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Universidad Andrs Bello Facultad de ciencias Laboratorio de biologa celular 133 Profesores: Luciana Oliveira Cruz Joselin Sofa

Jerez Ortega

TRABAJO PRCTICO N4:

Microscopa II
BIO133-2

Autores:

Juan Pablo Duarte Martn Quezada Fernanda Arredondo

- 05-05-2011 -

INTRODUCCION
La microcopia de campo oscuro se utiliza habitualmente para el anlisis de elementos biolgicos transparentes o sin pigmentacin alguna, nos permitir observar detalles en la superficie de las muestras analizadas. El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por la estructura de la muestra por consecuenciaobservaremos detrs de la muestra en anlisis un fondo completamente oscuro sobre el cual segmentos de la muestra emitirn pequeas partculas brillantes que reflejan la luz del foco hacia el objetivo. Es como una habitacin completamente oscura en la cual si llegase a entra un pequeo rayo de luz podremos ver partculas de polvo flotando en el aire. Lo que en un momento era invisible se volver visible mediante el haz de luz. Habitualmente ser necesario determinar tanto la densidad de las clulas en la suspensin como el porcentaje de stas, ocuparemos una cmara de Neubauer, normalmente utilizada para realizar un conteo celular en microscopia de campo claro o de contraste de fases,es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas de 0.25 mm.

Objetivos
El propsito de este laboratorio es poder analizar una muestra por medio de la microscopia de campo oscuro, donde apreciaremos en nuestros objetivos la luz que reflejara la muestra y detalles que solo podremos ver por medio de esta tcnica de microscopia. Por otro lado realizaremos un recuento de clulas, de una muestra de sangre humana diluida 1000 veces. Para esto utilizaremos la cmara de Neubauer (ocupada para el contaje de clulas), material que aportara una cifra exacta a lo requerido. Y por ltimo trataremos de medir el tamao de las clulas de la muestra. Para lograr nuestro propsito ocuparemos una reglilla en el ocular de nuestro microscopio, la cual despus de ser calibrada, nos ayudara a determinar el tamao de los leucocitos.

Materiales y mtodos
El material principal a utilizar es el microscopio ptico el que servir para la observacin de las muestras. En la primera muestra se visualizara un pelo humano en el que su objetivo ser identificarlo en dos campos diferentes, la primera es analizarlo mediante el microscopio de manera normal con el foco de luz despejado, y la segunda habr un cambio en el foco de luz ya que se le incorporara en la superficie un cartn oscuro dejando un pequeo espacio en sus costados para dejar una baja intensidad de luz hacia el objetivo (en este caso el pelo). Otro material que se ocupo para analizar fue la reglilla con la funcin de calibrar la medicin de los glbulos blancos de un frotis de sangre, esta reglilla presentaba diferentes mediciones (0.05 mm; 0.01 mm) marcadas con las que se poda obtener un dato aproximado del tamao de las clulas, todo esto con la ayuda del microscopio ptico. La ltima muestra analizada fue sangre humana en el que se necesitaba contabilizar las glbulos rojos, para esto se ocupo la Cmara de Neubauer que se adapta al microscopio con contraste claro, esta cmara est marcada con una pequea depresin en el centro formando diminutas cuadriculas. La gota de sangre fue colocada en esta depresin que estaba cubierta por un portaobjetos donde esta comenz a deslizarse, luego se debe esperar un cierto lapsus de tiempo para que sedimenten las clulas. As mediante un microscopio los glbulos rojos son observados y contabilizados donde se tendr que utilizar una frmula para saber el contenido de glbulos rojos en 1mL. Las principales muestras y materiales utilizadas en este laboratorio fueron: Microscopio ptico Reglilla calibrada Cmara de Neubauer Pelo humano Sangre humana Frotis de sangre

Actividad practica
A. Observacin de un cabello La observacin del pelo con objetivo 10X en campo claro se puede ver una franja marrn, plana, sin ningn detalle a distinguir. En cambio, en la observacin con objetivo 10X, a la misma muestra de cabello, con campo oscuro, se aprecia una franja marrn tridimensional destacando los bordes, se nota la forma cilndrica del pelo.

Fig. 1 Pelo con objetivo 10X en campo claro Fig. 2 Cabello con objetivo 10X en campo oscuro B. Reglilla

Fig. 2 Reglilla con objetivo 10X

Utilizamos una reglilla calibrada para calibrar la reglilla ocular La medicin de un glbulo blanco, al ponerlo al microscopio y medirlo con la reglilla, su radio era de aproximadamente 0,01mm [fig. 3].

Fig. 3 Un leucocito medido por un dibujo proporcional a la reglilla con objetivo 10X.

C. Determinacin del numero de clulas

Fig. 5 Cmara de Neubauer. Los cinco cuadrados del centro, es el rea donde se cuentan los eritrocitos. Las reas de las esquinas es donde se cuentan los glbulos blancos.

Contamos 23 eritrocitos en un cuadrado de 0,2 mm x 0,2 mm. Con esto y sabiendo los datos de los cuadrados de la cmara y su profundidad se calcula la cantidad de eritrocitos en 1mm3 de disolucin. Eritrocitos = 23 Volumen del cuadrado = 1/4000 mm 3 N de eritrocitos por cada mm3= Eritrocitos contados N de cuadrados pequeos x Volumen del cuadrado x disolucin N de eritrocitos por cada mm3= 23 x 4000 mm3 x 1000 = 5.750.000 eritrocitos/ mm3 16

Discusin
Es posible convertir un microscopio de campo oscuro a uno de campo claro. La observacin a travs del microscopio de campo oscuro hace que las porciones transparente de la muestra se vean oscuras, mientras que las superficies y partculas se ven ms brillantes. La observacin del cabello con campo oscuro a objetivo 10X resalta los detalles de la superficie del pelo y se aprecia la forma cilndrica de este, en cambio, en uno de campo claro solo se aprecia una figura plana.

Los leucocitos son clulas que se encuentran en la sangre, representes hemticos de la serie blanca, y efectores celulares de la respuesta inmunitaria. Estos no tienen pigmentos por eso su color blanco, tienen ncleo, son capaces de moverse libremente mediante seudpodos y su tamao oscila entre 8 y 20m. Su clasificacin: leucocitos mononucleares y leucocitos. La medicin de un glbulo blanco en el laboratorio, con un microscopio con objetivo 10X y con una reglilla calibradora fue de 0,01 mm, lo que corresponde 10m. Por tamao puede ser un linfocito, cuyo tamao es de 8 a 15m, un basfilo, el cual mide 10m o un Eosinfilo que mide de 10 a 12m.

La cmara de Neubauer es un instrumento, adaptado al microscopio de campo claro o al de contraste de fases, utilizado para realizar conteo de clulas en un medio lquido, en este caso la sangre. Es un portaobjeto con una depresin en el centro de 0,1mm respecto a la superficie y el volumen es de 0,1L. Es un cuadrado de 3 x 3mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas de 0,25 mm, donde sus esquinas corresponden a 1 mm2. Para contar globulos rojos, se agrega una gota de este, entre la cmara de Neubauer y el cubre objeto, luego observar con el microscopio objetivo 10X, el conteo de eritrocitos se hace en el centro de la cmara de Neubauer de 1mm x

1mm, el cual, consta de 25 cuadrados de 0,2 mm x 0,2 mm. Muy importante es recordar que los eritrocitos que quedan en la mitad de las lneas inferior y/o de la derecha no son contabilizados. El conteo de eritrocitos en varones es de 5 a 5.5 millones y en las mujeres de 4.5 a 5 millones por mm3. Los resultados arrojaron 23 clulas por cuadrado de 0,2 mm, lo que corresponde a 5.750.000 eri/mm3 de sangre (sin diluir), la muestra no est dentro del rango superior, que es el de varones pero no se aleja mucho, probablemente se deba al mal conteo de eritrocitos o por error de disolucin de la muestra de sangre. En un principio la muestra fue diluida en 1:10, pero eran muchas clulas, as que se diluyo en 1:1.000, pero an as fue diluida en 1:10.000 mas no funcion, de tal forma que la disolucin usada fue de 1:1.000. Lo ms probable es que todo este proceso de prueba de diluciones haya generado un error que afect al resultado de conteo de eritrocitos en la cmara de Neubauer.

Bibliografa
http://es.wikipedia.org/wiki/Linfocitos http://es.wikipedia.org/wiki/Monocitos http://es.wikipedia.org/wiki/Neutrofilos http://es.wikipedia.org/wiki/Basofilos http://es.wikipedia.org/wiki/Eosin%C3%B3filos http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_campo_oscuro http://migueldegetaupbl.blogspot.com/2008_02_01_archive.html http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A1mara_de_Neubauer http://bioservice77.obolog.com/camara-neubauer-100991