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Intro : Il a t, depuis longtemps admis, que les cellules iPS, autologues de lindividu dont ils en drivent, ne prsentent aucun

rejet immunologique lorsque r-inject chez celui-ci. Leur immunognicit na jamais t rellement tudie. Il a t montr dans cette tude que : lorsque des ES drivant de souris B6 sont rinjectes dans des souris B6 : formation de tratomes, car pas de rejet immunologique. Lorsque des ES drivant de souris 129 sont rinjectes dans des souris B6 (cellules alors allogniques) : pas de tratomes car rejet rapide de la souris B6. Des fibroblastes de souris B6 ont t reprogramms en iPS via des retrovirus (Vi-iPS) ou technique pisomale (pas d'i'ntgration dans le gnome), EiPS. Les B6 ViPS rinjectes dans des souris B6 : rejet immunologique (alors que les B6 ES forment des tratomes tolrs par la souris) Les B6 EiPS sont galement immunogniques : infiltration de LT, lsions tissulaires et rgression du tratome. Analyse globale du gnome : expression anormale dans certaines cellules diffrencies d'iPS cnduisant a une rponse T-dpendante, dans les souris syngniques (driv d'iPS B6 chez souris B6) D'ou le pouvoir immunognique des iPS doit tre valu avant toute application clinique, comme la rinjection des iPS d'un patient chez ce mme patient. Rsultats : Grce la capacit des ES et iPS a former des tratomes, on examiner le pouvoir immunognique des drivs d'iPS : valuation simultane de l'immunogncit de plusieurs cellules diffrencies. B6 ES forment des tratomes dans la souris B6, pas de rejet immunologique (pas d'infiltration de T CD4+ au niveau du tratome) 129 ES rejetes dans la souris B6 (infiltration de LT CD4+ dans tratomes en formation) Ces dcouvertes ont permis d'affirmer que la formation de tratome est un bon tmoin pour valuer l'immunogncit des drivs d'iPS in vivo. ViPS : driv de fibroblaste embryonnaires (MEF) de souris B6 par retrovirus : Oct4+SOx2+Klf4 ou Oct4+SOx2+Klf4+ myc Les clones rsultats ont un caryotype normal, expression en surface des marqueurs embryonnaires et de pluripotence, pluripotent (formation de tratomes dans des souris immunodprims/SCID), forment un adulte chimre Pour les analyses ultrieurs : utilisation de 4 clones indpendants d'iPS : 2 reprogramms avec les 3FT : V3-1 et V3-3 2 autres avec les 4FT : V4-1 et V4-2 La plupart des B6 iPS qui sont rinjects n'arrivent pas a former de tratomes car infiltration de LT et lsion tissulaire/ ncrose +++. Les tratomes qui ont pu tre visible ont t infiltr de LT aussi et qlq ncrose dans la tumeur. Les B6 ViPS rinjectes dans B6 : super immunognique. EiPS : Etudes rcentes : existence de LT spcifique pour l'expression d'Oct4, dans la priphrie. La raction de Oct4 dans les cellules diffrencies de B6 ViPS induit une rponse immunitaire chez B6. D'ou dveloppement d'une technique de reprogrammation utilisant un vecteur pisomal permettant l'expression de marqueurs de plur+embryo. Certains clones d'EiPS ont perdu leur vecteurs et sans nanmoins intgr les facteurs de reprogrammation (analyses Southern B). Caryotype normal, formation de tratomes dans les souris

B6. Mais la majorit des tratomes drivant des EiPS prsentent une infiltration de LT CD4+ (dans les passages cellulaires au tout dbut comme des plus tardifs). De plus, regression des tratomes avec ncrose dtect dans 10%, aprs 2mois d'injection des cellules. D'o : les cellules drivants des B6 EiPS peuvent tre immunognique dans souris B6, mais la rponse allognique y est plus faible, compar aux B6 ViPS. Pour tester cette conclusion : Gnration de 2 lignes d'iPS sans intgration : a partir de MEF B6, avec un vecteur plasmidique contennant les 4 FT. R-implantation des B6 iPS dans la souris B6. Infiltration de LT CD4+ dans la plupart des tratomes, qlq uns avec mme de la ncrose. Une petite fraction des tratomes ont completement rgrsss aprs seulmt 40jours aprs l'implantation de B6 iPS chez B6. D'o (et de manire sure) : les drivs d'iPS sont immunognique dans l'individu de dpart (syngnie). Afin de comprendre les mcanismes immunologiques : analyse d'expression gnique dans les tratomes provenant de B6 ES et B6 iPS Sur-expression de 9 gnes dans les cellules du tratomes B6 EiPS, gnes alors commun dans tous les tratomes B6 EiPS, dont : Hormad1 : AG de tumeur Spt1 : AG tissu-spcifique Comprendre pourquoi ces 9 gnes sur-exprims provoque une raction immunognique dans la sourie B6 : expression ectopique de 7 de ces 9 gnes dans des cellules B6 ES sous le contrle d'un promoteur ubiquitaire (CAG). Comme observs lors de l'implantation de B6 ES dans souris B6 : 90% des cas, formation de tratomes (expression ectopique de Lcef1, Retn) MAIS : quand expression ectopique de Zg16 : 80% pas de formation Expression ectopique de Hormad1 50% pas de formation.. blablablblblbalbalablabala... D'o : L'immunit inne n'a pas un grand rle jouer dans cette rponse, et que LT CD4+ (helper) et CD8+ (cytotoxique) sont importants dans le processus. Pas identifi les peptides rponsables de l'activation des LT, mais expression anormale de Hormad1 et Zg16 contribuent directement a l'immunogncit des iPS dans les individus syngniques. Conclusion gnrale : Qlq drivs d'iPS peuvent etre immunognique car rintroduits dans les individus d'origine. La rponse T-dpendante est active par l'expression anormale d'AG qui ne sont pas exprims durant le dveloppmeny normal ou la diffrenciation des ES. L'expression de ces petits AG serait probablement due a une subtile diffrence pigntique entre ES et iPS. Nanmoins, pour le dveleppement des iPS pour une utilisation clinique, amlioration/optimisation faire au niveau des technologies de reprogrammation actuelles afin de minimiser les diffrences pigntique entre ES et iPS. Le test d'imunogncit in vivo dcrit ici (=formation de tratomes) est un bon moyen pour voir si les cellules se sont correctement reprogrammes et diffrencies (dans le but d'amliorer les techniques).