Transcripcin.: Es el proceso mediante el cual se forma una secuencia de ARN (ARNm) a partir de un molde de ADN.

Factor de Transcripcin: Protena necesaria para iniciar el proceso de transcripcin ya que reconoce las posiciones en cis que forman parte de los promotores, participando y regulando la expresin de un gen o un grupo de genes, a travs de la regulacin del inicio de la transcripcin. Algunos de estos elementos y factores son comunes a varios genes, y se encuentran en una cierta variedad de promotores que hace que se utilicen de manera constitutiva. Por el contrario, otros son bastante especficos, lo que hace que su utilizacin est bastante regulada. Elemento Cys: Los elementos cis-reguladores son secuencias especficas del DNA tambin llamadas sitios de unin o sitios de consenso que permiten promover o regular la expresin de varios genes; sin ellos ningn gen podra ser expresado. Regin de cido nucleco que regula la expresin de genes localizados en la misma hebra. Puede estar localizado en la regin promotora 5 del gen que controla, en un intrn o en una regin 3 no codificadora. Son generalmente sitios de unin de uno o ms factores trans-activadores. Elemento regulador Trans: Protena que interviene en el proceso de transcripcin y que acta en cys. Reconoce un elemento Cys especfico o parecidos llamados putativos. Gen: Fragmento de ADN capaz de ser transcrito a ARN y, en el mayor de los casos, traducido a un polipptido. Unidad fundamental fsica y funcional, de la herencia que transmite la informacin de una generacin a la siguiente. Transcrito primario: Pre-ARNm. ARN Precursor. Cadena simple de ARNm producto de la transcripcin antes del splicing (cuando las cadenas de ADN y la ARN polimerasa se separan de la cadena de ARN). Intrn: Es un fragmento de ADN que est presente en un gen pero que no codifica ningn fragmento de la protena (no codifican amino cidos). Los intrones son eliminados en el proceso de maduracin del ARN. Exn: Fragmentos del gen que codifican aminocidos de la protena. Estas regiones no son separadas durante el proceso de splicing, por lo que se mantienen en el ARNm maduro. Los exones son las regiones de un gen que codifican protena. Cada exn codifica una porcin especfica de la protena completa, de manera que el conjunto de exones forma la regin codificante del gen. UTR: Regin no traducida de los genes. Se habla generalmente de un 5'-UTR y de un 3'-UTR, que son las dos partes no traducidas de cada gen, debido a que se encuentran colindando el marco abierto de lectura (u ORF). De este modo, el elemento que est aguas arriba del ORF es el 5'-UTR, pues contacta con el ORF mediante el carbono 5' de la desoxirribosa del primer desoxirribonucletido del ORF (es decir, de la adenosina del codn de inicio de la traduccin); y, aguas abajo, se

sita el 3'-UTR, pues contacta mediante el carbono 3' del ltimo desoxirribonucletido del ORF (es decir, el ltimo del codn de stop). Las UTRs poseen gran importancia en la regulacin de la expresin gnica. Por ejemplo, existen protenas adaptadoras que reconocen secuencias especficas, no codificantes, del 3'-UTR. Promotor: Secuencia especfica de ADN que controla la iniciacin de la transcripcin del gen. Es el punto de inicio de la transcripcin del ADN y contiene la informacin necesaria para activar o desactivar el gen que regula. El promotor est presente tanto en procariotas como eucariotas. Acta como sitio para la unin de los factores de transcripcin y la ARN polimerasa durante el inicio de la transcripcin. Se encuentra corriente arriba del gen. Los promotores se localizan en los extremos 5'-terminales de los genes, antes del comienzo del gen, y a ellos se unen los factores de transcripcin mediante fuerzas de Van der Waals y enlaces de hidrogeno. Los promotores tienen secuencias reguladoras definidas, muy conservadas en cada especie, donde las ms conocidas son la caja TATA (situada sobre la regin -10 -30), con la secuencia consenso TATA(A/T)A(A/T); y la caja CAAT (situada en un punto anterior). Unidad Transcripcional: Segmento de ADN comprendido entre la iniciacin y la terminacin de la transcripcin. Fragmento de ADN que se transcribe; incluye en sus extremos el promotor y el terminador. Puede ser: Monocistrnica: UT con un solo gen. Policistrnica: UT con ms de un gen. Regin codificante: Trozo de ARN que codifica una protena. Todos los exones de un gen que contribuyen a su producto o productos proteicos. Ribozima: Molcula de ARN con capacidad cataltica, es decir, tienen la capacidad de actuar como catalizadores (acelerar reacciones de forma especfica). Su actividad se basa en transesterificacin e hidrlisis del enlace fosfodister. Poseen un centro activo que se une especficamente a un sustrato (con frecuencia una molcula de ARN) y que facilita su conversin en un producto. Splicing: Eliminacin de los intrones y unin de los exones en ARN durante la transcripcin. Spliceosoma: (tambien llamado Complejo de corte y empalme) es un complejo formado por cinco ribonucleoprotenas nucleares pequeas (snRNP) capaz de eliminar los intrones (secuencias no codificantes) de los precursores del mRNA; este proceso se denomina splicing de ARN. Las snRNP son complejos formados por unas diez protenas ms una pequea molcula de RNA, rica en uracilo (U), que es la encargada de reconocer al intrn mediante apareamiento complementario de bases. Reconoce seales presentes en la secuencia de RNA, se une a ellas, corta en dos puntos el transcrito y luego une el extremo del RNA que se encuentra ro arriba del sitio de corte ms prximo al 5' con el extremo que se encuentra ro abajo del sitio de corte ms cercano al extremo 3.

Opern: Es una unidad gentica funcional formada por un gen operador y uno o ms genes estructurales capaces de ejercer una regulacin de su propia expresin por medio de los sustratos con los que interaccionan las protenas codificadas por sus genes estructurales, que participan en vas metablicas cuya expresin generalmente est regulada por otros 2 factores de control, llamados: Factor promotor. Operador. El operador permite la activacin/desactivacin del promotor a modo de "interruptor gnico" por medio de su interaccin con un compuesto inductor. Y de esta manera el promotor dar lugar a la expresin/represin del resto de los genes estructurales. Secuencia enhancer: Secuencia (cis-actuante) de ADN en la regin promotora que intensifica la expresin de un gen. La secuencia central del enhancer se conoce como enhanson. ACTUAN COMO REGULADORES DE LA EXP GENICA. Secuencia regulatoria del ADN de eucariotes que puede encontrarse lejos del gen cuya expresin controla. La unin de protenas especficas al enhancer modula la velocidad de transcripcin del gen. Promotor constitutivo: Se dice que un promotor es constitutivo cuando permite que la expresin del gen que est bajo su control se d de forma continua. Por el contrario, los promotores regulables slo permiten la expresin de los genes que controlan cuando su producto es esencial. Pueden ser inducibles si slo permiten la expresin del gen o genes que regulan tras un estmulo determinado (en presencia de las condiciones de induccin), y reprimibles, cuando la expresin de los genes bajo su control es continua y slo se detiene tras un determinado estmulo (bajo las condiciones de represin) o bajo determinadas condiciones. Burbuja de Transcripcin: Es una apertura de ADN desnaturalizado de 18 pares de bases, donde empieza a sintetizarse el ARN cebador a partir del (nucletido nmero 10) del ADN molde de la burbuja de transcripcin. La burbuja de transcripcin se llama complejo abierto. 2. Dogma central Biologa Molecular: Expone que el ADN es convertido a varios tipos de ARN: ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), y ARN ribosomal (ARNr). Y este ARN es traducido a protenas. Adems, la transcripcin es el primer nivel de expresin gnica. Con estos tres mecanismos (replicacin, Transcripcin, Traduccin) conseguimos extraer de la informacin gentica (ADN) y los materiales (protenas) necesarios tanto funcional como estructuralmente para que una clula funcione. TRANSCRIPCIN PASOS. PREINICIACION Antes del inicio de la transcripcin se necesitan toda una serie de factores de transcripcin que se unen a secuencias especificas de ADN para reconocer el

(promotor) sitio donde la transcripcin ha de comenzar y se sintetice el ARN cebador. La formacin del complejo de transcripcin se realiza sobre el promotor TATA, all se forma el ncleo del complejo de iniciacin. Sobre la caja TATA se fija una protena de unin (TBP) junto con el factor de transcripcin TFII D (TF: transcripcin factor). Despus, a ellos se unen otros factores de transcripcin especficos: TFII A, que estabiliza el complejo TFII D-ADN; los factores TFII B y TFII E se unen al ADN y el TFII F (una helicasa dependiente de ATP) y al final la ARN polimerasa. Todo ello forma un complejo que se llama complejo de pre-iniciacin cerrado. Cuando la estructura se abre por mediacin del factor de transcripcin TFII H, da comienzo la iniciacin. INICIACION La ARN polimerasa se une a las regiones promotoras, lo que permite un desenrollamiento local de 17 pares de bases de la molcula de ADN - patrn (llamada burbuja de transcripcin). La sntesis de ARN siempre comienza con GTP ATP, es decir, con una base purina. Cuando se forma el complejo abierto, la ARN polimerasa comienza a unir ribonucletidos mediante enlaces fosfodiester. La subunidad sigma () se disocia desde la holoenzima cuando se han trascrito 12 bases. Esta subunidad una vez suelta puede unirse a otra enzima ncleo, permitiendo el inicio de una nueva sntesis. DISGREGACION DEL PROMOTOR Una vez sintetizado el primer enlace fosfodiester, se debe deshacer el complejo del promotor para que quede limpio y volver a funcionar de nuevo. Durante esta fase hay una tendencia a desprenderse el transcrito inicial de ARN y producir transcritos truncados, dando lugar a una iniciacin abortada, comn tanto en procariotas como eucariotas. Una vez que la cadena transcrita alcanza una longitud de unos 23 nucletidos, el complejo ya no se desliza y da lugar a la siguiente fase, la elongacin. La disgregacin del promotor coincide con una fosforilacion de la serina 5 del dominio carboxilo terminal de la ARN polimerasa, que es fosforilado por el TFII H (que es una protena quinasa dependiente de ATP). ELONGACION La ARN polimerasa cataliza la elongacin de cadena del ARN. El centro activo de la ARN polimerasa reconoce a los ribonucletidos trifosfato entrantes para unirlos por apareamiento de bases a la cadena de ADN. Cuando el nucletido entrante forma los enlaces de hidrgeno idneos, entonces la ARN polimerasa cataliza la formacin del enlace fosfodiester que corresponde. TERMINACION Al finalizar la sntesis de ARNm, esta molcula ya se ha separado completamente del ADN (que recupera su forma original) y tambin de la ARN polimerasa, terminando la transcripcin.

Justo cuando el complejo de transcripcin se ha ensamblado activamente debe desensamblarse una vez que la elongacin se ha completado. La terminacin est sealizada por la informacin contenida en sitios de la secuencia del ADN que se est transcribiendo, por lo que la ARN polimerasa se detiene al transcribir algunas secuencias especiales del ADN. Estas secuencias son ricas en guanina y citosina, situadas en el extremo de los genes, seguidas de secuencias ricas en timina, formando secuencias palindrmicas, que cuando se transcriben el ARN recin sintetizado adopta una estructura en horquilla que desestabiliza el complejo ARNADN, obligando a separarse de la ARN polimerasa, renaturalizndose la burbuja de transcripcin. Algunas secuencias de ADN carecen de la secuencia de terminacin, sino que poseen otra secuencia a la que se unen una serie de protenas reguladoras especficas de la terminacin de la transcripcin como rho. RESUMEN: Para iniciar la transcripcin del ARNm, la ARN polimerasa II se une a un promotor en el ADN (secuencia de nucletidos que se localiza antes de un gen en extremo 5). Esta enzima separa las cadenas de un fragmento de ADN, exponiendo sus bases libres. La cadena antisentido de ADN proporciona el molde para la sntesis de ARNm, dado que el ARN slo puede ser sintetizado en el sentido 5-3. La ARN polimerasa se desplaza en sentido 3-5 a lo largo del molde de ADN, ensamblando la cadena de ARNm complementaria en sentido 5-3. Poco despus de iniciarse su sntesis, a la molcula de ARN se adiciona en el extremo 5 un nucletido de guanina modificado qumicamente, evitando la degradacin de la molcula e indicando, posteriormente, la posicin inicio de la traduccin. La transcripcin contina hasta alcanzar un grupo de bases: secuencia de terminacin. Cerca de este punto se aaden 100-200 pb de adenina en el extremo 3 del ARN (cola de poli-A), que estabiliza a la molcula de ARNm para evitar que sea degradado cuando llegue al citoplasma. Por ltimo, las cadenas de ADN y la ARN polimerasa se separan de la cadena de ARN, dejando transcrita una cadena simple de ARNm (transcrito primario). Los genes constitutivos se transcriben en todas las clulas del organismo, codifican protenas necesarias para el mantenimiento y el metabolismo celular. Algunas protenas que participan en el proceso de transcripcin de los genes estructurales se denominan factores de transcripcin generales (FTG). Otras, las que slo activan ciertos genes y en determinados momentos del desarrollo, se denominan factores de transcripcin especficos. Una transcripcin eficaz requiere de la interaccin de un amplio complejo de aprox 50 protenas diferentes. stas incluyen factores de transcripcin generales (basales) que se unen a la ARN polimerasa y a secuencias especficas del ADN en la regin promotora (secuencias del tipo TATA). Los FTG permiten a la ARN polimerasa unirse a la regin promotora para que stas pueda funcionar eficazmente en la transcripcin (fig. 2.9).

(Bamshad White, Jorge Carey. Gentica mdica. 3 edicin. Ed. Elsevier. Espaa. 2005.)

de plegar el ADN y facilitar as las interacciones entre amplificadores localizados a distancia y los correspondientes factores basales y los promotores (genes). ARN POLIMERASAS Protenas enzimticas que sintetizan ARN a partir de ADN molde.

Es una enzima de 11 KDa en fagos, dirigida por el ADN que forma el enlace fosfodister en el RNA en crecimiento mediante un ataque nucleoflico al nucletido entrante. No necesita cebador y sintetiza en direccin 5'-3'. En otras palabras, Sintetizan en direccin 5-3 a partir de un molde de ADN. Se observa unida al promotor en el ADN. Adems de la polimerizacin de los ribonucletidos trifosfato, tiene funciones como: Se reconoce y se une a localizaciones especficas o promotores de la molcula de ARN. Desenrrolla parcialmente la molcula del molde de ADN, gracias a su actividad helicasa intrnseca. Sintetiza un ARN cebador para la elongacin posterior. Cataliza consecutivamente la elongacin de la cadena de ARN, al mismo tiempo que enrrolla y desenrrolla la doble cadena de ADN, y termina la transcripcin despus de copiar el gen. Se le han identificado cuatro tipos de subunidades: , , y . Alfa, beta, beta prima y sigma. La subunidad es llamada enzima interna, y reconoce el locus/centro promotor (secuencia de ADN que seala el sitio inicio de la transcripcin), por ello puede haber diferentes sigmas. Una vez que la RNA pol lleva iniciados dos o tres NTP se suelta sigma y sigue el ncleo, este factor sigma se une a otro ncleo y contina la transcripcin hasta que encuentra la seal de terminacin. Su masa total son 480 kDa. Las subunidades (funciona como centro activo) y (subunidad de unin al ADN porta el dominio carboxi termimal-) se combinan para constituir el sitio activo de la enzima para la polimerizacin. ARN polimerasa PROCARIOTAS Cataliza la sntesis de todos los tipos de ARN: ARNm, ARNr y ARNt. Est formada por cinco subunidades: dos alfa, beta, beta prima y sigma, que funcionan conjuntamente para llevar a cabo las reacciones de transcripcin. La enzima completa es denominada Holoenzima y se divide en dos componentes principales: La enzima central, denominada Core, formada por las subunidades 2 , y . El Factor Sigma (el polipptido ). Los nombres indican que solamente la Holoenzima tiene la capacidad de unirse a la cadena molde de ADN e iniciar la transcripcin; pero una vez realizado esta, el factor es liberado, dejando que el Core contine con la elongacin. En definitiva, es el factor el que le da la capacidad a la ARN polimerasa para poder iniciar la sntesis del ARN mensajero en el sitio apropiado. La Holoenzima reconoce un sitio de unin especfico en el ADN, este sitio es denominado Promotor. Como consecuencia de lo dicho, la ARN polimerasa puede encontrarse en dos estados: 1) Un estado apropiado para la unin con el Promotor: estado de iniciacin u Holoenzima.

2) Un estado apropiado para la elongacin: Core de la enzima. La unin de la Holoenzima con el promotor, determina el Complejo Promotor Abierto, y esto es posible gracias a la presencia del factor . TRANSCRIPCION Procariotas Es una nica RNA pol (polimerasa) la que transcribe todos los ARNs. Promotores reconocidos por la misma enzima. INICIACION: El sentido de la transcripcin de un gen determinado es hacia la derecha. Al punto en el cual se inicia este proceso se lo denomina punto 0. Con nmeros negativos se sealan las bases ubicadas a la izquierda del punto 0. Con el mismo criterio, se sealan con nmeros positivos a las bases ubicadas a la derecha del punto 0. La secuencia de consenso ubicada 10 bases a la izquierda es la TATAAT. Esta caja orienta a la ARN polimerasa la direccin de sntesis del ARN; adems, es donde la doble hlice se abre para formar el complejo promotor abierto (Burbuja de transcripcin). 1. La ARN polimerasa unida a sigma identifica la secuencia promotor. 2. La enzima abre localmente las cadenas de ADN (cuando la holoenzima contacta la caja TATA) y empieza a leer la cadena molde. La fase de iniciacin no se completa hasta que se hallan polimerizado los primeros seis ribonucletidos. ELONGACIN: Despus que se han colocado los primeros seis ribonucletidos, la ARN polimerasa sufre un cambio en su conformacin, perdiendo la sub unidad . Se contina la sntesis en el estado de Core. El Core se mueve a lo largo del ADN colocando los ribonucletidos complementarios a la cadena de ADN molde, abriendo la hlice a medida que se desplaza. Inicio de la transcripcin en sentido 5-3. Los ribonucletidos se unen al extremo 3 de la cadena de ARN en crecimiento, formndose un Hbrido ARN-ADN (12 pb) en la regin desenrollada, el cual se mantiene estabilizado mediante enlaces puente de Hidrgeno. El nuevo ARN es liberado de estas uniones cuando el ADN recupera su estado de doble hlice por desplazamiento del Core. TERMINACION: Ocurre en secuencia terminadora. All, la enzima deja de aadir los ribonucletidos a la cadena de ARN en crecimiento. La ARN polimerasa identifica una seal de terminacin (secuencia palindrmica, rica en G y C, seguida de otra repetitiva rica en T).

Las secuencias terminadoras son Palindrmicas y estn antes del punto de terminacin. Esta secuencia contina con una secuencia de pares A-T, las cuales producen en el ARN mensajero una secuencia de 6 a 8 Uracilos en el extremo transcripto. Esta secuencia de Uracilos es la que da la seal a la ARN polimerasa para que se disocio del ADN molde. Cuando se transcribe el palndromo, las secuencias complementarias en el ARN se aparean formando un bucle que favorece la separacin del ARN transcrito de la hebra molde. LIBERACIN (MADURACION): Los puentes de Hidrgeno del hbrido de ARN-ADN, se rompen. Se reconstruye el ADN dplex. Los ARN transcritos primarios son cortados por enzimas especficas; los fragmentos resultantes adoptan la configuracin tpica de los ARNt y ARN r. Los transferentes adems sufren modificacin de algunas bases y adicin de la secuencia CCA en 3. Las molculas de ARNm son copias de los genes, no pasan por esta fase. Los RNA de procariotas no tienen ni cabeza de metil-GTP ni cola de poli-A. En procariotas la transcripcin y la traduccin es simultnea, mientras que las eucariotas requieren primero una maduracin del ARNm y despus se produce la traduccin. ARN POLIMERASAS EUCARIOTAS Tipos de ARN polimerasas: I, II y III. Son mayores de 600 kDa y se dividen en dos partes L y L'. Hay una ARN pol para cada tipo de ARN. ARN pol I (en el nuclolo): Sntesis, reparacin, revisin y retiro de cebadores, sintetiza precursores de ARN ribosmico. ARNr 28 S, 18 S y 5.8 S. RNA pol II (nucleoplasma): Reparacin, sintetiza precursores de ARNm, microARNs (snRNA). Los promotores para la ARN polimerasa II estn localizados en el lado 5 del sitio de inicio de la transcripcin. La RNA pol III (nucleoplasma): Enzima principal de polimerizacin. Sintetiza ARN de transferencia, ARN ribosmico de 5S, ARN-U, y otros ARN pequeos en el ncleo celular (ARNpnucleares) y en el citoplasma (ARNpcitoplasmticos). Los genes que codifican a los ARNt y ARNr son copias idnticas dispuestas en tndem. Polimerasa IV y V: reparacin en condiciones nicas. Otros tipos de ARN polimerasa se encuentran en la mitocondria, cloroplasto y ncleo del ribosoma.

Las ARN polimerasas I y III se encargan de transcribir los genes housekeeping (gen que se expresa en todas o en la mayor parte de las clulas, por intervenir en alguna funcin celular bsica. Son diferentes segn el tipo celular y el estado funcional). La ARN polimerasa II cataliza la transcripcin de los genes que codifican protenas. TRANSCRIPCION EUCARIOTAS En eucariotas el proceso ocurre en el ncleo, mitocondrias y cloroplastos. INICIACION: Los factores activadores se unen a las secuencias potenciadoras. Estos factores disocian el octmero de histonas, desenrollan la doble vuelta de ADN y dejan accesible la regin promotora. Tambin facilitan, a travs de los coactivadores, el acoplamiento de los factores basales con el ARN polimerasa II. Los factores basales se unen con el promotor (secuencia TATA, secuencia CAAT y secuencia rica en GC) y facilitan la colocacin de la ARN polimerasa II en el sitio de inicio del gen. La ARN-polimerasa II comienza la sntesis del precursor del ARN a partir de unas seales de iniciacin "secuencias de consenso" que se encuentran en el ADN. Entre las secuencias potenciadoras se intercalan secuencias silenciadoras. A ellas se unen factores represores que disminuyen la velocidad de transcripcin (impiden la actuacin de los factores activadores). ELONGACIN: La sntesis de la cadena contina en direccin 5'-3'. El extremo 5 del ARNm contiene 2 nucletidos conectados que siempre estn metilados (-CH3). Despus de 20-30 nucletidos se le aade al extremo 5' del ARN una cabeza (caperuza o lder) de metil guanosina trifosfato (metil-GTP) que lo protege de nucleasas (enzimas exonucleasas que destruyen los ARN) y es reconocida como punto de inicio de la traduccin. Contina la sntesis del ARN en direccin 5-3. FINALIZACION/TERMINACION: La ARN polimerasa reconoce la secuencia de finalizacin TTATTT. La enzima poliA-polimerasa adiciona una cola de poli-A (serie de nucletidos con adenina) al extremo 3. El ARN, ahora llamado ARNm precursor, se libera.

Esta cola de poli-A interviene en la maduracin y transporte fuera del ncleo. MADURACION: El ARN transcrito primario contiene secuencias intrnicas y exnicas. En el proceso de maduracin un sistema enzimtico reconoce, corta y retira los intrones (no codificadores). Los cortes-empalmes se realizan en secuencias concretas, con ayuda de la ribonucleoproteinas pequeas nucleares (asociaciones de ARN-U y proteinas). En algunos organismos la maduracin es regulada por ribozimas (ARNm autocataltico). Las ARN-ligasas unen los exones, formndose el ARNm maduro. Se pueden dar mecanismos alternativos de corte y empalme a partir de un mismo ARN transcrito primario lo que origina cadenas de ARNm con secuencias distintas: amplificacin de la expresin gnica. ADN POLIMERASAS Poseen una actividad exonucleasa; esto corresponde a la actividad de hidrolizar el ADN de hebra simple, removiendo deoxirribonucletidos terminales desde el extremo 3 (actividad exonucleasa 3 5) o desde el extremo 5 (actividad exonucleasa 5 3). Primer de ARN. PROCARIOTAS: ADN pol I: Act. exonucleasa 5-3. Replicacin y Reparacin. ADN pol II: Reparacin del ADN. Elimina el cebador de ARN y completa los huecos con ADN. ADN pol III: Holoenzima que replica la hebra retardada. EUCARIOTAS: ADN pol alfa y delta: Duplicacin del ADN cromosomal. ADN polimerasa beta: Reparacin del ADN. ADN pol gamma: Duplicacin del ADN mitocondrial. ADN pol psilon: Replicacin y reparacin del ADN. ARN POLIMERASAS La secuencia de ADN transcrito por la ARN polimerasa en ARN es llamado unidad de transcripcin y el producto de la sntesis (ARN) es el transcripto primario. No necesita una secuencia partidora o primer y no posee una actividad nucleasa. El ADN patrn es totalmente conservado despus de la sntesis de ARN. Formada por sub-unidades 2 . E. Coli. La sub-unidad (factor) sigma ( ) aumenta la velocidad y especificidad de la transcripcin, debido que reconoce 35 bases antes del sitio de inicio de la transcripcin (Regin promotora). Enzima Core: Formada por subunidades 2 , y . EUCARIOTAS: ARN polimerasa I (en el nuclolo) transcribe los genes de ARN ribosomal. El transcrito primario producido corresponde a un pre-rARN que posteriormente sufre algunas modificaciones para transformarse en una rARN maduro. ARN polimerasa II (nucleoplasma) transcribe los genes que codifican para protena y el transcrito primario corresponde a un ARN nuclear heterogneo (hnARN), que son los precursores del ARN mensajeros citoplasmtico. ARN polimerasa III (nucleoplasmtica) transcribe el rARN 5S, tARNs, ARN

citoplasmtico y ARN-U. DESTINO DEL PRODUCTO DE LA TRANSCRIPCION: El ARNm ha de ser exportado desde el ncleo hasta el citoplasma. Este ARNm sirve como molde de la traduccin. Es el proceso que convierte una secuencia de ARNm en una cadena de aminocidos para formar una protena. Este proceso consta de cuatro fases: activacin, iniciacin, elongacin y terminacin. SPLICING: Corte y empalme de ARN. En EUCARIOTAS. Poco despus de iniciarse su sntesis, a la molcula de ARN se adiciona en el extremo 5 un nucletido de guanina modificado qumicamente, evitando la degradacin de la molcula e indicando, posteriormente, la posicin inicio de la traduccin. La transcripcin contina hasta alcanzar un grupo de bases: secuencia de terminacin. Cerca de este punto se aaden 100-200 pb de adenina en el extremo 3 del ARN (cola de poli-A), que estabiliza a la molcula de ARNm para evitar que sea degradado cuando llegue al citoplasma. Por ltimo, las cadenas de ADN y la ARN polimerasa se separan de la cadena de ARN, dejando transcrita una cadena simple de ARNm (transcrito primario). ste es complementario a la secuencia de ADN molde. Los intrones son cortados del ARNm inmaduro por un sistema especfico que reconocen secuencias cortas dentro de l y que se encuentra cerca de los lmites con exones. Estas secuencias son llamadas "sitio dador" (comn en casi en todos los intrones), en el extremo 5y "sitio aceptor", en el extremo 3. Transcripcin y procesamiento del ARN. En eucariontes, el ADN es transcripto cuando la ARN polimerasa se une al promotor, normalmente situado upstream (ro arriba) del lugar de inicio. Una vez sintetizado, el preARNm sufre ciertas modificaciones: se eliminan los intrones o secuencias no codificantes (splicing), y se agrega una caperuza al extremo 5 y una cola poliadenina al extremo 3. El trabajo del corte y empalme esta catalizado por una estructura pequea, compuesta por ribonucleoproteinas nucleares llamadas snRNPs, constituidas por pequeos ARN nucleares (snARNs) asociado a protenas. Su nombre es spliceosoma. Esta estructura tiene a su cargo el reconocimiento de las secuencias mencionadas anteriormente en los intrones y su posterior fijacin. Luego

se desarrollan una secuencia de pasos que determinan el clivaje y ligado de los intrones y exones (Fig. 3): 1. El extremo 5del intrn es clivado y unido a otros sitios internos del intrn, cercano a su extremo 3 llamado "sitio de ramificacin". 2. Se produce el corte en el extremo 3 del intrn y son empalmados los dos exones de cada lado, liberndose el ARNm maduro del spliceosoma. 3. El intrn eliminado queda formando una estructura con forma de lazo, llamada "lariat", que posteriormente es degradado en el ncleo. Slo cuando se completa este proceso de corte y empalme del ARN, el transcrito maduro sale del ncleo. Se ha observado que ARNm inmaduros idnticos del mismo gen se procesan en ms de una forma. Esto significa que existen diversos empalmes alternativos, los cuales desarrollaran diversos ARNm maduros y por lo tanto distintos polipptidos funcionales. Algunos genes contienen sitios alternativos de corte y empalme que permiten que un mismo transcrito primario pueda ser cortado y ensamblado de diferentes formas. Dando lugar en ltimo trmino a distintas protenas a partir de un mismo gen. Los errores en el mecanismo splicing, al igual que los errores en la replicacin, constituyen una forma de mutacin que puede dar lugar a una enfermedad gentica. SIMILITUDES Y DIFERENCIAS ESTRUCTURALES QUE EXISTEN ENTRE LOS PROMOTORES DE LOS GENES TRANSCRITOS POR CADA UNA DE LAS ARN POLIMERASAS: Estructura de los genes en eucariotas: La secuencia de nucletidos que constituye un gen, y los propios genes entre s, no se disponen linealmente en los cromosomas sino espaciados por fragmentos de ADN que no poseen informacin que pueda ser transcrita. En todo gen, adems, distinguiremos las siguientes regiones: La regin promotora es una porcin del ADN situada al principio del gen y que, sin codificar ningn aminocido, sirve para que las enzimas que realizan la transcripcin reconozcan el principio del gen. La regin codificadora es la parte del gen que contiene la informacin para la sntesis de la protena. En la regin codificadora van a existir fragmentos de ADN que no contienen informacin: los intrones, y fragmentos que s que contienen informacin: los exones. Considerando la hebra 5'->3', el principio de esta regin

viene marcado por la secuencia de bases nitrogenadas ATG y el final por una de estas tres tripletas: TAA, TAG, TGA; tripletas que se denominan de paro, sin sentido o secuencias stop. La regin terminadora. Marca el final del gen.

ARN POLIMERASA I: (nuclolo) Genes clase I transcritos: En el gen (ADN) para el rARN presenta una regin promotora de 150 pares de bases, ubicada en la posicin -142 y +6. ARNr 285 ARNr 185 ARNr 5.85 Transcrito primario: preARNr grande. ARN POLIMERASA II: (nucleoplasma) Genes clase II transcritos: Sus promotores estn localizados en el lado 5 del sitio de inicio de la transcripcin. ARNm ARNsn Transcrito primario: ARNhn ARN POLIMERASA III: (nucleoplasma) Genes clase III transcritos: La regin interna promotora est entre las posiciones + 50 y + 84. En la regulacin de las sntesis de rARN 5S existen factores llamados: TFIIIA, TFIIIC. ARNt ARNr 5S Algunos ARNsn Transcrito primario: preARNt pre ARNr pequeo. CUL ES EL ROL DE LOS FACTORES DE TRANSCRIPCIN EN LA TRANSCRIPCIN: Protena necesaria para iniciar el proceso de transcripcin. Muchos de los factores de transcripcin actan mediante el reconocimiento de posiciones en cis que forman parte de los promotores o intensificadores de los genes. Los factores que ayudan a la labor de la ARN Pol II pueden dividirse en tres grupos: Factores generales, necesarios para el comienzo de la sntesis de ARN a partir de todos los promotores de clase II (genes codificantes). Junto a la Pol ARN II forman un complejo alrededor del punto de inicio de la transcripcin, y determinan en punto

concreto de inicio de sta; este complejo constituye el complejo de transcripcin basal. Factores corriente arriba,(upstream) o situados en 5', son protenas de unin al ADN que reconocen secuencias consenso cortas especficas situadas corriente arriba o en 5' (proximales) del punto de inicio de la transcripcin (p. ej. Sp1, que se une a la caja GC). Estos factores son ubicuos y actan sobre cualquier promotor que contiene el lugar apropiado de unin al ADN. Su funcin es incrementar la eficiencia del comienzo de la transcripcin. Factores inducibles, que funcionan de manera semejante a los factores corriente arriba, pero con un papel ms regulador. Se sintetizan o activan en momentos especficos en tejidos determinados. Las secuencias a las que se unen se denominan elementos de respuesta. El proceso de transcripcin debe estar finamente regulado, ya que de l depende la adaptacin al medio y el buen funcionamiento del organismo. Cada tipo celular y cada estado funcional, necesita un perfil de expresin gnica diferente que se adapte a sus necesidades. Los factores reguladores pueden incidir sobre cualquiera de los elementos de este complejo proceso. As hay reguladores que modifican la accesibilidad de los genes, otros que alteran la fase de iniciacin, otros que actan en la fase de elongacin y otros en la de terminacin. Igualmente existen reguladores de la transcripcin que actan sobre los procesos de maduracin del ARN. Los factores de transcripcin corresponden a pptidos cuya accin es clave para el control de la expresin gnica a travs de la regulacin del inicio de la transcripcin. Los factores de transcripcin pueden ser identificados como basales, especficos de tejido y dependientes de seales extracelulares. Los basales son aquellos presentes en la mayora de las clulas de un organismo eucariota y sin los cuales la transcripcin no se puede iniciar, es decir estn presentes de manera continua en la clula. Son muy conservados evolutivamente y promueven la formacin de un complejo plurimolecular. Los especficos de tejido se expresan de manera restringida en grupos de clulas pertenecientes a un tejido especfico, por ejemplo MyoD y Myogenina en clulas musculares. Los factores de transcripcin dependientes de seales pueden ser basales o especficos de tejido, estos se expresan en respuesta a seales extracelulares, es decir no estn en forma continua en la clula. Los genes que regulan tambin se expresan en tiempo y espacio muy especfico. Ej: los receptores nucleares para hormonas esteroideas o tiroideas. Los factores de transcripcin pueden actuar activando o reprimiendo la expresin de un gen o de un grupo de genes. El mecanismo de accin puede ser diferente para cada factor, entre los mecanismos ms estudiados estn: 1- Unin sobre los complejos de iniciacin 2- Eliminacin de un represor constitutivo 3- Activacin por unin a un elemento especfico presente en el ADN 4- Reclutamiento de inhibidores o de coactivadores de la transcripcin

Estructuralmente los factores de transcripcin poseen en general uno o varios dominios de reconocimiento y unin a secuencias especficas presentes en el ADN, dominios de activacin de la transcripcin y de interaccin con otras protenas. Los dominios corresponden a regiones estructurales que forman parte de la estructura terciaria de la protena.

Dominios de reconocimiento y unin al ADN ms frecuentes: El reconocimiento de secuencias especficas presentes en los promotores de los genes se lleva a cabo gracias a la posibilidad de variaciones locales en la estructura tridimensional del ADN, as como a la interaccin directa de la protena con las bases, sin necesidad de que se separen las hebras de la doble hlice. Esta interaccin tiene lugar generalmente en el surco mayor de la doble hlice. Un mismo dominio puede interaccionar simultneamente con diferentes puntos del ADN, induciendo en este un cambio conformacional que puede aproximar secuencias lejanas o incluso inducir la separacin local de las dos hebras del ADN favoreciendo el acceso de otras protenas. Tal es el caso del inicio de la transcripcin, donde los factores de transcripcin facilitan el acceso de la ARN polimerasa. -Hlice-Bucle-Hlice se abrevia HLH: Tambin consta de dos segmentos en forma de hlice y de un pptido de unin que le confiere una forma de bucle y da mayor flexibilidad a la estructura. Generalmente las protenas se asocian formando dmeros para interactuar con el ADN. -Homeodominio: puede considerarse como una ampliacin del motivo HGH, pero se diferencia por aparecer repetidamente y con estructura idntica en diferentes protenas. Posee una tercera hlice de la cual emerge una regin sin estructura secundaria definida que interacciona con el ADN. -Dedo de Zinc: elemento estructural formado por unos 30 aminocidos, de los cuales 2 cistenas y 2 histidinas aparecen en posiciones constantes relacionadas tetradricamente con un in de Zinc. Est constituido por dos hojas antiparalelas cada una con un residuo Cys, seguidas de un giro y de un hlice con lados His. El plegamiento de la cadena peptdica en esta regin forma una estructura

tridimensional alargada similar a un dedo. Es frecuente que una protena posea mltiples dominios en forma de dedo de zinc consecutivos. - De activacin de la transcripcin: Dominio rico en aminocidos glutaminas que permite la interaccin del factor de transcripcin con coactivadores o con factores basales de la transcripcin. Su estructura, puede contener mltiples sitios de fosforilacin. Esta regin es indispensable para que el factor de transcripcin contribuya a la activacin de los genes bajo su regulacin. -De inhibicin de la transcripcin: Ej. Rb, Histonas deacetilasas. -De interaccin con otros factores: Dominios con diferentes estructuras. Ej Caja MADS. Secuencias reguladoras en los genes eucariontes codificadores de protenas. La expresin de los genes eucariontes codificadores de protenas suele estar regulada por medio de mltiples regiones de control de la transcripcin de accin cis. Algunos elementos de control estn ubicados cerca del inicio (elementos proximales del promotor) mientras que otros se encuentran ms distantes (amplificadores). Los elementos proximales del promotor aparecen a no ms de 200 bp del sitio de inicio. Varios de estos elementos, con hasta 20 bp, contribuiran a regular un gen en particular. Los amplificadores que suelen tener una longitud de 100 200 bp, contienen mltiples elementos de control de 8 a 20 bp. Pueden estar ubicados desde 200 bp hasta decenas de kilobases hacia 5 o hacia 3 de un promotor, en un intrn o hacia 3 del exn final de un gen.

FOSFORILACION DEL DOMINIO DE LA ARN POLIMERASA (MOMENTO, PROCESO Y RESIDUOS):

Durante la fase de iniciacin de la transcripcin, es necesario que el gen est accesible para lo que la cromatina debe disminuir su grado de empaquetamiento. La acetilacin de determinadas lisinas de las histonas favorece la descondensacin de la cromatina. El complejo remodelador de la cromatina o CRM (Chromatin-RemodelingMachine) tiene afinidad por las lisinas acetiladas de las histonas y se une a ellas a travs del dominio llamado "Bromodominio". El CRM desorganiza los nucleosomas aumentando el grado de exposicin y de accesibilidad de los promotores. Finalmente el mediador, la ARN polimerasa II y los factores de transcripcin hacen que se inicie la transcripcin. Una vez que la ARN polimerasa ha reconocido el promotor y se ha unido a l en primer lugar se forma el complejo de preiniciacin. Este complejo est formado por algunos factores de transcripcin y la ARN polimerasa II. Despus se forma el complejo de iniciacin cerrado al unirse otros factores de transcripcin y el mediador. Posteriormente se forma el complejo de iniciacin abierto gracias a la actividad helicasa de uno de los factores. En este instante comienza la sntesis de ARNm por la ARN polimerasa II a partir del sitio llamado +1 que marca el punto de inicio de la transcripcin de un gen. Hasta que el fragmento de ARNm sintetizado no tiene 8-10 nucletidos el proceso es reversible siendo posible que el complejo se desorganice y la transcripcin del gen no se lleve a cabo. A este fenmeno se le conoce como iniciacin abortiva. Cuando ya hay un fragmento de ARN de tamao adecuado, se fosforila el dominio CTD (Carboxi-Terminal Domain) de la ARN polimerasa II. Esta fosforilacin, llevada a cabo por el mismo factor que tiene actividad helicasa o por el mediador, es muy importante, ya que desestabiliza las interacciones que tiene la ARN polimerasa II con algunos factores de transcripcin favoreciendo su avance rpido transcribiendo el gen. Fase de elongacin. Durante la fase de elongacin el CTD debe seguir fosforilado. En esta etapa, la ARN polimerasa II cataliza la formacin de los enlaces fosfodister entre nuclotidos. Intervienen otros factores, conocidos como factores de elongacin. Sus funciones son disminuir las pausas de la ARN polimerasa II, desorganizar los nucleosomas y favorecer los procesos de correccin de errores. Tambin intervienen factores de transcripcin involucrados en la iniciacin. En la elongacin se fosforila otra posicin del CTD. El CTD fosforilado es reconocido tambin por protenas encargadas del procesamiento y maduracin del pre-ARNm, de modo que la maduracin del pre-ARNm se produce de forma simultnea a la transcripcin. La poliadenilacin comienza en la fase de terminacin de la transcripcin y acaba una vez finalizada sta. Fase de terminacin. El CTD es defosforilado por una fosfatasa. La ARN polimerasa II contina transcribiendo hasta llegar a una secuencia especfica que determina el sitio de poliadenilacin. Esta secuencia es reconocida por una endonucleasa. Esta enzima corta el ARNm unos nucletidos ms all de la secuencia que reconoce, liberndolo. Posteriormente esta secuencia especfica es reconocida por una enzima encargada de aadir la cola de poli-A al transcrito TEMA: REGULACIN DE LA EXPRESIN GENETICA

La REGULACIN de la accesibilidad de los genes depende de las regiones controladoras de locus o LCRs (Locus Control Region), de los insulators (aisladores), de los procesos de modificacin de histonas, de los procesos de desempaquetamiento y desorganizacin de nucleosomas y de la metilacin del ADN: Las LCRs son regiones del ADN donde la expresin gnica est favorecida. Los insulators son regiones del ADN que delimitan a modo de barrera las zonas transcripcionalmente activas de las que estn inactivas participando en la correcta organizacin de la cromatina. Las modificaciones en las histonas son muy importantes en el control de la transcripcin. La metilacin de lisinas impide la transcripcin gnica ya que las histonas con este tipo de modificacin reclutan protenas silenciadoras de genes que suelen poseer un cromodominio que intervienen en la interaccin con las histonas metiladas. En cambio, la acetilacin de determinadas lisinas favorece la interaccin con el CRM que lleva a cabo la desorganizacin de los nucleosomas y por tanto hace los genes accesibles para ser transcritos. La metilacin del ADN es otra modificacin que produce silenciamiento de genes. La metilacin de genes es muy importante en procesos del desarrollo, en la impronta gantica y en el silenciamiento de genes repetidos. Otro nivel de regulacin de la transcripcin es el que se lleva a cabo actuando sobre el proceso de iniciacin. Existen protenas activadoras que se unen a elementos prximos al promotor y otras que se unen a los llamados potenciadores que pueden localizarse en posiciones ms alejadas del promotor. Las protenas activadoras se unen a sus sitios de unin en el ADN y favorecen el reclutamiento de la ARN polimerasa II y de los factores de transcripcin necesarios para que se forme el complejo de iniciacin y comience la transcripcin. Las protenas represoras actan de forma directa unindose al operador y evitando que se una la ARN polimerasa, o de forma indirecta bloqueando la accin de las protenas activadoras. Otros reguladores de la transcripcin actan sobre las protenas involucradas en el proceso de elongacin bloqueando la transcripcin a este nivel. Tambin existen reguladores de la transcripcin que actan sobre el proceso de poliadenilacin, evitando la liberacin de la ARN polimerasa y la finalizacin de la transcripcin. El control gentico se puede realizar a diferentes niveles durante la transmisin de la informacin a partir de ADN, ARN y protena: - Previamente a la transcripcin - Durante la transcripcin - Posterior a la transcripcin en el procesamiento y maduracin del ARN - Transporte de los ARN funcionales - Degradacin de los ARN - Durante la traduccin - Maduracin y distribucin de las protenas - Funcionalidad y estabilidad de las protenas El control se hace necesario para evitar que la clula produzca continuamente molculas de ARN o de protenas innecesarias. CONTROL PRETRANSCRIPCIONAL

La transcripcin no puede tener lugar DNA en estados de condensacin superiores a la fibra de 10nm (rosario de nucleosomas). En ocasiones el DNA se puede transcribir cuando se encuentra bajo la forma de complejos de histonas (nucleosomas), pero tambin puede ser necesario que estos se desensamblen para permitir el acceso al DNA. En general, la accesibilidad del DNA a la transcripcin o actividad transcripcional de la cromatina, est relacionada estrechamente con el grado de condensacin y puede valorarse experimentalmente por la sensibilidad a la accin de ADNasas. CONTROLES TRANSCRIPCIONALES: DNA= RNA transcrito primario Frecuencia/velocidad de inicio de la transcripcin: Puntos de inicio accesibles Factores de transcripcin Eficacia de los promotores Velocidad de elongacin del RNA (poco regulada) Eficacia de terminacin de la transcripcin Por medio de la regulacin del inicio de la transcripcin se puede elegir qu genes encender (activar) o apagar (inhibir) en un momento determinado, as como tambin regular la cantidad de ARNm producido. Esto se logra a travs de mecanismos muy diferentes, pero aqu solo discutiremos dos de ellos. El primero implica mantener apagados ciertos genes: en determinados tipos celulares, hay regiones de ADN que estn siempre apagadas y cuyos genes no se transcriben nunca. El segundo involucra el uso de regiones regulatorias, ubicadas en la secuencia anterior al inicio de la transcripcin. Estas secuencias permiten la unin de factores de transcripcin que pueden facilitar o impedir la unin de la ARN polimerasa al promotor, regulando de esta manera la cantidad de mensajeros producidos. Como ya vimos, para que la transcripcin ocurra es necesario que la ARN polimerasa se una al promotor del gen. Esta unin puede regularse utilizando ciertas protenas, denominadas factores de transcripcin, que se unen a secuencias especficas cercanas al promotor y pueden facilitar o impedir la transcripcin. Esta es una manera de regular la cantidad de molculas de ARN que se transcriben. CONTROLES POSTRANSCRIPCIONALES: RNA transcrito primario = RNA maduro NCLEO Velocidad de procesamiento: Corte y empalme. Modificaciones. PAS DE NCLEO A CITOPLASMA Seleccin de que RNAs son transportados Transporte activo a travs de los poros CITOPLASMA: RNA maduro= m RNA Estabilidad del m RNA maduro

 Mecanismos de corte y empalme (Splicing): Elinicacion de intrones en preARNm. En ciertos casos, pueden quedar entre las secuencias de exones algunos intrones que son utilizados como molde en la traduccin. Esto se denomina splicing alternativo y en teora puede generar protenas diferentes, de manera proporcional al nmero de intrones que contenga el gen. Por medio de este mecanismo de regulacin se elige qu intrones sacar de la secuencia que va a ser traducida. Si una protena contiene tres intrones, se puede crear un ARNm con uno, dos o tres intrones entre la secuencia codificante. Como resultado obtenemos protenas similares, ya que los exones son iguales, pero su diferencia est dada por la secuencia de los intrones. Edicin del ARN. En algunos casos, la secuencia del ARNm es modificada luego de ser transcripta. Los cambios incluyen la insercin de nucletidos en regiones especficas, lo que motiva un corrimiento en el marco de lectura y genera la expresin de protenas muy diferentes. Transporte del ARNm al citoplasma. Para poder ser transportado, el ARNm debe haber sido procesado correctamente; de lo contrario es degradado en el ncleo Iniciacin de la sntesis proteica. El ARNm contiene en sus extremos secuencias que no son traducidas y que sirven para regular la traduccin (5 UTR y 3 UTR, del ingls untraslated regions). Si esas secuencias son bloqueadas, el ARN no es reconocido por el ribosoma y no se puede traducir el mensajero. Por otro lado, las secuencias que flanquean el codn inicial (AUG) son determinantes. Si el ribosoma se saltea el primer AUG, comenzar la traduccin en el segundo codn produciendo una protena con menos aminocidos y/o secuencia diferente. Estabilidad del ARNm. La vida media de un ARNm est determinada principalmente por la longitud de la cola poliA. Una vez en el citoplasma, la secuencia comienza a acortarse; cuando se hace demasiado corta el mensajero es degradado. Eliminacin de ARNm con errores. Los ribosomas junto con otras protenas- son capaces de detectar codones de terminacin en lugares errneos de la secuencia del mensajero (generados por algn error previo en el splicing o por mutaciones). Cmo lo hacen? Reconociendo las secuencias de unin entre los exones. Si el mensajero es adecuado, todos los lugares de unin entre los exones deberan encontrarse antes del codn de terminacin. Si esto no ocurre, el ARNm fallado es degradado. ARN de interferencia. Cuando una clula humana es infectada por un virus que fabrica una doble cadena de ARN, ciertas enzimas lo reconocen y lo degradan. Esto mecanismo permite la eliminacin de ciertos virus y puede ser utilizado tambin para regular la traduccin de un mensajero: si se introduce (o se transcribe en la misma clula) una cadena de ARN complementaria

a un mensajero, este no podr ser traducido y adems ser detectado como forneo y degradado. Esquema mostrando los diferentes puntos de control de la expresin gnica en una clula eucariota VIA DE SEALIZACIN: Describe un grupo de molculas de una clula que trabajan juntas para controlar una o ms funciones de las clulas, como la multiplicacin celular o la muerte celular. Despus de que la primera molcula recibe una seal, esta activa a las otras molculas. Este proceso se repite hasta que la ltima molcula se activa y la clula realiza la funcin. La activacin anormal de las vas de sealizacin puede conducir a un cncer. Principio de la transduccin de seales. Inicialmente se recibe una seal del entorno que interacciona con un componente celular, normalmente un receptor de la superficie celular. La informacin que porta la seal recibida se transforma en otros compuestos qumicos, es decir se transduce. El proceso de transduccin consta, habitualmente de varias etapas. Con frecuencia la seal se amplifica antes de provocar una respuesta. La retroalimentacin de las vas regula por completo el proceso de sealizacin. LIBERACIN DE UN PRIMER MENSAJERO RECEPCIN DEL PRIMER MENSAJE: Las protenas de membrana actan como receptores que unen las molculas sealizadoras y transfieren al interior de la clula la informacin que estas han recogido del medio. DIFUSIN DEL MENSAJE DENTRO DE LA CELULA POR EL SEGUNDO MENSAJERO: Molculas intracelulares cuya concentracin se modifica en respuesta a seales ambientales ACTIVACIN DE EFECTORES QUE ALTERAN DIRECTAMENTE LA RESPUESTA FISIOLGICA: El efecto ultimo de la va de sealizacin es activar o inhibir las bombas, enzimas y factores de transcripcin de genes que controlan directamente las vas metablicas, la activacin de genes y procesos tales como la transmisin nerviosa FINALIACION DE LA SEAL: El proceso de sealizacin debe terminar despus de q la clula ha completado su respuesta a la seal por que perderan su capacidad para responder a nuevas seales Los estudios del Proyecto del Genoma Humano han revelado que, de los aproximadamente 32.000 genes identificados, un 20% codifican protenas involucradas en los procesos de transduccin de seales, incluyendo receptores tirosina quinasa, subunidades de protenas G y enzimas generadores de seales. Tal magnitud nos indica que las clulas han diseado un complejo entramado de vas de sealizacin, en el que diversas rutas pueden ser activadas por distintas hormonas en un mismo contexto celular. Por tanto, las distintas respuestas celulares dependern en gran medida del conjunto de rutas, iguales o distintas, presentes en las clulas diana, que cada seal extracelular sea capaz de estimular.

Va Notch La va de sealizacin Notch se ha asociado con los procesos de proliferacin, diferenciacin y muerte celular en casi todos los estadios del desarrollo (54). En general, la activacin de Notch conduce a la supresin transcripcional de los genes especficos de linaje, inhibiendo la diferenciacin en respuesta a seales inductivas de la misma (55). Esta va est constituida principalmente por cuatro genes Notch (Notch1, Notch2, Notch3 y Notch4), que se expresan ampliamente durante la embriognesis. Las protenas NOTCH son grandes polipptidos transmembranales con diferentes regiones o dominios estructurales. El dominio extracelular de Notch contiene un nmero variable de repeticiones que adems de atravesar la membrana celular son importantes para que el ligando se una al receptor y active la va. Una vez formado el complejo ligando-receptor, se produce un cambio estructural que favorece la activacin y liberacin del dominio intracelular del receptor (Notch-IC) al interior de la clula. El dominio intracelular de Notch contiene una regin que favorece las interacciones protena-protena, necesarias para continuar con la transmisin del mensaje. A pesar de no tener una actividad enzimtica conocida, la protena Notch, transmite las seales a travs de interacciones moleculares directas. Las protenas Notch-IC de Drosophila y Notch 1, 2, y 3 en mamferos, contienen seales de localizacin nuclear (nls) y secuencias OPA que constituyen un dominio rico en glutamina, con funcin de transactivador de la transcripcin. Otras regiones descritas incluyen el dominio RAM, el cual se une a los efectores o potencializadores de la actividad de la va, CSL (CBF1/Supressor de Hairless/Lag-1) asociados con diversos efectos de Notch 1,2 y 3 sobre la diferenciacin mieloide. La familia de protenas Notch, est integrada por receptores transmembranales con mltiples ligandos identificados en mamferos como Delta o Delta-like (Dll), y Serrate o Jagged (55, 54). Una vez se forma el complejo receptor-ligando, el receptor pierde un fragmento del dominio intracelular denominado Notch-IC se libera en el citoplasma y activa la molcula efectora CSL (CBF1/RBP-Jk en mamferos). Esta protena interacta fsicamente con Notch-IC y media la transduccin de seal del citoplasma hacia el ncleo, donde el complejo se une de manera especfica a secuencias del ADN especficas llamadas promotoras cuya funcin es la de regular la expresin de genes blanco como por ejemplo Hairy/Enhancer of split (HES). El efecto final es la represin de la transcripcin de los genes HES, los cuales funcionan como reguladores negativos de la expresin gnica especfica de linaje (55, 56). La va de sealizacin Notch es un importante regulador de la

auto-renovacin de las CMHs por inhibicin de la diferenciacin. A lo largo de la maduracin hematopoytica los receptores Notch-1 y Notch-2 se expresan y cualquiera de los dos es capaz de inhibir la diferenciacin mieloide en clulas 32D, Notch-1 en respuesta a G-CSF y Notch-2 en respuesta a GM-CSF (57,58). En conclusin, la va Notch puede jugar un papel de gran importancia como regulador de la proliferacin y de la capacidad de auto-renovacin de las CMHs, y es capaz de influir directamente en la determinacin celular de las mismas. Via Notch: su activacin esta implicada en la supresin transcripcional de los genes especficos de linaje, Inhibiendo la diferenciacin en respuesta a seales inductivas (55). El grupo de protenas Notch son receptores transmembranales, cuyos ligandos en mamferos son denominados Delta o Delta-like (Dll), y Serrate o Jagged (55, 54). El dominio extracelular de Notch se activa cuando los ligandos DSL ubicados sobre clulas adyacentes se unen a Notch.Esta activacin da como resultado el rompimiento proteoltico de Notch, mediado por una metaloproteasa y por protenas de membrana como Presenilina y Nicastrina, con la posterior liberacin y translocacin al ncleo del dominio intracelular de Notch (Notch-IC). Notch-IC acta con diferentes protenas citoplsmicas y nucleares y la el mensaje puede seguir dos va diferentes, una dependiente de protenas CSL (Su[H], CBF1) y otra independiente de stas. Al interactuar Notch-IC con las protenas CSL se produce la activacin transcripcional dependiente de CSL por el desplazamiento de co-represores (NCoR/SMRT y CIR) y su reemplazo co-activadores (PCAF y GCN5) moduladores de la estructura del ADN que facilitan la activacin de los genes blanco E(spl)/HES, los cuales son reguladores negativos de la expresin gnica especfica de linaje (55, 56).Por otro lado, en la va independiente de CSL el resultado tambin es la regulacin transcripcional, mediada por la interaccin de Notch-IC con otras protenas tambin moduladoras de la estructura de los genes, EMB5, SKIP y Deltex (55,56). ACTIVACION Notch es un receptor de superficie celular que se activa por el contacto con ligandos de membrana en las clulas vecinas. Los ligandos que activan primero incluyen Delta y Serrate, y Lag-2 es un ligando de Notch en C. elegans. Activacin de Notch al unirse a su ligando en la superficie de las clulas vecinas participa en varios caminos de desarrollo, ayudando a determinar el destino celular. La unin con la protena causa una rotura proteoltica de Notch liberndose el dominio intercelular que se transloca al ncleo. REGULACION Al interactuar Notch-IC con las protenas CSL se produce la activacin transcripcional dependiente de CSL por el desplazamiento de co-represores (N-CoR/SMRT y CIR) y su reemplazo co-activadores (PCAF y GCN5) moduladores de la estructura del ADN que facilitan la activacin de los genes blanco E(spl)/HES, los cuales son reguladores negativos de la expresin gnica especfica de linaje .Por otro lado, en la va independiente de CSL el resultado tambin es la regulacin transcripcional, mediada por la interaccin de Notch-IC con otras protenas tambin moduladoras de la estructura de los genes, EMB5, SKIP y Deltex (55,56). PAPEL DESEMPEAN LA VAS DE SEALIZACIN EN LA EXPRESIN GENTICA:

Las vas de sealizacin conducen a la fosforilacin de factores de transcripcin y estos a la activacin de promotores para la expresin de genes, pueden generar cambios concominantes en la expresin de los genes, la alteracin de las vas de sealizacin estas implicadas en la formacin de tumores, de cncer entre otros EPIGENETICA: La epigentica es el interlocutor del ambiente con la gentica. Cualquier proceso que altere la actividad del gen sin cambiar la secuencia del ADN, y conduce a modificaciones que pueden transmitirse a clulas hijas (aunque los experimentos muestran que algunos cambios epigenticos pueden ser revertidos). 1. Los patrones de metilacin de ADN son los mejores estudiados y entendidos como marcadores de fenmenos epigenticos. s la adicin o remocin de un grupo metilo (CH3) que ocurre predominantemente donde las bases de citosina se disponen consecutivamente. La metilacin de la citosina del ADN: Es una modificacin del ADN, en la que un grupo metilo es trasferido desde S-adenosilmetionina a una posicin C-5 de citosina por una ADN-5 metiltrasferasa. La metilacin del ADN ocurre, casi exclusivamente, en dinucletidos CpG, teniendo un importante papel en la regulacin de la expresin del gen. 2-La Impronta Genmica. 3-Modificacin de histonas: incluyendo acetilacin, metilacin y fosforilacin. La epigentica hace referencia, entonces, a cualquier mecanismo que utilice un organismo para traspasar informacin hereditaria de una generacin a otra. Los cuatro bases de nucletidos de ADN -citosina (C), adenina (A), guanina (G) y timina (T)- forman un total de 16 posibles pares de dinucletidos. En uno de estos casos, una citosina est junto a una guanosina en direccin 5, el dinucletido CpG. ste dinucletido se encuentra a una frecuencia menor de lo esperado a lo largo de la mayor parte del genoma, pero se encuentra en una frecuencia ms alta de lo normal en unas porciones del ADN que se conocen como islotes CpG.(7) Es curioso destacar que estos islotes CpG se encuentran usualmente concentrados cerca de los sitios de inicio de la transcripcin gnica, las regiones promotoras, donde la transcripcin de ADN a ARN comienza. La metilacin del ADN ocurre en sitios especficos. La ausencia de metilacin en un islote CpG es un indicador de que el sitio de transcripcin est activado y que es capaz de ser transcrito de ADN a ARN. En las clulas cancerosas se pierde el patrn de metilacin normal: los islotes CpG de algunos genes muestran un patrn de metilacin inusualmente elevado en las regiones promotoras, pero no en las regiones fuera de estas. Estas modificaciones interactan con factores que modifican la estructura de la cromatina, dando como resultado el silenciamiento del gen. El silenciamiento transcripcional de genes que tienen actividad antitumoral puede resultar en eventos celulares anormales, que contribuyen a la progresin del fenotipo celular tumoral.Por ende, el silenciamiento epigentico de los genes es otro

mecanismo mediante el cual se altera la produccin efectiva de genes supresores de tumores. En las clulas eucariotas existe una marca gentica conocida como impronta genmica, que acta como la modificacin epigentica diferencial de las secuencias encargadas de regular la expresin de genes especficos en el oocito y en el espermatozoide, dando origen a una sola copia del gen de acuerdo a su origen parental, el cual despus de la fecundacin, se expresar en el embrin. Es importante resaltar que no todo el genoma funciona bajo la influencia de la impronta, debido a que luego de la fecundacin, el nuevo genoma sufre una reprogramacin post-cigtica que ocurre antes de la expresin de genes especficos durante el desarrollo embrionario, permitiendo que la regulacin propia de la impronta ocurra desde la etapa de clula germinal hasta la embriognesis de la descendencia. La metilacin del ADN en los mamferos, ocurre sobre los residuos de citosina que estn presentes en los motivos de dinucletidos formados por la 5 citosina y la guanosina, conocidos como islas CpG, donde el grupo metilo (CH3) se une al carbono 5 de la citosina formando la metilcitosina-5 en las Regiones Diferencialmente Metiladas (DMR) y en las Regiones de Control de la Impronta (ICR). Las DMR pueden tener diversas propiedades, algunas son metiladas en el alelo silenciado mientras otras son metiladas en la copia activa11. Una de las DMR mejor caracterizada en el modelo murino, est localizada en el segmento 15 del brazo corto del cromosoma 11 (11p15) e incluye genes de expresin monoallica que se encuentran muy cerca en el cromosoma como Igf2 y H19, los cuales se transcriben exclusivamente del alelo no metilado de origen paterno y materno, respectivamente. La expresin recproca de estos dos genes, identificados en murinos pero tambin observados en humanos, refleja una interaccin que involucra secuencias reguladoras compartidas, localizadas corriente arriba del gen H19 Otro proceso epigentico significativo es la modificacin de la cromatina. La cromatina es un complejo de protenas (histonas) y ADN que estn apretadamente empaquetadas para que quepan en el ncleo. El complejo puede ser modificado por substancias tales como grupos acetilo (el proceso llamado acetilacin), enzimas, y algunas formas de ARN tales como los microARN y pequeos ARN de interferencia. Esta modificacin altera la estructura de la cromatina para influenciar la expresin del gen. En general, la cromatina fuertemente doblada tiende a ser desactivada, o no expresada, mientras que la cromatina ms laxa es funcional, o expresada. TEMA: TECNICAS MOLECULARES PARA EL ESTUDIO DE LA REGULACIN DE LA EXPRESION GENICA. GEN REPORTERO. DEFINICION: Tcnica de biologa molecular usada para encontrar protenas que interactan mutuamente. La tcnica consiste en la activacin de un gen reportero por la accin de un factor de transcripcin que se enlaza a la secuencia regulatoria "UAS" localizada en el promotor ms arriba del sitio de inicio de la transcripcin.

PRINCIPIO: El factor de transcripcin es separado en dos fragmentos, uno que reconoce UAS y el otro que promueve la activacin de la maquinaria de transcripcin. Cada fragmento es introducido a las protenas cuya interaccin se desea analizar (ingeniera gentica). Si las protenas forman un complejo entre s, los dos fragmentos del factor de transcripcin se encontrarn y el gen reportero ser transcrito. PROCEDIMIENTO:

 EMSA: Definicin: Los anlisis de la rotacin de la movilidad tambin se conocen como anlisis de la rotacin del gel, anlisis de la rotacin de la venda o anlisis del retraso del gel. EMSA es una tcnica comn usada a la DNAprotena del estudio o a las interacciones de la ARN-protena. PROCEDIMIENTO: Funcin de EMSA para analizar el conjunto de las protenas de transaccin (o de protena) que obran recprocamente con secuencias de una DNA de cis-actuacin especfica o del ARN. Hay de hecho dos tipos de EMSAs, incluyendo la desnaturalizacin de EMSA y la nodesnaturalizacin de EMSA. Desnaturalizacin de EMSA: Se conduce bajo desnaturalizacin de condiciones y de funciones para determinar el nmero y la talla de las protenas a las cuales estn atando directamente y estn obrando recprocamente con fragmento de la secuencia de un cido nuclico de la DNA o del ARN. Desnaturalizando EMSAs son hechos Ultravioleta-reticulando cualquier protena directamente que obra recprocamente al fragmento de la DNA o del ARN (haciendo enlaces covalentes), y despus ejecutando el complejo bajo desnaturalizacin de condiciones que quite cualesquiera interacciones no-covalentes (tales como interacciones de la protena-protena). As, usted debe dar lugar tericamente a los fragmentos del cido nuclico que estn limitados solamente a los factores de la protena directamente que obran recprocamente. Nodesnaturalizacin de EMSA la No-desnaturalizacin de EMSA funciona para determinar los diversos tipos de complejos que aten fragmento de la secuencia de un cido nuclico de la DNA o del ARN. No-desnaturalizando EMSAs: Puede indicar a veces si ms de una molcula de protena est implicada en el complejo del atascamiento. Los anlisis de la rotacin del gel se realizan a menudo in vitro simultneamente con el huella de la ADNasa, extensin de la cartilla, y promotor-sondan experimentos al estudiar el lanzamiento de la transcripcin. PRINCIPIO del anlisis de la rotacin de la movilidad Un anlisis de la rotacin de la movilidad implica generalmente la separacin electrofortica de una mezcla protena-DNA en una poliacrilamida o un gel de la agarosa por un perodo corto. La velocidad a la cual diversas molculas (y las combinaciones de eso) se mueven a travs del gel es determinada por su talla y carga, y en un grado inferior, su dimensin de una variable (vase la electroforesis del gel). El carril del control sin presente de la protena contendr una sola venda que corresponde al fragmento desatado de la DNA. Sin embargo, si se asume que la protena es capaz de atar al fragmento de la DNA, el carril con el presente de la protena contendr otra venda que represente el complejo ms grande del lmite de la DNA a la protena.

De la relacin de transformacin del lmite desat la DNA, la afinidad de la protena a la secuencia de la DNA puede ser resuelto. A menudo, un carril adicional se ejecuta con un oligonucletido del competidor para determinar la secuencia obligatoria ms favorable para la protena obligatoria. El uso de diversos oligonucletidos de la secuencia definida permite la identificacin del punto de enlace exacto por la competicin. (No mostrado en diagrama). Las variantes del anlisis de la competicin son tiles para medir la especificidad de atar y para la medida de la cintica de la asociacin y de la disociacin. Para los propsitos de la visualizacin, el fragmento de la DNA se etiqueta generalmente con una escritura de la etiqueta radiactiva o fluorescente, pues la coloracin estndar del bromuro de etidio falta la sensibilidad para detectar relativamente las pequeas cantidades de DNA usadas en estos experimentos. PROTOCOLO DE EMSA: El anlisis de la DNA EMSA permite el anlisis del atascamiento de protenas a los fragmentos de la DNA. La premisa del anlisis es que el lmite de la DNA a la protena emigrar ms lento (ser retardado en la migracin) en una matriz del gel que la DNA desatada durante electroforesis. La mayora del etiquetado del utilizador 32P de los procedimientos de EMSA del fragmento de la DNA. Sin embargo, es tambin posible detectar la DNA va mtodos de deteccin no radiactivos (vase EMSA no radiactivo) (los mtodos de deteccin incluyendo del enyzme de fluorescencia y de la biotina-streptavidin). La coloracin del bromuro de etidio no es generalmente bastante sensible puesto que las pequeas cantidades de DNA se utilizan generalmente en este anlisis. VISUALIZACION DE RESULTADOS: Principio de electroforesis.

 Mtodo de ensayo Gel Shift. Tres Pasos fundamentales: (1) Las Reacciones de unin, (2) electroforesis, (3) la Deteccin de la Sonda. En este Ejemplo se Muestra idealizada la eliminacin COMPLETA de la Protena: Complejo de la Sonda Con la adicin de competidor o Determinado Protena Especfica de anticuerpos.
El carril 1 es un control negativo, y contiene solamente la DNA. El carril 2 contiene la protena as como un fragmento de la DNA que, basado en su secuencia, no obre recprocamente. El carril 3 contiene la protena y un fragmento de la DNA que reaccione; el complejo resultante es ms grande, ms pesado, y lento-mudanza. Se idea esta situacin, y en realidad habra probablemente una segunda venda en el carril 3 debido a la disociacin del complejo de la DNA-protena.

PRIMER EXTENSIN: PRINCIPIO: Primer extensin Es una tcnica mediante la cual el 5 'terminal de ARN o ADN se pueden asignar. El primer extensin se puede utilizar para determinar el sitio de inicio de la transcripcin del ARN de un gen conocido. Esta tcnica requiere un cebador marcado radiactivamente (generalmente 20 a 50 nucletidos de longitud), que es complementaria a una regin cerca del extremo 5'del gen. Permite recocer el RNA y la transcriptasa inversa, se utiliza para sintetizar complementarias cDNA al ARN hasta que llega al extremo 5 'del ARN. Al ejecutar el producto en una electroforesis en gel de poliacrilamida, es posible determinar el lugar de inicio de la transcripcin, como la longitud de la secuencia en el gel representa la distancia desde el punto de inicio de la cartilla a marcar. DEFINICION: Se utiliza para asignar los extremos 5' del ADN o fragmentos de ARN. Se realiza mediante una cartilla de recocido de oligonucletidos especficos a una posicin ro abajo de dicho extremo 5. La cartilla se etiqueta, generalmente en su extremo 5 ', con 32P. Esto se ampla con la transcriptasa inversa, que puede copiar un ARN o ADN de una plantilla, hacer un fragmento que termina en el extremo 5 'de la plantilla molcula. La polimerasa de ADN tambin se puede utilizar con el ADN plantillas.

1. Cosechar ARN celular que contiene la transcripcin del extremo 5 que queremos. 2. Luego hibridar un oligonucletido marcado (la cartilla) de al menos 12 nucletidos a los ARN celular. Por lo general, cartillas de al menos 18 nucletidos de largo se utilizan. Para el diseo de una cartilla necesitamos saber la secuencia de al menos

una parte del ARN. La especificidad de este mtodo se deriva de la complementariedad entre la cartilla y la transcripcin, as como la especificidad de la cartografa S1 viene de la complementariedad entre la sonda y la transcripcin. 3. Luego se utiliza la transcriptasa inversa para ampliar la cartilla del oligonucletido al extremo 5' de la transcripcin. La transcriptasa reversa hace una copia de ADN de una plantilla de ARN. Una vez que esta reaccin extensin de la cartilla se ha completado, se puede desnaturalizar el hbrido RNA-DNA y la electroforesis de ADN marcado en gel de poliacrilamida, junto con los marcadores en un gel de alta resolucin, como las utilizadas en la secuenciacin del ADN. Es conveniente utilizar el mismo cebador utilizado durante imprimacin de extensin para hacer una serie de reacciones de secuenciacin con deoxinucletidos. A continuacin, podemos utilizar los productos de estas reacciones de secuenciacin como marcadores. Usos: 1. Cartografa del extremo 5 'de las transcripciones. Esto permite determinar el punto inicial de la transcripcin (suponiendo que el ARNm no es procesada), que ayuda a localizar los promotores o cajas TATA. 2. La cuantificacin de la cantidad de transcripcin en un in vitro la transcripcin del sistema. Un ejemplo es el Yudkovsky et al. papel. 3. Determine las ubicaciones de las interrupciones o modificado sus bases en una poblacin mixta de ARN o muestras de ADN. Esto es til en aplicaciones como footprinting. Dos mtodos se utilizan diferentes. En uno, el de nucletidos modificados no pueden ser reconocidos por la polimerasa transcriptasa inversa o, en cuyo caso, la cadena termina en el sitio de la modificacin (como con KMnO 4 - Por ejemplo en el Kainz y Roberts papel). En el otro, la modificacin se convierte en un paso posterior del anlisis a una ruptura hebra por tratamiento qumico. Por ejemplo, los sitios de las modificaciones con sulfato de dimetilo (DMS) se pueden identificar mediante el tratamiento de ADN con DMS, exponiendo la muestra a las condiciones que se rompen la columna vertebral en el sitio de la modificacin, seguido por extensin de la cartilla. PROTOCOLO: Extensin de la cartilla es el mtodo utilizado para medir la cantidad de un determinado transcripcin del ARN o para asignar el inicio de la transcripcin (5 'final) de una transcripcin. Un experimento de extensin de la cartilla incluye los siguientes pasos: 1) Total de ARN o RNA poli-A es aislado y se utiliza como la plantilla, 2) un oligonucletido sinttico, 20-40 nt de longitud y complementaria al extremo 5 'final de la mayora de los conocimientos transcripcin , es el final marcado por lo general con un istopo, 3) la cartilla etiquetados se hbrida al ARN y luego extendida a travs de la transcriptasa inversa para producir la DNA de cadena sencilla usando el ARN como plantilla, y 4) El ADNc resultante es analizada en una desnaturalizacin gel de poliacrilamida (PAGE). Una reaccin de secuenciacin manual tambin se ejecuta junto con la extensin de la cartilla de productos para ayudar a determinar el tamao de los productos ampliados. La longitud del ADNc refleja el nmero de bases de nucletidos entre el etiquetado de la cartilla y el extremo 5 'del ARN, y la cantidad de producto cDNA es proporcional a la cantidad de ARN de entrada de destino.

 RT-PCR DEFINICION: Reaccin de la Cadena de Polimerasa en Transcripcin Reversa. Es una variante de PCR, donde una hebra de ARN es retrotranscrita en ADN complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa reversa, y el resultado, se amplifica en un PCR tradicional. T Tcnica molecular utilizada para poder amplificar secuencias desconocidas del extremo 3-5del mRNA, obteniendo un DNAc. Principio: Se basa en la obtencin de DNA complementario, seguido de una PCR convencional, se utiliza en la mayora de los casos para ver la expresin de un gen. Para qu se usa?: Amplificar y clonar cDNA de un gen o para el estudio cualitativo de la expresin de genes. APLICACIONES: Esta tcnica ofrece una gran cantidad de aplicaciones al ser capaz de cuantificar de manera absoluta o relativa molculas molde de DNA o RNA. De este modo, la RT-PCR cuantitativa se usa para determinar la carga vrica, el ttulo de grmenes y contaminantes en la comida, sangre u otro tipo de muestras, la expresin gnica en distintos tejidos, tratamientos o estadios del desarrollo, la discriminacin allica, y la delecin o el grado de amplificacin de los genes. RT-PCR tiene aplicaciones clnicas muy importantes, como el diagnstico de tumores, la respuesta a medicamentos en cnceres humanos y el perfil de citocinas en la respuesta inmune. Tambin el genotipado de muestras se puede realizar a travs de la cuantificacin y diferenciacin de alelos y la deteccin de polimorfismos, llegando incluso a detectar los SNP (polimorfismos mononucleotdicos, del ingls single nucleotide polymorphism). Por ltimo, la validacin de los resultados de experimentos con microordenamientos (microarray) de DNA se suele realizar mediante RT-PCR. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS: Para llevar a cabo estas aplicaciones se necesita un termociclador con capacidad para detectar y medir la fluorescencia. La exactitud y la precisin de los aparatos de RT-PCR se ven afectadas, en gran medida, por la razn seal:ruido, la cual depende del formato de deteccin (fluorforos) y de la calidad del sistema ptico. Otro parmetro a tener en cuenta es la homogeneidad de la temperatura dentro del instrumento, ya que la menor desviacin de la temperatura llevara a una cuantificacin errnea. Existen adems gran variedad de formatos de deteccin (figura 1). La seal fluorescente es proporcional a la cantidad de producto de la PCR y la generan los fluorforos especficos de DNA bicatenario o las sondas fluorescente especficas de la secuencia. El SYBR-Green I (figura 1a) es el fluorforo especfico de DNA bicatenario ms usado en la RT-PCR. Este fluorforo se une con gran afinidad al surco menor del DNA bicatenario, aumentando su fluorescencia unas 1000 veces. La deteccin con SYBRGreen I es tan sensible que llega a identificar la produccin de una nica molcula. Este formato de deteccin necesita una puesta a punto previa para que la PCR no amplifique productos inespecficos que luego el fluorforo detectara, introduciendo errores en el posterior anlisis de los resultados.

Para detectar especficamente una secuencia se utilizan sondas de oligonucleotidos etiquetadas con fluorforos. La intensidad de la seal se relaciona con la cantidad de producto de PCR de dos formas: a) una disminucin del amortiguamiento de la fluorescencia dependiente de producto, en la que el fluorforo (la molcula delatora) y el amortiguador (quencher) se separan al unirse la sonda a la diana (figura 1c, d, e, f); b) un incremento de la transferencia de energa resonante fluorescente (FRET) del donador al fluorforo aceptor al quedar cercanos cuando se une la sonda a la diana (figura 1b). El SYBR-Green I produce resultados muy precisos en la cuantificacin del producto. Por otra parte, las sondas especficas de secuencia facilitan la identificacin de mutaciones y permiten realizar mltiples experimentos simultneamente al poder utilizar varias sondas con fluorforos distintos a la vez. Para el anlisis cuantitativo del producto, se analiza la curva de amplificacin, la cual est constituida por al menos tres fases distintas: 1) fase de latencia (lag) donde la acumulacin de producto no se puede detectar, 2) fase exponencial y 3) fase de saturacin. El nmero de copias de la diana al inicio de la reaccin se puede cuantificar con gran precisin a travs del ciclo umbral (Ct). El Ct es el nmero de ciclos necesarios para que se produzca un aumento de fluorescencia significativo con respecto a la seal de base, y es inversamente proporcional a la cantidad inicial de molculas molde. De esta manera, utilizando muestras patrones que contienen diluciones seriadas de concentraciones conocidas de la diana, se construye una recta de calibracin que relaciona los Ct con el logaritmo de la cantidad inicial de molde (N0). Extrapolando en esta recta los Ct obtenidos para las muestras problema, se puede estimar el valor de sus N0. La eficiencia de la reaccin tambin se puede calcular a partir de los Ct de los patrones. Para lograr una cuantificacin correcta, la eficiencia de patrones y muestras problema deben ser iguales, lo que implica una puesta a punto previa de la PCR. En caso de conocer la concentracin absoluta de molculas de molde en los patrones, los resultados sern absolutos. Pero la cuantificacin absoluta no siempre es necesaria. Para analizar cambios relativos en la cantidad de transcritos se elige como patrn un transcrito de referencia que no vare su expresin en los tratamientos a analizar, normalmente un gen de mantenimiento (housekeeping). Comparando los Ct del gen de referencia con el gen problema en muestras tratadas y sin tratar, se pueden determinar cambios relativos en la expresin del gen problema. Otro resultado a analizar es la curva de fusin del producto. sta se obtiene tras la amplificacin y se produce como consecuencia del decaimiento de la seal fluorescente debido a la fusin dependiente de temperatura del producto.

TEMA: CONTROL CICLO CELULAR

REGULACIN

DEL

PROONCOGEN: Son genes cuya funcin es la de codificar protenas trascendentales (factores de crecimiento) en la regulacin de la proliferacin, diferenciacin y apoptosis. Cuando los protooncogenes sufren una alteracin dan lugar a la formacin de una protena que no acta adecuadamente, esto conduce a un trastorno muy grave de las funciones celulares que se transforma en una clula cancerosa al multiplicarse sin control, indiferenciarse y ser inmortal, desarrollndose entonces un tumor maligno o cncer. ONCOGEN: Son protooncogenes alterados o sobre expresados por una mutacin en el gen o por alteraciones cromosmicas, siendo las ms importantes las denominadas translocaciones, provocadas por los carcingenos. GENES SUPRESORES DE TUMORES: Codifican protenas que sirven normalmente como freno en el crecimiento de la clula. Cuando dichos genes sufren una mutacin, el freno puede ser retirado, resultando ello en el crecimiento descontrolado de la clula conocido como cncer. Cules son las posibles causas de la desregulacin del ciclo celular? La prdida de la regulacin de los puntos de control en las fases G1 G2 S, tambin la prdida de la regulacin en la mitosis. Cules son las consecuencias de la desregulacin del ciclo celular? Cncer y poliploidias. CNCER: El cncer es un conjunto de enfermedades en las cuales el organismo produce un exceso de clulas malignas (conocidas como cancergenas), con crecimiento y divisin ms all de los lmites normales, (invasin del tejido circundante y, a veces, metstasis). Pasos de la carcinognesis:

1. LA INICIACIN ocurre a nivel del genoma y las alteraciones pueden darse en los tumores benignos y malignos al igual que la segunda etapa, pero la tercera, o sea la de progresin, es exclusiva de la transformacin maligna. Los agentes que actan en la primer etapa pueden ser: FSICOS - QUMICOS o VIRALES. 2. LA PROMOCIN, representa la etapa de crecimiento tisular con la formacin del tumor. Participan: los factores de crecimiento y los receptores a los factores de crecimiento, como as tambin la angiognesis y degradacin de las matrices extracelulares. 3. LA PROGRESIN implica la capacidad de invadir tejidos vecinos o a distancia, por parte de la clula tumoral maligna. Esa capacidad est codificada tambin en los genes de la misma con modificaciones estructurales y funcionales. Qu es inmortalizacin celular y por qu se puede dar? Est mediado por diferentes aspectos. Dentro de lo que es el telmero, esta es un porcin de la clula que va dirigiendo el proceso de produccin celular, pero que a medida que se va reproduciendo la clula se va perdiendo parte de este telmero, que se debe regenerar usando la telomerasa, a medida que pasa el tiempo se va produciendo menos telomerasa y no se regenera el telmero, con lo que la clula va perdiendo progresivamente su capacidad de reproduccin, lo cual est bien enganchado con la teora de la apoptosis. Qu es transformacin celular y como puede determinarse la ocurrencia de este evento? en una clula, adquisicin de ciertas propiedades de una celula tumoral bajo la accin de virus o de genes causantes de tumores (encgenos). Explique brevemente Cncer cervical y papilomavirus: Los papilomavirus humanos (VPH) son virus de DNA de doble cadena que infectan clulas epiteliales de la piel y mucosas. Un grupo de HPVs que incluye los tipos 16 y 18 (VPH-16 y VPH-18) esta asociado con la aparicin y progresin de lesiones prenoeplsicas y neoplsicas en la mucosa genital. En la mujer, el VPH-16 es el papilomavirus ms comn en infecciones genitales latentes, lesiones benignas y premalignas del crvix y ms de la mitad de carcinomas cervicales invasivos. De hecho, cualquier mujer que ha presentado una citologa anormal por la prueba de Papanicolau muy probablemente ha sido infectada por algn tipo de VPH. Cada ao a nivel mundial medio milln de mujeres muere como consecuencia de carcinomas cervicales y alrededor de 800,000 casos nuevos son diagnosticados. En Mxico, ms de 5,000 muertes por cncer cervical y 30,000 casos nuevos son reportados anualmente. Estos nmeros indican que Mxico tiene una de las tasas de mortalidad por cncer cervical ms altas a nivel mundial (sobre 14.0 por cada 100,000 habitantes de acuerdo al ltimo reporte de la OMS). El potencial oncognico de los VPH se encuentra ligado a los productos de los genes virales tempranos E6 y E7. La expresin de estos genes es requerida para adquirir y mantener eficientemente un fenotipo transformado en un amplio espectro de tipos celulares. Las protenas E6 y E7 interactan fsicamente con los supresores de tumor

(antioncogenes) p53 y Rb, respectivamente. La interaccin de la protena E6 de VPH16 con p53 resulta en degradacin por la va de la ubiquitina, llevando a un fenotipo equivalente al de un p53 mutante. La asociacin de E7 con Rb impide la interaccin de esta ltima con varias protenas regulatorias (p. ej. E2F) resultando en la eficiente disrupcin del ciclo celular. De esta forma, la accin combinada de E6 y E7 deja a la clula infectada con la imposibilidad de detener su crecimiento por la va de p53 y produce una multiplicacin descontrolada ante la inactivacin funcional de Rb. Luego entonces, los genes E6 y E7 son candidatos ideales para terapias contra el cncer cervical. La terapia actual ms efectiva para lesiones cervicales de alto grado es ciruga radical e irradiacin debido a la carencia de alternativas superiores. La aplicacin de terapia lser no tiene influencia significativa a largo plazo en la historia natural de padecimientos asociados a VPH en la mujer. El uso de interferones per se, ha sido frustrante an para infecciones virales agudas. Esto, porque al parecer cualquier beneficio obtenido con interferones se debe a un efecto antiproliferativo mas que antiviral, resultando en el resurgimiento de la infeccin. Los agentes citotxicos para cncer cervical tienen serias limitaciones por su alta toxicidad inespecfica y por el desarrollo de clonas con resistencia mltiple a drogas. Recientemente se ha producido un cambio en las estrategias teraputicas que no incluye reacciones txicas directas pero con la capacidad de modificar el crecimiento de clulas tumorales y afectar el ciclo de vida de los VPH. Cncer pulmonar:

Estructura de ARN: Lleva una sola cadena de polinucleotido, se encuentra en la pared de los ribosomas. Hay varios tipos y cada uno de ellos va a desempear una funcin diferente en la sntesis de proteinas y tambin en la transferencia de informacin del ADN. Se puede afirmar que el ARN se sintetiza en el ncleo, como un filamento complementario a una de las cadenas del ADN. Una vez separado el ARNm atraviesa la membrana nuclear y se dirige a los ribosomas que se encuentran en el citoplasma. El ARNr se encuentra en los ribosomas unido a las protenas. Una vez que el ARN mensajero se une a los ribosomas sirve como molde para la interconexin entre los diferentes aminocidos. Son transportados por el ARNt. La principal diferencia con el ADN es la presencia de un grupo hidroxilo en posicin 2' del azcar ribosa en el ARN. Este grupo hace que la molcula sea menos estable. Las regiones flexibles del ARN pueden ser atacadas qumicamente por el enlace fosfodister adyacente de modo que se puede escindir. El grupo hidroxilo tambin fuerza a la ribosa a adoptar la conformacin C3'-endo en lugar de la ms habitual C2'-endo del ADN. Esto fuerza a la doble hlice a adoptar una conformacin ligeramente diferente a la del ADN.

Entonces, el ARN se diferencia qumicamente del ADN por dos cosas: la molcula del azcar del ARN contiene un tomo de oxigeno que falta en el ADN; y el ARN contiene la base uracilo en lugar de la timina del ADN. El uracilo es qumicamente similar a la timina, aunque emplea menos energa para producirse. Sin embargo, el uracilo es un producto de la trasmutacin por daos de la citosina, haciendo que el ARN sea particularmente susceptible a mutaciones que pueden reemplazar un par de bases GC por GU o AU. Las propiedades qumicas del ARN hacen que las molculas grandes de ARN sean inherentemente frgiles y se puedan fragmentar con facilidad, siendo posteriormente descompuestas en nucletidos por hidrlisis. Las bases aromticas tambin absorben fuertemente la fraccin ultravioleta del espectro y podran haber sido susceptibles de daos y descomposicin por la radiacin de fondo. Estas limitaciones no hacen que sea imposible la utilizacin del ARN para almacenar informacin, sino solamente exigente desde el punto de vista energtico (para reparar o reemplazar las molculas daadas de ARN) y propensas a la mutacin. ESTRUCTURA PRIMARIA DEL ARN: Secuencia de las bases nitrogenadas que constituyen sus nucletidos. ESTRUCTURA SECUNDARIA: Regiones de la misma cadena con secuencias complementarias capaces de aparearse. ESTRUCTURA TERCIARIA: Es un plegamiento, complicado, sobre la estructura secundaria. CLASIFICACIN DE LOS ARN: (ARNm): - Cadenas de largo tamao con estructura primaria. Transporta la informacin necesaria para la sntesis proteica. Cada ARNm tiene informacin para sintetizar una proteina determinada. - Su vida media es corta. a) En procariontes el extremo 5posee un grupo trifosfato b) En eucariontes en el extremo 5posee un grupo metil-guanosina unido al trifosfato, y el extremo 3posee una cola de poli-A. En los eucariontes se puede distinguir tambin: - Exones, secuencias de bases que codifican proteinas - Intrones, secuencias sin informacin. Un ARNm de este tipo ha de madurar (eliminacin de intrones) antes de hacerse funcional. Antes de madurar, el ARNm recibe el nombre de ARN heterogeneonuclear (ARNhn ). (ARNr): - Cada ARNr presenta cadena de diferente tamao, con estructura secundaria y terciaria. - Forma parte de las subunidades ribosmicas cuando se une con muchas protenas. - Estn vinculados con la sntesis de protenas. (ARNn):

- Se sintetiza en el nuclolo. Posee una masa molecular de 45 S, que actua como precursor de parte del ARNr, concretamente de los ARNr 28 S (de la subunidad mayor), los ARNr 5,8 S (de la subunidad mayor) y los ARNr 18 S (de la subunidad menor) ARNu: - Son molculas de pequeo tamao que poseen mucho uracilo en su composicin - Se asocia a protenas del ncleo y forma ribonucleoprotenas pequeo nucleares (RNPpn) que intervienen en: Corte y empalme de ARN, Maduracin en los ARNm eucariontes, Obtencin de ARNr a partir de ARNn 45 S. (ARNt): - Son molculas de pequeo tamao. - Poseen en algunas zonas estructura secundaria, lo que va hacer que en las zonas donde no hay bases complementarias adquieran un aspecto de bucles. - Los plegamientos se llegan a hacer tan complejos que adquieren una estructura terciaria - Su misin es unir aminocidos y transportarlos hasta el ARNm para sintetizar protenas. El lugar exacto para colocarse en el ARNm lo hace gracias a tres bases, a cuyo conjunto se llaman anticodn (las complementarias en el ARNm se llaman codn).