Primera Parte Proyecto

Proyecto de innovacin: Introduccin de las Tcnicas de Biologa Molecular en el CFGS de Laboratorio de Diagnstico Clnico
PRIMERA PARTE: INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULAR
1.1. Introduccin a la Biologa Molecular 1.2. El descubrimiento del ADN 1.3. Ac nucleicos 1.3.1. ADN 1.3.2. ARN 1.4. Replicacin del ADN 1.5. Disposicin del material genrico en el ncleo
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1. INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULAR

La Biologa molecular es la parte de la Biologa que estudia los seres vivos y los fenmenos vitales con arreglo a las propiedades de su estructura molecular. Un anlisis basado en el ADN nos sirve para el diagnstico de enfermedades infecciosas, genticas y neoplsicas, as como para el estudio de determinados cuadros clnicos. La Biologa molecular supone un nuevo enfoque de la medicina, ya que utiliza factores genotpicos y no fenotpicos para la identificacin de una enfermedad. El poder diagnstico basado en el ADN es debido a que los cidos nucleicos se pueden medir de forma sencilla y rpida y a que la secuencia de nucletidos del ADN es muy especfica. Las ltimas dcadas han supuesto el desarrollo de numerosas tcnicas de anlisis molecular, capaces de identificar fragmentos concretos de ADN y que, junto al desarrollo en tcnicas de micromanipulacin y nanotecnologa, estn permitiendo numerosos avances en el campo de la biomedicina. 1.1. EL DESCUBRIMIENTO DEL ADN. HISTORIA DEL ADN Hasta mediados del siglo 20 no se sospechaba que el cido disoxirribonucleico, ADN, fuera la molcula capaz de asegurar la transmisin de los caracteres hereditarios de clula a clula. Su limitada variedad qumica no permita suponer que poseyera la versatilidad y ductilidad necesarias para almacenar la informacin gentica de los seres vivos. En 1869 un bilogo suizo Johann Friedrich Miesscher, comenz a analizar los restos de pus de los desechos quirrgicos, aislando los ncleos de los glbulos blancos y extrayendo una sustancia cida y cargada de fsforo a la que denomin "nuclena" y posteriormente Richard Altmann las identific como cidos y les di el nombre de cidos nucleicos. Robert Feulgen, en 1914, describi un mtodo para revelar por tincin el ADN, basado en el colorante fucsina. Se encontr, utilizando este mtodo, la presencia de ADN en el ncleo de todas las clulas eucariotas, especficamente en los cromosomas. Durante los aos 20, el bioqumico P.A. Levene analizo los componentes del ADN, los cidos nucleicos y encontr que contena cuatro bases nitrogenadas: citosina y timina (pirimidinas), adenina y guanina (purinas); el azcar desoxirribosa; y un grupo fosfato. Tambin demostr que se encontraban unidas en el orden fosfato-azcar-base, formando lo que denomino un nucletido. Levene tambin sugiri que los nucletidos se encontraban unidos por los fosfatos
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formando el ADN. Sin embargo, Levene pens que se trataban de cadenas cortas y que las bases se repetan en un orden determinado. El experimento de Griffith En el ao 1928 Frederick Griffith investigando una enfermedad infecciosa mortal, la neumona, estudi las diferencias entre una cepa de la bacteria Streptococcus peumoniae que produca la enfermedad y otra que no la causaba. La cepa que causaba la enfermedad estaba rodeada de una cpsula (tambin se la conoce como cepa S, del ingles smooth, lisa, que es el aspecto de la colonia en las placas de Petri). La otra cepa (la R, de rugosa, que es el aspecto de la colonia en la placa de Petri) no tiene cpsula y no causa neumona. La cepa S era daina, mientras que la rugosa (R), no lo era ya que la cepa S se cubre a si misma con una cpsula de polisacrido que la protege del sistema inmune del ser que ha sido infectado, mientras que la cepa R no contiene esa cpsula protectora y es derrotada por el sistema inmunitario Griffith inyect las diferentes cepas de la bacteria en ratones. La cepa S mataba a los ratones mientras que la cepa R no lo haca. Luego comprob que la cepa S, muerta por calentamiento, no causaba neumona cuando se la inyectaba. Sin embargo cuando combinaba la cepa S muerta por calentamiento, con la cepa R viva, es decir con componentes individuales que no mata a los ratones e inyectaba la mezcla a los ratones, los ratones contraan la neumona y moran. An ms, en la sangre de estos ratones muertos Griffith encontr neumococos con cpsula (S). En apariencia la cepa R se convirti en cepa S. Es decir que en las bacterias S muertas haba algo capaz de transformar a las bacterias R en patgenas y este cambio era permanente y heredable. Ms tarde se demostr que esta transformacin tambin se produca si se incubaban los neumococos R con un extracto libre de clulas S. Las bacterias que se aislaban de los ratones muertos posean cpsula y, cuando se las inyectaba, mataban otros ratones. Frederick Griffith fue capaz de inducir la transformacin de una cepa no patognica Streptococcus pneumoniae en patognica. Griffith postul la existencia de un factor de transformacin como responsable de este fenmeno.
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El principio de transformacin observado por Griffith era el ADN de la bacteria de cepa S (virulenta). Si bien la bacteria haba muerto, su ADN sobrevivi al proceso de alta temperatura y fue tomado por la bacteria R (inofensiva). EL ADN de la cepa S contiene los genes que forman la cpsula de proteccin de polisacrido. Equipado con este gen, la cepa de bacteria R estaba ahora provista de proteccin frente al sistema inmune del animal y por lo tanto poda matar al animal. La naturaleza exacta del principio de transformacin de ADN fue verificada en los experimentos realizados por Avery, McLeod y McCarty, y por Hershey y Chase. La naturaleza del principio transformante El microbilogo Oswald Avery, junto con sus colegas Colin MacLeod y Maclyn McCarty, se propuso descubrir la sustancia responsable del fenmeno de transformacin. Comenzaron a fraccionar el extracto de bacterias S libre de clulas y encontraron que podan eliminar las protenas, los lpidos, los polisacridos y el ARN del extracto sin disminuir la propiedad del extracto de transformar a los neumococos R en S. Y comprobaron que si purificaban el ADN presente en el extracto y lo incubaban con las bacterias R, stas se transformaban en S. Por lo tanto, era el ADN el que llevaba la informacin necesaria para que la cepa R fuera capaz de sintetizar una cpsula de polisacridos idntica a la que posean las bacterias S. Cuando Avery, MacLeod y McCarty publicaron sus resultados en 1944, fueron muy pocos los que concluyeron que los genes estaban compuestos de ADN. En esa poca era realmente difcil de imaginar que una molcula montona compuesta slo de cuatro bases nitrogenadas diferentes pudiera tener la suficiente variabilidad como para llevar toda la informacin gentica que precisaban los seres vivos. El experimento de Hershey-Chase Llev ocho aos ms para que la comunidad cientfica se convenciera de que el ADN era el material gentico. Fue gracias al experimento que presentaron Al Hershey y Martha Chase en 1952, sobre la infeccin de bacterifagos o fagos. Los fagos estn compuestos por una cabeza proteica que guarda en su interior ADN. En 1952 Alfred Hershey y Martha Chase realizaron una serie de experimentos destinados a dilucidar si el ADN o las protenas era el material hereditario. Marcando el ADN y las protenas con istopos radiactivos en un cultivo de un virus, se poda seguir el camino de las protenas y del ADN en un experimento,
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demostrando cual de ellos entraba en la bacteria. Ese seria el material hereditario (factor transformador de Griffith). Dado que el ADN contiene fsforo (P) pero no azufre (S), ellos marcaron el ADN con fsforo-32 radioactivo. Por otra parte, las protenas no contienen P pero si S, y por lo tanto se marcaron con azufre-35. Hershey y Chase encontraron que el S-35 queda fuera de la clula mientras que el P-32 se lo encontraba en el interior, indicando que el ADN era el portador de la informacin gentica del fago, es decir, el soporte fsico de la herencia. James Watson y Francis Crick Un ao despus de los experimentos de Hershey-Chase apareci en la revista Nature, un artculo conjunto de Watson y Crick que narraba de forma cautelosa el descubrimiento que haban realizado; comenzaba con estas palabras:"Deseamos sugerir una estructura para la sal del cido desoxirribonucleico (ADN).Esta estructura posee nuevas caractersticas que son de considerable inters biolgico" . Eligiendo los datos ms relevantes de un cmulo de informacin y analizaron con recortes de cartn y modelos de alambre y metal, fueron capaces de develar la estructura de la doble hlice de la molcula del cido desoxirribonucleico, ADN, y formularon los principios de almacenamiento y transmisin de la informacin hereditaria. Este hallazgo les vali el premio Nobel, que compartieron con M.H.F. Wilkins.
1.2. CIDOS NUCLEICOS Estas molculas cidas fueron aisladas, por primera vez, en 1869 por el mdico suizo Friedrich Miescher a partir de extractos de unos ncleos celulares. Posteriormente, se observ tambin su presencia en el citoplasma, aunque se conserv la denominacin de nucleicos para designar estos compuestos. Existen dos tipos de cidos nucleicos: el ADN y el ARN. Los cidos nucleicos (ADN y ARN) son polmeros de nucletidos. Cada nucletido est formado por la unin de un nuclesido y de una molcula de cido fosfrico. Cada nuclesido es, a su vez, la unin de una pentosa (ribosa o desoxirribosa) y de una base nitrogenada
(prica o pirimidnica). Las bases pricas son la adenina y la guanina y las pirimidnicas son la citosina, el uracilo y la timina. Los grupos fosfatos unen las posiciones 3y 5de pentosas consecutivas. Los nucletidos estn formados por una pentosa unida a una base nitrogenada por el carbono 1 y a un grupo fosfato por el carbono 5. En el cido desoxirribonucleico (ADN), la pentosa es desoxirribosa y las bases nitrogenadas pueden ser la adenina, la guanina, la citosina y la timina; sin embargo, en el cido ribonucleico (ARN), la pentosa es ribosa y las bases nitrogenadas pueden ser la adenina, la guanina, la citosina y el uracilo. 1.2.1. cido desoxirribonucleico (ADN) El ADN est formado por la unin de desoxirribonucletidos, es decir, sus nucletidos componentes contienen desoxirribosa. Sus bases nitrogenadas pueden ser adenina, guanina, citosina y timina, pero nunca uracilo. Con excepcin de algunos virus, el ADN est constituido por dos cadenas polinucleotdicas unidas entre s en toda su longitud. Esta doble cadena puede disponerse en forma lineal (ADN del ncleo de las clulas eucariotas) o en forma circular (ADN de las clulas procariotas, de ciertos virus y de algunos orgnulos citoplasmticos de las clulas eucariotas). La molcula de ADN porta la informacin necesaria para el desarrollo de las caractersticas biolgicas de un individuo y contiene tambin los mensajes e instrucciones para que las clulas puedan realizar sus funciones. Es decir, lleva codificada la informacin a partir de la cual se forma un organismo vivo, por lo que constituye el material gentico. Como excepcin, los llamados ARN virus no tienen molculas de ADN y la informacin gentica se encuentra codificada en forma de ARN. Estructura del ADN El ADN es una molcula altamente estructurada en la que, de manera semejante a las protenas, se distinguen varios niveles de complejidad. Esto permite que las molculas de ADN, que pueden llegar a tener una longitud de varios
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centmetros, constituyan cromosomas de solo pocos micrmetros. Estructura primaria Est formada por la secuencia de desoxirribonucletidos, en cuyo extremo 5 existe un fosfato y en el extremo 3una pentosa con el OH del carbono 3 libre. Como todos los nucletidos contienen desoxirribosa, la diferencia entre las molculas de ADN de los distintos organismos radica nicamente en el orden de las bases nitrogenadas que cuelgan de las pentosas. Es decir, la secuencia precisa en que aparecen los cuatro tipos de bases de las molculas de ADN determina las caractersticas biolgicas de la clula o del individuo que la contiene. Estructura secundaria La secuencia polinucleotdica se dispone en el espacio en forma de una doble hlice, segn la estructura propuesta por James Watson y Francis Crick en 1953. Dos descubrimientos previos abrieron el camino a este modelo de estructura secundada del ADN aceptado en la actualidad. En 1950, Erwin Chargaff, tras estudiar gran cantidad de muestras de ADN pertenecientes a diversas especies de organismos, observ que siempre exista la misma cantidad de bases nitrogenadas pricas y pirimidnicas. Descubri, adems, que el nmero de adeninas siempre es igual al de timinas, y el nmero de guaninas, al de citosinas. Estos resultados constituyen la conocida como ley de equivalencia de bases de Chargaff. Por otra parte, en esta misma poca, Rosalind Franklin y Maurice Wilkins aplicaron el mtodo de difraccin de rayos X al ADN y dedujeron que esta molcula posee una estructura helicoidal con dos periodicidades, una cada 0,34 nm y otra cada 3,4 nm. A partir de estos datos, Watson y Crick elaboraron su modelo de estructura tridimensional del ADN, que presenta las siguientes caractersticas: El ADN est constituido por dos cadenas polinucleotdicas unidas entre s en toda su longitud. Las dos cadenas son antiparalelas, lo que significa que el extremo 3 de una de ellas se enfrenta con el extremo 5 de la otra. La unin entre las cadenas se realiza por medio de puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas de ambas: concretamente, la adenina forma dos de estos puentes con la timina y la guanina tres con la citosina. Resulta evidente que las dos cadenas no son idnticas, sino complementarias, ya que una de ellas tiene la secuencia de bases complementaria de la otra. (Si se conoce la secuencia de una cadena es posible deducir de forma inmediata la secuencia de la cadena complementaria.)
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Las dos cadenas estn enrolladas en espiral formando una doble hlice alrededor de un eje imaginario. Las bases nitrogenadas quedan en el interior de la doble hlice, mientras que los esqueletos pentosa-fosfato se sitan en la parte externa. De esta forma, las cargas negativas de los grupos fosfato se unen a las cargas positivas de cationes o de otras molculas presentes en el medio, estabilizando la estructura. Los planos de las bases nitrogenadas enfrentadas son paralelos entre s y perpendiculares al eje de la hlice. El enrollamiento de la doble hlice es plectonmico, es decir, las cadenas no se pueden separar sin desenrollarlas. La doble hlice es dextrgira: el enrollamiento gira en el sentido de las agujas del reloj. (El trmino dextrgiro aplicado a la doble hlice de ADN no guarda relacin alguna con la actividad ptica, sino nicamente con el sentido de su enrollamiento.) La anchura de la hlice es de 2 nm, mientras que la longitud de cada vuelta es de 3,4 nm (34 A) y cada 0,34 nm (3,4 A) se encuentra un par de bases complementarias. Puede deducirse, por tanto, que existen 10 pares de nucletidos por cada vuelta. Presenta dos surcos, uno mayor y uno menor. La diferencia entre ambos surcos esta dada por dos razones: el borde superior de cada par de bases es estructuralmente distinto al borde inferior y los residuos de desoxirribosa son asimtricos.
Adems de la estructura descrita, que corresponde a la denominada forma B, se conocen otros tipos de estructura en doble hlice del ADN, como por ejemplo, la llamada forma A, en la que los planos de las bases nitrogenadas no son perpendiculares al eje de la hlice, y la forma Z, donde la doble hlice presenta irregularidades y es levgira. Aunque todava se desconoce el papel exacto que desempean estas dos formas de doble hlice, se cree que ambas podran estar relacionadas con los mecanismos de regulacin de la expresin de los genes. Estructura terciaria La estructura en doble hlice sufre nuevos plegamientos que dan lugar a un tercer nivel estructural. Esto es necesario por dos razones fundamentales: Las largas cadenas de ADN deben acoplarse en el reducido espacio que est disponible en el interior celular. La complejidad del plegamiento y el grado de empaquetamiento del
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ADN es mucho mayor en el caso de las clulas eucariotas, ya que la longitud de la cadena es muy grande y debe estar incluida en el interior del ncleo. La regulacin de la actividad del ADN depende en gran medida del grado de plegamiento que posea la molcula. La estructura terciaria es compleja y no ha sido totalmente elucidada, pero s se sabe que existen unas protenas que estn asociadas al ADN que organizan la estructura.
Como resultado final, el ADN aparece constituyendo la cromatina o los cromosomas.
1.2.2. cido ribonucleico (ARN) El ARN, al igual que el ADN, es un polmero no ramificado, compuesto por una serie de nucletidos unidos por enlaces ster fosfricos. El ARN difiere del ADN en que la pentosa de los nucletidos es la ribosa, en lugar de la desoxirribosa, y en que entre las cuatro bases nitrogenadas mayoritarias presentes aparece uracilo en lugar de timina. El uracilo, como ocurra con la timina, puede emparejarse con la adenina. En algunos tipos de ARN, como el ARN de transferencia (ARNt), se localizan otras bases especiales derivadas de estas (dihidrouracilo, metilguanina, etctera), aunque son siempre minoritarias. Las cadenas de ARN son ms cortas que las de ADN y pueden aparecer tanto en el ncleo como en el citoplasma celular.
Excepto en los reovirus, el ARN est constituido por una nica cadena, aunque en el ARN de transferencia existe un apareamiento de bases intracatenario, lo que hace que aparezcan tramos bicatenarios, originados por el plegamiento de la cadena sobre s misma. El ARN es la molcula encargada de sintetizar las protenas especficas de un organismo transmitiendo el mensaje gentico codificado por el ADN; es decir, mientras el ADN contiene la informacin, el ARN la utiliza para que se sinteticen las protenas especficas del individuo. Este proceso es sumamente complejo y requiere la intervencin de varios tipos de ARN.
ARN mensajero (ARNm) El ARNm es una copia de una parte del ADN (la que corresponde a cada gen que vaya a expresarse) que ser utilizada por los ribosomas como informacin para unir los aminocidos en el orden adecuado y poder as constituir una protena concreta. Las cadenas de ARN mensajero tienen una vida muy corta, ya que si no fueran destruidas (mediante enzimas ribonucleasas) la sntesis proteica se prolongara indefinidamente y se originara una superproduccin de protenas. As, cuando se necesita sintetizar una protena concreta, se fabrica de nuevo el ARN mensajero correspondiente. El ARNm es minoritario y constituye, aproximadamente, entre el 3 % y el 5% del total del ARN celular. ARN ribosmico (ARNr) El ARNr forma parte de los ribosomas y participa, por tanto, en el proceso de unin de los aminocidos para sintetizar las protenas. No constituye una molcula especfica de cada organismo, pues, a diferencia del ARNm, no contiene informacin sobre la clase de protena que se va a sintetizar.
Existen varias cadenas distintas de ARNr, que se diferencian por su coeficiente de sedimentacin. El ARNr es el tipo ms abundante, ya que corresponde al 80-85% del ARN celular total.
ARN de transferencia (ARNt) El ARNt se encarga de transportar los aminocidos presentes en el citoplasma celular hasta los ribosomas, donde se unirn para constituir las protenas. Cada molcula de ARNt transporta un aminocido especfico. Las diferencias entre los ARNt son debidas, sobre todo, a una secuencia de tres bases nitrogenadas, denominada anticodn, que vara entre los distintos ARNt. Los ARNt estn formados por cadenas cortas (entre 70 y 90 nucletidos) que contienen un 10% de bases nitrogenadas diferentes a las cuatro mayoritarias, como ya se ha indicado. Las molculas de ARNt poseen una estructura secundaria caracterstica, en la que existen tramos de doble cadena, por emparejamiento intracatenario. Estos tramos se denominan brazos y hay cuatro en cada molcula, aunque tambin puede aparecer un quinto brazo ms corto que los otros. En los extremos de tres de los brazos existen zonas sin emparejar que componen los denominados bucles. Cada uno de ellos desempea una funcin particular en la traduccin. El extremo 3 de la cadena tiene siempre la secuencia de bases CCA. A este nucletido terminal de adenina se une el aminocido que se va a transportar. En el extremo 5 siempre existe un nucletido con guanina. La estructura extendida del ARNt tiene forma de hoja de trbol, aunque en la realidad los brazos se disponen plegados, constituyendo una estructura acodada que recibe el nombre de estructura en boomerang. El ARNt constituye, aproximadamente, el 10 % del ARN celular total.
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1.3. REPLICACIN DEL ADN El ADN portador de la informacin gentica debe transmitirse fielmente a cada una de las clulas hijas obtenidas tras la divisin celular. Por tanto, antes de producirse esta, es imprescindible que el ADN pueda formar rplicas exactas de s mismo para disponer de dos copias iguales. Este proceso, conocido como replicacin o autoduplicacin, resulta fundamental para asegurar que todas las clulas de un organismo pluricelular mantengan la misma identidad. Cuando Watson y Crick elaboraron su modelo de doble hlice en 1953, indicaron tambin cul podra ser el mecanismo para llevar a cabo la replicacin del ADN: separacin de las dos cadenas y sntesis de la cadena complementaria de cada una de ellas. Sin embargo, otros investigadores plantearon distintas hiptesis que proponan tres posibles formas de replicacin: Conservativa. La doble cadena original se mantiene y se sintetiza otra completamente nueva. Semiconservativa. Una hebra de cada doble hlice procede de la original, mientras que la otra se sintetiza de nuevo. Es la propuesta por Watson y Crick. Dispersiva. En cada doble hlice existen fragmentos de la original y fragmentos nuevos. Poco despus, Matthew Meselson y Franklin Stahl demostraron experimentalmente la hiptesis semiconservativa. 1.3.1. Mecanismo de la replicacin La precisin necesaria en la replicacin del ADN implica un mecanismo complejo para asegurar la obtencin de copias idnticas. Baste decir que para que un ser humano se desarrolle a partir del cigoto, se calcula que deben producirse unos mil billones de divisiones celulares con otras tantas replicaciones previas del ADN. Si consideramos que existen unos 3500 millones de pares de nucletidos en el genoma humano, es posible hacerse cierta idea de la magnitud del proceso. La replicacin de la clula se lleva a cabo durante la fase S del ciclo celular. Originalmente fue estudiada en clulas procariotas, pero posteriormente se comprob que el mecanismo es similar en las eucariotas, aunque no idntico.
Inicio de la replicacin. La replicacin comienza en ciertas zonas del ADN donde existen determinadas secuencias de nucletidos. En primer lugar interviene en el proceso una enzima helicasa que separa las dos hebras de ADN al romper los puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas complementarias. La separacin y desespiralizacin de ambas hebras genera tensiones en ellas, que son eliminadas por la intervencin de otras enzimas, las topoisomerasas. Para ello cortan una de las dos hebras (topoisomerasa I) o las dos (topoisomerasa II o girasa). Una vez separadas, las dos hebras se mantienen as por la accin de las denominadas protenas SSB (protenas estabilizadoras de la cadena sencilla).
Formacin de las nuevas hebras A continuacin comienza la sntesis de las hebras complementarias sobre cada una de las originales mediante la enzima ADN polimerasa III, que presenta las siguientes caractersticas: Necesita una hebra molde de ADN, que recorre en sentido 3> 5 y sobre la que sintetiza la hebra complementaria. Une nucletidos en sentido 5 > 3; es decir, la nueva hebra formada crece en este sentido. Los nucletidos que se van uniendo son los que se sitan previamente frente a los correspondientes nucletidos complementarios del ADN molde. Utiliza nucletidos trifosfato, los cuales proporcionan, al mismo tiempo, la energa necesaria para la unin. No puede comenzar la sntesis por s misma, pues solo puede aadir nucletidos sobre el extremo 3 libre de una cadena polinucleotdica previa. Por este motivo es necesario que exista una cadena corta, de ARN (de 40 o 50 nucletidos), denominada ARN cebador o primer.
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El ARN cebador es sintetizado por la enzima primasa (ARN polimerasa ADN dependiente) que, utilizando ADN como molde, sintetiza ARN complementario de este.
El cebador se escinde en una etapa posterior de la replicacin. A medida que la doble hlice del ADN original se va separando se forma la llamada burbuja de replicacin donde acta la ADN polimerasa III. Existe una horquilla de replicacin en cada extremo, pues el proceso es bidireccional, es decir, avanza en ambas direcciones. Dado que la ADN polimerasa III recorre el ADN molde en sentido 3 5, la sntesis de una de las hebras es continua, ya que, a medida que se abre la doble hlice, esta enzima va avanzando y aadiendo nuevos nucletidos a la cadena en formacin. Dicha hebra se denomina hebra conductora. Sin embargo, como la otra cadena es complementaria, la ADN polimerasa debera recorrerla en sentido 5 3, aadiendo nucletidos a la hebra en formacin en sentido 3 > 5, lo cual no es posible. La sntesis, en este caso, es discontinua y se produce en segmentos separados. Esta cadena se denomina hebra retardada, pues su sntesis es ms lenta que la de la hebra conductora. Los segmentos de ADN sintetizados de este modo se conocen corno fragmento de Okazaki y constan de 1 000 a 2 000 nucletidos. Cada fragmento de Okazaki requiere un ARN cebador para iniciar la sntesis de una secuencia de nucletidos. Posteriormente, tras la eliminacin de los ARN cebadores, los fragmentos de Okazaki se unen gracias a la accin de las enzimas ligasas.
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La enzima ADN polimerasa I elimina los ARN cebadores gracias a su actividad exonucleasa (rotura de enlaces fosfodister a partir de un extremo nucleotdico libre). Esta misma enzima posee tambin actividad polimerasa, por lo que puede rellenar el hueco dejado por el ARN cebador que se ha eliminado. Finalizacin Al acabar el proceso, cada hebra recin sintetizada y la que ha servido de patrn aparecen enrolladas originando una doble hlice. A pesar de todas estas etapas, el proceso de replicacin es muy rpido; en Escherichia coli, por ejemplo, se unen 45 000 nucletidos por minuto. DIFERENCIAS EN EL PROCESO REPLICATIVO ENTRE PROCARIOTASY EUCARIOTAS Procariotas Eucariotas
ADN polimerasas Tamao de los fragmentos de Okazaki Origen de la replicacin 3 5 10002000 nucletidos100200 nucletidos nico Mltiple (cientos en cada cromosoma de mamferos, lo que hace que haya varios miles en el conjunto de su genoma). Cada unidad de replicacin se denomina replicn y produce la sntesis de fragmentos de 100 a 150 nucletidos. La necesidad de numerosos puntos de origen de la replicacir resulta evidente, pues la cantidad de ADN en las clulas eucariotas es muchsimo mayor. Si solo existiera un lugar de inicio, el proceso de replicacn necesitara varios meses para llevarse a cabo. Menor (hasta 50 veces) en cada replicn, aunque dado gran nmero de estos la velocidad total resulta mayor. Las histonas originales se mantienen en la hebra conductora, mientras que se forman nuevas histonas que se unen a la hebra de ADN retardada Pgina 15
Velocidad de replicacin
Mayor
Sntesis de histonas
No hay histonas
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1.3.2. Correccin de errores La replicacin no ha concluido hasta que se comprueba que la copia de la secuencia nucleotdica es correcta. Es necesario, pues, detectar y corregir los errores producidos. El ADN es la nica molcula capaz de efectuar una reparacin de s misma. La ADN polimerasa III no une los nudetidos que no sean complementarios de los correspondientes nucletidos de la hebra molde, aunque, en ocasiones, se produce un error que hay que eliminar. En estos casos el nucletido mal emparejado es eliminado por la accin de enzimas nucleasas. Por esta razn, el nmero de errores producidos durante el proceso de replicacin es muy bajo (uno por cada 107-108 bases incorporadas). Sin embargo, esta proporcin tan baja no es despreciable, ya que el nmero de nucletidos de una cadena de ADN es muy alto, sobre todo en organismos pluricelulares (con ms informacin gentica y un gran nmero de clulas). Por ello, existe un proceso posreplicativo de correccin de errores en el que participan varias enzimas: Endonucleasas que detectan errores y cortan la cadena anmala. Exonucleasas que eliminan el fragmento incorrecto. ADN polimerasas que sintetizan el segmento correspondiente al fragmento eliminado. Esta accin y la anterior puede ser realizada por la enzima polimarasa I, como ya se indic. ADN ligasas que unen el nuevo segmento al resto de la cadena.
Tras la correccin realizada, el nmero de errores desciende hasta uno por cada 10 10 bases incorporadas. Para posibilitar la deteccin de los errores es necesario diferenciar la cadena nueva de la antigua. Esto se consigue por metilacin de las adeninas, proceso que tiene lugar pasado un cierto tiempo. As, las adeninas pertenecientes a la hebra recin sintetizada no estn an metiladas y las de la hebra antigua s, lo que permite que las enzimas reparadoras la identifiquen. A pesar de los mecanismos correctores de errores, la fidelidad en la replicacin no es absoluta, lo cual no es necesariamente negativo, ya que si los errores no tienen consecuencias sobre la viabilidad de las clulas (o de los individuos) que los poseen, se convierten en fuente de
variacin gentica, imprescindible para el desarrollo de los procesos evolutivos.
1.4. DISPOSICIN DEL MATERIAL GENTICO EN EL NCLEO La estructura y composicin del ncleo depende del estadio del ciclo celular. Se distingue as entre ncleo interfsico, propio de la interfase (periodo que transcurre entre dos divisiones celulares) y ncleo mittico o en divisin. La principal diferencia entre ellos es la estructura del material gentico, en forma de cromatina difusa en el primer caso y en forma de cromosomas en el segundo. El grado de empaquetamiento del material gentico en los cromosomas es mayor que en la cromatina. Los ncleos de las clulas de los eucariotas (clulas de los humanos) estn ocupados, en su mayor parte, por cromatina. La cromatina de los eucariotas es un complejo constituido por una asociacin de una doble hlice de cido desoxirribonucleico (ADN) bicatenario y de protenas nucleares bsicas (histonas y protaminas), a la que se une una cierta cantidad de cido ribonucleico (ARN) y enzimas. La unidad elemental de la cromatina, constituida por una fibra de unos 10 nm de espesor, se denomina fibra elemental, que observada al microscopio tiene aspecto de collar de cuentas. Cada una de estas cuentas es un complejo nucleosomal, integrado por un octmero de histonas (complejo octamrico) alrededor del cual se enrolla el ADN (dos vueltas de doble hlice de ADN por octmero, que equivalen a 146 pares de bases). Los complejos nucleosomales estn unidos por ADN internucleosomal o espaciador formado por 54 pares de bases. La unidad bsica de la fibra de cromatina se denomina nucleosoma, constituido por el complejo nucleosomal y el ADN espaciador situado a ambos lados (200 pares de bases en total). Las histonas son protenas de bajo peso molecular, que contienen una elevada proporcin de aminocidos bsicos (lisina y arginina). Se han descrito cinco tipos de histonas, cuatro de ellas
forman el complejo nucleosomal y la ltima, denominada H1, la responsable del plegamiento helicoidal de la fibra elemental de cromatina para formar fibras complejas superenrolladas. Segn la hiptesis ms aceptada actualmente, la cadena de nucleosomas se enrolla helicoidalmente formando un solenoide o fibra de 30 nm, que contiene seis nucleosomas por cada vuelta de hlice. Esta estructura queda estabilizada por la interaccin con la histona H1. A su vez, estas fibras complejas de 30nm se hallan plegadas en el ncleo interfsico en forma de bucles radiales que se enrollan helicoidalmente y experimentan sucesivos grados de compactacin en el ncleo en divisin hasta dar lugar a las cromtidas del cromosoma metafsico. Cuando las clulas no estn en estado de divisin, es decir, cuando estn en interfase, la cromatina de su ncleo se organiza en forma de filamentos finos y muy largos (cromtidas o cromtides). Por el contrario, durante el proceso de divisin celular, la cromatina se repliega sobre s misma y se condensa en tal grado que adoptan una forma espiral que las hace ms tupidas y, por lo tanto, ms fcilmente teibles y visibles al microscopio. Estas formas distinguibles de cromatina son los cromosomas. El nmero y la forma de los cromosomas son caractersticos de cada especie de vida. As pues, cada clula normal del ser humano contiene 46 cromosomas. stos se clasifican en veintids pares de autosomas y un par de heterocromosomas, cromosomas sexuales o gonosomas. El nmero de cromosomas es par, y cada par de autosomas est constituido por dos cromosomas del mismo (cromosomas homlogos), pero que proceden de distinto progenitor (del padre o de la madre). Hay dos tipos de cromosomas sexuales: el X y el Y. Ya que la madre siempre proporciona un cromosoma X, si el padre aporta otro cromosoma X, el descendiente tiene dos cromosomas X y es de sexo femenino; pero si el padre aporta un cromosoma Y, el descendiente tiene un cromosoma X y otro cromosoma Y, por lo que es de sexo masculino. El nmero de cromosomas de cada serie recibe el nombre de nmero haploide o n y, como ya se ha dicho, ha sido heredado de
uno de los progenitores. En la especie humana son 23. El nmero total de cromosomas es el nmero diploide o 2n. As, en la especie humana 2n=46, siendo n y 2n las frmulas cromosmicas haploide y diploide respectivamente.
El ADN de cada cromosoma est dividido en multitud de porciones ms pequeas, que son capaces de transmitir la informacin que contienen y dar lugar a la sntesis de protenas estructurales o de enzimas. Estas porciones son los genes. Cuando se pretende fabricar una protena especfica, la informacin del gen que codifica su sntesis es copiada en forma de molculas de ARN mensajero, cuya secuencia de bases nitrogenadas es idntica a la del ADN de ese gen. Seguidamente, este ARN mensajero se dirige al citoplasma para que los ribosomas lean su informacin e inicien la produccin de esa protena. Cada gen puede tener distintas variedades que reciben el nombre de alelos. Entre los genes se intercalan fragmentos de ADN que no son capaces de transcribirse. A este ADN se le conoce como ADN espaciador o linker. Cada gen ocupa un lugar concreto dentro del cromosoma, denominado locus. Los lugares ocupados por varios genes se llaman loci. El genotipo es la constitucin gentica de un individuo y el fenotipo es la manifestacin externa del genotipo. As pues, por ejemplo, un sujeto tiene un genotipo AO, con respecto al grupo eritrocitario ABO, cuando en uno de sus cromosomas 9 hay un gen A y en el cromosoma homlogo hay un gen O. Este genotipo determina la presencia de sustancia A en la superficie de los hemates y, por tanto, la pertenencia del individuo al grupo A (su fenotipo).
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Proyecto de innovacin: Introduccin de las Tcnicas de Biologa Molecular en el CFGS de Laboratorio de Diagnstico Clnico

PRIMERA PARTE: INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULAR

1. INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULAR

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