THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY Examens immunologiques PDF Split Merge Pages.

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DCEM1 2008 Nolwen PRIE Laboratoire dimmunologie CHU Nantes

INTRODUCTION

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY Introduction dune substance trangre, lantigne, dans lorganisme PDF Split Merge Pages. ! rponse immune You can order danticorps par les plasmocytes ! scrtion the program at www.filehunter.com
2 fragments Fab ! sites de reconnaissance de lAg fragment Fc raction antigne-anticorps interaction pitope/paratope

! Dfinitions
1.Epitope = THIS IS Aantignique dterminant DEMONSTRATION

PAGE PRODUCED BY 2. PDFParatope = site de Pages. Split Merge liaison de lanticorps You can order the program at 3.Haptne: ! petite www.filehunter.com molcule antignique mais
non immunogne

4.Ractions croises: ractivit d'un anticorps vis vis dun antigne diffrent de celui qui a suscit son apparition

Anticorps polyclonaux et anticorps monoclonaux ! anticorps polyclonaux THIS IS AdAc de spcificits diffrentes mlange DEMONSTRATION Ac dirigs contre : PAGE PRODUCED BY -les diffrentes molcules de la substance injecte PDF-les diffrents dterminants dune mme molcule Split Merge Pages.

You can order the program at ! Anticorps monoclonaux www.filehunter.com Ac fabriqus par une ligne unique de ly B
= clone cellulaire Ac strictement identiques et homognes =spcificit unique ! synthse dAc monoclonaux: -Technique des Phages display : banque de fragments variables -Technique des hybridomes

Technique des hybridomes

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY PDF Split Merge Pages. You can order the program at www.filehunter.com

I/ SITE ANTICORPS

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY STRUCTURE : PDF Split Merge Pages. You can order the program at www.filehunter.com
TAILLE : une quinzaine dacides amins

II/ REACTION ANTIGENE ANTICORPS

THIS IS A DEMONSTRATION Liaisons PRODUCED BY PAGEnon covalentes rversibles spcifiques PDFde liaison Merge Pages. Split varie en fonction de : Force You can order the program at la distance entre les molcules dAg et dAc complmentarit dans l'espace www.filehunter.com aires de contact tendues

II.1 Bases physico-chimiques de la liaison Ag-Ac

Effet du PH, de la force ionique et de la temprature:

sur les vitesses de ractions Ag/Ac certaines ractions sont plus rapides froid 4C et d'autres 37C PH acide: dissociation du complexe Ag/Ac

II.2 Proprits de la liaison Ag/Ac A/ La constante dassociation intrinsque(1):

THIS IS A DEMONSTRATION liaison rversible entre un haptne et un anticorps PAGE PRODUCED BY k PDF Split Merge Pages. : [A] [H] k = [AH] k A + H AH Loi daction de masse You k can order the program at A site anticorps www.filehunter.com H haptne
k vitesse d'association du complexe AH k vitesse de dissociation du complexe AH

constante d'association intrinsque = K = k/k en litre /mole ou M-1 = affinit de lAc pour le site antignique " la force de la liaison Ag/Ac

A/ La constante dassociation intrinsque(2): Changement dun seul acide amin ! variation de laffinit: -systme immunitaire ! maturation daffinit par mutation THIS IS A DEMONSTRATION -micro-organismes ! chapper la rponse immune de PAGE PRODUCED BY lhte

PDF Split Merge Pages. exemples de constantes dassociation: You can order the program at Trs affine Ag / Ac 1010 1013 www.filehunter.com 7 10
Peu affine Ag / Ac Rcepteur cellulaire / hormone Transporteur srique / hormone Enzyme / substrat Albumine /mdicament 10 10 109 1011 108 1010 104 106 104 106

M -1 M -1 M -1 M -1 M -1 M -1

" trs grande spcificit des ractions immunologiques " sensibilit des dosages immunologiques

B/ Valence d'un anticorps nombre A DEMONSTRATION THIS IS de sites antigniques identiques auxquels peut se lier une molcule d'anticorps PAGE PRODUCED BY fragment Merge Pages. PDF Split Fab ! monovalent Les Ig G ! bivalentes You can order the program at Les Ig A monomriques ! bivalentes Les Ig M pentamriques ! www.filehunter.com dcavalentes Linteraction entre Ag/Ac est dautant plus forte que la valence est leve. Des molcules avec de multiples pitopes peuvent former un rseau tridimensionnel avec des Ac multivalents : prcipits ou agglutinas.

C/ Affinit Caractrise la force et la stabilit de la liaison entre un Ag et un Ac. THIS IS Astructure complmentaire parfaite Forte affinit = DEMONSTRATION Calcul daffinit: constante dassociation intrinsque K PAGE PRODUCED BY

PDFD/ Avidit: Split Merge Pages. Macromolcules : multiples dterminants antigniques You can order the program at Ensemble des forces dinteraction entre molcules dAc et dAg: www.filehunter.com pas de calcul possible de cette force
nergie de liaison > # des nergies de liaison de chacun des sites impliqus !La valence augmente la stabilit des complexes par coopration entre les sites
Intrt diagnostic: Mesure de lavidit des Ac (diagnostic de la toxoplasmose)

E/ Spcificit

THIS IS site de liaison lAc (Fab) est spcifique Spcificit: unA DEMONSTRATION dun dterminant antignique et dun seul PAGE PRODUCED BY PDF de la vaccination Principe Split Merge
lpitope. Proprit utilise pour dtecter in vitro des Ac dans les srum des patients ou des Ag la surface de cellules des patients.

Pages. You can order the program at www.filehunter.com Repose sur une complmentarit troite entre le paratope et

II.3Classification des ractions Ag-Ac utilises en diagnostic

THIS IS A DEMONSTRATION 1 les PRODUCED BY PAGEractions "primaires" mise en vidence de linteraction directe PDF Split Merge Pages. entre un Ag et un Ac. Youles mthodes "secondaires" 2 can order the program at mise en vidence de phnomnes www.filehunter.com physiques qui dcoulent de la raction Ag-Ac : -prcipitation
-agglutination -raction dpendant du complment

III Tests directs = Ractions Primaires

THIS IS A DEMONSTRATION seule la liaison Ag /Ac intervient PAGE PRODUCED BY raction non visible PDF Split Merge Pages. " marquer lAc ou lAg par: You can order the program at Une enzyme et son substrat www.filehunter.com
changement de couleur du milieu ractionnel Mesure dune Densit Optique Incorporation dun isotope radioactif Mesure de la radioactivit Couplage un fluorochrome Mesure dune fluorescence

!Applications : # recherche dantignes -dosages hormonaux THIS IS A DEMONSTRATION -dosages de marqueurs tumoraux -dosages de BY PAGE PRODUCEDmdicaments -typage de lymphocytes cytomtrie PDF Split Merge Pages. de ux You can order the de coupes de tissus ou -analyse program at frottis www.filehunter.com (immunohistochimie) # recherche danticorps -srologies virales, bactriennes, parasitaires -dosages dIgE totales ou spcifiques -dosage dauto anticorps

III.1 Dosages radio-immunologiques (RIA)

! les radiolments Iode 125, le tritium 3H THIS IS A radioactivit ! compteur DEMONSTRATION

PAGE !avantages: PRODUCED BY - mthodes rapides -hautement reproductibles PDF Split Merge Pages. -trs prcises

You can order the program at ! technique de rfrence www.filehunter.com

-dosage des auto-Ac anti-ADN dans le lupus (Test de Farr) -dosages hormonaux -Recherche des IgE spcifiques (RAST) et des IgE totales ! inconvnients : -utilisation de matriel radioactif -risques de ractions croises

Radio-immunosorbant: dosage RIA par comptition:

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY IgE*/ IgE vis vis de la comptition fixation PDF Split Merge Pages. Ac anti-IgE Mesure du signal libre ou du signal li et You can order the programcourbe talon report sur une at www.filehunter.com Signal li/libre
Courbe talon: Quantit dAg en fonction du rapport radioactivit lie/ radioactivit libre

Ac anti-IgE fixs sur un support + une quantit dIgE marques + srum contenant les IgE doser

Signal Ag

concentration

Quantit dAg en ng/ml

RAST :Radio-allergosorbant

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED MesureRIA IgE spcifiques dun BY des Ag par Ag (allergne fix sur un support) + PDF Split Merge Pages. les IgE spcifiques doser srum contenant You can order the program at Incubation www.filehunter.com + Ac marqu anti-IgE
Mesure du signal aprs sparation de phase: proportionnel la quantit dIgE spcifiques du srum doser

III.2 Immunofluorescence IF

THIS IS A DEMONSTRATION !Visualisation de la raction Ag/Ac grce PAGE PRODUCED BY au marquage de lAc par un fluorochrome PDF Split Merge Pages. !Les fluorochromes: You can order the program at ex: isothiocyanate de fluorescine (FITC) www.filehunter.com
phycoerythrine (PE) rayonnement ! microscope UV ou cytomtre Avantages: -technique sensible et simple -Permet la recherche de plusieurs Ag sur une mme cellule (CMF) ou sur un mme tissus

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY PDF Split Merge Pages. You can order the program at www.filehunter.com o IFD: ractif = Ac marqu
analyse possible de plusieurs Ag -sur un tissus :Immunohistochimie -sur des cellules :cytomtrie en flux o IFI: ractif= Ac secondaire marqu (antiglobuline) Recherche dAc dans le srum

Exemple 1 : IFI

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY IFI: recherche PDF Split Merge Pages. danticorps antiYou can DNA sur cellules order the program at Hep-2 www.filehunter.com

Exemple 2 : La cytomtrie de flux

Etude des cellules aprs une incubation avec des Ac marqus par un fluorochrome dirigs contre les Ag recherchs .

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY PDF un flux Merge Passage dans Split laminaire et Pages. analyse descan order une program at You cellules une par the devant un faisceaux de lumire www.filehunter.com monochromatique
! avantages : - analyse des cellules une par une = mesure exacte -multiparamtrique $ taille, granulosit, fluorescence 1 mesure de la lumire diffuse = renseignement morphologique 2 mesure de la fluorescence = prsence ou absence des Ag recherchs

Exemple 2 : La cytomtrie de flux protines membranaires spcifiques des populations THIS IS A DEMONSTRATION de lymphocytes : PAGE PRODUCED BY rcepteur, enzyme $ molcules dadhrences, de signalisation, $PDF Splitselon les Cluster de Diffrenciation CD classification Merge Pages. Ac monoclonaux spcifiques deprogram at You can order the ces protines www.filehunter.com Complexe CD3/TCR : marqueur pan-T
$

CD4 : marqueur des ly Th auxiliaires CD8 : marqueur des CTL CD16 : rcepteur FcgRIII marqueur des cellules NK CD19 : marqueur spcifiques des lymphocytes B

Exemple 2 : La cytomtrie de flux

THIS IS A DEMONSTRATION PN PAGE PRODUCED BY PDF Split Merge Pages. Monocytes You can order the program at R2 www.filehunter.com lymphocytes
BT01a.001

Granulosit

R2

200

400

600 Taille

800

1000

BT01a.001

BT01a.001

BT01a.001

CD4APC

CD3PC5

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

CD45 FITC

10 0

10 1

CD3PC5

10 2

10 3

10 4

CD3PC5

81%

39%

33%

10 0

10 1

CD8 PE

10 2

10 3

10 4

Applications: Exploration de limmunit cellulaire spcifique

THIS IS A DEMONSTRATION Phnotypage lymphocytaire: BY PAGE PRODUCED tude sur sang prlev sur anticoagulant PDF Split Merge Pages. (aprs NFS lymphocytes=1600 2400/ mm3) You can order the program at = cytomtrie en flux www.filehunter.com
Ex lymphocytes T CD3+ lymphocytes T helpeur CD3+CD4+ lymphocytes T cytotoxiques CD3+CD8+ lymphocytes B CD19+ lymphocytes NK CD3- CD16+ CD56+ 69-79 % 39-53 % 20-32 % 10-16 % 6-18 %

Exemple 3 : La technique Luminex (1) Tester le srum A DEMONSTRATION THIS IS (Ac) de patient sur des microbilles recouvertes de molcules (Ag) ayant les spcificits PAGE PRODUCED BY recherches (HLA, PR3, MPO,Connectives)

PDF Split Merge Pages. Elle permet de dtecter simultanment plusieurs analytes You can order the dans un mme puit ractionnel. program at www.filehunter.com Rvlation par un anticorps anti-IgG humaines conjugu la
PE: lecture au cytomtre en flux.

Exemple 3 : La technique Luminex (2)

THIS IS A DEMONSTRATION Utilisation de microsphres fluorescentes PAGE PRODUCED BY Double lecture aprs excitation par 2 lasers PDF Split Merge Pages. You can order the program at www.filehunter.com Le cytomtre:
Un laser rouge excite les fluorochromes incorpors aux billes pour identification prcise de chacune delle Un laser vert excite le fluorochrome coupl une molcule reporter qui dtecte linteraction Ag/Ac ou sonde /amplicon (PE)

Exemple 3 : La technique Luminex (4) Billes couples leur surface avec des sondes oligonuclotidique caractristiques THIS IS A DEMONSTRATIONdallles des peptides (antignes purifis) caractristiques PAGE PRODUCED BY danticorps PDF Split Merge Pages. des anticorps de capture caractristiques dantignes You can Applications: order the program at www.filehunter.com Recherche danticorps Recherche de peptides particuliers Recherche dallles particuliers

Exemple 3 : La technique Luminex (3)

THIS IS de cette technologie: CaractristiquesA DEMONSTRATION PAGE PRODUCED Ac et Spcificit: qualit des Ag purifis, BY sondes qui recouvrent Split Merge Pages. PDF les billes
Sensibilit: dpend de la qualit program You can order the qui marquage fluorescent Simplicit et temps de manipulation Multiplexage des analyses: 15 cytokines dans un mme tube et jusqu 100 billes diffrentes.

at

www.filehunter.com

Exemple 3 : La technique Luminex (5)

THIS IS A DEMONSTRATION Domaine dapplications: PAGE PRODUCED BY Histocompatibilit: Anticorps anti-HLA, typage HLA PDF Split Merge Pages. Immunologie et cancrologie: dtection et quantification de cytokines,can order the program at You dtection dautoanticorps (MAI)
Infectiologie: dterminer et quantifier les acides nucliques www.filehunter.com (VIH, VHC, HSV) Biochimie: dtection TSH, T4 libre, 17 hydroxyprogestrone, trypsine immunoractive

III.3 Techniques immunoenzymatiques

Rvlation de la raction Ag/Ac grce la fixation dune enzyme lAc Enzyme elle mme rvle par ajout dun substrat chromogne

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY PDF Split Merge Pages. " raction colore dont lintensit est proportionnelle la quantit de complexe Ag/Ac You can order the program at " lecture dune densit optique ! photomtre www.filehunter.com

!les enzymes : peroxydase / phosphatase alcaline !Avantages: pas de risques lis la radioactivit automatisable ! la plus utilise / remplace la radio-immunologie

Exemple: ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay)

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Ag fixs sur une plaque Ajout du srum contenant les Ac recherchs
Incubation lavages

Ajout danti-globulines marques par une enzyme

Incubation lavages

THIS IS A DEMONSTRATION Mesure de DO PAGE PRODUCED BY PDF Split Merge Pages. talon You can order the DO program at Ajout du substrat chromogne de lenzyme www.filehunter.com
COURBE ETALON: DO Ac

Lintensit de la coloration est proportionnelle la quantit de molcule doser

[Ac]?

[Ac] pg/ml

IV. Tests indirects = Ractions Secondaires

IV.1 Immunoprcipitation

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED liquide Limmunoprcipitation en phase BY !PDF Split phnomne quantitatif Description du Merge Pages. You dHeidelberger ! courbecan order the program at www.filehunter.com systme Ag-Ac prcipitant
Ac en quantit constante + antigne ajout en quantit croissante ! Thorie du rseau : Marrack multivalence des Ac et Ag = chaque Ac est li plusieurs Ag

courbe dHeidelberger
1-zone dexcs danticorps zone de travail en immunoprcipitation 2- zone dquivalence 3- zone dexcs dAg

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saturation incomplte des Ac ! petits complexes immuns solubles

rseau de complexes Ag-Ac insolubles

dissociation partielle du rseau ! complexes Ag-Ac solubles

THIS IS A DEMONSTRATION Turbidimtrie ! mesure de la diminution dintensit dune lumire PAGE PRODUCED BY monochromatique entrane par la formation de complexes immuns PDF Split Merge Pages. You can order the program at www.filehunter.com
entrane par la formation de complexes immuns * Applications: IgG, A, M Protines de linflammation :CRP, orosomucode, haptoglobine Transferrine, fractions C3, C4 du complment

Applications pratiques: turbidimtrie et nphlmtrie

Nphlmtrie ! mesure de la dispersion dune lumire monochromatique

Limmunoprcipitation en milieu glifi

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED des antignes et/ou des anticorps BY diffusion ordonne, en fonction de la taille PDF Split Merge Pages. Les complexes Ag-Ac sont emprisonns et forment un front de prcipitation You can order the program at Immunodiffusion en tube www.filehunter.com
Immunodiffusion simple

! Description du phnomne quantitatif raction dans un gel ! rseau maill de macromolcules filamenteuses !

! Immunodiffusion radiale quantitative de MANCINI

Immunodiffusion bidirectionnelle

! Mthode dOUCHTERLONY

V.Ractions Ag/Ac faisant intervenir des Ag cellulaires ou particulaires

THIS IS dagglutinations V.1 RactionsA DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY ! Mcanisme de lagglutination Ag sur un lment figur + Ac spcifique agglutinant PDF Split se manifeste par: Merge Pages. Lagglutination You can order thesuspension des particules 1-une clarification du milieu de program at 2-une formation dagglomrats observables soit l'il nu, soit au microscope. www.filehunter.com
particules antigniques : - des cellules vivantes . bactries . parasites . hmaties - des particules inertes recouvertes dAg . latex . cristaux de cholestrol

! Agglutination directe

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY PDF Split Merge Pages.titre technique semi-quantitative : rsultat en You can order the program at titre = inverse de la plus forte dilution www.filehunter.com agglutination

Ag naturellement prsent la surface de la particule Ac directement agglutinant ! IgM temprature de la raction : de 4C 37C ! agglutinine froide

donnant une

Applications : -Groupages sanguins -Titrage des agglutinines froides auto-anticorps anti-globules rouges ! AHAI -virologie : MNI test ! IgM agglutinants les hmaties de mouton

Groupages sanguins

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY PDF Split Merge Pages. You can order the program at www.filehunter.com

THIS IS A DEMONSTRATION Ag soluble sur un support inerte : PAGE PRODUCED BY billes de latex ou de polystyrne PDF Split Merge Pages. hmaties (hmagglutination passive) You can order the program at Applications: www.filehunter.com
immunologie : dtection et titrage des facteurs rhumatodes ! raction de Waaler-Rose :rythrocytes de moutons recouverts dIgG de lapins. ! test au latex : particules de latex recouvertes dIgG humaines.

! agglutination passive

THIS IS A DEMONSTRATION Dtection dAc non agglutinants BY PAGE PRODUCED fixs par leurs fragments Fab aux hmaties PDF Split Merge Pages. srum anti-globuline ! site antignique sur Fc reconnu par un You can order the program at NB : anti-globulines ! anticorps dirigs contre une Ig www.filehunter.com
Applications : 1- Transfusion sanguine 2- Allo-immunisation foeto-maternelle (incompatibilit rhsus) 3- Anmie hmolytique auto-immune 4- Anmie hmolytique immunoallergique

!Ex: Test de Coombs

! Coombs direct = test globulaire : recherche dAc fixs in vivo sur les hmaties

THIS IS A DEMONSTRATION ! Coombs indirecte = test srique : PAGE PRODUCED BY recherche dAc dans le srum aprs PDF Split Merge Pages. fixation sur des hmaties tests (in vitro) You can order the program at www.filehunter.com
Anti-globuline agglutints

V.2 Ractions utilisant le complment

THIS IS ! activation du complment Raction Ac/AgA DEMONSTRATION Si Ag de PRODUCED BY lyse de la cellule PAGE membrane cellulaire ! concerne PDF Split Merge Pages. lecture : sican orderest une program at You la cellule cible the hmatie ! raction Ag Ac = lyse des hmaties ! www.filehunter.com dosage de l'hmoglobine libre

Exemple : dosage de lactivit du complment, CH50 Mesure lactivit fonctionnelle globale de la voie classique du complment.(suivi des lupus, dficit de certains facteurs) Rsultats rendue en % dactivit par rapport un pool de srums humains tmoins.

Mesure de lactivit du complment

THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY PDF mouton Srum : hmaties de Split Merge Pages. sensibilises l'aide Youlapin antican orderComplment the program at dAc de hmaties. www.filehunter.com
Fixation et activation du complment: formation du complexe dattaque membranaire

Le complexe Ag-Ac ainsi form permet au complment contenu dans le srum test de se fixer sur l'anticorps et de provoquer la lyse des hmaties

Libration dhmoglobine mesure la DO 540 nm

Le % de lyse est proportionnel la quantit de complment contenu dans le srum tester.

Lyse des hmaties

Conclusion: THIS IS A DEMONSTRATION PAGE PRODUCED BY Les proprits physiologiques PDF Split Merge Pages. de la liaison entre un Ac et lAg spcifique de cet Ac You can order the program at sont utilises dans de nombreux dosages www.filehunter.com en biologie. des fins diagnostic