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Principe physique de la Fluorescence

Tounsia At-Slimane, UMRS 938, CDR Saint-Antoine CHU Saint-Antoine

La microscopie est divise en deux grands groupes I-La microscopie optique ou photonique: La microscopie en lumire directe La microscopie en contraste de phase La microscopie fluorescence II-La microscopie lectronique: La microscopie transmission La microscopie balayage

La microscopie optique (ou photonique)


La plus ancienne et celle dont il existe le plus de variantes Principe: la prparation est claire par une lampe. Les molcules observer vont interagir avec la lumire de plusieurs faons

Soit en absorbant certaines longueurs dondes de la lumire. Cest la microscopie en lumire directe.

Soit en provoquant un dphasage des diffrents rayons lumineux. Cest la microscopie en contraste de phase.

Soit en mettant de la lumire une autre longueur donde que celle dorigine. Cest la microscopie fluorescence.

Introduction la Fluorescence Le succs de la Fluorescence est li sa grande sensibilit de dtection


Utilisation extensive dans de nombreux domaines: - Physique - Chimie - Biochimie - Biologie - Mdecine - Industrie pharmaceutique - Environnement Intrt de la fluorescence en Biologie: 1- Localisation subcellulaire de lipides et de protines (ex vivo) 2- Etude dynamique du trafic intracellulaire 3- Etude des interactions molculaires 4- Etude de la viscosit membranaire 5- Etude du repliement dune protine (dnaturation / renaturation) 6- Etude du Squenage de lADN 7-Analyse gntique par hybridation in situ (FISH)

Introduction la Fluorescence Un peu dhistoire


Anne 1565 1602 1640 1833 1842 1845 1852 1853 1858 1867 1858 1888 Chercheur Monardes N. Cascariolo V. Licetus Brewster D. Becquerel E. Herschel J. Stokes G.G. Stokes G.G. Becquerel E. Goppelsrder F. Von Baeyer A. Wiedemann E. Evnement
Emission de lumire par une infusion de bois Lignum Nephriticum (premire publication dune observation de la fluorescence) Emission de lumire du phosphore de Bologne (premire publication dune observation de la phosphorescence) Etude du phosphore de Bologne. Premire dfinition dune mission de lumire qui ne soit pas dorigine thermique. Emission de lumire par des solutions de chlorophylle Emission de lumire par du sulfure de cadmium sous excitation UV. Premire assertion sur le fait que la lumire mise correspond des longueurs donde plus grande que la lumire incidente. Emission de lumire par des solutions de sulfate de quinine Emission de lumire par des solutions de sulfate de quinine sous excitation UV Introduction du terme fluorescence Premires mesures de luminescence rsolue en temps (phosphoroscope) Premire analyse fluorimtrique Synthse de la fluorescine Introduction du terme luminescence (Tir du livre de Bernard Valeur)

Introduction la Fluorescence

La premire observation de la fluorescence: John Frederick William Herschel En 1845 Solution de quinine

Introduction la Fluorescence

LUMINESCENCE

PHOTOLUMINESCENCE

-CHIMILUMINESCENCE -BIOLUMINESCENCE -THERMOLUMINESCENCE -ELECTROLUMINESCENCE etc.

FLUORESCENCE

PHOSPHORESCENCE

La photoluminescence est un phnomne radiatif conscutif une excitation lumineuse (photons de lumire visible ou ultraviolette). La chimiluminescence est un phnomne radiatif conscutif une raction chimique (chimiluminescence vraie) ou enzymatique (bioluminescence).

Introduction la Fluorescence

La Fluorescence Molculaire
Phosphorescence Croisement intersystme Emission de fluorescence Fluorescence retarde Conversion interne Transfert de charge intramolculaire

hv

Changement conformationnel

MOLECULE EXCITEE
Transfert de proton transformation photochimique Formation dexciplexe Formation dexcimre Transfert dnergie Transfert dlectron

Divers Processus suivant lexcitation dune molcule


(Tir du livre de Bernard Valeur)

Principe de la fluorescence Loi de Stokes


E1
Emission de fluorescence

E0

Absorption UV

Lnergie emmagasine par un photon est inversement proportionnelle sa longueur donde


h = constante de planck C = vitesse de la lumire = longueur donde

E= hc/

Remarque: du fait de la dissipation dnergie, lnergie mise est plus faible que lnergie excitatrice et donc la longueur donde est plus leve. hvex > hvem

ex < em

Principe de la fluorescence

Diagramme de Jablonski (trs simplifi)


Transitions radiatives et non radiatives entre tats lectroniques
Etat excit Singulet

S2 S1

Diagramme de Perrin-Jablonski -11 -9


10 -10 S

CI
10-10-10-8S CIS Relaxation non radiative Fluorescence Absorption Transfert dnergie Non radiatif

10-15S

Etat excit triplet T1 10-10-10-7S Photoblanchiment Phosphorescence

hvex

10-6-1S

Etat fondamental S0 Longueur donde (nm)

Etat fondamental S0

Transitions radiatives: Fluorescence et phosphorescence. Transitions non radiatives: conversion interne (CI), croisement intersystme (CIS).

Principe de la fluorescence

Etat singulet et tat triplet: Distinction entre fluorescence et phosphorescence


Fluorescence
S2 Etat fondamental S1 Etat excit triplet T1

Phosphorescence

Absorption

Dsexcitation

Absorption

Dsexcitation

10-15S

10-10-10-7S

10-6-1S

Etat fondamental S0 Lmission de lumire se produit entre deux tats de mme multiplicit (singulet excitsingulet fondamental).

Etat fondamental S0 Lmission de lumire se produit entre deux tats de multiplicit diffrentes (Triplet T1singulet fondamental S0). Processus plus long que la fluorescence.

Rappel: Multiplicit, M= 2S+1

Si S=+1/2-1/2 M=1 (Singulet) Si S=+1/2+1/2 M=3 (Triplet)

Introduction la Fluorescence
Un spectre dmission de fluorescence est un histogramme des nergies libres par la population de fluorophores lors de la transition radiative vers les diffrents niveaux de rsonances de ltat fondamental S0.

S1

Etat excit

S0

Etat fondamental

intensit

Longueur donde Energie


(Daprs B. Valeur)

Introduction la Fluorescence

Spectres et dplacement de Stokes


Une partie seulement de lnergie absorbe peut tre mise sous forme de rayonnement Longueur donde du maximum dexcitation < du maximum dmission Dplacement de Stokes = la distance entre les maxima d'excitation et d'mission

ABS.

EM.

La dtection dune espce fluorescente est dautant plus facile que le dplacement de stokes est grand Exemple: pour la fluorescine, respectivement 495 nm et 521 nm, dplacement de Stokes = 26 nm.

Principe de la fluorescence

Caractristiques de la fluorescence

Longueur donde dmission (maximum du spectre): em Rendement quantique de fluorescence: Coefficient dextinction ou absorbance spcifique: Lintensit de fluorescence ou brillance: If Temps de vie de fluorescence:

Caractristiques de la fluorescence

1) Excitation et Emission

Spectres dexcitation Intensit (excitation)

Spectres dmission Intensit (mission) Longueur donde Molecular Probes

Lexcitation dun fluorophore 3 longueurs dondes ne change pas le profil dmission correspondant Par contre, lintensit dmission est proportionnelle lintensit de lexcitation

Caractristiques de la fluorescence

2) Rendement quantique
Lefficacit de fluorescence pour une molcule donne est dtermine par le rendement quantique . Dfini par le rapport entre le nombre de photons mis et le nombre de photons absorbs par la molcule. = If / Ia

Valeur comprise entre 0,05 et 1

Le rendement quantique peut varier en fonction de lenvironnement des fluorochromes: concentration, polarit, PH

Exemple: = 0,85 pour la fluorescine

Caractristiques de la fluorescence

3) Coefficient dextinction ou absorbance spcifique

Reflte la probabilit dabsorption dune molcule. Sa valeur peut constituer un critre pour le choix des colorants Plus est grand, Plus intense sera la fluorescence intensit lumineuse incidente gale

Valeur comprise entre 5000 et 250 000 cm-1.M-1

Exemple: pour la fluorescine 488 nm, = 80 000 cm-1.M-1

Caractristiques de la fluorescence

Absorption: Loi de Beer-Lambert


Lefficacit avec laquelle la lumire est absorbe la longueur donde par un milieu absorbant est caractrise par labsorbance. Labsorbance dun chantillon suit la loi de Beer-Lambert:

Ia = Io - It = Io ( 1 - 10-.C.l )
qui se simplifie :

If 2,3 f . Io . . C. l
Soit une relation linaire entre C, la concentration du fluorophore, et If, lintensit dmission Io : intensit lumineuse incidente It : intensit lumineuse transmise C : concentration de la molcule absorbante, en mol.l-1 (M) l : trajet optique, en cm If : intensit dmission

Caractristiques de la fluorescence

4) Intensit de fluorescence ou brillance


La brillance est proportionnelle et Brillance (unit arbitraire) 72 000 70 000 51 000 2 360 000 600 550 000 1 800 000

Fluorescine Cyanine5 EYFP B-phycorythrine Tryptophan Quantum Dot 605 Quantum Dot 655

80 000 200 000 84 000 2 410 000 6 000 1 000 000 3 000 000

0,9 0,35 0,61 0,98 0,1 0,55 0,60

Caractristiques de la fluorescence

5) Temps de vie de fluorescence


Dure pendant laquelle un fluorophore demeure dans un tat excit. De lordre de la nanoseconde pour la plupart des fluorochromes. Plus ce temps sera court, meilleure sera la sensibilit du fluorochrome. Varie en fonction de lenvironnement: milieu, PH
Dure de vie du singulet excit le plus bas = tau, la constante de temps de dclin de fluo, f

f = f . N
N , constante de temps intrinsque de ltat excit

Quelques exemples

Caractristiques de la fluorescence

5) Temps de vie de fluorescence

0 ns
Impulsion laser (picoseconde)

5 ns

On utilise une lumire pulse pour mesurer le temps de vie de fluorescence (la dtection doit tre rapide). Les molcule sont excites t=0, puis on enregistre lintensit de fluorescence en fonction du temps (Rsolue en temps)

10 ns

32 ns

Daprs Y Usson

Caractristiques de la fluorescence

5) Temps de vie de fluorescence

Daprs Y Usson

Les Fluorochromes en Biologie

Les fluorochromes en biologie Un peu dhistoire


Fin du 19me sicle: methyl violet, malachite green, safranin O, methylene blue Base pour le dveloppement des futures sondes fluorescentes comme la fluorescine, la rhodamine ou lacridine orange. Dbut des annes 1920: Dveloppement de la microscopie de fluorescence: premiers marquages vitaux pour bactries, protozoaires Dbut des annes 1940: Dveloppement (par Albert Coons) dune technique pour marquer les anticorps avec des sondes fluorescentes: dveloppement des techniques dimmunofluorescence. Dveloppement dun large spectre danticorps secondaires coupls une large varit de fluorochromes permettant des marquages multiples. 1992: Clonage du gne codant pour la GFP partir de la mduse du pacifique Aequorea victoria: dveloppement des techniques de production de protines de fusion. Dveloppement de nombreux variants spectraux de la GFP et dcouverte dautres protines fluorescentes Plus rcemment: Dveloppement des nano-particules fluorescentes conductrices: quantum dots permettant le suivi dobjet individuel. semi-

Les fluorochromes en biologie

Au moins trois familles de marqueurs fluorescents

Les molcules organiques: colorants, les sondes fluorescentes Les protines auto-fluorescentes: GFP et ses drivs Les nano-cristaux semi-conducteurs: quantum dots

Les fluorochromes en biologie.

Exemples de fluorochromes couramment utiliss en microscopie de fluorescence


Fluorochrome: Sonde ou molcule naturelle ou synthtique capable dmettre de la fluorescence. Souvent des molcules polynuclaires htrocycliques contenant de lazote, de loxygne avec des systmes dlectrons dlocaliss et des structures ractives qui permettent de les coupler des structures biologiques.

Fluorescine

Texas Red

DAPI

Phosphore Oxygne

Azote carbone Hydrogne

Introduction la Fluorescence
Spectres dabsorption et dmission de liso-thiocyanate de fluorescine et de liodure de propidium

Les fluorochromes en biologie

Les fluorochromes en biologie

Les fluorochromes en biologie

Les fluorochromes en biologie

Les fluorochromes en biologie Quelques exemples des produits drivs de la fluorescine

Les fluorochromes en biologie Quelques exemples des produits drivs de la fluorescine (1)

Les fluorochromes en biologie Quelques exemples des produits drivs de la fluorescine (2)

Une famille de fluorophores pour marquer des protines, des anticorps secondaires, etc

Caractristiques de la fluorescence

Effets denvironnement sur la fluorescence molculaire


Polarit Ions Potentiels lectrique Liaisons hydrogne

FLUORESCENCE MOLECULAIRE
Inhibiteurs

PH

Pression Temprature Viscosit

Reprsentation schmatique des diffrents facteurs environnementaux susceptibles dinfluencer la fluorescence (tir du livre de Bernard Valeur)

Aspect temporel de la fluorescence

Quenching de la fluorescence
Diminution du rendement quantique dun fluorochrome par les conditions environnementales comme la force ionique, le pH, leffet des solvants ou la prsence dautres fluorochromes qui rduisent lefficacit dmission. Le quenching correspond une relaxation non-radiative des lectrons excites vers ltat fondamental.

Exemple de quenching de fluorescence de la 5-tetramethylrhodamine couple des primers M13 par des sondes non fluorescentes attaches en 3.

Fluorescence emission

Aspect temporel de la fluorescence

Deux types de quenching


Quenching dynamique: le fluorophore ltat excit est dsactiv en subissant Un contact avec une autre molcule ( quencheur ). Formation dexcimres: interaction entre les fluorophores pour former des dimres ltat excit ayant un spectre dexcitation altr Quenching statique: le fluorophore tablit un complexe stable et non fluorescent avec une deuxime molcule. La formation du complexe a lieu ltat fondamental. Labsorption de lumire tant un phnomne rapide (10-15 s), les spectres dabsorption sont peu sensibles au phnomne de diffusion et la dynamique molculaire. Seul lenvironnement immdiatement adjacent aux chromophores peut affecter les spectres dabsorption. A linverse, la fluorescence tant plus lente (temps de vie typique = 10ns), lenvironnement pouvant influer sur le spectre dmission de fluorescence est plus large.

Aspect temporel de la fluorescence

Effet de la temprature sur la fluorescence

Quand la temprature diminue, lintensit de fluorescence augmente

Diminution du quenching dynamique, on diminue la probabilit de collision entre les molcules

Aspect temporel de la fluorescence

Influence de la polarit du solvant sur la fluorescence


Quand la polarit augmente, lintensit de fluorescence augmente et diminue

polarit

1 Tolune 2 Chloroforme 3 Actonitrile 4 thanol 5 Mthanol 6 Eau

Wavelength Exemple dmission de fluorescence du 6- bromoactyl-2dimthyllaminonaphthane

Aspect temporel de la fluorescence

Influence du pH sur la fluorescence


La protonation ou la dprotonation de groupes fonctionnels modifient profondment de nombreux fluorophores, -Soit au niveau de leur rendement quantique -Soit au niveau des spectres dexcitation (cas de la GFPwt, pKa 5,5 ou de la fluorescine, pKa 6,3) ou dmission.

Ex= 488 nm

Ex= 514 nm

Ex= 534 nm

Spectres dmission de fluorescence dpendant du pH, de la sonde carboxy-SNARF-1 (Molecular Probes)

Aspect temporel de la fluorescence

Extinction de fluorescence: Photobleaching et fading


Lextinction de fluorescence comprend au sens large tout phnomne diminuant lintensit de fluorescence.

Le photobleaching (photoblanchiment) correspond la destruction irrversible dun fluorochrome excit par la lumire en prsence doxygne. Le fading correspond la diminution de fluorescence sur une longue priode sans ncessairement dexcitation lumineuse (simple oxydation)

FRAP: perte de fluorescence par hyper-excitation lumineuse

Aspect temporel de la fluorescence

Comparaison du photoblanchiment de deux fluorochromes

Alexa Fluor 488

Fluorescein

Les chantillons ont t illumins continuellement et une image a t enregistre toutes les 5 secondes avec une camra CCD.
(Daprs C. Poujol)

Aspect temporel de la fluorescence

Effet de lillumination sur le photoblanchiment


Fluorescine Texas-Red

Illumination time (seconds)

Illumination time (seconds)

Profil de photoblanchiment de la fluorescine et du Texas-Red. Les mmes chantillons sont placs dans un milieu de montage ProLong (antifading reagent), dans un produit X ou dans un milieu sans anti-fading . La prsence danti-fading prserve lintensit de fluorescence en inhibant la formation de radicaux libres.
(Daprs C. Poujol)

Aspect temporel de la fluorescence

Comment limiter le photoblanchiment ou le fading ?


Utiliser des quenchers pour rduire la concentration doxygne
-Agents anti-oxydants: DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane) ou parapenylene diamine -utiliser des milieux de montage avec anti-fading

Attnuer lintensit lumineuse excitatrice Augmenter la vitesse de balayage en microscopie confocale ou diminuer le temps dillumination en microscopie plein champ (obturateur rapide, temps dexposition diminu, rapidit de lacquisition en Z

Les fluorochromes en biologie

Quest ce quun bon fluorochrome?

Coefficient dextinction important Fort rendement quantique (0,8-0,9) Faible rendement triplet Dure de vie de ltat excit courte (3ns) Grand dcalage de Stokes Faible photoblanchiment

Les fluorochromes en biologie

Recouvrement des spectres dmission La solution

(daprs Spencer Brown)

Les fluorochromes en biologie

Lauto-fluorescence

Les fluorochromes en biologie

Les Quantum dots, des nano-cristaux fluorescents


Les Quantum Dots sont des cristaux semi-conducteurs de dimensions nanomtriques (2-10nm) qui prsentent des proprits de fluorescence ajustables par le contrle de leur diamtre.

La magie des QDs est de pouvoir modifier leurs proprits optiques loisir simplement en changeant leur taille, leur forme ou leur composition.

Les fluorochromes en biologie

Proprits des Quantums Dots

Les fluorochromes en biologie

Les diffrentes approches de couplage des QDs des biomolcules

(daprs T. Jamieson et al., 2007)

Les fluorochromes en biologie

Les fluorochromes en biologie

Comparaison in vivo de la rsistance au photoblanchiment des QD et du dextran

(Tir de Dubertret, 2003, M/S)

Les fluorochromes en biologie

Exemples de marqueurs spcifiques des organites

(daprs C.Poujol)