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POPULATION D ADN COMPLEXE - ADN gnomique ou - copie d ARNm = CDNA

Amplification spcifique

Dtection spcifique

Clonage dans des vecteurs - hte cellulaire - vecteur - lier le fragment d ADN au vecteur - transfert dans lhte

Amplification in vitro

PCR
- polymrase thermostable -information sur la squence permettant de gnrer des amorces damplification

Hybridation molculaire - Sonde ADN ou ARN


marque

HYBRIDATION MOLECULAIRE

cible
Sonde

hybridation

Sonde hybride

Complmentarit
3 interactions hydrogne N N N N HN CH3 O NH N Thymine Thymine O N H N NH N N 2 interactions hydrogne Adnine Adnine H O O NH H NH N N Cytosine Cytosine

Guanine Guanine

I DEFINITION de la FUSION et de LHYBRIDATION MOLECULAIRE sb

db temprature Tm ADN double brin ADN simple brin glace refroidissement progressif REAPPARIEMENT HYBRIDATION Simple brin

Dnaturation - chauffage > Tm - agent dnaturant

II- FACTEURS DE LHYBRIDATION

-Temprature de fusion -Facteurs influenant lhybridation - la C% dADN et le temps COT ( ADN) et ROT (ARN) - la temprature - la complexit des squences - la force ionique

II- FACTEURS DE LHYBRIDATION

-Temprature de fusion -Facteurs influenant lhybridation - la C% dADN et le temps COT ( ADN) et ROT (ARN) - la temprature - la complexit des squences - la force ionique

III - Les diffrents types dhybridation


Lhybridation peut avoir lieu 1 - en solution 2 - sur support solide : immobilisation de la cible sur (nitrocellulose, nylon), sur verre colonies bactriennes chromosomes coupe de tissus...

une

membrane

Objectif : dtecter la prsence d'un acide nuclique d'une squence donne par lutilisation dun fragment dADN complmentaire = sonde

IV APPLICATIONS DE LHYBRIDATION 1-Hybridation dADN sur support solide : SOUTHERN BLOT

Procdure
Extraction ADN Fragmentation Electrophorse Transfert Hybridation, lavages, rvlation

SOUTHERN BLOT

..\Bureau

Applications
- Recherche daltrations sur un gne - Empreintes gntiques -

Southern blot : illustrations RFLP


E E E E AA BB CC AB AC

A
E

sonde 6 kb sonde 8 kb

2 kb
- 8 kb E E - 6 kb - 5 kb E E E

B
E

sonde 5 kb

2 kb

2 -Hybridation dARN sur membrane Northern Blot


Procdure

A B C D E - 3 kb - 2 kb

Extraction ARN Electrophorse Transfert Hybridation, lavages, rvlation

Application
- Analyse de lexpression dun gne - Recherche de variants dpissage

NORTHERN BLOT

3 - Hybridation dADN in situ


Procdure
Hybridation de sondes fluorescentes sur chromosomes en mtaphase

Applications
Recherche de remaniements du gnome Localisation dun gne

Hybridation in situ sur chromosome


Objectif : dterminer sur quel chromosome et dans quelle rgion se trouve le gne dont on possde la sonde. En pratique: - prparation des chromosomes - hybridation directement sur les prparations fixes sur lame - Sonde marque au tritium (H3): rayonnement trs court, donne donc une localisation fine de la zone mettant la radioactivit. - rsultat lu sous microscope : les signaux positifs apparaissent sous forme de grains noirs disposs sur les chromosomes.

Dtection d'un gne de Drosophile

Localisation chromosomique

Localisation en 2q13

Rouge : sonde gne BCL11A Vert: sonde centromre chromosome 2

Hybridation in situ
Dtection du virus d'Epstein-Barr laide dune sonde reconnaissant lARN (= gnome) du virus - coloration nuclaire bleu fonce des noyaux infects - contre coloration verte des autres noyaux

Indications: Syndromes lymphoproliferatifs et lymphomes

Hybridation sur coupe de tissu Objectif : dterminer quelle sous population du tissu exprime un ARN donn (un tissu est gnralement constitu de diffrents types cellulaires, pas toujours faciles sparer)

Coupe d'embryon de Drosophile qui a subi une hybridation avec une sonde d'un gne impliqu dans le dveloppement embryonnaire

Hybridation sur colonie de bactries, sur plage de lyse


Objectif: dtecter parmi un grand nombre de bactries ou de phages recombinants celle ou celui qui contient le fragment d'ADN recherch --> criblage de banque

Botes avec colonies -bactries ou phages(milliers millions)

Coussin de NaOH (clatement cellules + dnaturation ADN)

Hybridation Lavages

+ Sonde
Prise d'empreinte (nylon ou nitrocellulose) Autoradiographie

Fixation (cuisson ou UV)

Localisation des clones d'intrt

LES SONDES

LES SONDES
I Dfinition II - Les diffrents types de sondes - les sondes ADN gnomique - les sondes cDNA - les oligosondes - les ribosondes III- Obtention des sondes - clonage - PCR IV Marquage des sondes

IV Marquage des sondes 1 - lagent de marquage : - marquage radioactif


32P, 35S, 3H

- marquage froid - direct nuclotide modifi par un fluorophore - indirect nuclotide marqu par un reporter qui sera repr par une molcule affine 2 stratgies de marquage - nick translation - multi-amorage au hasard - marquage des oligonuclotides

Les sondes radioactives

32P, 35S, 3H

Attention : les sondes radioactives prsentent de nombreux inconvnients : 1. ncessit de se protger contre le rayonnement mis, maniement des sondes inconfortable 2. dcroissance rapide du 32P, d'o besoin de marquer les sondes frquemment Avantage : grande sensibilit

Les sondes froides Marquage direct avec un fluorophore Le nuclotide portant le marqueur est incorpor directement,au cours de la synthse du fragment dADN. Groupe chimique qui fluoresce quand il est expos une longueur donde donne : Fluoresceine, Cy5, Cy3, Rhodamine, Texas red, TAMRA, TET,

Marquage indirect : nuclotide marqu par un reporter qui sera repr par une molcule affine - digoxignine

- marquage par la biotine-streptavidine.

MARQUAGE PAR TRANSLATION DE COUPURE - Nick Translation


Endonuclase utilise dans des conditions mnages

La DNAse gnre quelques cassures alatoires simple brin

Au niveau des cassures la DNA polymrase I dtruit lADN par son activit exonuclasique (5-3).

et le synthtise par son activit polymrase en prsence de nuclotides dont un est marqu

MARQUAGE PAR MULTI AMORCAGE AU HASARD Random priming


Sparation des 2 brins

Ajout dun cocktail doligonuclotides Hybridation au hasard

Les oligonuclotides servent damorces la Polymrase (fragment de Klenow de la Pol I) qui utilise des nuclotides libres dont 1 est marqu Brin nosynthtis radioactif

MARQUAGE DUN OLIGONUCLEOTIDE