1.01.07. Biotecnolog A en El Diagn Stico

CAPTULO 1.1.7.
BIOTECNOLOGA PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y EL DESARROLLO DE VACUNAS
INTRODUCCIN
Los mtodos de biologa molecular se aplican cada vez ms al diagnstico de las enfermedades infecciosas y al desarrollo de vacunas. Para que estos mtodos se lleguen a utilizar ampliamente, es preciso que sean fciles, seguros, sensibles, reproducibles y finalmente automatizados para facilitar la evaluacin de gran cantidad de muestras. El propsito de este captulo es proporcionar una informacin bsica general para el personal no especializado. Dos entregas de la Revisin Tcnica y Cientfica de la OIE tratan de biotecnologa y el diagnstico de enfermedades animales, y se pueden consultar para una revisin ms detallada (103, 104). A continuacin se describen brevemente los temas tratados en este captulo. A. 1. 2. 3. 4. B. 1. 2. 3. 4. C. 1. 2. D. 1. 2. 3. 4. 5. Deteccin de cidos nucleicos Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR en tiempo real Diagnstico mediante el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin y estrategias basadas en las relaciones entre los ADN Diagnstico mediante sondas de ADN y la tecnologa de las micromatrices de ADN Extraccin del cido nucleico Deteccin de protenas Inmunohistoqumica Inmunoelectrotransferencia Enzimoinmunoensayo de captura antignica (ELISA) Protemica Deteccin de anticuerpos ELISA competitivo (C-ELISA) Produccin de antgenos mediante la tecnologa del ADN recombinante Vacunas Vacunas bacterianas con deleccin gnica Vacunas marcadas y pruebas diagnsticas complementarias Vacunas con vectores vricos Vacunas de ADN Otros avances en la tecnologa de las vacunas
A. DETECCIN DE CIDOS NUCLEICOS

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR en tiempo real
La PCR aprovecha los mecanismos de replicacin natural del ADN y tiene como resultado la produccin in vitro de grandes cantidades de una secuencia deseada de ADN a partir de una mezcla compleja de secuencias heterogneas (134). La PCR puede amplificar una regin seleccionada de 50 a varios miles de pares de bases en billones de copias. Mullis et al. (93) describen una discusin detallada sobre la metodologa y las aplicaciones de la PCR. La amplificacin del ADN mediante la PCR consiste en una sucesin cclica de etapas de incubacin a diferentes temperaturas. Primero el ADN diana se desnaturaliza por calor para separar las dos cadenas complementarias
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Captulo 1.1.7. Biotecnologa en el diagnstico de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas
para conseguir moldes monocatenarios. Posteriormente los cebadores especficos (molculas sintticas cortas de ADN complementario para ambas cadenas y que flanquean las secuencias diana) se asocian (hibridan) con los moldes monocatenarios a baja temperatura y se extienden con ADN polimerasa a una temperatura intermedia. Una vez que la polimerasa ha sintetizado una nueva cadena de ADN, se separa el producto del molde calentando a una temperatura mayor. Estas etapas, referidas como ciclos, se repiten 2040 veces, lo que conlleva la amplificacin de las secuencias del ADN diana. La clave para la amplificacin geomtrica de las secuencias del ADN diana mediante la PCR es la seleccin de los pares de cebadores que, cuando se extienden, crean lugares de hibridacin de los cebadores recprocos adicionales para la extensin de los cebadores en los ciclos posteriores. Para detectar el ARN (p.ej. virus de ARN), primero se debe hacer una copia de ADNc del ARN utilizando la transcriptasa inversa (RT). Entonces el ADNc acta como molde para la amplificacin mediante la PCR. A esta tcnica se la denomina RT-PCR. Cualquier producto generado con la PCR, tiene, por definicin, un tamao caracterstico. Su identidad se confirma generalmente empleando sondas de ADN (vase ms abajo) o se digiere por restriccin, lo que puede ser utilizado para las pruebas de los RFLP (vase ms arriba). Desde la llegada de las tcnicas de secuenciacin de ciclo automtico, lo ms habitual es que la identificacin se realice secuenciando de forma directa el producto de la PCR. Por ejemplo, la secuenciacin se ha utilizado en la tipificacin de la virulencia del virus de la gripe aviar tipo A, en el que los motivos estructurales asociados a la virulencia en el sitio de desdoblamiento del gen de la hemaglutinina son indicadores fiables de patogenicidad elevada en los pollos (63). La sensibilidad de la PCR puede aumentar utilizando un segundo juego de cebadores para amplificar un subfragmento a partir del producto de la PCR de la primera reaccin. A esta tcnica se la denomina normalmente PCR anidada y ha sido empleada para detectar niveles bajos de Anaplasma marginale en bvidos infectados de forma persistente (158). Sin embargo, el uso de la PCR anidada puede aumentar la proporcin de resultados positivos falsos. La PCR es un procedimiento muy sensible para detectar agentes infecciosos en tejidos del hospedador y vectores, incluso cuando slo se infecta una pequea cantidad de clulas del hospedador. La PCR puede apuntar y amplificar una secuencia gnica que se haya integrado en el ADN de las clulas hospedadoras infectadas. Tambin puede apuntar y amplificar secuencias gnicas vricas no integradas. Est claro que la PCR cumple una funcin en las pruebas de deteccin de contaminacin en las vacunas. Sin embargo, no diferencia entre organismos viables y no viables o fragmentos incompletos del ADN genmico, lo que puede complicar la interpretacin de los resultados y afecta a la aplicabilidad de la PCR en este papel. La PCR puede resultar muy til en el diagnstico de las infecciones crnico-persistentes, tales como las causadas por retrovirus (virus de la leucemia bovina, virus de la artritis/encefalitis caprina, etc.). Estas enfermedades presentan problemas serios en trminos de diagnstico y prevencin puesto que los animales infectados son una fuente potencial constante de transmisin. Cuando se utiliza la PCR con fines diagnsticos, se requiere un extremado cuidado para evitar la contaminacin de las muestras, porque la sensibilidad exquisita de la tcnica puede conducir fcilmente a resultados positivos falsos. Los estudios multicentro han demostrado que en los laboratorios las muestras positivas se detectan sin excepcin, pero frecuentemente se obtienen positivos falsos con muestras negativas conocidas, lo que indica la presencia continua de problemas de contaminacin (139). Se han desarrollado sistemas para solventar este problema, por ejemplo el sistema dUTP-UNG (d-uracil trifosfato y uracil-N-glicosilasa). Este sistema utiliza una reaccin enzimtica para degradar especficamente los productos de la PCR procedentes de la amplificacin de la PCR previa (en la cual se ha incorporado dUTP) sin degradar los cidos nucleicos moldes nativos (25). De esta forma, por supuesto, no se excluye la contaminacin de la muestra con virus extraos. Actualmente se dispone de una nueva generacin de sistemas automatizados controlados con microprocesadores en los que las reacciones de la PCR se pueden preparar con tan slo un tubo que se abre en cualquier momento dado. Esto reduce enormemente el riesgo de contaminacin. Tambin es importante controlar los potenciales resultados negativos causados por la presencia de sustancias que interfieren en la mezcla de reaccin de la PCR o en la muestra del paciente, mediante la inclusin de un molde conocido que da lugar a un producto de la PCR (25). Estas precauciones permiten que la PCR se convierta en una opcin realista para las pruebas diagnsticas. Para ampliar su utilidad en los diagnsticos veterinarios y en las identificaciones de patgenos, la PCR se ha modificado ampliamente en los ltimos aos. La PCR en la que se utilizan cebadores ampliamente conservados se ha diseado para la identificacin de tipos de patgenos. El mejor ejemplo es el uso de secuencias del gen 16s ARNr, un gen evolutivamente conservado en especies bacterianas (52). Utilizando cebadores de PCR que son complementarios a estas regiones de secuencias conservadas, se puede determinar la presencia de cualquier clase de bacteria en la muestra. Debe advetirse que un resultado positivo de la PCR necesita una caracterizacin adicional mediante hibridacin con sondas especficas de especie, mediante anlisis por digestin de enzima de restriccin o mediante secuenciacin. Del mismo modo, se ha diseado una PCR de consenso para utilizar cebadores degenerados orientados a regiones de secuencias conservadas o motivos de un grupo de patgenos relacionados (169). El uso de cebadores degenerados dirigidos a las regiones de secuencia del gen de la polimerasa del ADN herpesviral ha llevado a la identificacin de muchos herpesvirus no reconocidos previamente en varias especies animales (40, 76). Por otro lado, la PCR mltiple se ha diseado para utilizar dos o ms pares de cebadores dirigidos a las secuencias nicas especficas de patgeno dentro de una nica
reaccin para la deteccin simultnea de mltiples patgenos que son de inters (41). La PCR mltiple tiene la ventaja de poseer un alto grado de sensibilidad y de especificidad. Sin embargo, han aparecido informes de que las reacciones mltiples pueden reducir la sensibilidad en comparacin con las reacciones nicas, debido a la competencia. Esto debera tenerse en cuenta cuando se ha de realizar un ensayo muy sensible. Actualmente los mtodos clsicos de la PCR para el diagnstico de patgenos, tanto bacterianos como vricos, se complementan y en algunos casos se reemplazan por ensayos de PCR en tiempo real. La PCR en tiempo real controla la acumulacin del producto de la PCR durante la reaccin de amplificacin, as permite la identificacin de los ciclos durante los cuales se produce la generacin del producto de la PCR casi exponencialmente. En otras palabras, el ensayo puede utilizarse para cuantificar de forma segura el contenido de ADN o ARN en una muestra dada. En contraste con la PCR convencional, la PCR en tiempo real requiere menos manipulacin, es ms rpida que las tcnicas de PCR convencional, tiene un formato en tubo cerrado, por lo que decrece el riesgo de contaminacin cruzada, es altamente sensible y especfica, por lo que retiene la eficacia cualitativa y proporciona informacin cuantitativa. En muchos casos, los ensayos de PCR en tiempo real han demostrado ser ms sensibles que los mtodos de referencia existentes (58, 175). El desarrollo reciente de ensayos y mquinas porttiles de PCR en tiempo real (128) aumenta las perspectivas de estas tcnicas para ser utilizadas en el diagnstico rpido (menos de 2 horas) de brotes de enfermedad en el campo. La validacin de las tcnicas de PCR se incluye en el captulo 1.1.5. Validacin y control de calidad de los mtodos de la reaccin en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnstico de las enfermedades infecciosas. En este captulo tambin se plantean controles internos para garantizar los resultados de la PCR.
2.
Diagnstico mediante el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin y otros enfoques relacionados basados en el ADN
Es posible que las pruebas serolgicas que se utilizan habitualmente para identificar los microorganismos no diferencien entre aislamientos de patgenos estrechamente relacionados, sean virus, bacterias, hongos o parsitos. Un procedimiento basado en el ADN ofrecer la mejor discriminacin que con frecuencia se requiere, y un punto de partida apropiado pueden ser los anlisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP). El enfoque del RFLP se basa en el hecho de que los genomas, incluso los de los patgenos estrechamente relacionados, se definen por la variacin de su secuencia. Por ejemplo, el orden lineal de los nucletidos adyacentes que abarca la secuencia de reconocimiento de un enzima de restriccin especfico en un genoma puede estar ausente en el genoma de una cepa o aislamiento estrechamente relacionados. En la prctica el procedimiento del RFLP consiste en el aislamiento del patgeno diana, la extraccin del ADN o ARN (con la posterior trascripcin inversa a ADN) y a continuacin la digestin del cido nucleico con un enzima de restriccin seleccionado de un grupo. Los fragmentos individuales del ADN digerido se separan despus en un gel por electroforesis y se visualizan mediante la tincin con bromuro de etidio. Lo ideal es que cada cepa revele un patrn nico, o huella dactilar. Se pueden considerar muchos enzimas de restriccin diferentes al comienzo de cada nueva unidad de trabajo, de modo que se pueda realizar el anlisis de muchas huellas dactilares moleculares a partir de las digestiones con diversos enzimas de restriccin individuales, y la combinacin del mejor conjunto de resultados permitir una diferenciacin detallada entre las cepas o los aislamientos. Un buen ejemplo de la aplicacin de esta tcnica es la diferenciacin de los biotipos del virus de la rabia a partir de perros o murcilagos vampiros procedentes de Latinoamrica (83). Para el estudio de los patgenos, resulta de mayor utilidad una modificacin de la tcnica bsica del RFLP por la que se incorpora la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) como etapa preliminar. El ensayo de la PCR (descrito con ms detalle en la seccin 1 del presente capitulo) se utiliza para amplificar una regin especfica del genoma (cuyas secuencias el investigador sabe que varan de un patgeno a otro), que posteriormente sirve como ADN molde para la tcnica del RFLP. Esta nueva combinacin (PCR-RFLP) ofrece una sensibilidad mucho mayor para la identificacin de patgenos y es especialmente til cuando el patgeno est presente en cantidades pequeas o es difcil de cultivar, dos rasgos que caracterizan al parsito protozoario intestinal Crisptosporidium spp. Tanto el RFLP como, ms especialmente, el PCR-RFLP son extremadamente tiles para la genotipificacin de cepas de Criptosporidium, ya que permiten identificar las fuentes de la infeccin humana y proporcionar informacin acerca de su epidemiologa y aparicin (16, 145). De este modo puede definirse la implicacin de cepas o tipos especficos en un brote de enfermedad, y debera ser posible seguir el rastro epidemiolgico de los aislamientos dentro de un pas o entre pases. Existen otros muchos ejemplos en los que se ha demostrado que las tcnicas RFLP/PCR-RFLP son tiles para discriminar entre genotipos; por ejemplo, el hongo Candida (32), el virus del sndrome respiratorio y reproductivo porcino (162) y la bacteria Helicobacter pylori (54).
El patgeno humano Candida krusei proporciona un buen ejemplo de la aplicacin general de una variedad de tcnicas moleculares. Dassanayake et al. (32) investigaron la diversidad gentica de once aislamientos orales de C. krusei e identificaron cinco genotipos diferentes mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), nueve genotipos mediante RFLP empleando el enzima HinfI, mientras que el anlisis de huellas dactilares de ADN basado en el ADN polimrfico amplificado al azar (RAPD-PCR) revel tres, ocho u once genotipos dependiendo de los cebadores utilizados. La incorporacin de la PFGE facilita la separacin de fragmentos grandes de ADN (hasta tamao de megabase) y puede ser un accesorio til para el anlisis bsico por RFLP. Jager et al. (66) utilizaron una combinacin del enzima de restriccin de corte infrecuente NotI y la PFGE para caracterizar 80 aislamientos de Coxiella burnetii a partir de animales y humanos de Europa, EE.UU., frica y Asia. Distinguieron 20 patrones de restriccin diferentes y el anlisis filogentico de los diferentes patrones RFLP revel relaciones evolutivas entre los grupos que se correspondan con el origen geogrfico de los aislamientos. En este estudio no se detect correlacin entre el grupo de restriccin y la virulencia de un aislamiento, pero enfoques similares utilizados con otros varios patgenos sugieren tal conexin. Grigg y Boothroyd (53), por ejemplo, identificaron tres puntos de restriccin en el locus B1 repetido 35 veces que permiti diferenciar las cepas del tipo I (virulenta para el ratn) de las de los tipos II y III (no virulentas para el ratn) de Toxoplasma gondii. Los RFLP tienen un valor evidente para los estudios epidemiolgicos, pero una interpretacin ms crtica de los datos del RFLP supone la construccin de bases de datos para determinar si los perfiles del RFLP estn relacionados con factores tales como la virulencia, la gama de hospedadores y la relevancia clnica. En la prctica, para clasificar el aislamiento es til no basarse en un sitio de restriccin sino en la utilizacin de sitios en varias localizaciones dentro del genoma. Un asunto de permanente inters en el diagnstico veterinario es la valoracin correcta de cualquier diferencia molecular encontrada entre los aislamientos de un patgeno porque la prdida o adquisicin del (de los) sitio(s) de restriccin puede no estar asociada con diferencias en la capacidad del patgeno para causar enfermedad, es decir, una diferencia por RFLP puede no ser significativa desde el punto de vista funcional, excepto como rasgo diferenciador Los marcadores polimrficos del RAPD que definen cepas individuales, etc. pueden secuenciarse y ser utilizados como regiones amplificadas de secuencia caracterizada (SCAR). De este modo la conversin de un marcador polimrfico annimo a una SCAR significa que se puede realizar un solo PCR para identificar de un modo ms simple un genoma especfico. Lewin et al. (75) emplearon este enfoque para identificar 19 genotipos con multilocus nico entre 29 cepas del protozoo Leishmania donovani. Las tcnicas para poder detectar y caracterizar el ADN de un patgeno continan mejorando y desarrollndose. El procedimiento discriminatorio fundamental es la secuenciacin del genoma. La secuenciacin de una porcin del genoma bien caracterizado, est jugando un papel muy importante en la caracterizacin del patgeno y en los estudios epidemiolgicos. La secuenciacin de los productos amplificados por PCR utilizando cebadores degenerados dirigidos a un gen comn a los virus de la misma familia se ha convertido en una importante herramienta de diagnstico, especialmente para la identificacin de miembros de una misma familia previamente no reconocidos. Un buen ejemplo es la secuenciacin de amplicones de PCR degenerados a partir del gen de la polimerasa del ADN herpesvrico (169). En unos pocos casos se ha secuenciado el genoma vrico completo. Por ejemplo, el brote del sndrome respiratorio agudo severo (SARS), y la secuenciacin del genoma de 29.751 bases del coronavirus asociado (86) revel de modo prctico que el virus estaba relacionado slo moderadamente con otros coronavirus conocidos, entre los que se encuentran dos coronavirus humanos y no pareca tener una relacin prxima con ninguno de los tres grupos de coronavirus previamente establecidos. Este grado de cuestionamiento a nivel del cido nucleico no estar disponible para estudiar la mayora de los patgenos. Hasta dentro de muchos aos no se dispondr del conocimiento a nivel del cido nucleico para estudiar a la mayora de los patgenos. Las tcnicas tales como el RFLP, el PCR-RFLP, el RAPD-PCR y los anlisis de las SCAR continuarn desempeando un papel central en la identificacin y discriminacin de los aislamientos de la mayora de los patgenos.
3.
Diagnstico mediante sondas de ADN y la tecnologa de las micromatrices de ADN
Las pruebas convencionales con sondas de ADN y el anlisis de micromatrices son dos lados de la misma moneda. Para ambos procesos es fundamental la unin (hibridacin) del ADN procedente de una muestra sospechosa de contener un patgeno (el desconocido), con un ADN muy bien caracterizado procedente de un patgeno de inters (el ADN conocido). En las pruebas convencionales con sondas de ADN, el ADN desconocido (o ARN), la diana, se inmoviliza en una superficie slida, p.ej. un filtro. El ADN conocido, convertido en sonda mediante marcaje o etiquetado de alguna manera, se encuentra en la fase lquida y se aplica a la diana. En el diagnstico de micromatrices es el ADN conocido (oligonucletidos grandes o ADN complementario) el que acta de diana y se inmoviliza en un porta, en tanto que el ADN desconocido, en la fase lquida, es el que se marca y acta de sonda.
En las pruebas convencionales con sondas de ADN la diana pueden ser cidos nucleicos extrados a partir de un material clnico o de clulas en cultivo y o (a) se aaden a filtros (transferencia de gotas que quedan en forma de manchas, tipo dot blot o en ranura, en forma de lnea, tipo spot blot) o (b), de manera menos conveniente en un contexto diagnstico, se transfieren a un filtro despus de una electroforesis en gel. La cantidad de patgeno en una muestra clnica podra ser demasiado reducida para ser detectada. Consecuentemente, se podra amplificar el cido nucleico mediante PCR o PCR de trascripcin inversa (RT-PCR), aplicndose el producto de la PCR al filtro. Con objeto de visualizar una sonda unida a su diana, la sonda se puede marcar con un nucleido radiactivo, o de forma ms habitual y segura, con un etiquetado no radiactivo. Por ejemplo, se pueden incorporar en la sonda biotina o psoralenobiotina, y unido a la sonda se detecta mediante la adicin de estreptavidina ligada a un enzima para la generacin posterior de color o luz (quimioluminiscencia). La micromatrz se denomina as porque puede constar de 20.000 o ms ADNs conocidos diferentes, cada ADN se coloca en pequeas muestras sobre portas formando una matriz. Cada mancha de muestra es de tan slo 10 m de dimetro. Para preparar las matrices se pueden utilizar ADNs complementarios de partes de genes seleccionados de los patgenos (17). Sin embargo, si se va a investigar un gran nmero de patgenos, entonces sera ms fcil desde un punto de vista logstico utilizar oligonucletidos grandes. La micromatriz que se utiliz para identificar al virus SARS al ser un coronavirus tena oligonucletidos formados por 70 nucletidos (70-mer) (174). En el sondeo de la micromatriz esta es la muestra a partir de la que se prepara la sonda. Esencialmente, el cido nucleico se extrae a partir de una muestra y se realiza una (RT-) PCR empleando oligonucletidos cebadores al azar. De esta manera parte de todos los cidos nucleicos de la muestra, tanto de origen hospedador como patgeno, se amplifican. Estos productos de PCR, representativos de cada cido nucleico de la muestra, se marcan con un colorante fluorescente y se aplican a la micromatriz. En condiciones ptimas slo el ADN procedente del patgeno se unir al ADN del porta. Si se est interesado en detectar nicamente un patgeno particular o un grupo de patgenos relacionados entonces los oligonucletidos especficos del patgeno se pueden utilizar para amplificarlos en la muestra con el fin de obtener la sonda. Se pueden disear micromatrices para detectar patgenos a distintos niveles de diferenciacin. En el caso de oligonucletidos ADN diana inicialmente se pueden preparar oligonucletidos capaces de detectar y diferenciar patgenos a nivel de gnero. Se elegira un nmero, quizs 10 o as, de oligonucletidos con un grado elevado de conservacin de secuencia (oligonucletidos consenso) dentro de un gnero dado, de modo que una sonda hecha a partir de una muestra de campo que contenga un miembro de este gnero probablemente hibridara con al menos alguno de los nucletidos, mientras que no hibridara (o lo hara en menor grado) con aquellos correspondientes a los gneros relacionados,( p.ej. para diferenciar los aislamientos de Apthovirus (causantes de la fiebre aftosa, FMDV) a partir de cepas de Enterovirus de la familia Picornaviridae. Despus se podran seleccionar otros juegos de oligonucletidos, colocarlos en el mismo porta de la matriz, capaces de caracterizar un patgeno de forma ms especfica, (p.ej. para diferenciar los siete tipos de FMDV e incluso potencialmente afinar despus a nivel de subtipo.) En el sondeo convencional del ADN la deteccin de un patgeno est limitada por la cantidad de sondas empleadas, mientras que en el anlisis de micromatrices slo se est limitado por la cantidad de ADNs diana en la matriz. Si una micromatriz tiene 1000 oligonucletidos diferentes, entonces para conseguir el mismo poder de resolucin que el sondeo convencional seran necesarias 1.000 sondas, 1.000 reacciones de sondeo separadas. La gran ventaja del anlisis de micromatrices en la investigacin de los patgenos es que cientos de patgenos se pueden buscar de manera simultnea al sondear un nico porta de micromatriz. Claramente, el anlisis de micromatrices presenta un enorme potencial cuando se investigan enfermedades de etiologa desconocida, enfermedades en las que ms de un patgeno puede estar presente y cuando se precisa la subtipificacin. Para mejorar la sensibilidad en la deteccin de los patgenos se pueden complementar las micromatrices con amplificaciones por la PCR. Estas PCR se disean generalmente para amplificar uno o ms genes conservados o secuencias mltiples, tales como la PCR en la que se utilizan cebadores ampliamente conservados, la PCR de consenso, y la PCR mltiple, como se mencion en esta seccin. Si se tiene un patgeno in mente, entonces la utilizacin de una micromatriz est menos justificada, puesto que la produccin e hibridacin es relativamente cara. En cambio, para estos casos ms simples, se podran emplear PCRs especficas de patgeno/subtipo, seguidas de la secuenciacin o anlisis de los fragmentos de restriccin para conseguir la confirmacin. Si la experiencia previa en biotecnologa es indicativa del futuro, entonces es de esperar que los reactivos y el equipamiento de las micromatrices sean menos costosos, lo que conducir a una mayor aplicacin de esta tecnologa en el diagnstico de las enfermedades animales. Conseguir que la investigacin de los virus o la caracterizacin de las cepas bacterianas en trminos de virulencia, sensibilidad antimicrobiana, u otros marcadores importantes. Uno de los mayores retos afrontados cuando se utilizan los mtodos basados en la matrz, es el manejo y el anlisis del amplio conjunto de datos que se generan.
4.
Extraccin del cido nucleico
Las principales variantes de los ensayos de diagnstico moleculares descritos ms adelante en esta seccin dependen por completo de la disponibilidad de mezclas de cido nucleico limpias para actuar como molde en las reacciones. Mientras que es relativamente fcil extraer ADN de cultivos bacterianos o de sangre, es
tcnicamente ms complicado preparar material adecuado a partir de muestras fecales o de material procedente de abortos. Esta fase es crtica porque si el material de pruebas no se ha purificado de contaminantes en la muestra clnica, se compromete la fase de prueba y pueden obtenerse resultados falsos (captulo1.1.5 Validacin y control de calidad de los mtodos de la reaccin en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnstico de las enfermedades infecciosas). Existe una variedad de mtodos especializados para tipos concretos de muestras y tejidos, algunos de los cuales estn actualmente disponibles en el mercado como sistemas manuales o automatizados para estaciones de trabajo robotizadas. Estas tienen la finalidad de mejorar la fiabilidad de la extraccin del cido nucleico a partir de diferentes muestras, pero se trata de una tarea que ha de perfeccionarse.
B. DETECCIN DE PROTENAS
1. Inmunohistoqumica
Como complemento al aislamiento de los organismos causantes de las enfermedades, la inmunohistoqumica se est convirtiendo rpidamente en una herramienta estndar en los laboratorios de diagnstico para la identificacin de antgenos asociados con virus, bacterias y protozoos y la encefalopata espongiforme transmisible (124). La deteccin in situ de antgenos en tejidos fijados ofrece una serie de ventajas sobre otras tcnicas diagnsticas. Estas ventajas son: (a) la comodidad en la presentacin de las muestras; (b) el manejo seguro de los potenciales patgenos humanos; (c) los estudios retrospectivos de muestras conservadas; (d) la rapidez; y (e) la deteccin de organismos no viables (55). La inmunohistoqumica tambin se utiliza para detectar protenas prinicas anormales (PrPSc) en el tejido cerebral para confirmar enfermedades como el prurigo lumbar, la encefalopata espongiforme bovina y otras encefalopatas espongiformes transmisibles y ha demostrado ser ms sensible que el examen histopatolgico para el diagnstico de estas enfermedades (156). La demostracin de PrPSc en biopsias de tejido linfoide, p.ej. en la membrana nictitante, tambin puede ser utilizada para el diagnstico del prurigo lumbar (101). A medida que aumente la cantidad de anticuerpos monoclonales (MAb) para definir antgenos, aumentar el empleo de la inmunohistoqumica para la identificacin de organismos y otros marcadores especficos de la autoinmunidad y la neoplasia. La etapa limitante en el proceso de inmunohistoqumica consiste en identificar una combinacin MAb/antgeno que se una a los tejidos fijados con formalina. Este inconveniente se puede superar utilizando secciones congeladas o empleando tcnicas recuperadoras del antgeno (p.ej. digestin con enzimas proteolticos, microondas) antes de la inmunotincin.
2.
Inmunoelectrotransferencia
La inmunoelectrotransferencia combina la resolucin elevada de la electroforesis en gel con la especificidad de la deteccin inmunoqumica y ofrece un medio para identificar los eptopos inmunodominantes reconocidos por los anticuerpos a partir de animales infectados o los MAb dirigidos contra el agente diana. El procedimiento de inmunotransferencia se puede dividir en seis etapas: a) b) c) d) e) f) Preparacin de la muestra Resolucin del antgeno mediante electroforesis en gel Transferencia de los polipptidos separados a un soporte de membrana (membrana de nitrocelulosa) Bloqueo de los sitios de unin inespecficos en la membrana Incubacin con anticuerpo de deteccin Deteccin del anticuerpo de unin
Es crtica la eleccin del anticuerpo de deteccin. Los sueros policlonales estn compuestos de una variedad de anticuerpos que refleja el repertorio completo de la respuesta inmune frente a un antgeno complejo particular. Por tanto, detectarn una cantidad de polipptidos distintos que proporciona un perfil caracterstico de reactividad. Los MAb se unen slo a un eptopo, por lo que son adecuados para identificar polipptidos muy especficos. Despus de la incubacin con el anticuerpo de deteccin, cualquier anticuerpo que se una a las bandas de protenas especficas se visualizar empleando antisueros anti-especie conjugados a enzimas de marcaje y un sustrato/cromgeno adecuado. La inmunoelectrotransferencia se lleva a cabo principalmente en los laboratorios de diagnstico para identificar y/o caracterizar agentes infecciosos basndose en la especificidad del antgeno o empleando antgenos conocidos para buscar una respuesta serolgica especfica. Frecuentemente, los resultados positivos-falsos o negativos falsos de otros ensayos diagnsticos se pueden resolver mediante una inmunoelectrotransferencia (89). Como un ejemplo de deteccin de antgeno, la inmunotransferencia es el principal mtodo de deteccin para la EEB y el prurigo lumbar; se ha utilizado en millones de muestras de cerebro en Europa y en otros sitios para la deteccin de la protena del prin (138). Tcnicas revisadas de inmunotransferencia (por ejemplo SAF-
Western blot) se utilizan como mtodos de prueba confirmativos (8) y para diferenciar entre el prurigo lumbar y la EEB (146). Asimismo, se emplea con frecuencia para determinar la especificidad de los MAb individuales. Los polipptidos purificados individuales (o protenas de expresin recombinante) tambin se pueden transferir a membranas de nitrocelulosa mediante inmunoelectrotransferencia para examinar la reactividad de los sueros problema hacia protenas individuales. Este perfil caracterstico de reactividad se puede utilizar para ayudar a distinguir entre los animales vacunados y los infectados, tales como la prueba EITB, el mtodo Western Blot para la fiebre aftosa, que es muy usado en Sudamrica (10). El factor primordial que afecta al xito de la tcnica de inmunoelectrotransferencia es la naturaleza de los eptopos que son reconocidos por los anticuerpos. Las tcnicas en gel de mxima resolucin implican alguna forma de desnaturalizacin del antgeno. Esto destruye los determinantes conformacionales y nicamente permite la deteccin de los eptopos lineales o no conformacionales. La mayora de los antisueros policlonales contiene anticuerpos que reaccionan tanto con los eptopos lineales como con los conformacionales, pero los MAb estn dirigidos a los eptopos individuales; as si ellos apuntan a los eptopos conformacionales, no reaccionarn con protena desnaturalizada. Para detectar patgenos en muestras de tejido, que contienen una gran cantidad de protena, se requiere la concentracin selectiva del antgeno y mtodos de deteccin muy sensibles. Se utilizan buenos ejemplos de estas tcnicas para la deteccin de la protena del prin del prurigo lumbar (PrPSc) (91). Despus de la eliminacin de la protena del prin normal mediante la digestin de la proteinasa, el PrPSc se concentra por precipitacin de fosfotungstato sdico o precipitacin de alcohol, y se detecta el compuesto anticuerpo-antgeno en el filtro o en la placa del ELISA mediante el uso de un sustrato de luminiscencia qumica y la utilizacin de una cmara CCD o una placa de rayos X para eliminar la emisin de fondo (12, 133).
3.
Enzimoinmunoensayo de captura antignica (ELISA)
El enzimoinmunoensayo de captura antignica (ELISA) facilita la deteccin de antgenos de patgenos directamente a partir de un animal antes o durante el desarrollo de la enfermedad clnica. Comnmente, el ELISA sigue un formato de ensayo tipo sndwich empleando anticuerpos de captura y de deteccin (ya sean anticuerpos policlonales o MAb). Primero el antgeno de la muestra problema se captura mediante un anticuerpo policlonal o MAb especfico unido a un soporte en fase slida y su presencia se detecta utilizando un segundo anticuerpo policlonal o MAb, que puede tener marcaje radioactivo o ms generalmente, enzimtico (conjugado). Si el anticuerpo de deteccin no est conjugado entonces se emplea un conjugado (reactivo para el anticuerpo detector) anti-especie. El anticuerpo de captura selecciona el antgeno diana a partir de otras protenas competidoras presentes en las suspensiones de la muestra y asegura que est semi-concentrado para incrementar las posibilidades de su deteccin. Las caractersticas deseadas del MAb de captura son fuerte unin al patgeno, reconocimiento de un eptopo conservado y muy especfico para el agente diana y la capacidad de adhesin a las placas ELISA sin que pierda reactividad. Adems, con frecuencia se utiliza como parte de un sistema indicador un segundo MAb que reconoce un eptopo distinto del que es reconocido por el MAb de captura que se une a la placa ELISA. Sin embargo, puede resultar difcil identificar los MAb de reactividad intratpica completa por lo que es posible que se prefieran los antisueros policlonales para aumentar la probabilidad de reaccin contra todas las variantes antignicas. Como ejemplos de ELISA de captura antignica estn el sistema de deteccin de Anaplasma marginale en sangre de vacas preclnicas (160), la utilizacin del ELISA de captura antignica con muestras de sangre de vaca para detectar el virus de la diarrea vrica bovina (88, 136) y la deteccin rpida de los antgenos de los virus de la peste bovina y la peste de los pequeos rumiantes en muestras clnicas (79). El antgeno respiratorio sincitial en secreciones nasales se captur empleando un ELISA con MAb dirigidos contra eptopos de la cpsida vrica (102). Se han validado ampliamente varios Elisa de captura para la deteccin de la protena del prin y se utilizan como mtodos rpidos de anlisis en todo el mundo (42, 44, 91). Los Elisa de captura tambin se utilizan ampliamente para pruebas de la enfermedad de debilitamiento crnico en ciervos (60), y las pruebas de prurigo lumbar en ovejas y cabras (43). Un mtodo de captura relacionado con el antgeno, la prueba Priostrip, que es un mtodo en el que se utilizan tiras reactivas, tambin se usa como una prueba de anlisis rpida de la EEB (44). Actualmente algunos mtodos de captura antignica relacionados que utilizan perlas inmunomagnticas se consideran mtodos importantes y han tenido una buena aceptacin para detectar ciertas infecciones bacterianas, entre ellas las debidas a Listeria, Salmonella y Escherichia coli. El principio de esta tecnologa se apoya en la separacin inmunomagntica, es decir, la utilizacin de pequeas partculas super-paramagnticas o perlas recubiertas de anticuerpos contra los antgenos de superficie de las clulas. Las bacterias intactas y sus determinantes antgenicos solubles pueden determinarse despus de la extraccin magntica de la muestra de prueba, utilizando un segundo anticuerpo en un formato de sandwich. Una unin libre de superficie slida, los ensayos de captura antignica en los que se utilizan perlas inmunomagnticas, pueden acentuar la cintica de una reaccin de anticuerpo-antgeno. Como resultado, se reduce tanto la unin no especfica como el tiempo de incubacin. La validacin de las pruebas para detectar anticuerpos se aborda en el captulo I.1.4 Principios de validacin para las pruebas de diagnstico de las enfermedades infecciosas.
4.
Inmunocromatografa
La inmunocromatografa proporciona un mtodo apropiado para la deteccin de antgenos en varios minutos sin un mecanismo especial (3, 84). La muestra se aplica sobre un extremo del filtro y se emplean las microperlas (como el oro coloidal) conjugadas con anticuerpo. El anticuerpo se une al complejo antgeno-microperla, se atrapa en el segundo anticuerpo que est en el filtro y se visualiza fcilmente en el lugar donde se fij el segundo anticuerpo.
4.
Protemica
El proteoma es el conjunto completo de protenas que se expresan en una clula, un tejido o un organismo y la protemica es el estudio de las protenas, incluyendo su nivel de expresin, modificacin post-traduccional e interaccin con otras protenas, a gran escala. Puesto que no todas las protenas se expresan a la vez y en todo momento, pero son dependientes de factores fisiolgicos y ambientales, la protemica puede proporcionar una visin global excelente de los procesos caractersticos de la enfermedad a nivel de protenas. Debido a que la aplicacin de la protemica en el desarrollo de nuevas drogas promete unas ganancias econmicas enormes, las compaas de todo el mundo han invertido rpidamente sus recursos en este nuevo campo de investigacin (22). Muchos mtodos empleados en protemica, como la electroforesis bidimensional en gel (2DGE) y la espectrometra de masas (MS) estn establecidos desde hace aos. Sin embargo, los avances recientes en las tcnicas MS, junto con la secuenciacin completa del genoma y el desarrollo de plataformas robticas y bioinformticas potentes, han revolucionado la identificacin de las protenas. El principio general de la protemica es que las protenas se separan, normalmente mediante 2DGE en geles de poliacrilamida, a continuacin las manchas de las protenas se recortan, se digieren con tripsina y los pptidos resultantes se analizan mediante MS. Las masas de estos pptidos son entonces comparadas con las masas predecibles de pptidos procedentes de los anlisis informatizados de las bases de datos del genoma, con lo que se consigue la identificacin del gen. Tambin se puede utilizar la MS para deducir la secuencia de aminocidos de los pptidos y caracterizar las modificaciones post-traduccionales tales como la glicosilacin o la fosforilacin. La 2DGE muestra algunas limitaciones, particularmente para la separacin de protenas hidrofbicas, y actualmente se consideran ms adecuadas para algunas aplicaciones otras tcnicas de separacin basadas en la cromatografa lquida. Sin embargo, la 2DGE es el mtodo de eleccin para crear mapas cuantitativos de expresin gnica y permite que se puedan analizar muchos miles de protenas en un corto periodo de tiempo. Se pueden medir directamente alteraciones en el proteoma de los tejidos o fluidos corporales como el suero, la orina o el lquido cerebro-espinal de modo que los cambios que sucedan en el desarrollo de la enfermedad se pueden indicar con toda precisin. Este enfoque puede conseguir identificar molculas que pueden ser diana de terapias nuevas y, al mismo tiempo, es una herramienta muy poderosa para el diagnstico precoz de enfermedades. Las aplicaciones clnicas mejor establecidas de la protemica se encuentran por ahora en la identificacin de marcadores para el diagnstico precoz de casos de cncer, como el de vejiga de la orina (127). No obstante, tambin est en curso una investigacin considerable en otras reas tales como la de la enfermedad cardiaca (68), la enfermedad de Alzheimer (27) y la diabetes insulina-dependiente (1). La utilizacin de la protemica para el diagnstico de las enfermedades infecciosas est al comienzo de su desarrollo pero puede resultar ser de importancia notable. Por ejemplo, el diagnstico definitivo de la enfermedad crnica provocada por el virus de la hepatitis B (HBV) todava se basa en la biopsia heptica, pero el anlisis protemico de las muestras del suero muestra que la expresin de al menos siete protenas sricas cambia significativamente en los pacientes crnicos con el HBV (57). De manera similar, el diagnstico diferencial ante mrtem de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) se puede beneficiar de la protemica ya que los datos preliminares muestran que siete protenas del lquido cerebro-espinal (CSF) se expresan de modo diferente entre los pacientes con la CJD variante o espordica (28). Una aplicacin de la protemica de extremada utilidad para el diagnstico de enfermedades infecciosas es la identificacin de nuevos antgenos de diagnstico para estudios de deteccin en sueros procedentes de individuos infectados y no infectados enfrentndolos a proteomas de agentes infecciosos sometidos a 2DGE e inmunotransferencia. Llevando a cabo este tipo de estrategia con los sueros humanos, se han identificado nueve nuevos antgenos con potencial aplicacin inmunodiagnstica en Helicobacter pylori (50), ms de 80 antgenos en Borrelia burgdorferi que potencialmente podran diferenciar entre pacientes con sntomas tempranos y tardos de la enfermedad de Lyme (68) y siete antgenos de Toxoplasma gondii que quizs podran diferenciar entre la toxoplasmosis aguda y latente (68). Dentro del campo veterinario, en la actualidad estn en marcha proyectos de investigacin basados en la protemica e indudablemente producirn nuevas herramientas de diagnstico de utilidad en el futuro. Se estn consiguiendo mapas protemicos de una variedad de patgenos de inters veterinario entre los que hay bacterias como Brucella melitensis (92) y Streptococcus agalactiae (65), protozoos como Toxoplasma gondii (29), Eimeria tenella (21) y Trypanosoma brucei (130) y nemtodos como Haemonchus contortus (179).
C. DETECCIN DE ANTICUERPOS
1. Enzimoinmunoensayo competitivo (C-ELISA)
El ELISA competitivo (C-ELISA) es un inmunoensayo que puede utilizarse para detectar o cuantificar los anticuerpos o el antgeno, utilizando un mtodo competitivo. El C-ELISA para la deteccin de anticuerpos especficos ha reemplazado principalmente al ELISA indirecto para la deteccin a gran escala y la vigilancia serolgica. El C-ELISA ofrece ventajas significativas sobre el ensayo indirecto puesto que se pueden analizar muestras de muchas especies sin necesidad de utilizar conjugados especficos de especie marcados con un enzima para cada especie a probar. La purificacin de muchos antgenos es extremadamente difcil o requiere mucho tiempo. Si se utilizara un ensayo indirecto, se obtendran valores elevados de fondo debido a uniones inespecficas. Sin embargo, se pueden emplear antgenos relativamente crudos en el C-ELISA siempre que el anticuerpo de deteccin tenga la especificidad deseada. El principio del ensayo competitivo para la deteccin de anticuerpos se basa en la competicin entre el suero problema y el anticuerpo de deteccin. La unin especfica del anticuerpo de deteccin se detecta utilizando un conjugado anti-especie apropiado. La reduccin obtenida del color esperado se debe a la unin de los anticuerpos presentes en el suero problema, lo que impide la unin del anticuerpo de deteccin. El anticuerpo de deteccin puede ser policlonal o monoclonal dependiendo de la especificidad que se requiera. Los MAb dirigidos contra eptopos muy conservados darn ensayos de reactividad amplia mientras que los dirigidos contra eptopos muy especficos tendrn como resultado una prueba muy especfica. Una de las primeras referencias sobre la utilizacin del C-ELISA fue su empleo en la deteccin de los anticuerpos anti-virus de la lengua azul (4). Se utiliz un MAb contra P7 un eptopo muy conservado del virus de la lengua azul (BTV) y esto permiti detectar anticuerpos frente a los 24 serotipos existentes del BTV. El epitopo no lo comparte ningn otro serogrupo de los Orbivirus estrechamente relacionados, por tanto, la prueba tambin es especfica de BTV. La especificidad del ensayo puede, de este modo, ser adaptada en funcin de la especificidad del anticuerpo de deteccin. La sensibilidad del C-ELISA se mejora utilizando anticuerpos de deteccin conjugados con un enzima (77). El formato C-ELISA se ha utilizado con xito para detectar en gran nmero de sueros de cerdo los anticuerpos de la fiebre porcina clsica (177), detectar anticuerpos frente al virus de la fiebre catarral maligna en ovejas, ciervos y bisontes infectados asintomticos (77, 78) y anticuerpos frente a Babesia equi y B. caballi en caballos con infeccin persistente (71, 72). Se ha utilizado ampliamente un ELISA competitivo para brucelosis, basado en el lipopolisacrido liso inmunodominante de Brucella como una prueba de anlisis para la brucelosis en bovinos (98), caprinos y ovinos (96), porcinos (97) y mamferos marinos (99). Ms recientemente, se ha empleado el CELISA en fase slida para la vigilancia serolgica durante el brote de FA de 2001 en el Reino Unido (107). Este ensayo ha facilitado el examen de unos 3 millones de sueros en menos de un ao.
2.
Produccin de antgenos mediante la tecnologa del ADN recombinante
Los avances en gentica y biologa molecular de la dcada de 1970 iniciaron el desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante. Desde entonces el impacto de esta tecnologa es tal que juega un papel vital tanto en la investigacin cientfica como en el diagnstico y tratamiento de enfermedades. La tecnologa del ADN recombinante simplemente se refiere a la transferencia de un gen de un organismo a otro, literalmente, supone la recombinacin del ADN procedente de diferentes fuentes. Entre los objetivos de la tecnologa del ADN recombinante destacan la identificacin, el aislamiento, la modificacin y la re-expresin de genes en otros hospedadores u organismos. Estas etapas permiten al personal cientfico y clnico la identificacin de nuevos genes y las protenas que estos codifican, corregir defectos genticos endgenos y producir grandes cantidades de productos gnicos especficos tales como hormonas, antgenos para usar en vacunas y otras protenas producidas por agentes biolgicos de inters. De particular importancia es el grado de especificidad que se alcanza en las pruebas de diagnstico por la utilizacin de protenas recombinantes. Un ejemplo es el empleo de ESAT-6/CFO-10 (antgenos inmunognicos secretados) presente en las micobacterias virulentas Mycobacterium bovis and M. tuberculosis pero no en la avirulenta BCG ni en la mayora de micobacterias ambientales, para el diagnstico de la tuberculosis en vacas y en el hombre (24, 161). Los pptidos solapados de los antgenos ESAT6 y CFP-10 de M. tuberculosis aumentan la especificidad cuando se utilizan en la prueba ELISPOT para la deteccin del gamma interfern en el diagnstico de la infeccin por M. tuberculosis (61). Presenta el potencial de proporcionar un grado de especificidad en el diagnstico no alcanzable con la protena purificada derivada (PPD), el extracto bacteriano que actualmente se utiliza. Las protenas nativas son quizs los antgenos ideales, proporcionando eptopos de secuencias especficas y estructurales de superficie. Muchas pruebas de diagnstico actuales necesitan antgenos de prueba que tienen que ser producidos de forma continua a partir de cultivos celulares o recogindolos de animales infectados. Estas preparaciones antignicas son costosas y con frecuencia tienen un periodo corto de validez, siendo necesaria la estandarizacin del antgeno en cada nuevo lote. En escasas ocasiones se dispone de protenas naturales en una forma completamente pura, y a menudo se desarrollan anticuerpos contra polipptidos contaminantes que pueden conducir a resultados positivos-falsos. La tecnologa del ADN recombinante produce antgenos que
ofrecen muchas ventajas sobre los antgenos aislamientos a partir de otras fuentes biolgicas. Algunas de estas ventajas son la alta pureza, la elevada actividad especfica y puesto que la protena se sintetiza en clulas crecidas en el laboratorio modificadas genticamente, cada preparacin del producto proteico es idntica a la preparacin previa, asegurndose la invariabilidad lote a lote. Cuando se utilizan antgenos recombinantes en combinacin con un formato C-ELISA, puede no ser necesaria la purificacin del antgeno recombinante a partir del lisado porque la especificidad del C-ELISA reside principalmente en el MAb utilizado. Un ejemplo de este procedimiento es la clonacin de los genes de la envuelta del lentivirus de la artritis/encefalitis caprina en un vector de expresin vaccinia (80). Los pptidos sintticos tambin pueden utilizarse como antgenos valiosos para diagnsticos veterinarios de laboratorio. Las pruebas de diagnstico basadas en los pptidos se apoyan en la seleccin de fragmentos cortos que contienen los eptopos antignicos (lineales) ms potentes que son reconocidos por anticuerpos especficos inducidos por todas las protenas vricas. En los ltimos aos, los pptidos sintticos que imitan a los eptopos especficos de las protenas de agentes infecciosos se han utilizado en sistemas de diagnstico de varias enfermedades humanas y animales. Tanto las protenas recombinantes como los pptidos sintticos, utilizados como antgenos, son tiles para las pruebas de diagnstico acompaantes en DIVA, diferenciando los animales infectados de los vacunados. Las vacunas marcadoras llevan al menos una protena antignica menos que la correspondiente al tipo de virus de campo, que permite el rastreo serolgico de las cepas de campo en individuos vacunados (59). A continuacin se indica un resumen del procedimiento para la produccin de un antgeno mediante la tecnologa del ADN recombinante. La identificacin de un antgeno de significacin cientfica o diagnstica potencial se consigue mediante el estudio de la respuesta de anticuerpos del hospedador frente a las protenas del organismo en cuestin. Los antgenos inmunodominantes, protenas definidas del organismo contra las que el hospedador responde con el ttulo diagnstico potencial mayor, son de inters particular ya que son los principales estimuladores de la inmunidad celular y humoral contra la enfermedad concreta. Muchos estudios encaminados al descubrimiento de antgenos tratan de identificar antgenos inmunodominantes, de relevancia biolgica para ser empleados en la generacin de MAb y en el desarrollo de vacunas. Una vez que se ha identificado una protena de inters, se genera el gen que codifica la protena utilizando en ARN mensajero (ARNm) del organismo como molde para fabricar el ADNc. Este mtodo de clonacin del gen que codifica la protena de inters requiere un conocimiento previo acerca de la secuencia gnica, ya sea directamente del organismo en cuestin o a travs de la utilizacin de secuencias gnicas de especies estrechamente relacionadas con l. Un mtodo alternativo, cuando no se dispone de la secuencia gnica, consiste en la generacin de libreras recombinantes procedentes del ADN genmico del organismo o del ADNc sintetizado a partir del ARNm. Se pueden clonar fragmentos de las libreras recombinantes en un sistema de expresin, que puede ser procaritico o eucaritico, y se puede examinar la librera gnica para detectar la expresin de la protena. Existe una amplia variedad de sistemas de expresin. La protena se puede expresar en bacterias, normalmente E. coli (121), levaduras (26), clulas de insectos empleando baculovirus (147), o clulas eucariotas mediante la infeccin con vectores vricos apropiados (143) o mediante transfeccin permanente. Las diferencias en la glicosilacin cuando se prepara en cultivos celulares de bacterias, insectos o mamferos pueden modificar la estructura de la protena y su reactividad con el anticuerpo. Puede ser necesario extraer el antgeno de la clula o puede ser secretado. Frecuentemente es necesaria la purificacin aunque no siempre. Una tendencia al alza en la produccin de antgenos para la utilizacin en ensayos consiste en el desarrollo de antgenos peptdicos sintticos. Esto permite que los antgenos se prueben como reactivos de diagnstico basados en la secuencia gnica, sin que sea necesaria la expresin de la protena completa, lo que acorta el proceso. Un ejemplo es la produccin de antgenos peptdicos de dos antgenos inmunodominantes, de los que se ha publicado que son candidatos prometedores a ser reactivos de diagnstico para detectar la infeccin por M. bovis en vacas (172). En los ltimos aos, el uso de plantas para un sistema de expresin de la protena parece prometedor. Para la expresin de antgenos candidatos en plantas, los virus de las plantas ofrecen, entre otras ventajas, la rapidez de elaboracin del producto, la flexibilidad y los altos niveles de expresin del gen (48). Ya han sido determinadas las secuencias de genomas de cientos de bacterias y miles de virus. El gen de antgeno puede clonarse fcilmente con la tecnologa de la PCR, utilizando cebadores diseados a partir de la secuencia del nucletido de especies estrechamente relacionadas (126). El gen tambin puede manifestarse y su producto puede purificarse utilizando un pptido apndice. Entonces puede determinarse la antigenicidad de los productos del gen. El anlisis sistemtico del gen del antgeno in silico, a partir de los datos de la secuencia del genoma, acelera el desarrollo de los kits de diagnstico y las vacunas (159).
D. VACUNAS
1. Vacunas bacterianas con deleccin gnica
Durante la dcada pasada, la tecnologa del ADN recombinante ha hecho posible la elaboracin de vacunas ms seguras. Las razones para esta mejor proteccin no estn todava claras, pero una podra ser que las vacunas
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vivas son capaces de expresar antgenos in vivo necesarios para la proteccin que las preparaciones de las vacunas muertas no contienen. Otra razn podra ser que las vacunas vivas son capaces de estimular las clulas presentadoras de antgeno (APC) de una manera en la que las preparaciones de vacunas muertas son incapaces. Lo ms probable es que se trate de un combinacin de ambas, la expresin de nuevos antgenos y la interaccin con APCs. La generacin de las vacunas bacterianas vivas atenuadas se basa principalmente en la generacin y la seleccin de mutantes mediante pases en serie en hospedadores animales alternos, el cultivo prolongado in vitro, cambios en la temperatura de crecimiento o modificacin qumica, que resultan en atenuaciones indefinidas basadas en la acumulacin de numerosas mutaciones genticas. En algunos casos, por razones desconocidas, estos mutantes revierten al fenotipo de campo y, por tanto, no se pueden utilizar como vacunas (144). En 1981 Hosieth & Stocker (62), utilizando la tecnologa del transposn, desarrollaron cepas de Salmonella typhimurium con mutaciones genticas definidas de auxotrofa para aminocidos aromticos (Aro) que eran incapaces de sobrevivir en el hospedador inmunocompetente. Estas cepas pueden conferir proteccin contra el desafo virulento en el modelo murino de salmonelosis y en varias especies domsticas, aunque por razones desconocidas, no todos los mutantes son capaces de proporcionar proteccin en las especies domsticas (141). En 1992, Jones et al. (67) desarrollaron un mutante de Salmonella viva atenuada empleando la escisin genmica precisa de dos genes implicados en la ruta de los aminocidos aromticos, que tuvo como resultado incluso una menor probabilidad de reversin de la cepa al fenotipo de campo. Este mutante demostr ser una vacuna con efectos secundarios clnicos relativamente leves y capaz de conferir proteccin en vacas contra el desafo virulento a la edad a la que el hospedador es ms susceptible. Esta cepa de la vacuna tambin se ha utilizado como vector de transmisin de otros antgenos forneos, lo cual acerca a la realidad el ideal de una vacuna de dosis nica (170). El desarrollo en el campo de la biologa molecular y un mayor conocimiento de la interaccin hospedador-patgeno permitir el diseo racional de vacunas ms seguras y eficaces con marcadores que permitirn distinguir entre hospedadores vacunados e infectados. Aunque la mayora de las explicaciones descritas aqu se centran en Salmonella, se han aplicado tecnologas similares a otras bacterias patgenas. Se ha utilizado la tecnologa en la tuberculosis bovina; si el ganado est vacunado con BCG, el cctel de pptidos ESAT-6/CFO-10 detecta los animales infectados, no vacunados, con el ensayo de gamma IF.
2.
Vacunas marcadas y pruebas diagnsticas complementarias
En salud animal, se puede vacunar a los animales con objeto de prevenir la enfermedad o bien intentar eliminar la infeccin a travs de la aplicacin estricta de medidas sanitarias tales como el sacrificio de los animales infectados y evitando el contacto con otros animales. Para ciertas enfermedades de las que no existe vacuna (p.ej. fiebre porcina africana) y particularmente para las infecciones zoonsicas (p.ej. infeccin de cerdos por el virus Nipah), la nica solucin disponible es el sacrificio sistemtico de los animales infectados. El diagnstico de la infeccin es de importancia extrema cualquiera que sean las medidas que se tomen para combatir la enfermedad. El diagnstico puede ser directo, a travs de la deteccin e identificacin del agente infeccioso utilizando tcnicas inmunolgicas o moleculares, o indirecto, basado en la deteccin de anticuerpos especficos contra el agente infeccioso sospechoso. Los ltimos mtodos tienen como desventaja principal el que se deba esperar hasta que se sinteticen los anticuerpos por parte del animal despus de la infeccin y generalmente no permiten distinguir entre la respuesta inmune humoral resultado de una infeccin o de una vacunacin. Este problema se puede solventar adoptando nuevas estrategias en el desarrollo de las vacunas (105) utilizando tecnologas moleculares que permiten la produccin de vacunas marcadas asociadas con pruebas diagnsticas complementarias. Actualmente existen dos tipos: las basadas en la deteccin de una respuesta serolgica contra una protena cuyo gen delectivo en la cepa de la vacuna (empleada como vacuna replicante o como vacuna inactivada derivada de tal cepa de vacuna vrica delectiva), o en la deteccin de la respuesta serolgica frente a protenas vricas no estructurales (vacunas inactivadas purificadas). En el caso de las vacunas delectivas el gen que codifica la protena no esencial, la caracterstica marcadora, est siempre unido con la prueba de deteccin mientras que en el caso de vacunas de subunidades (p.ej. la protena E2 del virus de la peste porcina clsica expresada en baculovirus) otras protenas vricas distintas pueden ser seleccionadas como marcadores de los ensayos. Con fines de armonizacin, debera elegirse una protena consenso para la prueba (p.ej. la protena gE del virus de la pseudorabia). En el primer tipo de vacunas marcadas, debera utilizarse siempre un marcador negativo puesto que un marcador positivo, por ejemplo a travs de la insercin de un gen que codifica una protena fornea, no es adecuado; este ltimo tipo de vacuna slo podra mostrar si el animal est vacunado pero no indicara si tambin se infect con el virus de campo. La vacuna marcada que se utilice con la intencin de discriminar una respuesta serolgica resultante de una vacunacin de la de una infeccin tendra que estar siempre asociada con una prueba de diagnstico complementaria que se pueda emplear durante una campaa profilctica con el fin de eliminar el agente infeccioso. Las vacunas previas de uso veterinario se disearon principalmente para prevenir los signos clnicos en los animales despus de la infeccin sin tener demasiado en cuenta el impacto epidemiolgico de la vacunacin en la excrecin del virus de campo despus de la infeccin y en su posible diseminacin o circulacin. Si se utilizan vacunas marcadas con objeto de eliminar un virus se debe tener claro el posible impacto en la epidemiologa de la infeccin. Puede haber problemas con este enfoque, por ejemplo si se inhibe la multiplicacin del virus de campo hasta el punto de que no se induzca la sntesis de anticuerpos especficos en todos los animales vacunados. Por tanto, la
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mayora de las vacunas marcadas disponibles slo se pueden utilizar para la certificacin de rebaos y no para conseguir la de animales individuales.
a)
Vacunas marcadas con deleccin de un gen: los ejemplos de la pseudorabia y la rinotraquetis infecciosa bovina
La pseudorabia en cerdos y la rinotraquetis infecciosa bovina son dos infecciones causadas por herpesvirus que se vuelven latentes en el animal, incluso aunque ya est vacunado (111, 115, 116). Se dispuso de la primera vacuna marcada para prevenir la infeccin de cerdos por pseudorabia (165) despus de que Bartha desarrollara en Hungra (7) una cepa atenuada del virus que la causa, que presentaba una deleccin espontnea en la glicoprotena gE. Ms tarde se han desarrollado vacunas anlogas para la rinotraquetis infecciosa bovina. Como se menciona ms arriba, el herpesvirus responsable de la rinotraquetis infecciosa bovina permanece latente despus de la infeccin, haya sido o no vacunado el animal. No importa si la vacuna es del tipo inactivado o atenuado, de cualquier manera el animal se convierte en portador latente despus de la infeccin con un virus de capo. Adems, todas las cepas de vacuna atenuada establecen latencia despus de la vacunacin, incluida las cepas delectivas en la gE. Se debera tener in mente que las vacunas atenuadas producidas con cepas idnticas, delectivas o no, generalmente son ms eficaces que las equivalentes inactivadas (18, 69, 70). En una zona en la que est prohibida la vacunacin, todos los animales sero-positivos en cuanto al virus de la rinotraquetis infecciosa bovina se deben considerar como potencialmente infectados y portadores latentes del virus de campo. De manera similar, en una zona en la que se vacunen los animales con una vacuna convencional (no delecctiva), sea atenuada o inactivada, es imposible distinguir entre vacas vacunadas e infectadas de modo que si est preparado un programa de eliminacin, tambin deben ser eliminados del rebao todos los animales sero-positivos. Una solucin es la utilizacin de una vacuna marcada o delectiva que permite la diferenciacin del anticuerpo producido por la vacuna frente al producido por la infeccin. La protena delectiva de la cepa vacunal debe tener las siguientes caractersticas: 1) 2) 3) 4) 5) 6) Ser una protena estructural, para que sea capaz de producir vacunas inactivadas; No ser esencial con objeto de poder producir la vacuna; No ser un inmungeno protector esencial con el fin de que sea todava una vacuna eficaz; Inducir una respuesta humoral significativa y de larga duracin si est presente para que se pueda utilizar (cuando se deleccione) como marcador; Estar presente en todas las cepas del virus de campo; Inducir una respuesta inmune humoral o celular por un patgeno en los animales ya vacunados.
Si se emplea una vacuna marcada, siempre que un animal sea sero-positivo hacia la protena delectiva, se debera considerar infectado y ser eliminado. La protena gD de herpesvirus, que es un inmungeno protector fundamental, no se puede suprimir pero en cambio puede ser utilizada para desarrollar vacunas de subunidades. El problema principal que se encuentra con el empleo de las vacunas marcadas contra la rinotraquetis infecciosa bovina es su incapacidad para prevenir completamente la circulacin del virus de campo cuando se utiliza dentro del marco de un programa de eliminacin. No se dispone de vacunas que induzcan una inmunidad estril para estas enfermedades. Como consecuencia el calendario de vacunacin debe ser ms riguroso que uno convencional diseado meramente para impedir los signos clnicos en el rebao. Se debe repetir la vacunacin de acuerdo con un programa estricto para reducir la posibilidad de excrecin del virus de campo y debe, adems, estar asociada con medidas sanitarias completas (79). Dentro del marco de una campaa de eliminacin vrica coordinada, la vacunacin debe prevenir la excrecin del virus de campo de los animales sin experiencia previa y evitar la re-excrecin de los animales con infeccin latente. En Holanda se ha investigado bajo condiciones de campo la eficacia de una vacunacin repetida utilizando una vacuna negativa gE inactivada que se administra por va intramuscular. Este estudio ha demostrado la incidencia significativamente reducida de seroconversin contra el virus de campo en el grupo vacunado al compararlo con los animales de control inyectados con placebo. Adems, la circulacin del virus de campo, aunque no se restringi completamente, no obstante fue reducida significativamente (18) y bajo algunas circunstancias incluso se evit (166).
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b)
Vacunacin contra la peste porcina clsica con vacunas de subunidades

En la Unin Europea se ha establecido un programa de eliminacin de la peste porcina clsica. Actualmente, est prohibida la vacunacin que utiliza las vacunas convencionales y se encuentra en vigor una poltica de sacrificio. Esta poltica est desafiada por la existencia de una relacin antignica fuerte con otros pestivirus, tales como el virus responsable de la diarrea vrica bovina (DVB/MD), que impide el diagnstico serolgico, por la circulacin insidiosa de cepas hipovirulentas (14) y, por ltimo pero no menos importante, por la presencia de un reservorio silvestre en el jabal (Sus scrofa) en Europa continental (5). Las vacunas convencionales clsicas tuvieron una eficacia probada (123) e incluso evitaron la emergencia de portadores asintomticos cuando eran de potencia suficiente (15, 74). Las vacunas vivas atenuadas eran ms eficaces que sus equivalentes inactivadas a este respecto (31) y contribuyeron en gran medida a la eliminacin de la enfermedad. Su nica desventaja era la creacin de una poblacin de animales seropositivos, lo que no es aceptable si se pone en marcha un plan de sacrificio. Recientemente se han desarrollado vacunas de subunidades mediante la expresin de la protena E2, un inmungeno fundamental del virus de la fiebre porcina clsica, ya sea en un sistema baculovirus (van Rijn, 1999 129 /id}) o en virus vaccinia o pseudorabia (E1) (132, 168). La vacuna constituida por la protena E2 expresada en baculovirus permite distinguir los animales infectados de los vacunados cuando se utiliza con pruebas diagnsticas complementarias fiables para detectar la presencia de anticuerpos especficos dirigidos contra otros inmungenos fundamentales del virus de la fiebre porcina clsica no presentes en la vacuna de subunidades, tales como la protena NS2, una protena vrica conservada. Desafortunadamente, las vacunas inactivadas no son lo suficientemente eficaces desde el punto de vista epidemiolgico (37) si se las compara con las vacunas convencionales anteriores (35, 163). Adems, las pruebas de diagnstico complementarias disponibles en la actualidad no son del todo fiables y, por tanto, limitan el uso de estas vacunas de subunidades en el campo.
c)
Vacunacin contra la fiebre aftosa utilizando vacunas con un grado de purificacin elevado
Desde 1991 en la Unin Europea se ha prohibido la vacunacin preventiva. Esta prohibicin concluy periodo de vacunacin de 30 aos y, por consiguiente, en la actualidad existen en Europa rebaos de bovinos completamente susceptibles (149). Esta situacin es particularmente nociva cuando la enfermedad se reintroduce de manera accidental (39). El plan de contingencia que se ha desarrollado para ocuparse de los brotes inesperados se basa principalmente en la informacin y preparacin de los socios colaboradores de la Unin Europea. Con vistas a superar los riesgos asociados con la susceptibilidad completa de los ganados europeos, se han establecido bancos de vacunas del antgeno vrico altamente purificado y concentrado (135) y existe la posibilidad de utilizarlas como vacunas marcadas en el caso de un brote de emergencia (34). Considerando que se utilizan vacunas muy purificadas, siempre que se encuentre un animal sero-positivo frente a las protenas no estructurales (NSP) codificadas por el virus utilizando una prueba de diagnstico ELISA (kit 33), es posible entonces que se deba a la infeccin por un virus de campo. La NSP se produce durante la replicacin del virus en el animal infectado y en el cultivo celular. La NSP se debe extraer del antgeno del FMDV por purificacin durante la produccin de la vacuna y debe realizarse una prueba apropiada de los antgenos para demostrar la ausencia de seroconversin a NSP en los animales vacunados. Las NSP se sintetizan al mismo nivel que las protenas estructurales durante la infeccin y por eso producen una buena respuesta inmune humoral. Los animales infectados se convierten en seropositivos a la NSP y los anticuerpos contra la NSP se detectan generalmente utilizando los kits de diagnstico ELISA o el EITB. Desafortunadamente, las pruebas de diagnstico complementarias disponibles en la actualidad slo permiten la certificacin de la ausencia de la fiebre aftosa a nivel de rebao y no a nivel de animal individual. Cuando ocurre la multiplicacin del virus y no estn presentes en los viriones extracelulares utilizados para producir las vacunas purificadas e inactivadas.
d)
Gripe equina como un caso especial

Se ha aplicado un enfoque similar al utilizado para la FA, en un contexto diferente, para la gripe equina (110). Cuando se llevan a cabo estudios acerca de la duracin de la inmunidad protectora con las vacunas inactivadas de la gripe equina, es til tener una herramienta de diagnstico que permita la exclusin de los anticuerpos debidos a la infeccin intercurrente de los animales experimentales mediante un virus de campo de la influenza. Se ha desarrollado una prueba de diagnstico (13) basada en la respuesta serolgica a una protena no estructural codificada por el virus.
3.
Vacunas con vectores vricos
Muchas especies vricas, entre ellas el adenovirus, el herpesvirus y el poxvirus, se han utilizado como sistemas de transmisin (vectores) para antgenos forneos. Se puede utilizar el virus simplemente como un vector, por ejemplo el virus recombinante vaccinia-rabia, o como vector y vacuna contra la infeccin mediante el propio vector silvestre. Un ejemplo de un virus que acta como vector y como vacuna por s mismo, es el capripoxvirus
13
recombinante que expresa un antgeno del virus de la peste de los pequeos rumiantes (11). Un virus vector puede experimentar un ciclo completo de multiplicacin que conduce a la produccin de los virus de la progenie o un ciclo de multiplicacin abortivo sin produccin de progenie, como sucede en el caso del vector avipoxvirus en especies de mamferos. Los vectores ms habitualmente utilizados son los poxvirus y, por tanto, este captulo se centrar en la utilizacin de los poxvirus como vectores vacunales (117). Varias caractersticas hacen que los poxvirus recombinantes sean adecuados para ser vacunas: i) ii) La estabilidad de la vacuna liofilizada (28), su coste reducido, y la facilidad de producir y administrar; La vacuna se puede administrar por varias vas (46) e incluso en el caso del virus vaccinia se ha demostrado que se puede administrar el virus per os (esta caracterstica se ha utilizado para la vacunacin de la fauna salvaje) (113); La capacidad de inducir tanto respuesta de anticuerpos como de linfocitos T citotxicos contra el antgeno forneo de forma que se consigue una inmunizacin de larga duracin despus de una sola inoculacin (142, 143); La flexibilidad de empaquetado del genoma, que permite que cantidades importantes de l se pierdan o deleccionen y que se pueda insertar ADN forneo en su lugar (al menos 25 kb), lo que hace posible la creacin de vacunas multivalentes (118, 119, 142, 143); El uso de poxvirus recombinantes como vacunas permite la discriminacin entre los animales infectados de forma natural y los vacunados ya que la vacuna recombinante exhibe un subconjunto definido de antgenos de los patgenos correspondientes.
iii)
iv)
v)
Dentro de cada gnero de la familia Poxviridae los miembros estn relacionados antignicamente (90). Esta relacin antignica ha planteado una cuestin importante en relacin con la utilizacin de vectores derivados de poxvirus como vacunas vivas, ya que la inmunidad preexistente contra el vector podra reducir el xito de una vacunacin siguiente llevada a cabo con un vector poxvirus homlogo (30, 73). Para solventar este problema, se ha implementado la utilizacin de combinaciones diferentes de vectores y/o vas de inmunizacin (45, 125).
a)
Virus vaccinia como vector

El primer vaccinia recombinante para uso de campo es la vacuna recombinante vaccinia-rabia (VRG) utilizada para la vacunacin oral de zorros contra la rabia. Se desarroll empleando la cepa Copenhagen y una vez que se prob en varias especies diana potenciales bajo condiciones de laboratorio (20, 112, 155), finalmente en 1987 se utiliz bajo condiciones de campo (114) y demostr ser segura y eficaz (20). Se ha empleado a gran escala en diversos pases europeos que, como consecuencia, se han liberado de la rabia (19) al igual que en Norteamrica. Se puede incrementar la inocuidad del virus vaccinia mediante delecciones gnicas mltiples. Se ha demostrado con la construccin de la cepa NYVAC del virus vaccinia (152). Se eligi la cepa Copenhagen del virus vaccinia como sustrato de vacuna y basndose en la secuencia completa del ADN (49), el conocimiento extenso de los genes relacionados con la virulencia y de los genes que determinan la competencia de replicacin en el rango de hospedadores, se perdi la informacin gentica no deseada del genoma vrico de una manera muy precisa. El virus resultante, denominado NYVAC, presenta 18 marcos abiertos de lectura delectiva comparado con la cepa parental. NYVAC est muy atenuado como se ha demostrado en muchos estudios con animales. La inoculacin intracraneal del ratn lactante y del adulto joven demostr un rango de dosis muy favorable comparado con la cepa parental y otras cepas vaccinia. Lo ms significativo es que no existe diseminacin del virus en hospedadores inmunocomprometidos. NYVAC tiene reducida de forma drstica la capacidad de replicacin en una variedad de clulas de cultivo de tejido humano y es incapaz de producir partculas infecciosas en el hombre. Varios ensayos en animales y en el hombre han demostrado la inocuidad de los vectores derivados de la cepa NYVAC (108, 151, 176).
b)
Vectores avipoxvirus
Cuando se considera el desarrollo de vectores derivados de avipoxvirus para la produccin de vacunas para aves, se recomienda la utilizacin de cepas atenuadas con objeto de reducir el probable riesgo y las consecuencias potenciales que surgen de la propagacin ambiental a otras especies aviares. Se han probado extensamente derivados atenuados del virus de la viruela aviar, como el TROVAC, y canarypoxvirus, como el ALVAC, y se ha demostrado que son seguros en varias especies, entre ellas animales inmunocompromentidos y voluntarios humanos. Estos virus se pueden emplear bajo condiciones de seguridad de laboratorio de nivel 1, la categora ms baja para organismos recombinantes (109).
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A pesar del hecho de que su multiplicacin se encuentra reducida a especies aviares, se ha demostrado que las cepas atenuadas de avipoxvirus son vectores eficaces y extremadamente seguros para mamferos. La inoculacin en clulas de mamfero de recombinantes basadas en avipoxvirus, tiene como resultado la expresin del gen forneo y la inoculacin en especies de mamferos induce inmunidad protectora sin que se produzcan los virus de la progenie (153, 154). Esta observacin demuestra que tienen una ventaja significativa de seguridad para ser utilizada en el hombre y en los animales. Puesto que la inmunizacin se puede conseguir en ausencia de una replicacin productiva, se elimina el riesgo de diseminacin del vector entre los vacunados y, por tanto, la propagacin del vector por contacto a individuos no vacunados o al ambiente en general. Adems, el uso de este vector en especies que no son reservorio de avipoxvirus hace que la probabilidad de recombinacin in vivo sea nula. Adicionalmente, estos vectores se pueden utilizar para vacunar individuos con inmunidad preexistente hacia el virus vaccinia. En la pasada dcada, se ha producido una cantidad abundante de virus recombinantes empleando la cepa canarypoxvirus atenuada ALVAC como cepa parental. Un nmero importante de ensayos, tanto en humanos como en animales, ha demostrado la eficacia protectora y la inocuidad de las vacunas utilizando este vector.
4.
Vacunas de ADN
La vacunacin con ADN consiste en la introduccin directa en las clulas del hospedador de un plsmido de ADN bacteriano que expresa una protena antignica bajo el control de un promotor de la clula eucaritica (129). Como consecuencia de esto, se expresa el antgeno forneo dentro de la clula hospedadora y puede estimular la induccin de respuestas humoral e inmune mediada por clulas. Este enfoque de la vacunacin ha sido efectivo contra una variedad amplia de virus, bacterias y parsitos y no slo tiene muchos de los beneficios de las vacunas vivas, sino que tambin tiene varias ventajas frente a estrategias ms convencionales de vacunacin. Por ejemplo, las vacunas de ADN que codifican genes forneos son baratas y fciles de producir; obvian la necesidad de complejos con organismos portadores; estn ausentes los riesgos asociados con vacunas vivas; y se impide el impacto de la inmunidad preexistente hacia el organismo o vector en la eficacia de la vacuna. Sin embargo, una desventaja de la vacunacin con ADN es que, como el plsmido persiste durante mucho tiempo, existe la posibilidad de una integracin cromosmica teniendo como resultado la transformacin celular. La respuesta inmune de las vacunas de ADN se puede mejorar adicionalmente mediante la inoculacin simultnea de inmunoestimuladores, tales como las secuencias motivo CpG (122), plsmidos que expresen citoquinas (178), plsmidos que expresen molculas co-estimuladoras (85), o incluso adyuvantes convencionales (167). Tambin se puede mejorar la inmunogenicidad utilizando como inductor primero una vacuna de ADN plasmdico que exprese una protena inmunognica y posteriormente el refuerzo siguiente con la protena o con un vector vrico recombinante que exprese la protena, estrategia de combinacin llamada induccinpotenciacin (prime-boost) (171). Actualmente se estn desarrollando diversas vacunas de ADN para uso veterinario en vacas, cerdos y aves de corral (100, 106, 167). El ADN innovador del Oeste del Nilo es una nueva vacuna para caballos que ayuda a la prevencin de la viremia causada por el virus potencialmente mortal del Oeste del Nilo; esta vacuna representa un gran hito en la tecnologa y la ciencia del ADN. La administracin del ADN se realiza por va intramuscular, intradrmica, o intranasal; la administracin intradrmica est mediada por partculas emplendose una pistola de genes, en la que el ADN recubre microesferas de oro (82), o se puede efectuar utilizando bacterias intracelulares atenuadas, tales como Shigella flexneri o Salmonella typhimurium (38). Las vacunas bacterianas atenuadas vivas permiten la vacunacin a travs de las superficies mucosas y apuntar de forma especfica al antgeno presentando clulas localizadas en los sitios inductivos del sistema inmune. Mientras este ltimo enfoque tiene varias ventajas, existen varias cuestiones de seguridad que se necesitan tratar antes de aceptar este mtodo de administracin. Deberan tenerse presentes las desventajas de la vacunacin de ADN: estas incluyen la posibilidad de una reintegracin cromosmica con la consiguiente transformacin celular ya que el plsmido persiste en el hospedador durante un largo tiempo, aunque este riesgo es bajo. Otra estrategia de vacunacin con ADN se basa en la utilizacin de un vector de ADN que consiste en el ADNc del virus recombinante Semliki Forest (SFV) bajo el control de un promotor eucaritico y que expresa un gen forneo (9). A diferencia de los vectores de ADN convencionales, el promotor no controla directamente la expresin del antgeno forneo, sino que dirige la sntesis de un trascrito de ARN replicn del SFV recombinante. La traduccin de esta molcula de ARN produce un complejo replicasa del SFV que permite la replicacin del ARN en el citoplasma celular y tiene como resultado la produccin a nivel elevado del ARNm que codifica el antgeno forneo. Puesto que la expresin mediada por el vector SFV es transitoria y ltica, existe menos riesgo de posible integracin cromosmica. Las aplicaciones de la tecnologa de cromosomas bacterianos artificiales (BAC) ofrece posibilidades para la manipulacin de grandes genomas de virus de ADN, tales como herpesvirus (2, 23). El uso de clones BAC de herpesvirus no slo es una poderosa herramienta para el estudio de las funciones y la patognesis de los genes vricos (173), sino que tambin tiene un gran potencial para el desarrollo de la vacuna herpesviral (94). Los estudios experimentales en los que se utilizan clones BAC como vacunas para las infecciones por herpesvirus
15
han resultado prometedores (120, 150, 157). Esta tecnologa para la generacin de vacunas nuevas de herpesvirus tendr un gran impacto y aplicacin en la medicina veterinaria.
5.
Otros avances en la tecnologa de las vacunas
Las vacunas de subunidades, que contienen componentes proteicos o glicoproteicos purificados de un patgeno que se han identificado que portan eptopos crticos implicados en la induccin de una respuesta inmune protectora (6) presentan distintas ventajas en cuanto a la inocuidad y los avances recientes en su produccin empleando la tecnologa del ADN recombinante pueden facilitar su utilizacin ms amplia (36). Tambin se han diseado vacunas peptdicas sintticas (87), sin embargo hasta el momento no han demostrado ser muy efectivas en la induccin de proteccin frente a enfermedades infecciosas. Pueden existir muchas razones por las que los pptidos sintticos no puedan inducir inmunidad protectora. Por ejemplo, incluso los llamados pptidos lineales muestran un grado de flexibilidad conformacional de modo que adoptan una estructura diferente de aquella de la molcula parental y, por tanto, inducen anticuerpos de avidez baja frente al patgeno en cuestin. Una desventaja potencial del uso de pptidos que representan sitios antignicos nicos para estimular una respuesta de anticuerpos protectora, es la posibilidad de seleccionar mutaciones antignicas en el patgeno. Se han desarrollado varias estrategias para inducir respuestas de los linfocitos T citotxicos (CTL) empleando pptidos, tal como acoplar eptopos CTL a toxinas que son capaces de invadir clulas eucariticas o construir partculas tipo virus que porten epitopos CTL forneos (137, 140). Sin embargo, la utilidad de este enfoque en poblaciones hbridas se encuentra limitada por el polimorfismo de las molculas del complejo principal de histocompatibilidad. A partir de partculas producidas procedentes del gen TYA del retrotransposn Ty de levaduras se han preparado otras vacunas con partculas tipo virus que implican protenas de autoensamblaje que se pueden utilizar para transportar antgenos forneos (47). Una vacuna compuesta por partculas tipo virus vacas producidas mediante la expresin de las cuatro protenas estructurales principales del virus de la lengua azul en baculovirus, ha demostrado que protege contra el desafo con el virus de la lengua azul (131). Otro enfoque interesante consiste en el desarrollo de vacunas comestibles. Se pueden disear plantas que expresan una cantidad de protenas forneas y pueden expresar transgenes mltiples en un momento dado (148). La administracin oral de las vacunas de subunidades expresadas en plantas sera de particular inters para proteger contra los patgenos intestinales. Una desventaja sera que los antgenos administrados por va oral fueran susceptibles a degradacin proteoltica. Adems, la administracin oral de los antgenos tiende a producir tolerancia en vez de inmunidad activa. Sin embargo, la tolerancia se puede solventar mediante la expresin de una protena de fusin compuesta por el antgeno con la subunidad B de la enterotoxina termolbil (LT-B) de E. coli (56). La clonacin del genoma vrico completo ha sido posible por la gentica inversa, especialmente la del virus con ANR de polaridad negativa. Mediante la gentica inversa puede clarificarse la funcin de varias NSP, as como la de la funcin oculta de las protenas de virin. De esta manera se facilita la construccin del virus ARN por tecnologa recombinante. Esta tambin permite la identificacin de la estrategia de escape utilizada por el virus para evitar los mecanismos de defensa del hospedador, como el interfern (51, 164). La gentica inversa tambin proporciona un enfoque novedoso para la atenuacin de los virus mediante la supresin de los anti-IFN o de las funciones de las citoquinas de los virus (195). La gentica inversa se puede aplicar a los virus ARN que tienen una estructura genmica relativamente simple, como los virus de la gripe aviar. Se ha observado que la presencia de residuos de aminocidos en el sitio de escisin del gen de la hemoaglutinina ayuda al virus de la gripe aviar a replicarse dentro del animal. Por el contrario, los virus de la gripe aviar altamente patgena, que tienen este tipo de estructura gentica, pueden atenuarse removiendo de ese sitio el residuo de aminocido bsico (81, 95).
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CAPTULO 1.1.7.

BIOTECNOLOGA PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y EL DESARROLLO DE VACUNAS

A. DETECCIN DE CIDOS NUCLEICOS

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(2003). The genome sequence of the SARS-associated

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