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PROLOGO El presente libro tiene la finalidad de dar apoyo a las asignaturas relacionadas con el cultivo, manejo, aislamiento, conservacin

e identificacin de microorganismos para los estudiantes de educacin media y superior del rea biolgica. Se presentan algunas tcnicas bsicas microbiolgicas el cual tiene como principal objetivo poner en prctica el mtodo cientfico para despertar el inters y seguir estimulando en algunos casos al estudiante por esta rama de la ciencia.

Como una aportacin a las estructuras didcticas de este libro, colocamos una serie de imgenes de lo que esperamos en el experimento y de lo que no esperamos para poderlos comparar.

NOMBRE DEL ALUMNO: ___________________________________________

PROFESOR DE TEORA: ___________________________________________

PROFESORES DE LABORATORIO: _________________________________

GRUPO: _______________________________________________________

PERIODO LECTIVO: _____________________________________________

CARRERA: _____________________________________________________

ESCUELA: _____________________________________________________

NDICE

Pasos a seguir para trabajo diario de un laboratorio de microbiologa _________________________________ 4 Procedimiento para la realizacin de un medio de cultivo___________________________________________ 13 Realizacin de una preparacin en fresco y fija___________________________________________________ 19 Tcnicas de tincin _________________________________________________________________________ 22 Microscopia_______________________________________________________________________________ 27 Preparacin de material utilizado en microbiologa ________________________________________________ 35 Diluciones y diluyentes _____________________________________________________________________ 43 Aislamiento por estra cruzada y vaciado en placa________________________________________________ 47 Cultivo de microorganismos _________________________________________________________________ 52 Microcultivo_______________________________________________________________________________ 59 Conservacin de cepas _____________________________________________________________________ 67 Pruebas bioqumicas _______________________________________________________________________ 72 Toma de muestras _________________________________________________________________________ 88 Determinacin de OMA ____________________________________________________________________ 97

Determinacin de OCT _____________________________________________________________________ 100 Determinacin de mohos y levaduras _________________________________________________________ 106

Aplicaciones de la temperatura (pasteurizacin de leche y control de calidad) __________________________ 109 Preparacin de reactivos __________________________________________________________________ Medidas de seguridad _____________________________________________________________________ 114 120

PASOS A SEGUIR PARA TRABAJO DIARIO DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA La calidad en nuestro trabajo en un laboratorio de Microbiologa depende de una secuencia de pasos a seguir estrictamente por todo el personal que labora el, para ello sugerimos seguir los siguientes pasos para tratar de uniformar criterios. PASOS A SEGUIR: 1.- Preparacin del rea de trabajo 2.- Preparacin de medios de cultivo 3.- Preparacin de reactivos 4.- Preparacin de material 5.- Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras para su anlisis microbiolgico 6.- Realizacin de la tcnica 7.- Incubacin de la muestra 8.- Recuento 9.- Realizacin de los clculos 10.- Presentacin del informe. El personal de nuevo ingreso al laboratorio de Microbiologa deber de leer el manual de aseguramiento de la calidad y pondr ms inters en su rea de trabajo. PREPARACIN DEL REA DE TRABAJO Las caractersticas del rea de trabajo son las siguientes: 1.- La mesa debe ser de acero inoxidable con instalaciones de agua, luz, drenaje y gas, cada una de estas instalaciones deber de tener los siguientes cdigos de colores segn la NOM-026-STPS, Colores y seales de seguridad e higiene e identificacin de riesgos por fluidos conducidos en tuberas. LUZ AGUA GAS ROJO VERDE AMARILLO IDENTIFICACIN DE TUBERAS CONTRA INCENDIO IDENTIFICACIN DE FLUIDOS DE BAJO RIESGO IDENTIFICACIN DE FLUIDOS PELIGROSOS

2.- El rea de trabajo cuenta con luz natural principalmente y/o luz artificial. 3.- Una campana de flujo laminar para la realizacin del sembrado con instalaciones de luz. 4.- Siempre al inicio y al final de nuestras actividades la mesa se limpiar con una solucin de benzal al 10 % para desinfectarla, para ello siempre se debe tener una esponja y un atomizador con benzal, adems se debe de tener un frasco de con benzal para cuando se necesite, este reactivo hay que prepararlo frecuentemente para evitar que se contamine. 5.- La mesa debe tener dos mecheros con manguera en buen estado y una balanza granataria de 600 g de capacidad para el pesado de las muestras. 6.- En el cajn de la mesa se debe tener papel aluminio, cucharas de plstico nuevas, esptulas, frasco con torundas de algodn, hisopos, cuchillos, tijeras, pinzas, tenedores, ligas, (algunos estriles y otros no porque se pueden esterilizar con alcohol cuando se requieran)

7.- Debe existir un frasco de 2 litros de capacidad con 1 litro de benzal para colocar las puntas de las pipetas que se estn utilizando durante el anlisis perfectamente etiquetado (PUNTAS DE PIPETAS SUCIAS). 8.- En la mesa procurar distribuir el material que se necesita de tal manera que contemos con el espacio suficiente para manipular las muestras tanto en el pesado de la muestra como el sembrado, de tal forma que sugerimos apilar las placas de Petri del lado izquierdo para irlas corriendo al lado derecho. 9.- Debajo de la mesa se tendr un recipiente con una bolsa de plstico para desechar lo que no sirve, nunca las muestras, estas se guardan hasta que el anlisis y reporte estn terminados. 10.- El rea de trabajo estril no debe tener corrientes de aire para evitar contaminaciones. 11.- El analista debe traer una bata de preferencia blanca, limpia y en buen estado, con el pelo recogido y cubierto con una cofia, adems de utilizar un cubrebocas y guantes al manipular la muestra. 12.- Se debe de programar la fecha y hora de dar mantenimiento a las instalaciones as como la hora para la limpieza de este. 13.- El analista debe evitar en lo posible la entrada de personal ajeno al laboratorio o en zonas donde se preparen medios, reactivos, o rea de sembrado de muestras. 14.- Al final de cada da de trabajo el analista indicar al personal de lavado de material cual es el que tendr que lavar y esterilizar para ser utilizado nuevamente. 15.- Al desechar las muestras sobre todo las slidas utilizar una coladera para evitar que las partculas slidas de gran tamao se vayan por el drenaje.

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO El personal encargado de la preparacin de medios de cultivo debe conocer la NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo para poder clasificarlos, para ello mencionaremos lo siguiente: Un Medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar los microorganismos, as como efectuar pruebas de susceptibilidad, proporcionndoles las condiciones ambientales adecuadas para su desarrollo, estos requieren elementos que se encuentran en su composicin qumica. Los factores que se deben regular durante el crecimiento son los nutrientes, pH, temperatura, aireacin, concentracin de sales, y potencia inica del medio. Los componentes necesarios que debe contener un medio de cultivo deben ser: a.- Fuente de carbono Los microorganismos obtienen su energa a travs de la fotosntesis o de la oxidacin de compuestos orgnicos, son capaces de utilizar el CO2 como fuente principal de carbono. El carbono se suministra generalmente en forma de carbohidratos b.- Fuente de nitrgeno El nitrgeno es un componente de primer orden de las protenas y cidos nucleicos, las fuentes pueden ser los nitratos, nitritos, nitrgeno, amonio y aminocidos. c.- Fuentes de azufre El azufre es uno de los constituyentes orgnicas de la clula, constituye parte de la estructura de diversas coenzimas y se encuentra formando parte de la metionina y cistena, la mayora de las bacterias toman el azufre del in sulfato, otros ms lo pueden obtener a partir del H2S. d.- Fuente de fsforo Se requiere fosfato como componente de ATP, cidos nucleicos y coenzimas como el NAD, NADH y flavinas. El fosfato se asimila como fosfato inorgnico. e.- Fuentes minerales Algunos microorganismos requieren de iones Mg2+ y ferroso Fe2+, el magnesio es un componente de la molcula de clorofila y el hierro es parte de las coenzimas de los citocromos y las peroxidasas. El potasio se requiere para la funcin de los ribosomas y el calcio es un constituyente de las paredes celulares de las bacterias Gram positivas f.- Factores de crecimiento Se llama factor de crecimiento a la sustancia que favorece el crecimiento pero que el microorganismo es incapaz de sintetizar. Los factores de crecimiento pueden ser vitaminas del complejo B (tiamina, cido nicotnico, piridoxina, biotina), algunas de estas sustancias se pueden obtener del suero, yema de huevo o sangre. g.- Agar El agar utilizado en bacteriologa es un medio que esta libre de metales txicos, compuestos nitrogenados, sales insolubles, azcares libres, microorganismos muertos, bacterias termfilas y pigmentos. El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas rojas, particularmente de los gneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis, qumicamente el agar es una mezcla de dos polisacridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan como polmeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporcin de agarosa y agaropectina es variable, con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, segn la clase de algas utilizadas. El agar con agua destilada fra tiene un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%, en agua hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocos minutos. La tendencia a la unin de sus partculas, que en fro se mantienen independientes producen un gel limpio y transparente que al enfriarse, ya no cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a medida que la solucin disminuye en su temperatura, gelificando a los 35 40 C. Los cidos diluidos en fro, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los medios de cultivo como agente gelificante ha resultado muy bueno debido a : a.- Su estructura le confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias marinas son capaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora.

b.- Su estabilidad qumica, le permite mantener el medio al estado slido prcticamente en cultivos de cualquier bacteria c.- Su punto de fusin, superior a 80 C, permite cultivar en medio slido bacterias termfilas que se incuban hasta temperaturas de 65 C. d.- Su temperatura de gelificacin, inferior a los 39 C, permite mezclarlos en forma lquida. e.- Su elevado poder gelificante permite su utilizacin a muy bajas concentraciones, generalmente del orden del 1 al 1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos f.- Su empleo en concentraciones muy bajas permite la obtencin de medios semislidos en los cuales se pueden realizar pruebas de movilidad En algunas ocasiones un medio de cultivo posee algunas otras sustancias como colorantes o inhibidores para favorecer o inhibir el crecimiento de un microorganismo. Los colorantes e indicadores son de importancia en la preparacin de la mayor parte de los medios de cultivo diferenciales pues, pueden actuar de la siguiente manera: a.- Como agentes bacteriostticos b.- Como indicadores de los cambios de acidez o alcalinidad c.- Como indicadores redox en ciertos medios de cultivo. CLASIFICACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Segn la NOM los clasifica por:

A.- Su aspecto fsico, los medios de cultivo preparados pueden ser:


a.- Lquidos, b.- Semislidos, c.- Slidos. a.- Medios lquidos. Se emplean fundamentalmente para: - Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la produccin de metabolitos especficos. - Estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen. - Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioqumicas. b.- Medios semislidos. - Se utilizan para identificaciones bioqumicas y averiguar si el germen estudiado es mvil. Los medios semislidos tienen una consistencia blanda. c.- Medios slidos. - Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios slidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiologa.

B.- Su uso, se clasifican en:


a.- Medios selectivos. Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperacin del germen o grupo de grmenes de inters. b.- Medios selectivos de enriquecimiento. Son medios lquidos que estimulan la multiplicacin de algn germen determinado e impiden o inhiben la reproduccin de otros. c.- Medios diferenciales.

Son aquellos que contienen indicadores de cido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las caractersticas tpicas de las colonias. d.- Medios para cultivar grmenes anaerbicos. Son medios de cultivo para aquellos grmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia. e.- Medios de cultivo para medir la potencia de los antibiticos. f.- Medios de transporte. Sirven para transportar los especmenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporcin original de la flora microbiana en los especmenes. g.- Medios para filtracin a travs de membrana. Pueden ser lquidos o slidos. En el primer caso, se preparan a la concentracin usual y permiten el crecimiento de microorganismos presentes en la membrana. Los medios slidos tienen un contenido mnimo de agar para favorecer la difusin de nutrientes del medio de la membrana. h.- Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras. i.- Medios especiales para cultivo de protozoarios.

C.- Especificaciones
El fabricante debe especificar en cada medio: a.- Contenido de humedad (medio deshidratado). b.- Composicin del medio. c.- Mtodo de preparacin. d.- Condiciones de presin y temperatura para la esterilizacin del medio preparado (en autoclave). e.- Advertencia de no esterilizar el medio, si es el caso. f.- Caractersticas de desarrollo de los microorganismos en el medio. g.- Advertencia sobre la conservacin de los medios preparados. h.- Resultados de las pruebas de estabilidad del medio. i.- Resultado de las pruebas de viabilidad del medio. j.- pH del medio preparado. k.- Fuerza de gel (si procede).

D.- Etiquetado
El etiquetado sobre el envase del medio de cultivo debe ser en idioma espaol, con caracteres claros y legibles, de conformidad con lo establecido en la Ley General de Salud, su Reglamento en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios y las normas oficiales mexicanas que se emitan al efecto, debiendo incluir adems: - Nombre comercial del producto. - Uso. - La leyenda "Agente de Diagnstico". - Presentacin. - Datos de conservacin y almacenaje. - Fecha de caducidad. - Nmero de lote.

- Nmero de Registro SSA. - Nombre y domicilio del fabricante. - Nombre y domicilio del distribuidor. - Mtodo de preparacin y pH final. - Frmula. Por lo tanto haciendo uso de la reglamentacin mexicana tenemos ejemplos de los medios de cultivo por su aspecto fsico. a) Medios lquidos.- Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades de microorganismos o bien para la produccin de algn metabolito adems de estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen, se puede obtener el tubo o en matraz y en caso de cultivar a los mohos se puede hacer por agitacin o sin agitacin.

Figura 1: Cultivo en medio liquido (caldo nutritivo y caldo glucosa sales) b) Medios semislidos.-Se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad y su contenido de agar es de 13 g/l

Figura 2: Medio semislido (medio SIM), para observar la movilidad de un microorganismos c) Medios slidos.- Se elaboran en una placa para obtener colonias aisladas de microorganismos y la concentracin de agar es de 15 g/l, tambin lo utilizamos en medios slidos inclinados y cuando se trata de sembrar en tubo se colocan en ellos y despus de la esterilizacin se inclinan sobre una varilla de vidrio para dejar una superficie de aproximadamente 3 cm.

Figura: 3 Medio slido inclinado, slido en placa y en matraz para vaciado en placa B.- Por su uso se clasifican en: a) Medios selectivos.- Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperacin del germen o grupo de grmenes de inters.

Figura 4: Medios selectivo agar eosina azul de metileno. b) Medios selectivos de enriquecidos.- Son medios que estimulan la multiplicacin de algn germen determinado e impiden la reproduccin de otros como por ejemplo el agar Baird Parker que sirve para el aislamiento de S. aureus, estos medios de cultivo le adicionamos una sustancias enriquecida de composicin desconocida como suero, sangre, huevo, leche, extracto de hgado, etc.

Figura 5 Medio enriquecido c) Medios diferenciales.- Son aquellos que contienen indicadores de cido base para detectar cambios en el medio o en las caractersticas tpicas de la colonia.

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Fig. 9 Medio de transporte para la realizacin de exudados farngeos. C.- Tambin podemos clasificar a los medios de acuerdo a nuestras necesidades y lo podemos hacer de la siguiente forma. A.- POR SU COMPOSICIN a).- Medio sinttico.- Si un medio se le conoce el 100 % de su composicin qumica. b).- Medio complejo.- Si un medio de cultivo no conocemos su composicin qumica. La calidad del trabajo microbiolgico en el anlisis de muestras se encuentra vinculada tanto con la idoneidad de los medios de cultivo y reactivos, como de la limpieza del material de vidrio y/o plstico que se utilizan durante su preparacin y/o envase. Las mejores instalaciones y equipo disponible y la habilidad del analista pierden todo su valor si la composicin de los medios de cultivos no corresponde a la requerida y si durante la preparacin de stos no se respetan las indicaciones del fabricante. NOTAS: -Leer siempre las instrucciones del fabricante, las cuales estn en la etiqueta del frasco -Realizar los clculos para pesar exactamente lo solicitado. -Se debe siempre de fundir el medio (agar), a la temperatura de ebullicin y sobre un soporte con rejilla o sobre una parrilla de calentamiento. -Utilizar un recipiente al doble de la capacidad que se vaya a preparar -Verificar el pH con un potencimetro -Una vez preparado el medio de cultivo, si son placas y ya estn solidificadas se colocan en bolsas de plstico nuevas y en posicin invertida para evitar la deshidratacin y se colocaran en el refrigerador hasta su uso. -Si son tubos se tienen que inclinar, para ello se coloca una pipeta en una mesa plana y se sujeta con un masking, posteriormente se acomodan los tubos, de tal manera que al solidificarse quede un rea de aproximadamente 3 cm de longitud. Una vez solidificados se colocan dentro de un bote de lmina y este se introduce en una bolsa de plstico, para ser guardados en el refrigerador -Los medios que son lquidos se quedan en el interior del bote y una vez fros se colocan en el refrigerador. - No olvidar colocar en la incubadora, al menos una muestra de cada medio para testigo. -Un medio contenido en un matraz puede ser esterilizado una segunda ocasin. -El cido tartrico se esteriliza por filtracin con membrana.

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Figura 10 Medio de cultivo donde podemos preparar el medio siguiendo las instrucciones del fabricante

Fig. 11 Medios de cultivo preparados. Los cuales llevan un control de calidad y son probados con cepas ATCC, por ejemplo para el agar de sal y manitol es probado con: Resultado Crecimiento inhibido Colonias con pigmento amarillo caracterstico y halo de color amarillo (manitol positivo) ATCC12228 Colonias blancas, sin halo amarillo (manitol negativo) S. epidermidis ATCC 12453 Inhibicin parcial P. mirabilis Tabla No. 1 cepas de referencia para control positivo y negativo del agar de sal y manitol. MTODO DE PRUEBA La viabilidad de los medios se debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC (Coleccin Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas en centros de referencia) ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS Los medios de cultivo debern almacenarse en un lugar fresco y seco o en el refrigerador Microorganismo E. coli S. aureus Cepa de referencia ATCC 25922 ATCC 25923

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PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIN DE UN MEDIO DE CULTIVO 1.- Asegurarse que el frasco que contiene el medio de cultivo est bien cerrado, no presente grumos, no est hidratado y se encuentre dentro de su vigencia. 2.- Leer cuidadosamente las especificaciones del fabricante, generalmente son las siguientes: 2.1 Contenido de humedad (medio deshidratado). 2.2 Composicin del medio. 2.3 Mtodo de preparacin 2.4.- Condiciones de presin y temperatura para la esterilizacin del medio preparado

2.5.- Advertencia de no esterilizar el medio, si es el caso.


2.6.- Caractersticas de desarrollo de los microorganismos en el medio. 2.7.- Advertencia sobre la conservacin del medio preparado.

2.8 Resultados de las pruebas de estabilidad del medio.


2.9 Resultado de las pruebas de viabilidad del medio. 2.10 pH del medio preparado. 3.- Calcular NICAMENTE la cantidad de medio de cultivo que se necesita y anotar los clculos en la bitcora. 4.- Abrir el frasco y auxilindose de un esptula o cucharilla, pesar en balanza, previamente calibrada, la cantidad calculada. 5.- Colocar la pesada en un recipiente cuya capacidad sea por lo menos dos veces mayor a la del volumen de medio que se desea preparar. 6.- Adicionar el volumen de agua deseado, agitar vigorosamente y dejar reposar para iniciar su disolucin. NOTA: Antes de usar el agua, verificar el pH de la misma. 7.- Si para la disolucin completa se requiere calentar, efectuar esta operacin en platina caliente o sobre una rejilla de asbesto calentando con mechero. NO APLICAR CALOR DIRECTO AL MEDIO DE CULTIVO, porque puede sufrir alteracin. 8.- Ajustar el pH a 25 C con potencimetro ajustado. NO USAR PAPEL INDICADOR EN ESTA OPERACIN. 9.- Esterilizar los medios y/o soluciones preparadas, usando calor hmedo a temperaturas y tiempos establecidos por el fabricante, dicho valor lo obtenemos de la etiqueta del frasco de medio. Controlar el proceso de esterilizacin usando como bioindicadores al Geobacillus stearothermophilus y para calor seco utilizar al B. subtilis. Para sustancias termolbiles, esterilizar mediante el proceso de filtracin y el bioindicador utilizado es Pseudomonas diminuta, a.- Medios slidos en placa Cuando se necesite preparar placas de medios de cultivo, efectuar el proceso de vaciado en campana de flujo laminar o bien en la zona de trabajo bacteriolgico del mechero, siguiendo las siguientes recomendaciones. 1.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un bao Mara a una temperatura de 45 2C. 2.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y proceder a vaciar el medio

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Fig. 12 Medio slido a 45 C y vaciado en placa del medio 3.- Dejar entreabiertas las placas un momento para que el agua se evapore y no se condense en la tapa, una vez desplazada el agua tapar rpidamente.

Fig.13 Diferentes placas con medio de cultivo El medio slido tambin es utilizado para realizar el recuento y aislamiento de microorganismos por la tcnica de extensin con varilla, en esta tcnica contamos con el medio ya solidificado y adicionamos 0,1 ml del inoculo en la superficie del medio, posteriormente esterilizamos la varilla y dejamos enfriar para extender la muestra.

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Fig. 14 Tcnica de extensin con varilla Medio slido en placa, dejar entreabierta la tapa de la caja de lo contrario se formar agua de condensacin, tal y como se muestra en la figura. 14 4.- En caso de existir burbujas en el medio hay que flamear con la flama del mechero, procurando agarrar el collarn para que no se apague, tapar la placa y dejar solidificar.

Fig. 14 Cuando al vaciar nos queden burbujas, estas se pueden romper al hacer pasar la flama del mechero sobre ellas (Nunca hacer este procedimiento cuando ya se tenga el inoculo de la muestra) 5.- Los medios preparados se deben conservar de preferentemente en el refrigerador y protegidos con bolsas de plstico. 6.- Todos los medios de cultivo preparados deben llevar fecha de preparacin. 7.- De cada lote preparado de medio de cultivo, incubar dos placas a 35 C durante 48 horas como prueba de esterilidad. b.- Medios en matraz para vaciado en placa Cuando se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle un tapn de algodn con gasa y fundir el medio. 1.- Esterilizar el medio a las condiciones que indica el fabricante. 2.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un bao Mara a una temperatura de 45 2C. 3.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio. 4.- Despus de inocular las diluciones de las muestras preparadas, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas y dejar solidificar.

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Fig. 15Tcnica de vaciado en placa

Fig. 16 Medios de cultivo a temperatura de 45C para realizar la tcnica de vaciado en placa c.- Medios en matraz para vaciado en placa de mohos levaduras. Cuando se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle un tapn de algodn con gasa y fundir el medio. 1.- Esterilizar el medio a las condiciones que indica el fabricante. 2.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un bao Mara a una temperatura de 45 2C y adicionarle 1.4 ml de cido tartrico al 10 % por 100 mL de medio.

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3.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio d.- Medios lquidos en tubo. 1.- Preparar el medio de cultivo (caldo) en un vaso de precipitados y colocarlo en un dosificador regulado a 9 mL y proceder a colocarlo en tubos de ensaye de 16 X 150 mm con tapn de rosca, previamente etiquetados y conteniendo una campana de Durham. 2.- Procurar no cerrar los tubos de ensaye hasta el tope para evitar que estos exploten. 3.- Colocar los tubos en un bote de lmina y colocarle papel Kraft a manera de gorro y proceder a esterilizar a las condiciones que indica el fabricante. 4.- Una vez esterilizados, dejar enfriar y colocarlos en un lugar fresco y seco o en el refrigerador para evitar la evaporacin. 5.- Cuando se requiere tubos con otro tipo de caldo se le coloca a cada uno de los tubos 3 mililitros

Fig. 17 Preparacin de medios de cultivo lquido en tubo Las principales causas de error en la preparacin de medios de cultivo son: Diferencias en la medicin o peso de los medios y /o ingredientes. Falta de frescura del medio por estar bastante tiempo almacenado en el refrigerador el cual genera la deshidratacin del medio Presencia de residuos de detergente en el material utilizado. Efecto germicida de algunas sustancias presentes en el material de vidrio por mal lavado y enjuagado. Que la calidad del agua destilada utilizada no sea la indicada o que presente ciertas trazas de impurezas. Diferencias en el ajuste del pH antes de la esterilizacin o disminucin de este despus de la esterilizacin por efecto del calentamiento o bien por parte del analista. Aunque los medios sean de buena calidad podra en un momento dado tener sustancias que inhiban el crecimiento de los microorganismos. Al vaciar los medios si no se hace a la temperatura sugerida puede tener agua de condensacin y al sembrarlo puede generarnos colonias extendidas. Una mala esterilizacin por parte del personal que lo realice ya sea un sobrecalentamiento del medio trayendo como consecuencia que se desnaturalicen algunas sustancias y en ocasiones pueden perder su poder diferencial o su consistencia. Siempre que la tcnica indique esterilizar por separado alguna sustancia se deber de realizar nunca mezclarlos porque es una causa de error, que pudiera repercutir en el resultado de manera muy significativa. El esterilizar los medios ms de una vez corremos el riego de perdida de agua por lo que el medio estar ms duro de lo que debe estar, por lo tanto se deben de pesar solo cantidades necesarias. Revisar frecuentemente el funcionamiento del manmetro de la autoclave.

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EXPRESIN DE RESULTADOS Los bioindicadores no deben presentar desarrollo alguno a las 48 horas de incubacin en el bao Mara INFORME DE LA PRUEBA Del lote elaborado el 5 % de las cajas d Petri o matraces preparados para el vaciado en placa no deben de presentar desarrollo alguno. Esta prueba se debe realizar siempre que se prepare material.

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Elaboracin de una preparacin en fresco y una preparacin fija

Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios pticos, por lo que nos vamos a limitar a describir las tcnicas ms comnmente usadas para realizar preparaciones para microscopios pticos. A.- Preparacin en fresco: para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que no est fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubrindola, sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos se observa al microscopio de contraste de fases, pero antes debemos limpiar los portaobjetos de la siguiente manera.
Limpieza de los portaobjetos y cubreobjetos Es preferible utilizar material nuevo, pero en ocasiones presentan algo de grasa por lo que debemos desengrasarlos con alcohol y secarlos con un pao fino que no deje pelusa, si no se utilizan en el momento se deben de envolver con papel higinico, de esta manera quedan protegidos del polvo y nicamente se abre el paquete en el momento de hacerlos servir. B.- Preparacin de Frotis: Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodn y que contenga alcohol. a) Etiquetar la preparacin, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta ser preferentemente pegada a la izquierda de la preparacin, si con una etiqueta no basta colocar otra del lado derecho, la etiqueta llevar el nombre del microorganismos, el nombre de la tincin, el equipo, el grupo y la fecha. Mtodo A a) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ah tomar con el asa una pequea gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos. (para este paso no se necesita que el agua sea estril y que se tenga que esterilizar el asa) b) Encender el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el tubo de ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender el inoculo aproximadamente un cm2 para obtener una pelcula delgada de microorganismos. Flamear el asa para esterilizarla. c) Dejar secar el frotis a temperatura ambiente. d) Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rpidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el dorso de la mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente. Realizar esta operacin una vez ms. El calor deseable es aquel en que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado en el dorso de la mano. Dejar enfriar el portaobjetos antes de teir.

Fig. 18 Preparacin de un frotis para una preparacin Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inculo de lo contrario quedar un frotis grueso, la luz no pasar y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis

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Mtodo B a) Si se proporciona un tubo con una suspensin bacteriana, entonces encender el mechero. b) En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inculo de la suspensin. c) Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla d) Colocar el inculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inculo por lo menos 1 cm2, y flamear el asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor. OBSERVACIN DE UNA PREPARACIN EN FRESCO DE UN MOHO a) En un portaobjetos limpio coloca una gota pequea de azul de algodn lactofenol b) Con el asa coloca un poco del micelio del moho y colcale un cubreobjetos. Observa al microscopio a 40 X y realiza un esquema de lo observado.

Fig. 19 Preparacin de una muestra de mohos con azul de algodn lactofenol

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TCNICAS DE TINCIN
Las bacterias no teidas muestran pocos detalles morfolgicos; el diagnstico bacteriolgico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias por lo que para poder observar a los microorganismos es necesario teir la clula el cual resulta de un conjunto de reacciones fisicoqumicos muy complejos, algunas reacciones pueden ser irreversibles y otras no, por ejemplo algunos colorantes que han teido en exceso pueden eliminarse con disolventes adecuados. La mayora de los colorantes utilizados en microbiologa son derivados de la anilina, los colorantes estn formados por uno o ms anillos bencnicos conectados por uniones qumicas bien definidas (cromforos) que estn bien asociados con la produccin de color, tericamente ciertos radicales qumicos poseen la propiedad de absorber la luz de diferentes longitudes de onda, adems poseen un grupo funcional llamado auxocromo que permite su unin a componentes con carga contraria presentes en la clula. Los colorantes se designan como cidos o bsicos, termino que no indican necesariamente sus reacciones de pH en solucin, sino ms bien si una parte significativa de la molcula es aninica o catinica. Desde el punto de vista prctico, los colorantes bsicos tienen estructuras de naturaleza cida.

En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensin, fijacin, tratamiento con colorantes y observacin. Extensin: Se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es lquida se hace directamente y, si es slida, hay que resuspenderla previamente en una gota de H2O. Fijacin: Tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las protenas para facilitar la accin del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero. Tincin: Se realiza aadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los procesos anteriores. Puede ser de varios tipos: TINCIN NEGATIVA: Los colorantes no tien el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina). TINCIN SIMPLE: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tincin negativa, slo nos permite observar la forma, el tamao y el tipo de agrupacin de las clulas.
Tomar la preparacin y colocarla en el recipiente dispuesto con el colorante que previamente les ha tocado Tomar el tiempo por 1 minuto y con la pinza de diseccin sacarlo del recipiente. Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua Dejar secar la preparacin y observarla al microscopio.

Fig. 20 Pasos para la realizacin de una tincin simple, donde se pueden colocar varias preparaciones en un mismo portaobjetos

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Fig. 21 Esquemas de las diferentes formas microscpicas TINCIN DIFERENCIAL: Tincin de Gram La pared celular es responsable de la tincin de Gram, el procedimiento de la tincin se inicia con una tincin de las clulas bacterianas fijadas mediante el colorante bsico cristal violeta, posteriormente se trata con una disolucin de yodo, el yodo forma un complejo con el cristal violeta que es insoluble en agua y slo medianamente soluble en alcohol o acetona. Las clulas se tratan despus con alcohol para diferenciarlas, las clulas Gram positivas retienen el complejo colorante-yodo por lo que las observamos de color morado-azules y las clulas Gram negativas son decoloradas por el alcohol por lo que se hacen visibles mediante la coloracin de contraste que en este caso es la fucsina. Procedimiento en la tincin de Gram Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloracin segn la tabla Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto. Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto. Lavar los frotis con agua de la llave. Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante). Lavar inmediatamente con agua de la llave. Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos Lavar los frotis con agua de la llave. Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersin y observarlos al microscopio con el objetivo de 100X. (Previamente realizar la tcnica de iluminacin de Khler y enfocar a 10 y 40X)

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Fig. 22 Pasos a seguir para realizar la tincin de Gram Resultados en una tincin de Gram

Fig. 23 Tincin de Gram TINCIN DIFERENCIAL: Tincin de Ziehl Neelsen

Los microorganismos pertenecientes al gnero Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes eubacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lpidos que la hace impermeable a los agentes hidroflicos, por lo tanto estos microorganismos no se tien adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloracin de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son teidas adecuadamente por el mtodo de Ziehl-Neelsen (Tincin Acido-Rpida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solucin decolorante una mezcla de etanol y cido clorhdrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloracin cido-alcohlica y por eso se denominan Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR). Los microorganismos del gnero Mycobacterium contienen una membrana citoplasmtica formada por una bicapa lipdica similar a las restantes eubacterias. Por encima de esta membrana se encuentra el rgido peptidoglicano que contiene N-glucolilmurmico en lugar de N-acetilglucosamina. Por medio de una unin fosfodister, el peptidoglicano se halla unido covalentemente al arabinogalactano, un polmero de arabinosa y galactosa. En la porcin ms distal y externa de los arabinogalactanos se hallan fijados los cidos miclicos que tienen cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los glucolpidos son un grupo de compuestos (micolatos de trealosa, sulfolpidos, micsidos, etc) que se encuentran asociados no covalentemente a los cidos miclicos y se ubican perifricamente en la pared. Los micolatos de trealosa (llamados factores de cordn porque su presencia produce cultivos que tienen forma de cordones serpenteantes) y sulfolpidos se encuentran principalmente en las cepas de Mycobacterias ms virulentas. El lipoarabinomanano (LAM) es un compuesto que se halla anclado en la membrana citoplasmtica. El LAM es considerado como el equivalente mycobacteriano del lipopolisacrido de las Gram negativas debido a que provoca una 23

importante respuesta antimicrobiana en macrfagos. En las cepas de Mycobacterias ms virulentas la arabinosa terminal del LAM est recubierta con residuos de manosa (manLAM) a diferencia de las cepas no virulentas no estn recubiertas (AraLAM). Adems, el LAM tambin podra servir como poro para el paso de los nutrientes a travs de la pared celular. En la pared celular tambin se encuentran protenas inmunoreactivas que son utilizadas con fines diagnsticos (PPD). El Mycobacterium tuberculosis es el agente etiolgico de la tuberculosis, una enfermedad que primariamente produce lesiones en los pulmones y que puede causar la muerte si nos es tratada en forma adecuada. Existen otras Mycobacterias capaces de producir infecciones en el hombre. El M. bovis tambin causa tuberculosis, mientras que las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no tuberculosas. La lepra es una infeccin causada por el Mycobacterium leprae que es un parsito intracelular obligado que se multiplica lentamente en clulas fagocitarias mononucleares como los histiocitos de la piel y en las clulas de Shwan de los nervios. La tuberculosis es una enfermedad de distribucin mundial pero con consecuencias devastadoras en los pases en desarrollo. En el ao 1993 la Organizacin Mundial de la Salud (OMS-WHO World Health Organization) declar a la tuberculosis una "Emergencia Global". Se estima que un tercio de la poblacin mundial est infectada con el M. tuberculosis, y que en la prxima dcada sern infectadas ms de 300 millones de personas de las cuales 90 millones desarrollarn la enfermedad y 30 millones morirn por ella.
La Tincin de los microorganismos requiere una pared celular en buen estado, el interior de la clula, rico en lpidos conserva el colorante, pero la pared no. La funcin de sta, y el fenmeno de resistencia a los cidos, se debe a la insensibilidad de la pared frente a la accin del aclarador, en este casi el cido. A fin de que el colorante primario, la carbolfucsina, penetre a travs de las cpsulas cerosas de los bacilos acidorresistentes, se requiere de cierto tipo de tratamiento fsico como el calor. El calor favorece la fusin de las ceras por lo que el colorante puede penetrar, luego al dejar enfriar nuevamente las ceras solidifican, de modo que el colorante ya no puede salir. Como el tratamiento es muy enrgico cualquier bacteria que no tenga un alto contenido de lpidos como Mycobacterium y Nocardia perdern el colorante primario durante la decoloracin por lo que se teir con el colorante de contraste que es el azul de metileno. Las bacterias que resisten a la decoloracin por alcohol cido se denominan bacterias cido alcohol resistente (BAAR positivas) y los vemos al microscopio de color rojo y las BAAR negativas las vemos de color azul. Procedimiento en la tincin de Ziehl-Neelsen. Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloracin Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lmpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor peridicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparacin y esperar a que se enfre. Enjuagar con agua de la llave. Cubrir los frotis con alcohol cido por un minuto. Enjuagar con agua de la llave. Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersin

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Fig. 24 Pasos a seguir para la realizacin de la tincin de Zhiel-neelsen TINCIN SELECTIVA DE ESPORAS: Tincin de Shaeffer y Fulton. Una Tincin selectiva tiene por objetivo poner de manifiesto algunas estructuras de la clula bacteriana. Las endosporas son resistentes al calor y difciles de destruir, las bacterias formadoras de endosporas son del gnero Bacillus y Clostridium. Las endosporas son impermeables a los colorantes, por lo que a veces se ven como regiones sin teir dentro de las clulas que han sido teidas Procedimiento en la tincin selectiva de ShaefferFulton Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lmpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor peridicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparacin. Dejar que el frotis se enfre. Lavar con agua de la llave. Cubrir el frotis con safranina por un minuto. Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersin. Diferentes tipos de esporas que podemos observar al microscopio

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Fig. 25 Observacin microscpica de la espora (verde)

Fig. 26 Diferentes tipos de posicin de las esporas En la realizacin de las tinciones podemos tener ciertos errores como son: Edad del cultivo: Un microorganismo Gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismos, si sufre dao en la pared por alguna causa, se vuelve Gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante. Tincin de Gram decolorada: Esto nos ocurre cuando dejamos actuar por ms de 30 segundos el alcohol cetona, entonces la preparacin nos va a resultar un Gram negativa.

Fig. 27 Formas bacterianas

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MICROSCOPIA El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo. Es el instrumento que ms se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminacin se puede hacer visible un objeto microscpico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamao original. Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaos, formas y composiciones distintas, la mayora de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos.

Fig. 27 Tamaos aproximados de clulas y molculas Para poder observar a la clula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen diversas variedades, los cuales estn diseados a lo que pretendemos observar y como ejemplo tenemos a:

Un microscopio ptico Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observacin de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio ms simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mnimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la informacin. La resolucin depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espcimen, la calidad de la fijacin y la intensidad de la coloracin. Tericamente la mxima resolucin que se puede alcanzar es de 0,2 m dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolucin. Existen distintos microscopios pticos generales y de investigacin que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminacin del espcimen, la alteracin fsica de la luz que incide en la muestra y procesos analticos que se aplican a la imagen final.
El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminacin; 2. Sistema ptico y 3. Sistema mecnico. El sistema de iluminacin corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente la preparacin y esta formado principalmente por la lmpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar) El sistema ptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten agrandar la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular. El sistema mecnico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y cambio de las lentes as como el enfoque de la preparacin y esta formado por la base, estativo, tornillos macromtrico y micromtrico, platina, revolver y portarevolver.

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1) Base 2) Botn de encendido 3) Diafragma de campo 4) tornillo micromtrico 5) Tornillo macromtrico 6) Condensador 7) Diafragma de iris 8) Platina 9) Pinzas 10) Brazo o estativo 11) Objetivo de 4X 12) Objetivo de 10X 13) Objetivo de 40X 14) Revolver 15) Tubo del ocular 16) Ocular Fig.28 Fotografa de un microscopio ptico con sus componentes: Funcin bsica de cada parte del microscopio: a.- Sistema mecnico Base. Pieza metlica que sostiene a todo el aparato Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la preparacin, la cual es fijada por dos pequeas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con los tornillos macromtrico y micromtrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas numricas que permiten ubicar fcilmente la posicin de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar la preparacin en forma de cruz (ejes X y Y) para su localizacin. Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos. Tornillo macromtrico. Permite el enfoque mayor. Tornillo micromtrico. Permite el enfoque con precisin. Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular. Revolver. es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto aumento. Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se enva por separado a cada tubo, estos tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una diferente separacin entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala grabada para poder ajustar la distancia y cada persona debe memorizar su valor de apertura interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema mecnico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micromtrico el tubo que tiene el ocular fijo y despus se enfoca el que tiene el ocular mvil, pero en este caso sin mover el tornillo micromtrico, girando el ocular mvil hasta encontrar el foco.

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b.- Sistema de iluminacin Lmpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes caractersticas: 6V, 5-15 W 12 V, 50-100 W Diafragma de campo. Esta situada en la base del microscopio y su funcin es la de regular el dimetro de la emisin de la luz a fin de que se ilumine solo el rea de campo visual, es decir controla la cantidad de luz que atraviesa la preparacin. Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre l y los dirige hacia el plano focal del objeto.

Fig. 29 Esquema de un condensador. 1) Lente frontal, 2) lente auxiliar y 3) diafragma de iris c. Sistema ptico Oculares El ocular es la parte ptica final externa, situados en el tubo a travs de los cuales se obtiene la imagen final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo. Datos importantes grabados sobre la periferia de un ocular: 1) Correccin esfrica (CPL); 2) Ocular de gran campo (W); 3) aumentos (10X); 4) distancia focal amplia (1,8) y 5) Para observacin con gafas. Tubo El tubo es la parte ptica mecnica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser monocular o binocular, adems esta adaptada para poderle colocar una cmara fotogrfica una cmara de televisin. El tubo generalmente esta diseado para trabajar a una distancia mecnica fija entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total. 1.- Smbolo de lentes 2.- Dioptras 3.- Aumento del tubo 4.- Oculares 5.- aumento del ocular 6.- Tubo del ocular

Fig. 30 Vista frontal de los oculares de un microscopio

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Objetivos.- Son lentes que captan la imagen a observar, estn construidos de cristal o fluorita, poseen aumento propio, apertura numrica y esta diseada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillos de colores y nmeros grabados sobre el tubo metlico, que nos permite saber a detalle cuales son sus ventajas, la disposicin de estos caracteres es la siguiente: 1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 2) 2.- El lado superior izquierdo indica el nmero de aumentos 3.- El lado superior derecho la apertura numrica. 4.- El lado inferior la distancia mecnica 5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos 6.- El anillo de color inferior indica en qu medio se hace la inmersin del objetivo (tabla 3) 1.2.3.4.5.6.7.8.Anillo de color superior Aumento de 10X Aumento de 40 X Aumento de 100 X Espesor del cubreobjetos Apertura numrica Aceite de inmersin Anillo inferior

Fig. 31 Informacin contenida en los objetivos: En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el nmero 1, el cual indica que: Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor, 10= No requiere cubreobjetos 0,11 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm. Anillo superior Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento: Tabla 2. Correspondencia entre los aumentos y los anillos de colores grabados Aumentos Color anillo superior 1.0X Negro 2.5 X 4.0 X 6.3 X 10 X 16 X 25 X 40 X 63 X 100X Pardo Rojo Anaranjado Amarillo Verde claro Verde oscuro Azul claro Azul oscuro Blanco

Tabla 3. Colores para el anillo inferior que indican en qu medio se debe hacer la inmersin del objetivo ndice de Color del Carcter Sustancia refraccin anillo Oil Aceite 1.515 Negro W Agua 1.333 Blanco Glyz Glicerina 1.455 Anaranjado Metileno Yoduro de 1.740 Amarillo metileno

Aumentos totales: El nmero total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el nmero de aumentos que tiene el ocular por el nmero de aumentos que tiene el tubo y por el nmero de aumentos que tiene

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el objetivo con el que se esta observando. Distancia mecnica: Se llama distancia mecnica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecnica se mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de nuestro microscopio es de 160 mm. Poder de resolucin: El poder de resolucin de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos puntos muy cercanos entre s y que puedan verse separada. El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio ptico de 0,2 y el microscopio electrnico de 6 ngstrom. Apertura numrica:

Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del condensador o del objetivo. Microscopio de contraste de fase Permite observar clulas sin colorear y resulta especialmente til para clulas vivas. Este aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las distintas partes de una clula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor ndice de refraccin experimenta una deflexin y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos pticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porcin fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste til sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espcimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados. La resolucin de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partculas individuales ms pequeas en las imgenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es til para observar autorradiografas, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sfilis.
Cada uno de los microscopios tiene una funcin determinada, en este y en este caso este tipo de microscopio utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, adems en este tipo de microscopio tambin se realiza la tcnica de iluminacin de Khler.

Figura 32 Diafragma de iris de un microscopio de contraste de fases, microscopio auxiliar y filtro verde Microscopio estereoscpico

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Son aparatos con poca capacidad de amplificacin, pero muy tiles para observar especimenes ms grandes que los que se pueden observar con un microscopio ptico

Microscopio de fluorescencia la muestra se tie con una sustancia fluorescente que absorbe la energa de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas ms largas (verde). Se utiliza en inmunofluorescencia, tcnica en la cual una sustancia fluorescente se une a un anticuerpo especfico de ciertos microorganismos. Si el anticuerpo fluorescente se une al microorganismo, este microorganismo emite fluorescencia y se puede identificar. Microscopio de luz ultravioleta La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorcin de esa luz por las molculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una resolucin de 0,1 m. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un espectrofotmetro pero sus resultados son registrados en fotografas. La muestra no se puede observar directamente a travs del ocular porque la luz ultravioleta puede daar la retina. Microscopio de polarizacin Este microscopio es una simple modificacin del microscopio ptico, contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador entre el objetivo y el observador. Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ngulos de rotacin se usa para determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidad que tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz polarizada se denomina birrefringencia. Exhiben birrefringencia el msculo estriado o esqueltico y las inclusiones cristaloides de las clulas intersticiales testiculares. Microscopio electrnico Los microscopios electrnicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les permite tener un poder de resolucin muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750 nm; violeta - rojo). Es posible con el microscopio electrnico resolver objetos separados por una distancia de 0,003 m, comparado con los 0,25 m de uno ptico. Los aumentos pueden llegar a ser de un milln de veces. A causa de la naturaleza de este instrumento slo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo que, para preparar muestras para el microscopio electrnico se necesitan tcnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las clulas primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o acetona). Despus de la deshidratacin, la muestra se incluye en una resina y es aqu donde se realizan cortes finos con un ultramicrotomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola clula bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas. Si slo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas por lo que se montan clulas enteras que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El haz de electrones es dirigido sobre la preparacin y los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de observacin produciendo una imagen. A la primera tcnica se la denomina Microscopa Electrnica de Transmisin (MET) y a la segunda Microscopa Electrnica de Barrido (MEB). 32

Microscopio electrnico de barrido Se asemeja ms que al microscopio electrnico de transmisin a los tubos de televisin de donde deriva la microscopia electrnica. Para analizar la mayora de los tejidos se deja la muestra, se deshidrata por desecacin de punto crtico, se cubre con una pelcula evaporada de oro-carbn, se monta en un taco de aluminio y se coloca en la cmara de muestras del microscopio. En los tejidos mineralizados es posible eliminar todos los tejidos blandos con una leja y analizar las caractersticas estructurales del mineral. Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de electrones a travs de la superficie un tubo de televisin. Los electrones reflejados desde la superficie y los electrones forzados hacia el exterior de la superficie son captados por uno o ms detectores y reprocesados para formar una imagen tridimensional en un televisin. Se pueden tomar fotografas para registrar los datos o la imagen en una cinta de video. Muchos microscopios combinan las caractersticas de un microscopio electrnico de transmisin y de barrido, el cual permite microanlisis porrazos X con sonda electrnica. Se pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos X emitidos cuando el haz de bombardea el corte histolgico, y mediante analizadores apropiados se construye un mapa que muestra la distribucin en los cortes de los elementos que tienen nmero atmico mayor de 12, en concentracin suficiente para producir rayos X en cantidad tal que se pueda analizar
El microscopio es un instrumento ptico que se emplea para obtener imgenes amplificadas de pequeas estructuras que no son posibles verlos a simple vista. Cuidado y limpieza del microscopio Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos: a.- Para limpiar la parte ptica, se elimina primero las partculas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente. b.- Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y an el cemento de las molduras y los objetivos compuestos, por lo no se deben usar. c.- Las guas mecnicas deben mantenerse lubricadas. Se enlistan algunos compuestos recomendados slo para ciertas partes del microscopio. a.- Espuma de jabn suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos b.- Agua destilada con algn detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la ptica. c.- Solucin para limpiar la ptica.- etanol al 40 %, ter al 20 %, para limpiar superficies de la ptica o remover residuos de aceite de inmersin. TCNICA DE ILUMINACIN SEGN KHLER A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lmparas de filamento espirilado, Khler propone un mtodo que actualmente es utilizado. Su iluminacin comporta dos diafragmas: un diafragma denominado de campo, situado generalmente a nivel de la lmpara colectora y un diafragma llamado de abertura, situado generalmente debajo del condensador. Pasos a seguir para la iluminacin de Khler. 1.- Luz amarilla (bajo voltaje) 2.- Ajustar la distancia interpupilar 3.- Ajustar las dioptras 4.- Abrir el diafragma de campo e iris Tabla No. 4 Pasos a seguir para la iluminacin de Khler en un microscopio

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6.- Enfocar la preparacin con el objetivo 4X o 5- Subir completamente el condensador con la lente frontal introducida 10X y utilizando micromtrico los tornillos macro y

7.- Observar y cerrar el diafragma dispuesto en el pie del microscopio

8.- Bajar algo el condensador, hasta obtener mxima nitidez de la imagen del diafragma

9.- Centrar el diafragma de campo luminoso en el campo visual, recurriendo a los dos tornillos del condensador

10.- Abrir el diafragma de campo luminoso casi hasta el borde del campo visual, centrando con exactitud y abrirlo hasta que desaparezcas detrs del borde del campo visual.

11.- Regular el contraste de la imagen con ayuda del diafragma del condensador.

12.- Insertar el filtro azul, regular la intensidad de la luz con el control del voltaje.

13.- A cada cambio de objetivo: enfocar con el micromtrico y contrastar con el diafragma del condensador.

14.- Al utilizar objetivos panormicos de bajo aumento rebatir la lente frontal del condensador sin alterar su altura.

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PREPARACIN DE MATERIAL PARA SER UTILIZADO EN MICROBIOLOGA La esterilizacin se conoce como un proceso de destruir a todos los microorganismo de una superficie, existen varios mtodos fsicos y qumicos de esterilizacin, para seleccionar el ms adecuado es necesario conocer la naturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de esterilizacin. AGENTES FSICOS Calor hmedo: La aplicacin de calor es el mtodo ms simple para esterilizar un material, a condicin de que no sufra dao en s mismo. Una temperatura de 100 C matar a todas las formas vegetativas, pero no las esporas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 C, 15 minutos y 15 libras de presin. Generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente cuando se encuentran hmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del recipiente. Calor seco: Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos elctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una temperatura de 160 170 C durante una h. Para ambos tipos de calor aplicadas en los tiempos ya mencionados el calor acta desnaturalizando las protenas y los cidos nucleicos de la clula y fragmentando las membranas celulares. Flameo: La llama es un agente esterilizador eficaz, y el ms simple de todos. Es frecuentemente utilizado para esterilizar el asa bacteriolgica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biolgico, pues ste podra saltar diseminndose partculas infectantes. A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bistur o pinzas, se puede esterilizar el material mojndolo con alcohol y encendindolo ste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilizacin completa. El mtodo es rpido pero produce carbonizacin y prdida del filo.

Fig. 33 Autoclave para esterilizar por calor hmedo, horno para esterilizar por calor seco y flama del mechero para incineracin.

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Fig. 34 Olla de presin con manmetro para verificar la presin de esterilizacin Radiaciones ionizante y no ionizante: La radiacin ultravioleta provoca dao en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucletidos, formando dmeros pirimidnicos, las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles. Pueden emplearse tambin ondas supersnicas o ultrasnicas para romper o desintegrar a la clula. Filtracin a travs de Membranas Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor hmedo o seco pues son termolbiles, es decir que se desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas de filtracin de membranas para retener a los microorganismos. Aqu debemos de conocer las dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (dimetro) Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado, asbesto o esteres de celulosa, para el caso de los filtros de la marca Millipore se utiliza como bioindicador a Pseudomonas diminuta para filtros con un dimetro de poro de 0,45 m

Fig 35 Filtro (Millex) y Swinnex para filtracin a travs de membrana.

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Fig. 36 Diferentes tipos de filtro MTODOS QUMICOS Gases (oxido de etileno) y lquidos (formaldehdo y propiolactona) Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgeno lbiles como los que tiene grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria farmacutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plstico, equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y adems cancerigeno, por lo que se suministra normalmente con una concentracin entre el 10 y el 20 % de CO2. La concentracin de xido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad de esterilizacin. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 C o de 3 a 4 h a 54C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentracin de oxido de etileno es de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el oxido de etileno residual porque es muy txico. La -propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva despus de varias h y, por ello, no es tan difcil de eliminar. Destruye a los microorganismos ms rpidamente que el oxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser cancergena. Mtodos bacteriolgicos para verificar las tcnicas de esterilizacin. En todo lugar en donde se realice esterilizacin se debe de contar con indicadores de calidad que manifiesten que la esterilizacin se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estril, para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta.

Mtodo de la tira de papel Existen en el mercado tiras impregnadas con esporas de Bacillus stearothermophylus se presentan en una envoltura con dos compartimientos. En el primero est la tira testigo, que se ha esterilizado (testigo negativo) y en el otro compartimiento se encuentran dos tiras, una de las tiras se saca (problema y testigo positivo) y se coloca en un recipiente que se va a esterilizar en la forma habitual. Luego las tiras se vuelven a su compartimiento correspondiente y se incuban por 7 das a 55 C en caldo de soya y tripticasena. Las esporas sobre las tiras testigos se desarrollan, pero si la esterilizacin no fue la correcta habr desarrollo en la tira testigo.

Fig. 37 Muestra de una tira de esporas utilizada para diferentes tipo de esterilizacin Mtodo de la ampolleta:

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Son ampolletas que contiene una suspensin de Bacillus stearothermophylus en medio de cultivo. La temperatura ptima para el desarrollo de este microorganismo se encuentra entre 50 y 65C; dentro del medio lquido se encuentra un indicador que es el prpura de bromocresol. Al utilizarla se debe colocar la ampolleta en el interior del compartimiento que va a esterilizar el material, despus de terminar la esterilizacin, las ampolletas (sin abrir) se incuban entre 55 y 65 C durante 24 h, el enturbamiento y la aparicin de un color amarillo indica una esterilizacin defectuosa, en cambio si el color permanece igual durante varios das de incubacin el equipo esta funcionando bien. Debe llevarse el control constituido por una ampolleta que no se pone en el equipo, incubada en las mismas condiciones, debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo.

Fig. 38 Diferentes formas de comprobar la esterilizacin NOTAS: -Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente. -El material (pipetas o cajas de Petri) utilizado con suspensiones microbianas o con medio de cultivo, nunca se esterilizan por calor seco -Si existe material que ha estado en contacto con cultivo de microorganismos, ste debe ser esterilizado en autoclave a 121 oC, 1,05 atm de presin durante 15 minutos - Recolectar los desechos del material esterilizado en bolsas de plstico de alto punto de fusin para su posterior desecho PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN Lavado de material de vidrio e instrumental a).Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el material plano y el instrumental metlico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando dextran. b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente. PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO TUBOS DE ENSAYO a) Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodn siguiendo las indicaciones del profesor b) Colocar los tubos en un bote de lmina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.

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Fig. 39 Formas de preparacin de tubos de ensaye para esterilizacin por calor seco y hmedo CAJAS DE PETRI a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, nmero de equipo de laboratorio y grupo.

Fig. 40 Pasos a realizar para preparar cajas de Petri para ser esterilizado por calor hmedo PIPETAS a) Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy compactado, utilizar para ello una aguja de diseccin o un clip b) Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodn c) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con maskingtape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el nmero de equipo de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.

Fig. 41 Pasos a realizar para la preparacin de pipetas para ser esterilizadas por calor humedo.

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MATRACES a) Colocar en la boca de cada matraz un tapn compacto de algodn, envuelto con gasa, siguiendo las instrucciones del profesor. b) Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente ms grande que el tapn de algodn. c) En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No anotar los datos sobre el gorro de papel.

Fig. 42 Colocacin del tapn de algodn al matraz y gorro de papel Kraf para matraz para ser esterilizado por calor hmedo PINZAS Y TIJERAS a) Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lpiz sealar con una flecha la punta. b) Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.

Fig. 43 Preparacin de pinzas o tijeras para ser esterilizado por calor hmedo PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN POR CALOR SECO TUBOS DE ENSAYE a) Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metlica. b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape. CAJAS DE PETRI a) Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posicin invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MTODO MATERIAL CONTAMINADO) b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el nmero de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha. Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.

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Fig. 44 Cilindro de acero inoxidable para esterilizar cajas de Petri PIPETAS a) Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy compactado. b) Flamear las boquillas en la flama del mechero a fin de eliminar el exceso de algodn, antes colocar en el interior un poco de papel aluminio para evitar que las pipetas se despunten en el momento de introducirlas. c) Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas. d) Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la tira entre la tapa del cilindro pipetero.

Fig. 45 Cilindro de acero inoxidable para esterilizar pipetas MATRACES a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio. b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetndolo con masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble.

Fig. 46 Formas de esterilizar matraces vacos

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PINZAS Y TIJERAS a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera. b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura

Fig. 47 Envoltura en papel aluminio de objetos metlicos sin filo En la actualidad se utilizan pipetas automticas para pipetear las suspensiones microbianas, soluciones y reactivos, por lo que se tienen que esterilizar solo las puntas.

Fig. 48 Utilizacin de pipetas automticas.

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PREPARACIN DE DILUCIONES La utilizacin de la norma en nuestro laboratorio es la de proporcionar las guas generales para la preparacin de diluciones para el examen microbiolgico de alimentos. En vista de la gran cantidad de productos en este campo de aplicacin, estas guas pueden ser inapropiadas para todos ellos en forma detallada y para otros requerirse otros mtodos diferentes. Sin embargo en todos los casos donde sea posible se recomienda apegarse a estas guas y modificarse nicamente cuando sea necesario. La dilucin primaria tiene por objeto obtener una distribucin lo ms uniforme posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el anlisis. La preparacin de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el nmero de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, despus de la incubacin, la observacin de la prueba en el caso de tubos y la cuenta de colonias en el caso de placas. Definiciones Para nuestro trabajo tenemos que: 1.- Dilucin primaria, es la suspensin o emulsin obtenida despus de pesar o medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarda con una cantidad de nueve veces en proporcin de diluyente. 2.- Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la dilucin primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repeticin de esta operacin con cada dilucin as preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculacin de medios de cultivo. Procedimiento 1 Preparacin de la dilucin primaria. 1.1 A partir de muestras lquidas: Para muestras lquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribucin de microorganismos es homognea o fcilmente homogeneizable por medios mecnicos (agitacin, etc.). Para muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo en bao de agua de 40 a 45C un tiempo mximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. Para la parte lquida de una muestra heterognea la cual sea considerada suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales). 1.1.1 Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a sta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. 1.1.2 Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alcuotas mayores, por ejemplo volmenes de 10 u 11 ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describi anteriormente 1.2 A partir de muestras slidas o semislidas. Las muestras slidas y semislidas congeladas, deben descongelarse en refrigeracin de 4 a 8C durante 18 horas y no ms de 24 horas antes de proceder a su anlisis. 1.2.1 Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plstica estriles de tamao adecuado. 1.2.2 Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra. 1.2.3 Operar la licuadora de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensin completa y homognea para cada alimento. An en los equipos ms lentos, este tiempo no debe exceder de 2 a 5 minutos, tambien podemos utilizar un Stomacher.

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Figura 49 Stomacher para disgregar una muestra slida 1.2.4 Permitir que las partculas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de las capas superiores de la suspensin. Cuando la dilucin primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar ms diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o en la expresin de resultados. 2.2 Preparacin de las diluciones decimales adicionales. 2.2.1 Transferir 1 ml o un mltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilucin primaria 1 + 9 (10-1), en otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. 2.2.2 Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se menciono anteriormente. 2.2.3 La seleccin de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del nmero esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de anlisis previos y de la informacin que se obtenga del personal de inspeccin que la haya colectado. En ausencia total de informacin, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta. 2.2.4 Utilizar una pipetas para cada dilucin inoculando simultneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta. 2.2.5 Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de lquido equivalente a su capacidad total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en una rea de la caja Petri sin lquido. 2.2.6 Mientras se afora el lquido de la pipeta, la punta de sta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posicin vertical, para lo cual este ltimo debe inclinarse lo necesario. En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0,1 ml o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores. El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el nmero de microorganismos esperado es: Para la tcnica del nmero ms probable utilizar tres tubos, donde sea posible demostrar el microorganismo en 10 ml de la dilucin ms alta. Para la tcnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un mnimo de una de tres diluciones en el mtodo de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el caso de otros grupos microbianos, considerar el nmero especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana correspondiente. 2.3 Duracin del procedimiento. En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del anlisis y stas deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparacin.

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Fig. 50 Esquemas que muestras las diferentes formas de realizar las dilcuiones La finalidad en la realizacin de diluciones es encontrar conteos en la placa para bacterias de 25 a 250 UFC/ml y para mohos y levaduras de 10 a 150 UFC/ml

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Fig. 51 Placas que muestran la conveniencia de realizar diluciones

Fig. 52 Placa que muestra el intervalo de lectura para mohos que es de 10 a 150 UFC y para bacterias de 25 a 250 UFC

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS El aislamiento de un microorganismo para obtener un cultivo puro se realiza principalmente en un medio slido. Se inicia por la separacin de una sola clula a partir de una poblacin y requiere tambin que la colonia que surja de esta clula se mantenga separada de otras clulas o colonias. El aislamiento de un cultivo puro puede hacerse tambin en medios lquidos, siempre que el organismo predomine en el material de partida. Por una dilucin en serie de la suspensin en un medio se consigue que en la ltima dilucin se encuentren unas cuantas que al ser sembradas quedarn separadas. En la naturaleza generalmente existen poblaciones mixtas de microorganismos, y entre ellas se establecen interrelaciones, estas se basan en la competencia por el sustrato comn, la tcnica utilizada y el tipo de medio seleccionado dependen de la naturaleza de la investigacin, en general podemos tener: a) se puede necesitar tener una cosecha de clulas; b) puede ser necesario determinar el nmero y tipos de microorganismos presentes en una muestra o c) se puede aislar un tipo particular de microorganismos de una fuente natural. La siembra en placas, con una serie de condiciones, de una muestra del material, permitir producir colonias a un grupo seleccionado de formas, pero har que muchos otros tipos pasen inadvertidos. Por esta razn es costumbre sembrar en placas muestras del material usando tantos medios y condiciones de incubacin diferentes como sea posible. El sembrado en placa en un medio slido nos proporciona clulas inmviles o dentro del medio, las cuales estarn separadas y de ah los podremos tener en un tubo con agar inclinado para su conservacin. Cultivo puro Se entiende por cultivo puro a la descendencia (clon) de una sola clula, generalmente lo realizamos para poder estudiar las siguientes propiedades. a.- Aislamiento por estra simple para muestras con poca cantidad de microorganismos

Fig. 53 Placas con agar nutritivo y agar eosina azul de metileno (urocultivo) b.- Aislamiento por estra cruzada Inocular con el asa la placa y realizar las estras tal y como se muestra en el siguiente esquema

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Fig. 54 Siembra por estra cruzada en un medio selectivo y en un medio no selectivo. En ocasiones existen microorganismos que por poseer muchos flagelos invaden la capa y nos losp odemos asilaren ese medio, tal es el caso de Proteus en el medio agar sangre.

Fig.55 Placas de agar sangre sembrada por estra cruzada, en la segunda placa se puede observar el crecimiento invasivo de un microorganismo mvil. c.- Aislamiento por extensin con varilla Para el asilamiento de bacterias, mohos y levaduras podemos realizar la tcnica de extensin con varilla, donde el inculo sobre la placa con el medio es de 0,1 ml. La tcnica consiste en colocar el inculo sobre el medio de cultivo, posteriormente se toma una varilla de vidrio o de acero inoxidable del que tenga la longitud del dimetro de la placa de Petri Esta varilla se introduce en un frasco con alcohol y se flamea a la flama del mechero por lo menos tres veces para esterilizarla, se deja enfriar y se esparce el inoculo sobre la superficie del agar Se deja en posicin vertical derecha por 5 minutos, y se incuba

Fig. 56 Extensin con varilla d.- Aislamiento por la tcnica de vaciado en placa 1.2.Colocar 1 mL de la dilucin que le indiquen en una caja de Petri y realizar el procedimiento por duplicado. Agregar de 15 a 20 ml de agar cuenta estndar, mantenido a 45C.

3.Homogenizar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en el sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin del inoculo en el medio, cuidar que el medio no moje la cubierta de la caja. 4.El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

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5.Dejar solidificar el medio e incubar a 35 C por 24 horas o si es necesario hasta las 48 horas, para el caso de bacterias y para el caso de los mohos y levaduras de 3 a 5 das. 6.Para el caso del Agar de papa y dextrosa se debe de acidificar el medio mediante la adicin de 1,4 ml de cido tartrico al 210 % esterilizado por filtracin a cada 100 ml de medio para que el pH sea de 3,5, este procedimeitno se debe realizar cuando el medio este a 45C y ahora si se puede utilizar.

Fig. 57 Vaciado en placa Los movimientos rotatorios tienen por objetivo la distribucin homognea del inoculo, claro esta que con la ayuda de las diluciones de tal forma que el recuento para bacterias sea de 25 a 250 Unidades Formadoras de colonias (UFC)y para mohos y levaduras de 15 a 150 UFC En algunos casos el aislamiento lo podemos hacer directamente en un medio selectivo, pues lo que deseamos es ver la produccin de un metabolito, por ejemplo para el aislamiento de microorganismos productores de amilasas se utiliza el medio denominado agar almidn.

Fig. 58 Aislamiento de cepas silvestres mediante medios selectivos, por medio de halos de inhibicin, produccin de amilasas o produccin de hidrlisis El aislamiento nos sirve para obtener la morfologa colonial, microscpica y observar alguna caracterstica como hidrlisis o hemlisis. A. MORFOLOGA COLONIAL Morfologa colonial en placa para bacterias Una vez sembrada la placa la descripcin de cada una de las colonias debe incluir: 1. TAMAO: Dimetro en mm, los lmites de tamao de las colonias varan desde fracciones de milmetros hasta 10 mm de dimetro. La mayora de los microorganismos forman colonias de tamao limitado al tiempo de incubacin.

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2. FORMA: Es la apreciacin general de su figura la cual puede ser:

3.- ELEVACIN: Que puede ser:

Fig. 59 esquemas de diferentes formas y elevaciones en una colonia 4. BORDE O MARGEN: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser: Entero, ondulado, Lobulado, crenado, filamentoso o rizado.

Fig. 60 Esquema de algunos bordes que puede presentar una colonia. 5. COLOR: Blanco, amarillo, negro, marrn, anaranjado, etc.

Fig. 61 Colonias de diferentes colores 6. SUPERFICIE: Lisa o rugosa 7. ASPECTO: Hmedo, seco, algodonoso, pulverulento, aterciopelado, velloso, granuloso 8. CONSISTENCIA: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura, esta prueba se tiene que realizar con la ayuda de una asa. 9. LUZ REFLEJADA: Las colonias pueden ser brillantes o mate 10. LUZ TRANSMITIDA: Las colonias pueden ser translcidas o transparentes

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Fig. 62 Colonias con morfologias coloniales diferentes, durante el aislamiento

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CULTIVO DE MICROORGANISMOS Tanto en los cultivos estticos como continuos pueden establecerse condiciones definidas, y pueden determinarse sucesiones de distintos organismos y acumulaciones de productos metablicos. A partir de aqu pueden extraerse los productos producidos por los microorganismos. Los cultivos mixtos pueden obtenerse tambin por la unin de cultivos puros, tal es el caso de las cepas que producen el Yogurt. En ocasiones es muy difcil cultivar a los microorganismos sobre todo los parsitos y creciendo en un medio artificial, sin embargo se han ideado medios adecuados reproduciendo cuidadosamente las condiciones en el que el microorganismo se encuentra en su medio natural, estos parmetros son el pH, tensin de oxgeno, temperatura, los nutrientes, etc. Para los requerimientos de sales minerales y factores de crecimiento al medio se le adiciona extractos de algn tejido, yema de huevo, sangre, plasma, etc. Una vez recibida la muestra es necesario seleccionar el medio de cultivo primario adecuado para el tipo de muestra, determinarle la temperatura de incubacin, condiciones de anaerobiosis o aerobiosis para su desarrollo. Actualmente se recomienda usar slo medios enriquecidos y la realizacin de una coloracin de Gram del aislamiento para la seleccin de otros medios para la identificacin del microorganismo. La mayora de los microorganismos crecen a 35 C 2 C, el crecimiento de la mayora de los microorganismos se ve potenciado por una atmsfera de 5 10 % de CO2, pero si slo se tiene una incubadora de aire ambiental se puede mantener los cultivos es jarra de anaerobiosis. Cultivo en placa Petri Se conoce como cultivo en medio slido a la que se hace en una caja Petri o tubo de ensaye con medio slido inclinado. Cuando es en placa puede ser por estra cruzada, por estra simple o estra masiva esto depende del objetivo del cultivo. Cuando es por estra masiva se puede sembrar por medio de un hisopo, donde el inculo se esparce minuciosamente en ngulos rectos respecto de la estra primaria, luego la placa se gira 90, y el inculo se esparce para cubrir toda la superficie. En ocasiones cuando se tienen muestras con poca carga microbiana y utilizando un medio selectivo se puede sembrar por estra simple, es ms el mtodo se puede volver cuantitativo si se utiliza una asa calibrada de 0,01 ml de volumen y la forma de sembrar es la siguiente.

Fig. 63 Esquema de la estra simple

Fig. 64 Placa A estra simple, Placa B y C estra masiva y Placa D estra cruzada.

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Siembra en tubos de cultivo con medio slido Las siembras en tubos con medio slido, por lo general se emplean para la conservacin de un cultivo puro proveniente de una placa o para la siembra de pruebas bioqumicas como el medio OF, SIM y MIO. El pico de flauta del medio agarizado se inocula primero por puncin (cuando es necesario), seguido por una estra en el pico de flauta desde el fondo a la parte superior con un movimiento en S a medida que se retira el asa.

Fig. 65 Cultivo en medio slido vertical, esquema del cultivo por picadura y en estra simple en agar slido inclinado Existen dos variedades de cultivo en tubo: Por estras Se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia con el asa estril y sobre la superficie del medio se desliza sta en forma de estras. Por picadura Se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado en forma inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picndolo longitudinalmente. Cultivo por punto Esta tcnica de cultivo, generalmente se utiliza cuando necesitamos una gran cantidad del moho.

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Fig. 66 Cultivo en medio slido (placa) y en medio slido (tubo). CULTIVO EN MEDIO LQUIDO Siembra en medios de cultivo lquidos. La siembra en tubos de cultivo en medio lquido, el tubo debe inclinarse en un ngulo de 30 y el asa de inoculacin debe tocar la superficie interna del vidrio, justo encima del punto donde la superficie del agar forma un ngulo agudo. Cuando el tubo es vuelto a su posicin vertical, el rea de inoculacin queda sumergida debajo de la superficie, se puede agitar suavemente el asa en el interior del medio lquido.

Fig. 67 Esquema del sembrado de un cultivo lquido. El crecimiento de los mohos es diferente si este es agitado o no, debido a que la mayora de los mohos son aerobios cuando no son agitados tienden a crecen como una nata sobre la superficie del medio, por lo tanto cuando necesitamos algn metabolito, es necesario la agitacin y esta debe ser regulada para evitar la poca produccin de pellets, pues eso disminuye la superficie de contacto. El medio de cultivo de mohos cuando esta bien sembrado se ve translucido, sin embargo cuando un medio de este tipo esta contaminado con bacterias se pone turbio.

Fig. 68 Cultivo en medio liquido en matraz para mohos en agitacin y sin agitacin

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Fig. 69 Cultivo de mohos en agitacin a diferentes revoluciones por minuto

Fig. 70 Pellet de un moho en donde el medio esta contaminado Medio de cultivo con un moho en agitacin el cual esta contaminado, en la fotografa se nota un pequeo crecimiento de un moho, adems de que el medio esta turbio. Para la obtencin de metabolitos o para la realizacin de una cintica es necesario utilizar una agitadora como se muestra en la figura siguiente.

Fig. 71 Agitadora En la naturaleza existen microorganismos que llevan a cabo la respiracin anaerobia en la cual no interviene el oxgeno, sino que se emplean otros aceptores finales de electrones, muy variados, generalmente minerales y, a menudo, subproductos del metabolismo de otros organismos. Un ejemplo de aceptor es el SO42- (anin sulfato), que en el proceso queda reducido a SH2: Para cultivar a los microorganismos anaerbicos se utilizan varios mtodos debido a que hay microorganismos anaerobios estrictos y otros micoraerofilicos y los mtodos ampliamente utilizado son el cultivo en estufa con atmsfera de CO2 controlado o la jarra de anaerobiosis, en donde se introducen los tubos o placas y

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posteriormente se coloca un sobre al que previamente se le ha cortado una esquina y se le ha adicionado 10 ml de agua destilada con una pipeta y se cierra inmediatamente. -El sobre contiene una pastilla de borohidruro de sodio y otra de carbonato de sodio para generar H2 y CO2 - La jarra se puede meter a la incubadora sin riego de sufrir dao alguno, pues esta hecha de policarbonato -Se puede colocar un indicador para verificar si existen condiciones de anaerobiosis -El indicador utilizado para que se efectu la reaccin es el paladio El bioindicador para verificar la las condiciones de anaerobiosis es: Testigo de crecimiento aerbico es: Micrococcus luteus ATCC 9341 Testigo de crecimiento anaerbico es: Clostridium novii ATCC 9690

Fig. 71 Jarra de anaerobiosis y sobre Gas Pak

CULTIVO DE BACTERIAS EN MEDIO SEMISLIDO

Fig. 68 Cultivo en medio semislido en SIM y OF Interpretacin de los cultivos: La interpretacin de los cultivos primarios luego de la incubacin requiere de habilidad y experiencia, esta valoracin es realizada anotando las caractersticas y el nmero relativo de cada tipo de colonia recuperada en el medio de cultivo, por la determinacin de la pureza, la coloracin de Gram, la morfologa de la colonia y la observacin de los cambios en el medio que rodea la colonia, el cual refleja la actividad metablica del organismo. La inspeccin se lleva a cabo sosteniendo la placa en una mano y observando la superficie del agar para detectar el crecimiento, durante el examen las placas deben ser viradas en distintas direcciones bajo una iluminacin brillante y directa, de modo que la luz se refleje en distintos ngulos, se puede utilizar un contador de colonias para tener mejor iluminacin. Los olores producidos por la accin de ciertas bacterias sen el medio pueden ser tiles para la identificacin tentativa de los microorganismos por ejemplo. Pseudomonas: zumo de uva, Algunas especies de Proteus. Chocolate quemado, especies de Corynebacterium, aroma frutal, Nocardia y Streptomyces: stano mohoso, y especies de Clostridium. Fecal, ptrido. Algunas de las caractersticas a observar son las siguientes:

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Tipos de crecimiento:

Produccin de pigmentos

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Mediante la evaluacin de las caractersticas de las colonias descritas y la accin en el medio, se puede hacer una identificacin preliminar de las diferentes bacterias aisladas en un cultivo primario. Estas caractersticas son tiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para completar la identificacin de los microorganismos. NOTA: -Para cultivar a los microorganismos anaerbicos se utiliza una jarra de anaerobiosis, en donde se introducen los tubos o placas y posteriormente se coloca un sobre al que previamente se le ha cortado una esquina y se le ha adicionado 10 ml de agua destilada con una pipeta y se cierra inmediatamente. -El sobre contiene una pastilla de borohidruro de sodio y otra de carbonato de sodio para generar H2 y CO2 - La jarra se puede meter a la incubadora sin riego de sufrir dao alguno, pues esta hecha de policarbonato -Se puede colocar un indicador para verificar si existen condiciones de anaerobiosis -El indicador utilizado para que se efectu la reaccin es el paladio El bioindicador para verificar la las condiciones de anaerobiosis es: Testigo de crecimiento aerbico es: Micrococcus luteus ATCC 9341 Testigo de crecimiento anaerbico es: Clostridium novii ATCC 9690

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