A UTILIZAO DE MARCADORES GENTICOS ASSOCIADOS DEFINIO DE TRAOS FENOTPICOS PARA IDENTIFICAO HUMANA NA PRTICA FORENSE Diana S Wanderley de Souza

a Lima1 (1) Bacharel e Licenciada em Cincias Biolgicas pela Universidade de Braslia e aluna do Curso de Especializao em Biocincias Forense pela Universidade Catlica de Gois. dianaswsl@gmail.com Silviene Fabiana de Oliveira2 (2) Orientadora doutora em Cincias, rea de concentrao em Gentica, pela Universidade de So Paulo.

INTRODUO Marcadores genticos so regies do genoma que apresentam variabilidade de sequncia nucleotdica entre diferentes indivduos, isto , apresentam polimorfismo gentico, situao na qual o alelo mais frequente encontrado em at 99% dos cromossomos numa determinada populao (SAITOU, 1995). A utilizao desses marcadores na identificao humana tem sido aprimorada pelo desenvolvimento de novas tecnologias de anlise do DNA e pela descoberta de inmeros marcadores de relevncia para o contexto forense (BUDOWLE e VAN DAAL, 2008; PULKER et al., 2007). As atuais tcnicas de identificao empregadas na prtica forense utilizam marcadores que no esto relacionados a nenhuma caracterstica ou trao fenotpico (MORLING, 2003; MOREIRA et al., 2003). So fortemente baseadas em procedimentos comparativos, atravs dos quais o perfil gentico obtido de amostras coletadas em locais de crimes comparado com o perfil gentico de potenciais suspeitos ou de um banco de dados, quando existente (KAYSER e SCHNEIDER, 2009). Dessa forma, situaes em que no h suspeitos ou testemunhas, ou um banco de perfis genticos disponvel como o caso do Brasil, onde a legislao ainda no permite o armazenamento dessas informaes , o alto poder de individualizao alcanado com as tcnicas de DNA torna-se limitado e insuficiente. Marcadores genticos que estejam relacionados a algum trao ou caracterstica fenotpica tm recebido crescente ateno da comunidade cientfica por serem valiosas ferramentas para auxiliar a identificao de indivduos em casos em que no h perfis

genticos de referncia para comparao. Nessas situaes, a inferncia dos traos fenotpicos baseada nesses marcadores proporciona o direcionamento da investigao criminal por permitir a excluso de indivduos que no se encaixam no perfil fenotpico obtido da amostra questionada e, assim, reduzir o grupo de potenciais suspeitos a serem investigados. Os traos fenotpicos mais promissores para a identificao forense so aqueles relacionados pigmentao, em especial pigmentao da pele, dos olhos e dos cabelos, por serem caractersticas muito marcantes, de fcil visualizao e constiturem um dos fentipos mais variveis na populao humana (JABLONSKI e CHAPLIN, 2000; KAYSER e SCHNEIDER, 2009; PARRA, 2007; STURM et al., 2001). O desenvolvimento de tcnicas quantitativas para mensurar a pigmentao proporcionou uma maior objetividade na classificao da ampla variao de pigmentao existente, permitindo identificar de forma mais precisa os genes que de alguma forma exercem influncia sobre essa caracterstica (JABLONSKI, 2004). A investigao de genes candidatos ao controle da pigmentao pode ser feita de forma direta ou indireta (GRAHAM, 2008). A abordagem direta consiste em se identificar os genes e alelos diretamente responsveis por determinadas variaes fenotpicas na pigmentao e pode ser realizada atravs de estudos de associao que envolvem centenas de indivduos e milhares de marcadores (KAYSER e SCHNEIDER, 2009). Por outro lado, a abordagem indireta realizada atravs da inferncia da ancestralidade do indivduo e, a partir disso, de sua provvel aparncia fsica. Nesse caso, no possvel definir com exatido os traos fenotpicos do indivduo questionado, mas o conhecimento de sua contribuio gentica ancestral permite, em teoria, limitar o rol de indivduos a serem investigados. Para essa abordagem, so utilizados marcadores que permitem traar a histria gentica das diferentes populaes por apresentarem diferenciais de frequncia allica entre as populaes definidas geogrfica ou etnicamente, sendo, por isso, denominados marcadores informativos de ancestralidade AIMs (SHRIVER et al., 1997). Apesar de ser promissora a utilizao de marcadores genticos de traos fenotpicos na identificao humana para fins forenses, a descrio de genes e do mecanismo pelo qual influenciam a definio das caractersticas fenotpicas de difcil elucidao, uma vez que essas caractersticas apresentam um padro de herana complexa por serem determinadas por mltiplos genes polignica e sofrerem forte influncia do meio ambiente multifatorial (STURM e LARSSON, 2009). No obstante, estudos

demonstram que a base gentica da variao normal da pigmentao passvel de ser decifrada (VAN DAAL, 2008) se utilizadas as variantes genticas mais adequadas (LIU et al., 2009). I. OBJETIVO Em vista da relevncia da utilizao desses marcadores no contexto forense e dos numerosos trabalhos que visam identificar os diversos genes envolvidos na determinao desses traos fenotpicos, o presente trabalho teve por objetivo fazer uma breve reviso sobre as bases genticas da pigmentao da pele, olhos e cabelos e sobre os processos fisiolgicos de pigmentao, passveis de controle gentico. Por fim, discute a utilizao desses marcadores no Brasil. II. METODOLOGIA O presente trabalho foi realizado atravs da consulta a artigos de lngua inglesa, pesquisados pela base de dados PubMed, stio do Google Acadmico e acessados atravs dos Peridicos Capes e stios de editoras como Elsevier, Science Direct, Wiley InterScience e Scielo. Tambm foram obtidas informaes online em stio especfico e consultado um livro referente ao tema. Foram priorizadas as publicaes a partir do ano 2000, pesquisadas pelos termos physical traits, pigmentation, forensics, genetic markers, human pigmentation variation e outros obtidos de artigos de reviso bibliogrfica que abordam o assunto em questo. III. TRAOS FENOTPICOS DE INTERESSE FORENSE Dentre os mais diversos traos fenotpicos observveis em um indivduo, como formato corporal, morfologia facial, estatura e sexo, caractersticas da pele, olhos e cabelos, como a estrutura, textura e pigmentao, podem ser considerados os mais promissores para utilizao na identificao humana com fins forenses, j que so visualmente marcantes e de rpida e fcil observao. Ainda, dentre essas caractersticas, a pigmentao pode ser considerada a mais relevante para a identificao por apresentar uma gama ilimitada de variaes contnuas entre os diferentes indivduos das mais diversas populaes. Mesmo que esse fentipo, como qualquer outro trao morfolgico, sofra forte influncia do ambiente em que se encontra e possa ser mascarado pela colorao artificial dos cabelos, bronzeamento da pele ou uso de lentes coloridas de contato, o conhecimento do provvel fentipo de um indivduo, obtido a partir de uma amostra biolgica coletada

em local de crime, constitui uma ferramenta adicional e complementar a outros elementos obtidos na investigao, auxiliando na delimitao do rol de pessoas a serem investigadas. Essa ampla gama de variao da pigmentao existente devida s diferentes combinaes do tipo, quantidade e disperso da melanina produzida na pele, olhos e cabelos, as quais, por sua vez, so influenciadas direta ou indiretamente por diversos genes e seus alelos. Para se compreender o mecanismo de atuao dos genes na formao da pigmentao, necessrio o conhecimento do processo de produo, transporte e armazenamento da melanina nas clulas da epiderme, ris e bulbo capilar, descritos a seguir. 3.1 PRODUO DE MELANINA A melanina, pigmento responsvel pela colorao da pele, olhos e cabelos, um biopolmero de tamanho varivel capaz de absorver a luz incidente e conferir proteo ao ncleo celular por ser altamente resistente degradao qumica (STURM e FRUDAKIS, 2004). Sua produo ocorre em organelas celulares denominadas melanossomos, localizadas no interior de clulas epidrmicas especializadas, os melancitos. A densidade de melancitos varia ao longo da superfcie corporal, sendo a atividade dessas clulas influenciada por fatores como a incidncia de raios ultravioletas (UV), que aumenta a quantidade de clulas ativas, e pela idade do indivduo, que leva diminuio destas (HALABAN et al., 2003 apud JABLONSKI, 2004). No entanto, a quantidade total de melancitos relativamente invariante entre diferentes indivduos, estando a variao da intensidade da pigmentao principalmente relacionada quantidade, tipo e disperso da melanina produzida e ao tamanho, quantidade e disposio dos melanossomos nas clulas (JABLONSKI, 2004). Diferentes combinaes na concentrao de dois tipos de melanina so responsveis pelas diferentes tonalidades observveis: a feomelanina, pigmento vermelhoamarelado, geralmente caracteriza coloraes mais claras e a eumelanina, de colorao marrom-escura, geralmente presente em coloraes mais escuras (OETTING e KING, 1999). A produo desses pigmentos ocorre nos feomelanossomos e eumelanossomos, respectivamente, e a determinao da produo de um ou outro pigmento realizada pelos precursores disponveis em diferentes rotas bioqumicas (STURM e FRUDAKIS, 2004), sendo a enzima tirosinase (TYR) a enzima chave responsvel por mediar as primeiras etapas da produo de melanina, comum aos dois tipos de pigmento.

Inicialmente, o hormnio estimulante de melancitos (-MSH) se liga protena transmenbrnica MC1R e desencadeia uma cascata de reaes intracelulares com a gerao do fator de transcrio MITF, que ativa a enzima TYR. Uma vez ativada, a TYR oxida o aminocido tirosina em dopaquinona, o elemento intermedirio que determinar a produo de eumelanina ou feomelanina, dependendo das condies. Na ausncia de cistena, a dopaquinona sofre reaes de oxi-reduo gerando dopa e, em seguida, eumelanina. J a produo de feomelanina determinada pela reao da dopaquinona com a cistena presente no meio (STURM e FRUDAKIS, 2004). Acredita-se que a produo de feomelanina continuada enquanto houver cistena disponvel, sendo a rota bioqumica alterada para a produo de eumelanina quando cessar a disponibilidade deste aminocido ou ocorrer a degradao de algum dos elementos intermedirios da via. Os pigmentos produzidos e as etapas bioqumicas da melanognese so semelhantes na pele, nos olhos e nos cabelos, ocorrendo apenas algumas diferenas quanto ao transporte e armazenamento dos melanossomos em funo das particularidades morfolgicas de cada uma dessas estruturas. 3.2 PIGMENTAO DA PELE A pele o maior rgo do nosso organismo, recobrindo toda a superfcie corporal e chegando a atingir 16% do peso de um indivduo (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). Morfologicamente, composta por uma poro epitelial externa denominada epiderme e, abaixo desta, uma poro conjuntiva denominada derme. Na epiderme, encontram-se as clulas responsveis pela pigmentao, sendo os melancitos, clulas dendrticas presentes na juno da derme com a epiderme, responsveis pela produo da melanina, e os queratincitos, as mais abundantes e que compem a epiderme como um todo, as clulas que armazenam a melanina produzida (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). Na pele, os melancitos projetam seus dendritos entre os queratincitos adjacentes e transferem seus melanossomos quando estes esto maduros e repletos de melanina (JABLONSKI, 2004). Dentro dos queratincitos, os melanossomos geralmente se estabelecem na regio supranuclear, conferindo proteo ao DNA contra a ao da radiao UV (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). A intensidade da pigmentao da pele determinada por diversos fatores como o nmero total de melanossomos, sua forma de disperso nos queratincitos, a taxa de produo de melanina, o grau de melanizao dos melanossomos, a taxa de transferncia

destes entre melancitos e queratincitos, a proporo entre os dois tipos de melanossomos eumelanossomos e feomelanossomos e a idade cronolgica do indivduo, uma vez que o nmero de melancitos metabolicamente ativos decresce com o aumento da idade (HALABAN et al., 2003 apud JABLONSKI, 2004). Estudos populacionais demonstraram que os melanossomos de indivduos negros africanos so em geral maiores que os melanossomos de indivduos asiticos e caucasianos, mas que existem variaes dentro desses grupos populacionais (TODA et al., 1972 apud STURM et al., 1998). Esses diferentes padres de disperso, quantidade e tipo de melanossomos presentes nas clulas esto presentes desde o nascimento e no so determinados pela intensidade de exposio aos raios UV (ROSDAHL e SZABO, 1976 apud STURM et al., 1998). No entanto, pesquisas que visam mensurar o grau de pigmentao de um indivduo para determinar sua pigmentao constitutiva utilizam tcnicas objetivas que medem o grau de refletncia da pele nas partes menos expostas ao sol a fim de agregar o menor erro possvel (JABLONSKI e CHAPLIN, 2000). A pigmentao constitutiva da pele, entendida como a quantidade de melanina geneticamente determinada no influenciada pela radiao UV incidente, uma valiosa ferramenta para inferncia sobre os genes que controlam direta ou indiretamente o processo de pigmentao, j que constitui uma caracterstica relativamente estvel ao longo da vida de um indivduo, no apresentando grandes alteraes por ao dos diferentes fatores ambientais (ROBINS, 1991 apud PARRA, 2007). Inmeros genes j foram relacionados com a pigmentao, mas o nmero certo e as variantes allicas que esto envolvidas ainda esto para ser elucidados. 3.2.1. Evoluo da Cor da Pele A pigmentao da pele de um indivduo constitui um fentipo superficial que est em contato direto com os mais diversos fatores ambientais que o circundam (JABLONSKI e CHAPLIN, 2000). Dessa forma, acredita-se que esteja submetido a diferentes presses seletivas determinadas pelas caractersticas do ambiente no qual se desenvolve. No entanto, a atual existncia de inmeras estratgias de proteo da pele, como a utilizao de vestimentas, filtro solar, abrigos contra o sol ou ainda as constantes migraes das atuais populaes humanas, minimizam o efeito de fatores ambientais sobre a pigmentao da pele entre os diferentes indivduos. Com isso, acredita-se que a variao da pigmentao atualmente existente tenha sido resultado de presses seletivas geradas por fatores

ambientais sobre as populaes humanas ancestrais (JABLONSKI, 2004), durante o processo de disperso dessas populaes pelos diferentes continentes. O conhecimento das provveis presses seletivas que atuaram na evoluo da colorao da pele de grande auxlio para a inferncia das bases genticas que controlam essa caracterstica, permitindo a identificao de genes que de alguma forma atuam no processo da pigmentao. Assim como observado nos primatas proximamente relacionados ao homem moderno, provvel que a condio ancestral do homem tenha sido o corpo coberto de plos com a pele fracamente pigmentada abaixo (JABLONSKI, 2004). Com a perda dos plos e a intensa exposio ao sol nas baixas latitudes, mais especificamente na frica, de onde os ancestrais humanos provavelmente se originaram, a induo da melanognese deve ter sido selecionada por proteger o organismo dos efeitos nocivos dos raios UV (JABLONSKI e CHAPLIN, 2000). Jablonski e Chaplin (2000) utilizaram mensuraes diretas da incidncia de raios UV ao longo da superfcie terrestre e analisaram o grau de pigmentao de populaes aborgenes de diversas localidades e continentes. Os resultados encontrados corroboram a teoria de que a pigmentao da pele muito provavelmente foi delineada como uma adaptao para a regulao da penetrao de raios UV em quantidades certas na epiderme. Dependendo da latitude em que se encontram determinadas populaes, o grau de pigmentao da pele crucial para que a epiderme receba a quantidade de raios UV suficiente para a correta produo de vitamina D, enquanto protege contra a degradao de nutrientes, como o cido flico, em casos de incidncia excessiva. Assim, peles mais melanizadas requerem maior quantidade de raios UV e peles menos melanizadas requerem maior proteo contra o sol por serem mais sensveis absoro desses raios (JABLONSKI, 2004). Com isso h um gradiente na cor da pele, sendo as populaes mais pigmentadas nas latitudes mais baixas perto do equador e menos pigmentadas medida que se aproximam dos plos (JABLONSKI e CHAPLIN, 2000). 3.3 PIGMENTAO DOS OLHOS A ris a regio ocular composta por tecido conectivo e muscular que apresenta colorao varivel entre os indivduos (STURM e LARSSON, 2009). Ela responsvel pelo controle da entrada da luz incidente atravs de sua abertura central denominada pupila e, dessa forma, permite a regulao da formao de imagens na retina.

Essa regio subdividida em cinco camadas, sendo a mais externa denominada borda anterior, seguida do estroma, esfncter e msculos dilatadores e, mais internamente, o epitlio posterior pigmentado (STURM e FRUDAKIS, 2004). Dessas, a borda anterior e o estroma so as principais camadas contribuintes para a variao da colorao da ris (WILKERSON et al., 1996), uma vez que o epitlio posterior pigmentado apresenta pigmentao em todos as cores observadas, no contribuindo de forma relevante para essa variao (STURM e FRUDAKIS, 2004). ris de colorao marrom apresentam melancitos com alto contedo de melanina na borda anterior e no estroma, enquanto em ris azuis, essas camadas possuem baixo teor de melanina, permitindo maior passagem da luz e consequente refletncia de ondas curtas azuis pelas fibras de colgeno presentes. No estroma, os dendritos dos melancitos so geralmente paralelos superfcie da ris, os quais tendem a se agrupar na borda anterior, e correspondem a aproximadamente 66% das clulas componentes dessas camadas, independentemente da colorao da ris (WILKERSON et al., 1996). Ao contrrio do que ocorre na pele, onde a melanina continuamente produzida e secretada, os melanossomos da ris no so secretados dos melancitos, mas sim retidos e acumulados no citoplasma destes. As variaes na colorao observadas so resultado das diferentes quantidades e tipos de melanossomos presentes nos melancitos, sendo a proporo de eumelanina/feomelanina geralmente maior em coloraes mais escuras e coloraes mais claras apresentando maior concentrao do pigmento feomelanina (STURM e LARSSON, 2009). Apesar de a quantidade de melancitos ser relativamente invariante entre as diferentes coloraes da ris, estudos populacionais demonstram haver diferenas na quantidade de melancitos entre as populaes de diferentes ancestralidades (ALBERT et al., 2003) e que fentipos mais claros esto geralmente associados ancestralidade europeia (STURM, 2009). Estudos de populaes so de grande relevncia para a caracterizao da influncia de determinadas variantes genticas sobre caractersticas fenotpicas. No caso da pigmentao, foi demonstrado haver a possibilidade de variao populacional no nmero de melancitos, tamanho dos melanossomos, quantidade e distribuio de melanina na ris (ALBERT et al., 2003). No entanto, mesmo com o crescente interesse, pouco ainda se sabe sobre a base gentica das variaes populacionais na colorao dos olhos por esta ser de grande complexidade, uma vez que o mesmo fentipo pode ser gerado por diferentes

hapltipos entre diferentes populaes (IIDA et al., 2009). Estudos que objetivem a elucidao do processo evolutivo e das presses seletivas que atuam sobre essa caracterstica podem ser de grande auxlio para o entendimento da distribuio dos genes que influenciam a colorao dos olhos entre as populaes, fazendo desta uma valiosa e acurada ferramenta para a identificao humana. 3.4 PIGMENTAO DOS CABELOS Os plos so estruturas delgadas e queratinizadas presentes em toda a superfcie corporal, com exceo de algumas regies bem delimitadas (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). Originam-se em invaginaes na epiderme, os folculos pilosos, e apresentam-se estruturados em uma cutcula externa, um crtex medial e uma medula interna. A regio terminal do plo, denominada bulbo capilar, apresenta uma papila drmica na poro central sobre a qual localizam-se as clulas que constituem a raiz do plo, responsveis pela produo de clulas que originaro a medula. Quanto mais externa a camada celular, maior a concentrao de queratina (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). De forma semelhante ao que ocorre na pele, os melanossomos produzidos nos melancitos so transferidos para os queratincitos, localizados na regio pr-cortical, ocasionando a maior concentrao de melanina na regio cortical do plo, seguida de uma menor concentrao na medula e, em situaes raras, havendo alguma concentrao de melanina na cutcula (SLOMINSKI et al., 2005). Nos cabelos, apesar de serem encontrados melancitos nas diferentes regies anatmicas que compem cada plo, somente os melancitos presentes no bulbo capilar realizam a melanognese. Tambm, diferentemente do que ocorre na pele, onde a melanina produzida de forma contnua, esses melancitos s esto ativos nas fases de crescimento dos plos, fazendo com que a melanognese ocorra de forma cclica (SLOMINSKI et al., 2005). Alm da continuidade do processo de pigmentao, so observadas diferenas morfolgicas e de degradao entre os melancitos capilares e epidrmicos: os grnulos de melanina transferidos para os queratincitos adjacentes nos cabelos tendem a ser menos degradados do que nos queratincitos da epiderme, onde a melanina chega a ser quase completamente degradada (SLOMINSKI et al., 2005). Como conseqncia desse processo diferencial de pigmentao, indivduos com coloraes escuras para os cabelos podem apresentar peles e olhos com coloraes mais claras.

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Em relao disperso, estrutura e quantidade de melanossomos nos melancitos, o processo semelhante na pele e cabelos. Cabelos pretos geralmente contm maior quantidade de eumelanossomos estruturalmente maiores e mais melanizados, enquanto em cabelos castanhos os melanossomos tendem a ser menores e em loiros, geralmente so menores e fracamente melanizados. Em cabelos ruivos, ocorre o predomnio de feomelanossomos e a melanina geralmente depositada de forma irregular e agregada (SLOMINSKI et al., 2005). Inmeros estudos tm-se voltado para a identificao dos genes que influenciam a pigmentao da pele, olhos e cabelos e vrios genes j foram identificados como responsveis pelas variaes da pigmentao encontrada nessas estruturas. No entanto, em sua maioria, os genes no atuam isoladamente, agindo em conjunto com variantes allicas de outros genes e influenciando a pigmentao da pele, dos olhos e dos cabelos simultaneamente. Dessa forma, as bases genticas da pigmentao devem ser estudadas de forma integrada, devendo-se analisar o conjunto dos genes envolvidos e dos fentipos determinados, discutidos a seguir. IV. BASES GENTICAS DA PIGMENTAO A busca pela identificao de genes que esto envolvidos direta ou indiretamente na pigmentao geralmente realizada atravs de estudos de associao em escala genmica (GWAS do ingls Genome-Wide Association Study), que frequentemente investigam mais de 500.000 SNPs espalhados pelo genoma em amostras populacionais de tamanho considervel, geralmente envolvendo milhares de indivduos (STURM, 2009). Anlises de ligao tambm so frequentemente utilizadas para a identificao desses genes associados pigmentao. Porm, apesar de serem as ferramentas mais adequadas para a identificao das variantes genticas que apresentam forte associao com a variao da pigmentao, os GWAS so preferencialmente empregados por possibilitarem a identificao das variantes genticas que apresentam fraca associao com essa variao e que ocasionam apenas efeitos secundrios (KAYSER et al., 2008). Atualmente, mais de 150 genes com efeitos conhecidos j foram descritos em modelos animais e seus homlogos identificados em humanos (IFPCS, 2009). Esses genes podem ser divididos em grupos funcionais de acordo com a influncia que seus produtos proteicos exercem na produo e regulao da pigmentao: 1) genes que codificam fatores de crescimento e transcrio para o controle do crescimento e diferenciao dos

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melanoblastos em melancitos; 2) genes que codificam protenas componentes dos melanossomos; 3) genes que controlam a biossntese de organelas relacionadas; 4) genes que determinam a produo de eumelanina versus feomelanina e 5) genes envolvidos no transporte dos melanossomos. Dentre os genes mais estudados, so considerados fortes candidatos na determinao da variao normal da pigmentao dos olhos, pele e cabelos os genes MC1R, ASIP, OCA2/HERC2, SLC24A5, MATP (ou SLC45A2) e TYR, entre outros. Um dos genes mais estudados e bem caracterizados o MC1R, localizado no cromossomo 16q24.3, que codifica o receptor transmembrnico de melanocortina 1 acoplada protena G, presente na membrana dos melanossomos (MAKOVA e NORTON, 2005; PARRA, 2007). Variantes allicas desse gene foram relacionadas presena de cabelos ruivos, pele clara, baixa capacidade para bronzeamento (VALVERDE et al., 1995) e, posteriormente, presena de sardas (DUFFY et al., 2004). A atividade do receptor MC1R crtica na comutao da produo de eumelanina e feomelanina. Como j comentado, a ligao do MSH desencadeia a produo de eumelanina. Por outro lado, a ligao da protena antagnica codificada pelo gene ASIP bloqueia a ao do MC1R e promove um decrscimo na atividade da enzima tirosinase, desencadeando a produo de feomelanina. Mais de 30 alelos j foram identificados para o gene MC1R em populaes europeias (STURM et al., 2001). Nove destes foram funcionalmente analisados (DUFFY et al., 2004), dos quais quatro apresentaram forte associao com cabelos ruivos e pele clara Asp84Glu, Arg151Cys, Arg160Trp e Asp294His e trs apresentaram fraca associao Val60Leu, Val92Met e Arg163Gln. O gene MC1R apresenta um padro peculiar de distribuio dos seus alelos entre as populaes humanas: populaes africanas e outras caracterizadas pela pele escura apresentam as menores variaes allicas desse gene, enquanto em populaes asiticas e europeias, esse gene altamente polimrfico (MAKOVA e NORTON, 2005). Essa distribuio caracterstica contrria ao que ocorre com a maioria dos marcadores genticos conhecidos, os quais so, em geral, mais polimrficos nas populaes africanas por estas serem consideradas populaes mais antigas. A teoria sobre a evoluo da pigmentao que considera a incidncia de raios UV em funo das diferentes latitudes terrestres como uma forte presso seletiva poderia explicar a distribuio allica atpica do gene MC1R. Isso porque, teoricamente, este gene encontra-se sob presso que inviabiliza o surgimento de mutaes que levem produo de peles mais claras nas baixas latitudes,

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onde a forte incidncia de raios UV seria desvantajosa para a permanncia dessas variantes allicas (MAKOVA e NORTON, 2005). Como as mutaes conhecidas no gene MC1R levam produo de fentipos mais claros, h presso seletiva para que esse gene mantenha-se monomrfico nas populaes de baixas latitudes. O gene ASIP (do ingls agouti signaling protein gene), localizado no cromossomo 20q11.2, tambm exerce influncia na variao normal da pigmentao por codificar a protena ASIP, antagonista do receptor MC1R. Foi identificado um SNP (do ingls Single Nucleotide Polymorphism) na regio 3UTR desse gene, caracterizado pela substituio de uma guanina na posio 8818 por uma adenina (BONILLA et al., 2005), responsvel pelo aumento da atividade antagnica ao receptor MC1R e consequente clareamento da pigmentao. O alelo ancestral G apresenta-se associado colorao escura dos cabelos, olhos e pele (BONILLA et al., 2005), o que pode ser devido a uma menor expresso do gene ASIP ocasionado por essa variante allica e, consequentemente, menor antagonismo ao receptor MC1R por haver menor quantidade da protena ASIP traduzida (VOISEY et al., 2006). Diferentemente, uma forte associao do gene ASIP com alta sensibilidade da pele ao sol, presena de sardas e cabelos ruivos, fentipos esses semelhantes aos ocasionados pelas mutaes j conhecidas no gene MC1R foi observado em um estudo de GWA (SULEM et al., 2008). Outros alelos desse gene j foram associados variao normal da pigmentao da ris (FRUDAKIS et al., 2003). O gene OCA2, localizado no cromossomo 15q11.2-q12 (RAMSAY et al., 1992), apesar de ser responsvel por uma forma de albinismo, denominado albinismo oculocutneo tipo II, tambm encontra-se associado variao normal da pigmentao (LEE et al., 1995). Esse gene composto por 24 xons que abrangem mais de 345 kb de pares de nucleotdeos (LEE et al., 1995) e codificam uma protena integral de membrana protena P localizada na membrana dos melanossomos, influenciando a regulao da melanognese (STURM, 2006). O gene OCA2 j foi considerado o principal gene na determinao da pigmentao dos olhos (DUFFY et al., 2007). Em um estudo que analisou todo o locus OCA2, Duffy et al. (2007) identificaram um hapltipo de trs SNPs, localizado no intron 1, fortemente associado variao azul/no azul da cor dos olhos. O dipltipo combinao dos hapltipos TGT/TGT foi o gentipo mais fortemente associado colorao azul, presente em 91% dos indivduos com olhos azuis e em apenas 9,5% dos indivduos com olhos marrons. No entanto, estudos mais recentes identificaram uma regio 21,1 kb a montante do gene OCA2 que apresentou poder preditivo da

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colorao dos olhos maior do que os SNPs previamente identificados neste gene (KAYSER et al., 2008; MENGEL-FROM et al., 2009; STURM et al., 2008). Essa regio inclui o gene HERC2, localizado na posio 15q13.1, que se encontra em forte desequilbrio de ligao com OCA2 (STURM et al., 2008), apresentando o SNP rs12913832 no intron 86 fortemente associado variao da pigmentao da ris. Sturm et al. (2008) propuseram um modelo de regulao da expresso do gene OCA2 pelos alelos T e C desse SNP. De acordo com os autores, a presena do alelo T permite a expresso e atuao da protena codificada pelo gene OCA2, levando correta maturao dos melanossomos e determinao de olhos muito pigmentados de colorao escura. Por outro lado, a presena do alelo C ocasiona um bloqueio da transcrio do gene OCA2, promovendo uma falha na maturao dos melanossomos e a consequente gerao de olhos azuis pouco pigmentados. Tambm foi sugerido haver diferenas nas frequncias allicas desse SNP entre populaes de diferentes origens tnicas, o que pode constituir uma forte ferramenta para a identificao forense (STURM et al., 2008). Outro gene responsvel por influenciar a variao normal da pigmentao foi descrito em 2005 a partir de estudos com zebra fish, sendo identificado um homlogo em humanos (LAMASON et al., 2005). O gene SLC24A5 codifica um canal inico presente na membrana dos melanossomos que apresenta um papel crtico na melanognese, sendo que a principal mutao determina a substituio do aminocido alanina por uma treonina na posio 111 e responsvel pela produo de fentipos mais claros. A presena do alelo ancestral, que codifica a alanina, esteve mais relacionada, quando em homozigose, a fentipos mais escuros que aqueles determinados pela presena do alelo derivado, que codifica a treonina, quando em homozigose ou heterozigose (LAMASON et al., 2005). Sua distribuio allica entre diferentes populaes ocorre de maneira bastante caracterstica, sendo o alelo Ala presente em altas frequncias nas populaes do oeste da frica e do leste da sia de 93% a 100% enquanto o alelo Tre encontra-se praticamente fixado nas populaes europeias de 98% a 100% (LAMASON et al., 2005). Esse extremo diferencial de frequncia, associado diminuio da heterozigose observada numa regio de 150 kb que engloba o gene SLC24A5, indica a existncia de uma forte presso seletiva nesse locus. O gene que codifica a protena transportadora associada membrana MATP, recentemente denominado SLC45A2 (do ingls solute carrier family 45 member 2), apesar de ser responsvel pelo albinismo oculocutneo tipo IV, tambm encontra-se relacionado

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variao normal da pigmentao (GRAF et al., 2005). Dois SNPs Glu272Lys e Phe374Leu envolvidos nessa variao normal da pigmentao apresentaram grandes diferenciais de frequncia allica entre populaes europeias e populaes africanas, asiticas e aborgenes australianas, semelhante ao encontrado para o gene SLC24A5 (GRAF et al., 2005). Esses SNPs apresentaram-se fortemente relacionados colorao escura dos cabelos, pele e olhos nas populaes europeias. Os resultados encontrados indicam um forte poder preditivo do SNP Phe374Leu para fentipos claros e escuros dos olhos e cabelos, sendo necessrio incluir outros marcadores para uma predio mais acurada dos fentipos intermedirios (DANIEL et al. 2008). Da mesma forma como ocorre com os genes OCA2 e MATP, o gene TYR, que codifica a enzima chave da melanognese, a tirosina, responsvel por uma forma de albinismo oculocutneo tipo I e tambm est relacionado variao normal da pigmentao. Apesar de Alaluf et al. (2003) terem encontrado um significativo aumento da expresso do gene TYR em melancitos intensamente expostos radiao UV, no encontraram diferena nessa expresso entre diferentes grupos tnicos. Em contrapartida, Shriver et al. (2003), utilizando AIMs, demonstraram haver um aumento da atividade de TYR em populaes de ancestralidade africana quando comparada com populaes do oeste europeu. Apesar de j terem sido identificados uma grande quantidade de genes que influenciam de alguma forma a pigmentao (IFPCS, 2009), poucos apresentam efeitos principais. A avaliao de 37 SNPs em oito genes com relevncia estatstica para a pigmentao dos olhos levou identificao de um subgrupo de seis SNPs em seis genes, que apresentou forte poder preditivo de olhos azuis e marrons em populaes de ancestralidade europeia dentre eles OCA2, HERC2, SLC45A2 e TYR. Outros nove SNPs exercem apenas efeitos aditivos (LIU et al., 2009). Os valores preditivos de olhos azuis e marrons para indivduos de ascendncia europeia encontrados com os seis SNPs selecionados 91% e 93% respectivamente foram os mais acurados encontrados at o momento. Com isso, foi concludo que esses seis polimorfismos constituem fortes candidatos a serem empregados na prtica forense para a inferncia da cor dos olhos de indivduos de ancestralidade europeia em casos em que no h suspeitos ou no h correspondncia entre os marcadores tradicionais j utilizados e o banco de dados, quando existente (LIU et al., 2009)

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No entanto, nos pases em que a populao altamente miscigenada, como o caso do Brasil, a aplicao de marcadores de traos fenotpicos torna-se difcil e mais complexa. V. BRASIL O Brasil um pas que apresenta uma das populaes mais miscigenadas existentes, caracterizada pela contribuio gentica dos trs grupos principais presentes no perodo da colonizao: os europeus colonizadores, os africanos escravos e os amerndios nativos. Apesar de terem sido encontrados resultados satisfatrios na discriminao de populaes africanas, europeias e asiticas utilizando marcadores que influenciam a pigmentao (DANIEL et al., 2008), estudos com a populao brasileira demonstram que a correta identificao de diferentes grupos tnicos no to simples (PARRA et al., 2003; PIMENTA et al., 2007). Parra et al. (2003) demonstraram que utilizando 10 marcadores do tipo AIM possvel fazer a discriminao entre indivduos de marcada ancestralidade europeia e africana. No entanto, utilizando os mesmos marcadores, as anlises de uma populao brasileira de Minas Gerais e de indivduos representativos de quatro regies brasileiras Norte, Nordeste, Sudeste e Sul no permitem a discriminao entre indivduos com diferentes fentipos brancos, pardos e pretos. Os autores concluem que a cor, no Brasil, um pobre indicador de ancestralidade genmica e sugerem que, devido miscigenao, o mesmo pool gnico compartilhado por indivduos com diferentes tonalidades de pele, o que torna impraticvel a utilizao de marcadores que determinam a pigmentao para a inferncia do provvel fentipo do indivduo para fins forenses. Tambm, Pimenta et al. (2007) realizaram um estudo com 752 indivduos de So Paulo pertencentes s categorias de brancos, intermedirios e negros utilizando 12 marcadores microssatlites disponveis comercialmente para estudos forenses e, da mesma forma, no obtiveram resultados satisfatrios na determinao dos diferentes indivduos entre as trs categorias de cor. Apesar das dificuldades existentes para anlises de marcadores de traos fenotpicos em populaes miscigenadas, Shriver et al. (2003) desenvolveram um painel de marcadores do tipo AIM que possibilitam uma acurada discriminao entre populaes miscigenadas formadas pela contribuio de populaes parentais de ancestralidade africana, europeia e nativa americana. Ainda que estimem a necessidade de serem utilizados de 80 a 100 marcadores AIMs para minimizar o erro estatstico obtido, os

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autores sugerem que a miscigenao pode ser identificada por criar novos desequilbrios de ligao entre os marcadores que apresentam diferenciais de frequncias nas populaes parentais, facilitando a identificao e caracterizao de marcadores que influenciam os traos fenotpicos. Dessa forma, para o Brasil, torna-se necessrio um maior volume de estudos que identifiquem os marcadores mais especficos e adequados para o padro de miscigenao que determina a formao da populao brasileira. VI. CONSIDERAES FINAIS O aprimoramento das atuais tcnicas de anlise do DNA e o desenvolvimento de novas metodologias que permitam a anlise de uma maior quantidade de genes em uma grande quantidade de indivduos vem permitindo a identificao dos inmeros genes envolvidos na determinao de caractersticas fenotpicas de interesse forense, em especial a pigmentao da pele, cabelos e olhos. Essas caractersticas so as mais promissoras para o contexto forense por serem de fcil visualizao e observao, mas so de difcil anlise por serem caractersticas complexas, determinadas por vrios genes e influenciadas pelas diferentes condies ambientais. Dessa forma, quanto maior o nmero de genes conhecidos e identificados os mecanismos de atuao de suas variantes allicas, mais acuradas e precisas sero as inferncias do provvel fentipo de um indivduo obtido a partir de uma amostra biolgica, o que representa uma valiosa ferramenta para a prtica forense por direcionar as investigaes, delimitando um rol de possveis suspeitos. Teorias sobre a evoluo da pigmentao indicam que esta reflete as condies ambientais que exerceram presso seletiva nas populaes humanas ancestrais e, por isso, no constitui uma ferramenta confivel para anlises filogenticas entre as populaes modernas. Porm, a utilizao de marcadores genticos que apresentem diferenciais de frequncia allicas entre diferentes populaes AIMs permite inferncias a respeito da contribuio gentica de cada populao para determinado indivduo, possibilitando a inferncia indireta de seu provvel fentipo. No entanto, em populaes altamente miscigenadas e heterogneas, como o caso do Brasil, estudos demonstram que a pigmentao da pele no representativa da ancestralidade gentica do indivduo, dificultando a utilizao dessa caracterstica como ferramenta forense. Nesse caso, necessria a identificao de marcadores especficos que reflitam o padro de miscigenao caracterstico e demais peculiaridades inerentes s diferentes populaes.

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Apesar de pouco ainda se conhecer sobre as bases genticas da pigmentao, a adoo de estratgias promissoras para a identificao de genes envolvidos na variao normal da pigmentao, como, por exemplo, as que detectam a marca deixada pela seleo natural (PARRA, 2007), somado ao rpido conhecimento adquirido e acumulado nos ltimos anos, proporcionam condies favorveis e propcias correta elucidao e utilizao da gentica da pigmentao na identificao humana para fins forenses.

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