estacionria onde a carga total zero. O pH no qual a protena tem carga lquida zero chamado de ponto isoeltrico (pI). Na 2DE, as protenas so separadas pelo peso molecular, atravs de uma tenso, tambm em gel de poliacrilamida contendo ou no o detergente sulfato dodecil de sdio (SDS-PAGE). A mobilidade eletrofortica se d de acordo com o tamanho da protena sendo restringida pelo tamanho do poro da matriz de poliacrilamida, de uma forma que as protenas migram em uma velocidade proporcional ao seu tamanho. A matriz de poliacrilamida usada pode ser homo-

Figura 4. Ilustrao Esquemtica de DIGE ( adaptado de Patton, 2002) Duas amostras diferentes so derivatizadas em dois fluorforos diferentes, combinadas e submetidas a 2DE. AS protenas so detectadas em um scanner duplo a laser com filtros de excitao diferentes para gerar duas imagens separadas. As imagens so, ento sobrepostas com a ajuda de um programa de computador, os sinais so normalizados e os spots so quantificados. As diferenas na expresso das protenas so identificadas pela avaliao de uma imagem pseudo-colorida e os dados so comparados gnea ou em gradiente. J os parmetros eltricos usados na corrida dependem do tipo e da quantidade de amostra aplicada, influenciando na qualidade da focalizao. Estes parmetros devem ser cuidadosamente monitorados e controlados. Em aparelhos do tipo IPGphor (Amersham Biosciences), geralmente utiliza-se uma corrente de 50 uA por strip e uma voltagem que vai de 100 a 8000 (80kVh-150kVh). Para aplicar a tcnica de 2DE (Figura 1), as amostras biolgicas so, de uma maneira geral, tratadas da seguinte forma. Primeiramente, as clulas so rompidas atravs de mtodos qumicos (detergentes, solventes, etc) ou fsicos (homogeneizadores, monhos, french press). Seguido da ruptura celular, as protenas so solubilizadas e desnaturadas em uma soluo contendo detergentes no inicos ou zwiterinicos, caotropes (uria, tiouria), e pequenas quantidades de agentes redutores, como o ditiotreitol (DTT). Uma soluo comum a composta de uria (8 M), CHAPS (4%), DTT (70mM), anflito (0,5 a 2%) e azul de bromofenol (0,005%). A concentrao do anflito deve ser determinada para cada amostra empiricamente. A solubilizao das protenas uma etapa fundamental para o sucesso da eletroforese bidimensional. Estas solues devem ser otimizadas baseada nas amostras utilizadas no experimento. Sabe-se que protenas de membrana so de difcil visualizao em gel devido, principalmente a dificuldade de solubiliz-las, j que o uso do SDS

limitante para a 2DE. Recentemente foram disponibilizados diversos detergentes zwiterinicos que melhoraram muito o desempenho das solues de solubilizao para protenas hidrofbicas (Chevallet et al., 1998). Estes detergentes so sulfobetanas com cauda de cadeia geralmente com 8 a 16 carbonos. A Calbiochem comercializa estes detergentes com os nomes comerciais de SB 3-10, SB 312, ASB 14, ASB 16. Fizemos um estudo comparativo da eficincia de 4 detergentes na solubilizao de protenas de membrana de Xyllela fastidiosa(projeto Proteoma de Membrana de Xyllela fastidiosa financiado pela FAPESP), e mostramos que o ASB 14 mais eficiente quando comparado com o SB 3-10, seguido do CHAPS e Triton X-100 (Di Ciero et al., resultados recentes). Aps serem submetidas a 2DE, as protenas so visualizadas atravs de mtodos de deteco especficos para cada objetivo, como por exemplo deteco de protenas totais, modificaes ps-traducionais, etc. A maioria desses mtodos se baseia em colorao de protenas com corantes ou reagentes fluorescentes, ou deteco de protenas marcadas radioativamente por fluorografia ou autoradiografia. Dentre os diversos mtodos para colorao de protenas, os mais usados so colorao por Azul de Coomassie (Coomassie Blue) e colorao por prata, devido ao custo, facilidade de uso e compatibilidade com mtodos de caracterizao microqumica, tais como sequncia automtica de aminocidos e espectrometria de massa. Coomassie Blue detecta protenas com concentrao superior a 100 ng, enquanto a prata mais sensvel que o Coomassie, podendo detectar protenas em concentraes de at 1 ng. Os mtodos de marcao radioativa baseia-se na incorporao de 3H, 14 C, 35S, 32P, 33P ou 125I s protenas. Aps a eletroforese a deteco do sinal pode ser feita usando-se filme para autoradiografia ou fluorografia direta. Esses mtodos so aplicados em proteoma juntamente com a colorao por Azul de Coomassie ou nitrato de prata para anlise simultnea do nveis
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Figura 5. Ilustrao Esquemtica de Proteoma Mltiplo (MP) (Adaptado de Patton, 2002) Duas amostras diferentes so submetidas a 2DE. Os gs so corados por um atributo funcional particular, tal como glicosilao, e digitalizados. Os gis so ento corados para protenas totais usando o corante SYPRO Ruby e digitalizados novamente. As duas imagens so ento sobrepostas com a ajuda de um progarama de computador, e os spots so quantificados. As difertenas na glicosilao e expresso de protenas totais so identificadas pela anlise de imagens pseudo-coloridas e comparao de dados. O registro do perfil de protena total com padres de glicosilao so feitos pela sobreposio das imagens de expresso da protena total juntamente com a taxa de sntese de protena, bem como fornecer regies marcadas para a localizao de protenas
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de baixa abundncia em 2DE. Embora os mtodos de deteco por marcao radioativa sejam bastante sensveis e quantitativos por uma maior faixa de

abundncia, eles tendem a ser mais caros e perigosos de manipulao, e limitados a amostras que podem ser marcadosradioativamente(geralmente por marcao metablica). Mtodos de colorao reversa tm sido usados com menor freqncia para a visualizao de protenas em 2DE, os quais empregam cloreto de potssio, cloretos de cobre, cloreto de zinco, acetato de cobalto cloreto de nquel ou cloreto de zinco imidazol. Dentre elas, as mais usadas em proteoma so cloreto de potssio, cloreto de cobre e cloreto de zinco. O cloreto de cobre um pouco mais sensvel que o Azul de Coomassie, entretanto o cloreto de potssio menos sensvel. O mtodo que emprega o cloreto de zinco imidazol o mais sensvel entre eles e pode ser avaliados por densitometria, embora a faixa linear dinmica est restrita a 10-100 ng. Os gis corados com zinco-imidazol podem ser eletrotransferidos (electroblotted) ou eletroeludos (electroeluted) pela adio de um agente quelante ao tampo de transferncia. Outra vantagem deste mtodo que ele compatvel com mtodos de microsequncia baseados em Edman e a digesto trptica in gel para a identificao dos peptdeos por espectrometria de massa MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight). A deteco de protenas por fluorescncia em eletroforese em gel muito usada em laboratrios que pesquisam proteoma em larga escala. A faixa de deteco linear dinmica normalmente superior aos mtodos de colorao. Os corantes disponveis no mercado so o Vermelho do Nilo (Nile Red), SYPRO Vermelho, SYPRO Laranja e SYPRO Tangerina. Os corantes SYPRO so fceis de serem aplicados, atravs de somente uma etapa de colorao de 30 a 60 minutos sem a necessidade de descolorao. Estes corantes detectam pequenas quantidades de protena 4-8 ng e h metodologia para quantificao por anlise de imagem. Para anlise de modificaes pstraducionais so usados mtodos de deteco especficos para glicoprotenas (autoradiografias com a incor-

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Figura 6. Estrutura do reagente ICAT, composto de trs elementos: um grupamento reativo tiis, que se liga resduos de cistenas reduzidas; um espaador que pode conter deutrios (reagente pesado, com os deutrios nas posies indicadas por X) ou no (reagente leve, com hidrognios nas posies indicadas por X); e um grupamento de biotina utilizado para o isolamento seletivo dos peptdios contendo cistena (marcados com ICAT)

porao de 3H e 14C; fluorescncia, mtodo de Schiff, Azul de Alcian, etc.), fosforilao (autoradiografias com a incorporao de 32P ou 33P na cultura de clulas ou aps dentro de fraes subcelulares por protenas cinases, deteco in gel por hidrlise alcalina de sters de fosfato de serina ou treonina preciptando-se o fosfato liberado com clcio formando um complexo de fosfomolibdato e ento visualizando-se com um corante, tal como Verde de

Metil), protelise (ensaios zimogrficos, corantes fluorescentes BODIPY), nitrosilao (mtodo de Biotina), metilao (fluorografia), ribolizao (anticorpos especficos anti-ADP ribose). Aps a colorao do gel, observa-se um perfil bidimensional de pontos (spots), sendo que em cada ponto h mltiplas cpias de uma protena. A imagem deste perfil posteriormente documentada atravs de programas de computador apropriados (Figura

2), como o Melanie desenvolvido pela Genebio (Genebra, Suia), Image Master (Amersham BioSciences) e outros. Estes programas apresentam vrias funes, entre elas a de permitir uma anlise da abundncia da protena em cada spot atravs do volume, intensidade e rea. Diversos gis representando diferentes proteomas podem ser comparados com o objetivo de detectar protenas diferencialmente expressas . Apesar da tcnica de 2DE ter o potencial de separar milhares de protenas e ser a tcnica mais utilizada para anlise de proteomas, ela apresenta algumas limitaes para protenas muito cidas (pH menor que 3,5) or bsicas (pH maior que 9) protenas de baixa abundncia e paras protenas hidrofbicas, geralmente presentes nas membranes celulares. Porm, esta tcnica est sendo cada vez mais aperfeioada e logo limitaes como estas deixaro de existir. No geral, a 2DE um mtodo de separao eficiente, porque todas as protenas numa amostra so separadas simultaneamente, fornecendo informaes teis sobre pI, massa molecular, expresso e abundncia relativa e modificaes ps-traducionais pela alterao da mobilidade eletrofortica. Identificao das Protenas H vrias tcnicas para identificar uma protena, como por exemplo, o sequenciamento da protena atravs da degradao por Edman, sequenciamento qumico, processo imunolgico, espectrometria de massa entre outros. Uma das tcnicas mais utilizadas para a identificao das protenas a anlise do fingerprinting da massa precisa de um nmero de peptdios derivados da mesma protena (Figura 3). Para tal, as protenas de interesse so recortadas do gel, so fragmentadas (obteno dos pepitdeos), geralmente por digesto trptica, e os fragmentos so analisadas no espectrmetro de massa MALDI-TOF auxiliados por programas de informtica desenvolvidos por vrios grupos (Pappin, 1997; Mann et al., 1993; Henzel, 1993; Yates et al.,
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Figura 7. Esquema do procedimento de ICAT - Os resduos de cistena reduzida das protenas em amostras a serem comparadas so rotulados separadamente. Em uma das amostras usada a forma isotopicamente pesada e na outra amostra a forma leve do reagente ICAT. As duas amostras so combinadas e digeridas com tripsina. Os peptdios marcados, que contm cistena so isolados por cromatografia de afinidade e, posteriormente analisados por espectrometria de massa para a determinao da identidade da protena que deu origem ao peptdio e a abundncia relativa de cada protena nas amostras sendo comparadas

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1993; James et al., 1993). Uma vez conhecida a sequncia desta protena, a sua identificao geralmente feita por correlao de dados depositados em bancos acessveis via internet, como o da Swiss-Prot (Suia). Tcnicas e Opes para Anlise de Proteoma Diferencial O proteoma diferencial compara diferentes perfis de protenas entre situaes de interesse. O objetivo central do proteoma diferencial melhorar o contedo de informaes do estudo de proteoma atravs de anlises mltiplas. As trs principais tcnicas usadas atualmente para anlise de proteoma diferencial so eletroforese diferencial em gel (DIGE), Multplex Proteome (MP) e rotulao de protenas com reagentes ICAT (isotopecoded affinity tagging). A tcnica DIGE (Figura 4) usa sters de succinil de corantes de cianina, CY2, CY3 e CY5, que podem ser empregados para rotulao fluorescente para trs populaes complexas de protenas antes de mistur-las e resolv-las simultaneamente na mesma 2DE. Recentemente, foi desenvolvido outro procedimento similar usando corante Alexa Fluor. O Multplex Proteome (MP) baseia-se na determinao paralela dos nveis de expresso de protenas bem como em certos atributos funcionais, tais como nveis de glicosilao, capacidade de ligao com drogas ou metabolizao de drogas (Figura 5). Esta tecnologia utiliza o mesmo fluorforo para medir protenas atravs de todos os gis no banco de dados, e emprega fluorforos adicionais com diferentes excitaes e/ou emisso mxima para acentuar atributos funcionais especficos da espcie. A vantagem desta tcnica sobre a DIGE que ela d uma faixa muito mais larga de informaes. A tcnica de ICAT permite identificao sistemtica das protenas numa mistura complexa e quantificao precisa das diferenas em abundncia de cada protena presente em duas ou mais amostras proticas. O reagente ICAT formado por trs componentes funcionais: um grupamento reativo
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tiis, que seletivo para os grupamentos sulfidrilas das cadeias laterais de cistenas reduzidas, um grupo de etileno glicol que pode conter tomos de deutrio (isotopicamente pesado) ou no (isotopicamente normal) e que possibilita realizar quantificao precisa por MS, e um grupamento de biotina que a etiqueta de afinidade utilizado como base para o isolamento seletivo dos peptdios contendo cistena (marcados com ICAT) de uma mistura complexa de peptdios, atravs de cromatografia de afinidade em coluna de avidina (Figura 6). Os resduos de cistena reduzida das protenas nas duas amostras a serem comparadas so rotulados separadamente durante o experimento. Em uma das amostras usada a forma isotopicamente pesada e na outra amostra a forma leve do reagente ICAT. As duas amostras so combinadas e digeridas com tripsina. Os peptdios marcados, que contm cistena so isolados por cromatografia de afinidade e analisados por espectrometria de massa, determinando assim a identidade da protena que deu origem ao peptdio e a abundncia relativa de cada protena nas amostras sendo comparadas (Figura 7) (Gygi et al., 1999). Concluses A Protemica veio para revolucionar os estudos de Genoma, uma vez que utiliza-se de suas ferramentas para identificar as protenas expressas em situaes especficas em um dado momento naquele ambiente. A Protemica dinmica e permite fazer estudos comparativos. Os mtodos para anlise global da abundncia de protenas, modificaes ps-traducionais e as mudanas nesses dois parmetros como a funo de um estado biolgico da clula ou tecido se desenvolveram utilizando-se das tcnicas de eletroforese, cromatografia e espectrometria de massa como componentes-chave para o estabelecimento de plataformas de estudo. As inovaes tecnolgicas na deteco, anlise e quantificao de protenas acelerou rapidamente o desenvolvimento da Protemica nos ltimos 4 anos. Isso, sem dvida, ocorreu devido ao foco que institui-

es privadas e pblicas deram pesquisa do Genoma ao Proteoma. No Brasil, a Protemica vem se desenvolvendo desde o incio do Projeto Genoma da Xyllela fastidiosa financiado pela Fundao de Amparo a Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP). Diversos grupos inseridos no Genoma Funcional da FAPESP ainda continuam trabalhando com tcnicas protemicas com o objetivo de mapear as protenas funcionais importantes no estabelecimento da doena do amarelinhoe a sobrevivncia da bactrianaslaranjeirasvariedadedoce. Com os resultados obtidos destes estudos espera-se criar estratgias de controle desta doena, a qual j tem causado srios danos citricultura paulista. Literatura Consultada Chevallet M, Santoni V, Poinas A, Rouquie D, Fuchs A, Kieffer S, Rossignol M, Lunardi J, Garin J, Rabilloud T. New zwitterionic detergents improve the analysis of membrane proteins by two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 1998, 19, 1901-1909. Henzel, W. J., Billeci, T. M., Stults, J. T., Wong, S. C. et al. Identifying proteins from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide fragments in protein sequence databases. Proc Natl Acad Sci U S A 1993, 90, 5011-5015. James, P., Quadroni, M., Carafoli, E., Gonnet G. Protein identification by mass profile fingerprinting. Biochem Biophys Res Commun 1993, 195, 58-64. Mann, M., Hojrup, P., Roepstorff, P. Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases. Biol Mass Spectrom 1993, 22, 338-345. Pappin, D. J. Peptide mass fingerprinting using MALDI-TOF mass spectrometry. Methods Mol Biol 1997, 64, 165173. Yates, J. R. 3rd, Speicher, S., Griffin, P. R., Hunkapiller T. Peptide mass maps: a highly informative approach to protein identification. Anal Biochem 1993, 214, 397-408.

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