ndices qumicos para caracterizao de frmacos lipdicos

ndice de Saponificao.
Define-se o Indice de saponificao como o nmero de miligramas de hidrxido de Potssio necessrios para saponificar os steres e neutralizar os cidos gordos livres de 1 grama de amostra. O hidrxido de Potssio em meio alcolico e a quente, saponifica os steres e neutraliza os cidos. A quantidade deste reagente, consumida nestas condies e relativamente a um peso determinado de amostra, um indicador quantitativo dos steres e dos cidos livres presentes. No caso dos leos, o seu valor interpretado como indicador de qualidade, atendendo sua dependncia da massa molar dos compostos predominantes em anlise (os triacilglicerol) e, consequentemente, da massa molar dos cidos gordos que os constituem. Para cada leo o ndice de saponificao assume valores de intervalos estreitos e bem determinados. O mtodo proposto para determinao do ndice de saponificao baseia-se no doseamento, por titulao com um cido diludo, do KOH no consumido em condies saponificao da amostra com um excesso deste reagente. A realizao simultnea de um ensaio branco permite por diferena calcular a quantidade de KOH que reage com o peso de amostra tomado para o ensio real.

ndices de Hidroxicidos ndice de Hidroxilo

Exprime-se o ndice de hidroxilo no nmero de miligramas de hidrxido de potssio necessrio para neutralizar o cido actico que se combina por acetilao com os hidroxilos livres de 1 grama de amostra. O valor deste ndice um indicador quantitativo sobre a composio da amostra em compostos hidroxilados. A determinao valiosa para a caracterizao de frmacos gordos cuja composio inclui percentagens significativas de compostos hidroxilados, em especial steres de cidos gordos hidroxilados. o caso do leo de rcino cuja composio inclui cerca de 90% de ricinolena, o ster glicrico de cido ricinoleico (12-hidroxi-9-octadecenoico). Um mtodo proposto para a determinao recomenda a acetilao com anidrido actico, em excesso, na presena de piridina. Esta desempenha o papel de catalizador da condensao e diluente do anidrido actico. Aps a acetilao o anidrido actico no consumido na reaco hidrolisado e o cido actico titulado com uma soluo de hidrxido de potssio. A execuo em paralelo de um ensaio branco, que avalia o cido actico total, permite por diferena determinar o cido actico que se combina por acetilao com o peso de amostra tomado para o ensaio. Devido ao fundamento deste mtodo, o valor determinado pode vir afectado de erros. Por exemplo, os cidos livres presentes na amostra so neutralizados pelo hidrxido de potssio titulante, o que implica que em amostras extensamente hidrolisadas o valor do ndice de hidroxilo determinado possa vir afectado por defeito. O valor desse erro igual ao valor do ndice de cido da amostra.

Determinao do ndice de hidroxilo

Ensaio real
O H3C O H3C O

+ R-OH

Piridina

>

CH3 COO-R + CH COOH 3

Acetilao

O H3C O H3C O

H2 O

> 2 CH3 COOH

Hidrlise do anidrido actico

CH3 COOH + KOH

Titulao do cido actico

Fenolftalena

> CH3 COOK + H2 O

Ensaio branco

Seja:

Clculo
P o peso de amostra tomado para o ensaio; C a concentrao do hidrxido de potssio titulante; v r o volume de titulante consumido no ensaio real; v b o volume de titulante consumido no ensaio branco.

ento,

1000ml de KOH M <> 56,1g de KOH (massa molar do KOH) 1000ml de KOH C <> C x 56,1g de KOH 1ml de KOH C <> C x 56,1mg de KOH (v b-vr)ml de KOH C <> (vb-vr) x C x 56,1mg de KOH
(v b-vr) x C x 56,1mg de KOH <> P I.H. <> 1g de amostra

e o ndice de Hidroxilo dado pela expresso:

I.H.

( vb vr ). C. 56,1 P

ndice de Hidroxilo
Reagentes:

Anidrido actico 25 g Piridina lcool 95 Soluo aquosa KOH 0,5 M Soluo alcolica de fenolftalena a 1% Preparao da mistura acetilante: Solubilizar 25 g de anidrido actico em piridina q.b.p. 100ml.

Ensaio: Lanar num balo de acetilao o peso de amostra (frmaco com lpidos) e o volume de mistura acetilante adequados, em funo do ndice de hidroxilo previsto para a amostra em anlise. ndice previsto Peso de amostra (g) Mistura acetilante (ml) de 10 a 100 2,000 5 de 100 a 150 1,500 5 de 150 a 200 1,000 5 de 200 a 250 0,750 5 de 250 a 300 1,200 10 de 300 a 350 1,000 10 Adaptar um condensador de refluxo e aquecer em banho de gua fervente durante 1 hora. Assegurar que o contedo do balo fica abaixo da superfcie da gua do banho. Executar paralelamente um ensaio em branco. Deixar arrefecer e promover a hidrlise do anidrido actico, por adio, atravs do condensador, 5ml de gua. Se se formar turvao adicionar algumas gotas de piridina. Aquecer de novo o balo em banho de gua por mais 10 minutos.. Deixar arrefecer e adicionar atravs do condensador 5ml de lcool 95 neutralizado a fim de lavar o condensador e o colo do balo. Retirar o condensador e dosear o cido actico com uma soluo de KOH 0,5 M, em presena de fenolftalena.

Calcular o ndice de hidroxilo.

I.H.

( vb vr ). C. 56,1 P

P - Peso de amostra tomada para o ensaio. vb - Volume de KOH consumido no ensaio em branco. vr - Volume de KOH consumido no ensaio real.

ndices de cidos insaturados

A importncia dos ndices de insaturao deve-se ao facto de constituirem indicadores quantitativos dos frmacos com lpidos sobre o teor em cidos insaturados e respectivos steres e eventualmente do tipo de insaturao. Os mtodos de determinao dos ndices de cidos insaturados fundamentam-se na formao de compostos de adio. A adio aos carbonos insaturados das cadeias carbonadas dos cidos pode realizar-se custa de diversos reagentes, normalmente seleccionados pela forma particular como adicionam, permitindo enunciar diversos ndices de insaturao. Cada um deles exprime situaes particularidades de insaturao. Interpretados em conjunto podem revelar aspectos que contribuem para a identificao ou elucidao estrutural da cadeia carbonada de cidos gordos insaturados, especialmente no que respeita ao grau de insaturao e posio das insaturaes.

ndice de Hidrogenao
Define-se como a percentagem de hidrognio expressa em Iodo, adicionada pelo frmaco com lpidos. A adio de hidrognio e consequentemente a determinao do ndice exige equipamento especial, hidrogenadores com catalizadores metlicos. um ndice com um interesse limitado a reas especficas da investigao, quando a adio de ouros reagentes, ou seja, outros ndices de insaturao se demonstram ineficazes. (ligaes duplas nos carbonos adjacentes ao grupo carboxilo, etc..)

ndice de Sulfocianognio
Define-se como a percentagem de sulfocianognio expressa em Iodo adicionada pela amostra. A importncia deste ndice resulta da forma particular como o reagente, sulfocianognio, reage com alguns cidos gordos insaturados: adiciona apenas uma das duas ligaes do cido linoleico e duas do cido linolnico. O seu valor analtico, depende da realizao conjunta do Indice de Iodo, permitindo por comparao, avaliar da composio de cidos poliinsaturados na amostra.

ndice dinico
Define-se como a percentagem de anidrido maleico, calculada em Iodo, que reage com a amostra. Baseia-se na propriedade dos compostos com duplas ligaes conjugadas poderem cicloadicionar o anidrido maleico de acordo com a reaco de Diels e Alder. o nico indice de insaturao que revela especificamente cidos com duplas ligaes conjugadas.

ndice de Iodo
O ndice de Iodo nmero de gramas de halognio, expressa em Iodo fixados por adio, por 100 gramas de amostra. Para a sua determinao faz-se reagir um halognio com um peso rigoroso de amostra, doseando-se posteriormente o excesso do halognio, salvaguardando-se que os compostos halogenados formados sejam apenas compostos de adio. A primeira regra a observar para que se formem apenas compostos de adio e no de substituio, conduzir a reaco de halogenao na ausncia de luz. Apesar deste cuidado, a escolha do halognio reagente tambm crtica, j que alguns no manifestam reactividade suficiente para que a reaco seja quantitativa. Em contrapartida outros halognios reagem to violentamente, que no s se formam compostos de adio, como tambm compostos de substituio. Assim para a determinao do ndice de Iodo preconiza-se o monobrometo de Iodo, (BrI), cuja reactividade adequada aos fins propostos. Os cidos insaturados no reagem todos na mesma extenso: os cidos da srie oleica, monoinsaturados, reagem rapidamente e quantitativamente (2 tomos de Iodo). Da mesma forma reagem os cidos di-insaturados com ligaes no conjugadas. A existncias de duas ligaes conjugadas, implica uma menor reactividade, daquela que estiver mais afastada do grupo carboxilo. Em cidos com trs ligaes duplas conjugadas, a intermdia dificilmente adiciona halognio, fixando-se apenas 2/3 da quantidade de halognio prevista. As ligaes triplas adicionam apenas metade dos tomos de halognio previstos.

ndice de Iodo
Ensaio real
I R
Reaco de adio com excesso de BrI

BrI
abrigo da luz

R Br

BrI + KI

>

KBr + I2

O BrI no consumido convertido em Iodo por reaco com iodeto de Potssio

I2 + Na2S2O3
O Iodo formado doseado pelo tiossulfato

> 2 NaI + Na2S4O6

Ensaio branco

Clculo
Seja: C a concentrao do tiossulfato titulante; v r o volume de titulante consumido no ensaio real; v b o volume de titulante consumido no ensaio branco; P o peso de amostra tomado para o ensaio.

ento,

reaco)

1000ml de Na2S2O3 N

<>

126,9 g de Iodo (equivalente grama do Iodo na

1000ml de Na2S2O3 C <> C x 126,9 g de Iodo 1ml de Na2S2O3 C <> C x 0,1269 g de Iodo (v b-vr) ml de Na2S2O3 C <> (vb-vr) x C x 0,1269 g de Iodo

ou seja, (v b-vr) x C x 0,1269 <> I.I. <> 100g P

e o ndice de Iodo dado por;

I.I.

( vb vr ).12, 69. C P

ndice de Iodo
Reagentes: Bromo Iodo Sol. de Iodeto de Potssio a 10%. Clorofrmio Soluo de tiossulfato de Sdio 0,1 M Soluo de amido a 0,2%. Preparao da soluo de monobrometo de Iodo: Misturar 6,1g de Iodo e 3,9g de Bromo e promover a sua dissoluo em 500ml de cido actico glacial. Ensaio: Pesar para um balo cnico de rolha esmerilada de 200 a 300ml (balo de Indice de Iodo) a quantidade de amostra (frmaco com lpidos) adequada ao Indice de Iodo previsto.

Peso de amostra (g) 1,00 0,50 a 0,25 0,25 a 0,15 0,15 a 1,00

ndice de Iodo previsto < 20 20 a 60 60 a 100 > 100

Solubilizar a amostra em 15ml de Clorofrmio e adicionar 25ml de soluo de BrI, rigorosamente medidos. (O reagente voltil e txico). Rolhar e guardar ao abrigo da luz, para evitar a formao de compostos de substituio, durante uma hora, agitando de vez em quando. Adicionar 10ml de soluo de Iodeto de Potssio a 10%, isenta de Iodo livre, e 100ml de gua, lavando com ela a rolha e o interior do colo do balo. Titular o Iodo libertado com tiossulfato de Sdio 0,1 M, de incio directamente at o titulado apresentar uma cr amarela plida, depois em presena de cerca de 2ml de gua de amido a 0,2%, at desaparecimento da colorao azul. Praticar paralelamente um ensaio branco. Calcular o ndice de Iodo,

I.I.

( vb vr ).12, 69. C P

vb - volume de tiossulfato consumido no ensaio branco. vr - volume de tiossulfato consumido no ensaio real. C - concentrao da soluo de tiossulfato. P - Peso de amostra tomada para o ensaio.

ndices qumicos para avaliao de alteraes dos frmacos com lpidos Alteraes oxidativas
Designa-se por rano a alterao oxidativa dos frmacos com lpidos, que origina a formao de compostos carbonlicos de baixo peso molecular, volteis, que impressionam os sentidos do olfacto e do paladar de forma particular. usual, por motivos meramente didticos, distinguir dois tipos de rano com base, quer na causa do processo oxidativo, quer no tipo de compostos resultantes. Surgem ento as designaes de rano cetnico e de rano aldedico. Caracteriza-se o rano cetnico pela formao, durante o processo oxidativo, de metilcetonas e relaciona-se com a aco oxidativa de certos microorganismos. O rano aldedico, caracterizado pela formao de aldedos de baixo peso molecular, em especial com 7, 8 e 9 carbonos, relaciona-se com a aco oxidante do oxignio do ar, e com a interveno da luz. A formao de rano aldedico implica a oxidao pelo oxignio do ar dos cidos gordos, em especial o oleico e os da sua srie, com formao de perxidos, inspidos e inodoros, e a consequente degradao destes, por mecanismos de radicais livres, com formao dos compostos carbonlicos. usual dividir-se o processo de formao de rano aldedico em duas etapas: a primeira a que se d o nome de Fase de Induo de Rano ou Periodo Incipiente de Rano, que coincide com a formao dos perxidos; a segunda a que se d o nome de Fase de decomposio dos perxidos e que corresponde degradao destes com formao dos compostos carbonlicos.

Ensaios para pesquisa de Rano Aldedico Pesquisa dos caracteres organolpticos.

Entende-se por caracteres organolpticos o conjunto de propriedades directamente apreciveis pelos orgos dos sentidos. Para a pesquisa de rano tm especial valor o odor e o gosto do frmaco em anlise. Os compostos carbonlicos formados durante a fase de decomposio dos perxidos, so volteis e capazes de impressionar os sentidos do olfacto e do paladar de forma particular. Por outro lado, estes sentidos mostram elevada sensibilidade a tais estmulos, reconhecendo o odor e o sabor particular desses compostos, mesmo quando existentes em quantidades vestigirias. Por estes motivos, e tambm porque outros testes concebidos para a pesquisa de rano podem indicar falsos resultados, o teste torna-se de grande utilidade, sobrepondo-se a sua indicao, quando positiva, a qualquer indicao contrria de outro teste de pesquisa da alterao.

Teste de Fellenberg.
Este teste tem por base a pesquisa de compostos com grupo funcional aldedico, que como j referido atrs, se formam na decomposio dos perxidos. Fundamenta-se no facto de estes compostos restituirem a cr violeta-avermelhada ao reagente de Schiff, fucsina descorada pelo metabissulfito.

Refira-se que este mtodo apresenta frequentemente falsos resultados, pelo que a interpretao dos seus resultados deve ser cautelosa e acompanhada pelos resultados de outros testes.

Teste de Kreiss.
Este teste tem por base a pesquisa de um composto particular que se forma no processo de oxidao dos frmcos com lpidos. Trata-se do aldedo epihidrnico que ocorre na amostra sob a forma de dietilacetal. O aldedo epihidrnico reage com o floroglucinol em soluo etrea, formando um composto de colorao avermelhada. Note-se que para que a reaco ocorra necessrio hidrolizar o dietilacetal do aldedo epihidrnico custa de um cido mineral forte. Tal como o anterior, este teste apresenta frequentemente falsos resultados negativos. A elevada volatilidade, quer do dietilacetal, quer do prprio aldedo, e a libertao de calor da reaco de hidrlise, fortemente exotrmica, contribuem para a perda do composto. Por outro lado falsos resultados positivos, podem tambm ser encontrados em amostras no oxidadas mas sujeitas a exposio luminosa e/ou envelhecidas.

Indice de perxido.
Todos os ensaios atrs referidos para pesquisa de rano nos frmacos com lpidos, esto orientados no sentido de pesquisar propriedades ou compostos caractersticos do rano, mas note-se que quer os compostos carbonlicos, quer o dietilacetal do aldedo epihidrnico so produtos da decomposio dos perxidos. Note-se tambm que o cheiro e sabor caractersticos do rano so devidos aos compostos carbonlicos formados nessa fase, j que os perxidos se revelam inspidos e inodoros. Pode ento concluir-se que quer os caracteres organolpticos da amostra, quer os resultados dos testes de Fellenberg e de Kreiss so indicadores de rano se o processo oxidativo tiver atingido a fase de decomposio dos perxidos. Na verdade, a alterao rano inicia-se antes de qualquer daqueles indicadores possa acusar a sua existncia. Os perxidos formados na primeira fase de rano so j produtos da oxidao dos lpidos. Para que a pesquisa da alterao rano seja completa ser necessria a pesquisa, ou mesmo a quantificao, dos perxidos existentes. O ndice de perxido relaciona-se quantitativamente com os perxidos existentes. A Farmacopeia Portuguesa VI, define-o como o nmero de miliequivalentes de oxignio activo por 1000g de frmaco. A determinao baseia-se na oxidao do iodeto, em meio actico, pelos perxidos com doseamento posterior do Iodo formado com tiossulfato. A execuo simultnea de um ensaio branco elimina a interferncia de Iodo contaminante da soluo de Iodeto.

Indice de Perxido
O ndice de perxido, representa o nmero de miliequivalentes de Oxignio activo por quilograma de amostra.
O2 + 4H+ + 4e- --------- 2H2O 2 I- --------------------------- I2 +2 e___________________________ O2 + 4H+ + 4 I- ---------- H2O + 2I2 I2 +2 e- ---------------------------- 2 I-

2S2O32- ---------------------S4O62- + 2 e________________________________ 2 S2O32- + I2--------- 2 I- + S4O62-

O2 + 4H+ + 4 I- ---------- 2H2O + 2I2 4 S2O32- + 2I2 --------- 4 I- + 2S4O62_____________________________________ O2 + 4H+ + 4 S2O32- -------- 2H2O + 2S4O62-

1 eq (O2) --- 1 eq (S2O32-) 1000 ml Na2S2O3 0,01 N ---------- 0,01 eq Oxignio activo 1 ml Na2S2O3 0,01 N -------------- 0,01 meq Oxignio activo (n1 - n2) ml Na2S2O3 0,01 N ------------------ (n1 - n2) x 0,01 meq Oxignio activo

(n1 - n2) x 0,01 meq Oxignio activo ---------- m IP -------------------------------------1000 g

IP =

(n 1 - n 2) x 10

Pesquisa de alteraes oxidativas nos frmacos com lpidos ndice de Perxido (F.P. VI)

Reagentes: cido actico Clorofrmio Soluo saturada de KI Tiossulfato de Sdio 0,01 M Ensaio: Num matraz de 250ml, com rolha, introduzir 5,00g da amostra (m g). Juntar

30ml de uma mistura de 3 volumes de cido actico glacial e 2 volumes de clorofrmio. Agitar at dissoluo da amostra e adicionar 0,5ml de soluo saturada de iodeto de potssio. Agitar exactamente durante 1 min e adicionar 30ml de gua. Titular com tiossulfato de sdio 0,01 M, adicionado lentamente, sem cessar a agitao, at que a colorao amarela quase tenha desaparecido. Adicionar 0,5ml de soluo de amido. Continuar a titulao, com agitao enrgica, at desaparecimento da colorao (n1 ml). Executar um ensaio em branco nas mesmas condies (n2 ml). O ensaio em branco no deve consumir
mais de 0,1ml de tiossulfato de sdio 0,01 N.

IP =

(n 1 - n 2) x 10

Alteraes hidrolticas dos frmacos gordos

A alterao hidrlise deve-se actividade hidroltica de lipases contidas nas prprias oleaginosas de onde so extrados os frmacos com lpidos. Na presena de gua e quando a temperatura favorvel hidrolisam os estres com libertao dos cidos gordos. A hidrlise dos steres tem como consequncia imediata o aumento da acidez.

Ensaios para avaliao da extenso da hidrlise

Os ensaios propostos para avaliao da extenso da hidrlise baseiam-se na determinao da acidez expressa em peso de base tiulante ou em peso de um cido gordo especfico.

ndice de cido. O ndice de cido define-se como o nmero de miligramas de Hidrxido de Potssio necessrios para neutralizar os cidos livres de 1 grama de amostra.
Determina-se, titulando com uma soluo da base referida, os cidos livres de um peso P de amostra solubilizada num solvente apropriado e previamente neutralizado.

Grau de Acidez.
O Grau de Acidez um indicador frequentemente usado para avaliao da hidrlise de corpos gordos alimentares, em especial, do azeite.

Define-se em termos de percentagem de cidos gordos livres, expressa no cido predominante. Dada a sua utilidade na anlise do azeite, simplifica-se muitas vezes a definio, tomando como cido predominante, o cido oleico.

Alteraes hidrolticas dos frmacos com lpidos

Hidrlise
CH2-OOC-R CH -OOC-R CH2-OOC-R
lipases
gua / temperatura

CH2 - OH CH - OH CH2 - OH

R-COOH + R-COOH R-COOH

ndice de Acido. (mg KOH neut. ac. 1g F.G.) ndice de Ester. (mg KOH sap. esteres 1g C.G.) Grau de Acidez. (% c. livres expressa em c. oleico)

Indice de cido
R COOH + KOH R COOK

P - peso de amostra em ensaio. v - vol. de titulante em ml. C - Concentrao do titulante. 1000 ml KOH N --------------- 56,1g KOH 1000 ml KOH C N --------- C.56,1g KOH 1 ml KOH C N ----------- C.56,1mg KOH v ml KOH C N -----------v.C.56,1 mg KOH v.C.56,1 ---------- P I.A. ----------------- 1g v. C. 56,1 I. A. P

Grau de Acidez
1000 ml KOH N ---------------- 282g ac. oleico 1000 ml KOH C N ----------- C.282g ac. oleico 1 ml KOH C N ----------- C.0,282g ac. oleico v ml KOH C N ----------- v.C.0,282g ac. oleico v C 0,282 ----------- P G.A. ---------------- 100g

G. A.

v. C. 28, 2 P

Proporcionalidade entre o ndice de cido e o grau de acidez.

GA

k.IA

v. C. 28, 2 P

v. C. 56,1 P

v. C. 28, 2 P v. C. 56,1 P

28, 2 56,1

0, 502

ndice de cido
Reagentes: Soluo de KOH 0,1 N lcool ter dietlico. Soluo alcolica de fenolftalena a 1% Sulfato de sdio anidro.

Preparao do solvente: Misturar em partes iguais lcool e ter dietlico. Neutralizar a soluo com KOH 0,1 N em presena de fenolftalena. Ensaio: Homogenizar a amostra e desidrat-la por agitao com sulfato de sdio anidro. Filtrar. Pesar, com rigor, cerca de 5 gramas de amostra e promover a sua dissoluo em 15ml de solvente. Neutralizar os cidos livres com a soluo de KOH 0,1 N em presena de fenolftalena, at obteno de uma colorao persistente.

Calcular o ndice de cido, I. A. eo Grau de Acidez, G. A.

v. C. 56,1 P

v. C. 28, 2 P

v volume de titulante gasto no ensaio. C a concentrao do KOH titulante. P o peso de amostra