EXPERIMENTO 11

EXTRACCION Y PURIFICACION DE LIPIDOS COMPLEJOS

REQUISITOS Repasar los conceptos vistos en teora sobre los lpidos complejos, funcin, nomenclatura, propiedades qumicas y fsicas, distribucin en nuestro organismo 1. FUNDAMENTOS

OBJETIVOS Comprobar la presencia de los lpidos complejos en cerebro de res o de ratas una vez efectuada su extraccin por diferentes solvente y posterior fraccionamiento de los extractos.

El tejido adiposo esta constituido principalmente por las grasas neutras, pero el cerebro contiene relativamente pocas, los constituyentes lipdicos de estos tejidos son los lpidos complejos como: fosfolpidos y colesterol. Basados en la solubilidad de los lpidos en solventes orgnicos, es posible extraer y purificar lpidos del cerebro por sucesivas extracciones con diferentes solventes y posterior fraccionamiento de los extractos para obtener fracciones ricas en: esteroles, glicerofosfolpidos y esfingolpidos. El esquema se basa en los siguientes hechos: Los esteroles son solubles en acetona, al contrario de lo que sucede con otros lpidos complejos. Algunos glicerofosfolpidos, como las lecitinas, la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilserina, son solubles en ter e insolubles en acetona. Los fosftidos y glucsidos de esfingosina, se disuelven en alcohol caliente y son insolubles en acetona y ter.

Los productos finales de ste experimento son sustancias de una pureza relativa, y sern identificados una vez efectuadas las extracciones. 129

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MATERIALES Y MTODOS Alcohol de 95 % Cloroformo-metanol (1:1) cido sulfrico. -Naftol al 5 % en etanol. Anhdrido actico. cido ntrico. Molibdato de amonio, Carbonato de sodio al 2 %. Nitrato de potasio al 2 %.

2.1 Materiales Homogeneizador (o una licuadora) Sistema de destilacin. Plancha elctrica o mechero. Balanza. Matraz. Pipetas. Embudo de Bchner. Balones. 50 g de cerebro de res o de rata. ter etlico. Acetona. 2.2 Mtodos PRECAUCION: Muchos de los disolventes utilizados en las operaciones siguientes son muy inflamables. NO PUEDE USARSE, bajo ningn concepto una llama directa de mechero, emplee bao de vapor. 2.2.1 Extracciones y obtencin de las fracciones 2.2.1.1 Preparacin de la fraccin 1: Colesterol. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Pese 50 g aproximadamente de cerebro y coloque en el homogeneizador con 200 ml de acetona. Homogeneice por 1 min. y transfiera a un vaso de precipitado, lavando el recipiente del homogeneizador con 25 ml de acetona vertiendo el lavado en el vaso con la suspensin. Deje en reposo 5 min. agitando ocasionalmente. Filtre en un embudo de Bchner y homogeneice el residuo durante 1 min. con 100 ml de acetona, lave con 50 ml de acetona que verter sobre el residuo, esto constituye la fraccin 1. Guarde los residuos de la filtracin para preparar las fracciones 2 y 3. Evapore la acetona en un matraz de fondo redondo calentando a vapor y con la cabeza de destilacin conectada a la trompa de agua. Enfre la solucin al chorro y recoja el colesterol bruto en un embudo de Bchner.

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Recristalice el colesterol disolvindolo en una mnima cantidad de etanol caliente, filtrando la solucin todava caliente y dejando enfriar el filtrado, la filtracin se efecta sobre un filtro plegado colocado sobre un embudo encima de una fiola, la fiola debe estar a BM. Deje hervir el filtrado hasta que el alcohol se evapore. Seque el colesterol cristalizado al aire, pese y guarde para su posterior identificacin.

9. 11.

2.2.1.2 Preparacin de la fraccin 2: Lecitina y Cefalina 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Transfiera el residuo que queda sobre el papel de filtro (insoluble en acetona) a un vaso de 400 ml y extraiga tres veces con ter, utilizando 200 ml cada vez. Para hacer las extracciones, se deja el producto slido en ter 4-5 min., agitando de vez en cuando. Se filtra el producto al vaci y se guarda el residuo para el aislar la fraccin 3. Concentre los extractos etreos, hasta un volumen de 50 ml, a presin reducida. Vierta el extracto concentrado sobre 50 ml de acetona y agite. Recoja el precipitado sobre un embudo de Bchner (fraccin 2). Descarte el filtrado y pese el precipitado en un vaso de precipitado de 50 ml, previamente tarado, calcule el peso en mg. Disuelva el precipitado en una mezcla acetona-metanol (3:1). Tape el frasco, para evitar la oxidacin y guarde para posterior caracterizacin.

2.2.1.3 Preparacin de la fraccin 3: Fosftidos de Esfingosina y Glucsidos de esfingosina. 1. 2. 3. 4. 5. Extraer el residuo insoluble en ter, obtenido al preparar la fraccin 2, con 50 ml de etanol hirviendo. Filtre la suspensin an caliente y descarte el precipitado. Enfre el filtrado y recoja el precipitado resultante por filtracin al vaco (fraccin 3). Coloque el precipitado en un vaso de 50 ml previamente tarado y calcule el peso con precisin de mg. Disuelva el precipitado en cloroformo-etanol (3:1) y tape el frasco para posterior caracterizacin. 130

2.2.2

Identificacin de lpidos:

a. Colesterol: Prueba de Lieberman: Las sustancias que tienen como ncleo el ciclopentano perhidrofenantreno, como el colesterol, dan una coloracin verde caracterstica, la prueba es la muestra la siguiente tabla: Tabla 1 Identificacin del colesterol mediante la prueba de Lieberman 1. Tome tres tubos secos y coloque: Tubo 1 2 3 2. 3. 4. 5. Cloroformo 1 ml 1 ml 1 ml Colesterol certificado 0 mg 5 mg 0 mg Fraccin 1 0 mg 0 mg 5 mg

Mezcle los tubos 2 y 3 para disolver. Aada 1 ml de anhdrido actico a cada tubo y agite. Aada 0,5 ml de H2SO4 concentrado a cada tubo y mezcle suavemente. Observe los cambios de coloracin y anote.

2.2.2.1 Lecitinas y Cefalinas mediante la prueba de Fusin: Esta prueba sirve para investigar fsforo inorgnico, las sustancias orgnicas tambin dan positiva la reaccin si se efecta una hidrlisis previa. La reaccin positiva se manifiesta por un precipitado amarillo de fosfomolibdato de amonio, la reaccin es la siguiente: HPO4 -2 + 12 MoO4-2 + 23H + + 3NH4 + Molibdato de amonio 1. 2. 3. 4. 5. 6. (NH4)3 PO4 .12 MoO3 + 12H2O Fosfomolibdato de amonio

Tome dos tubos y proceda de la siguiente manera: Coloque 0,5 g de la fraccin 2 en el tubo rotulado 2, el tubo rotulado 1 no coloque muestra, ese tubo servir de blanco. Aada a cada tubo: 1 ml de una mezcla de carbonato de sodio al 2 % y nitrato de potasio al 2 % (2:1), recientemente preparada. 1 ml de agua caliente 80C. Mezcle y deje en reposo durante 10 min. Aada 0,5 ml de cido ntrico conc. 131

7. 8.

Mezcle y caliente suavemente a la llama SIN DEJAR HERVIR. Aada 0,5 ml de Molibdato de amonio, mezcle y observe.

2.2.2.2 Fosftidos de esfingosina y glucsidos de esfingosina: Para identificar la presencia de carbohidratos se pude practicar la prueba de Molish y se procede de la manera siguiente: 1. 2. 3. 4. 3. 1. 2. 3. 4. Aada en un tubo de ensayo 0,5 g de la fraccin 3, use otro tubo como blanco (sin muestra). Agregue a ambos tubos, 0,5 ml de -Naftol al 5 % en etanol y agite. Deje caer lentamente por las paredes del tubo 1 ml de H2SO4 concentrado, tenga cuidado de NO AGITAR. Observe la aparicin de un anillo rosado. Anote sus resultados. AUTO-EVALUACIN. En la literatura apropiada, consulte tres pruebas que sirvan para identificar y cuantificar los lpidos complejos estudiados. Por qu se usan diferentes solventes para separar lpidos. Escriba las frmulas general de los lpidos que Ud. separ en cada fraccin y ubquelos en la Clasificacin de lpidos. Explique por qu cree Ud. que identificamos los triglicridos.

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4.

INFORME 11 (EXTRACCIN DE LPIDOS) Nombres N del mesn N del estudiante Desarrollo Informe Definitiva

Apellidos Grupo de prcticas Fecha Calificaciones Entrada

1. Complete el siguiente cuadro con la informacin deseada. Exprese el peso en seco de cada fraccin en trmino de % de peso fresco de tejido cerebral que us. FRACCION LIPIDO % PRUEBA +

2.

Efecte los clculos en el siguiente espacio

3.

Clasifique y anote la composicin de los siguientes lpidos: LIPIDO CLASIFICACION COMPOSICION

Nota: El informe debe ser entregado al finalizar la prctica, sin anexar hojas. 133