Cromatografia 1

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA CENTRO DE CINCIAS DA SADE DEPARTAMENTO DE CINCIAS DA SADE DISCIPLINA:FARMACOGNOSIA CURSO: FARMCIA
MTODOS DE ANLISE - CROMATOGRAFIA
Mtodos de anlise Cromatografia
Cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, realizada atravs da distribuio desses componentes em duas fases, que esto em contato ntimo.
Fase estacionria MIGRAO DIFERENCIAL Constituintes da amostra

1
Fase mvel
PROFESSOR: JOS MARIA BARBOSA FILHO DOUTORANDA :GABRIELA LEMOS DE A. MAIA
Mtodo moderno de anlise Facilidade de separao Identificao Quantificao das espcies qumicas
Histrico
Classificao
Vrios critrios:
Forma fsica
Carbonato de clcio
ter de petrleo
Tcnica geral
Cromatografia em coluna
Botnico russo, que inventou a primeira tcnica cromatogrfica em 1900.
Cromatografia planar
Classificao
Vrios critrios:
Classificao
Vrios critrios:
Mecanismo de separao Fase mvel
Lquido
Gs
Flido supercrtico
Fsico
Qumico
Mecnico
Classificao
Adsoro
Baseia-se na adsoro dos componentes de uma soluo sobre a fase estacionria slida o componente que for mais fortemente atrado pelo adsorvente ser deslocado pela fase mvel de forma mais lenta.
Classificao
Partio Separao dos componentes de uma mistura com base nos seus coeficientes de partio entre dois solventes imiscveis que constituem as fases mvel e estacionria.
Coeficiente de partio (logP) uma medida de solubilidade diferencial de compostos qumicos em dois solventes.
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Classificao
Troca inica
Classificao
Excluso
Baseia-se no tamanho das molculas do soluto que passam atravs da fase estacionria, constituda por um gel poroso: as molculas maiores no conseguem penetrar nos poros e so arrastadas pela fase mvel, enquanto que molculas de menor tamanho, capazes de entrar nos poros da fase estacionria so retidos por mais tempo no interior da coluna.
Fase estacionria constituda por um suporte, ou matriz, onde so adicionadas grupos funcionais ionizveis
+ +
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Cromatografia em camada delgada
Consiste na separao dos componentes de uma mistura atravs da migrao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfcie plana.
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Preparao das placas

Preparao por espalhamento
Limpar as placas para eliminar gordura Tamanho da placa 20x20 cm Espalhadores aplicador ou basto de vidro uiniforme Secar ao ar Placas pequenas mergulhar a placa na soluo de adsorvente.
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Placas pr-fabricadas.
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Ativao da placa
Depois de secar ao ar livre As placas pr-fabricads geralmente no precisa ser ativadas Ativao depende do adsorvente Slica, alumina, terra diatomceas:105-110 0C por 30 a 60 minutos Celulose: 105 0C por 10 minuros Aps ativao conservar em dessecadores ou caixas fechadas.
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Fase estacionria adsorvente

Slica (SiO2): cido de silcio amorfo Altamente poroso cido
Diversos tipos:
Slica (SiO2): cido de silcio amorfo
Emprego
Separao de compostos lipoflicos como aldedos, cetonas, fenis, cidos graxos, alcalides etc
Merck G aglutinante (gesso, amido, talco) para reter a slica sobre a placa H sem aglutinante F Fluorescncia R Extrapuro P preparativa
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Preparao
30 g de slica em 60-70 mL de gua destilada 5 placas 20 x 20 cm
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Alumina (AL2O3)
Alcalina Neutra cida
Outros adsorventes:
Celulose Poliamida Terra diatomcea
Uso
Separao de compostos lipoflicos e pelo fato de poder ser preparada com caractersticas cida, neutra ou alcalina, bastante til na separao de substncias que apresentem variaes dessas caractersticas Ex: Alcalides, aminas e vitaminas lipossolveis
Preparao 30 g de alumina em 40 ml de gua

destilada para 5 placas 20 x20 cm
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Processo: adsoro
Fase mvel Devemos considerar a natureza qumica das substncias a serem separadas e a polaridade da fase mvel
Competio da fase mvel e da amostra, pela superfcie do adsorvente.
Srie eluotrpica polaridade poder de eluio. Se a fase mvel pura no separar usa-se misturas de solventes.
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Classificao
Cromatografia em Camada Delgada
Fase mvel Teste
Analtica (CCDA)
Preparativa (CCDP)
Identificao e Anlises de misturas e subst. Isoladas (Rf )
Separao Isolamento
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Formas de aplicao das amostras nas cromatoplacas. Formas de aplicao das amostras nas cromatoplacas. Placas analticas
Solues, em solventes volteis Micropipetas ou microsseringas Capilares de vidro Aplicadores automticos Gotas ou manchas 1 a 2 cm acima da borda inferior Entre as gotas 1 cm
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Forma incorreta de aplicao
Forma correta de aplicao
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Formas de aplicao das amostras nas cromatoplacas. Zona de aplicao - to pequena quanto possvel.
Placas preparativas
Aplicao na forma de faixas ou linhas, cerca de 2 cm acima da borda inferior Faixa horizontal uniforme Retirar a faixa da placa
Hexano - o ponto de aplicao ficou o menor possvel. 31
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Chromatotron Chromatotron
uma cromatografia em camada delgada preparativa e acelerada centrifugamente. A amostra a ser separada aplicada como uma soluo no centro do disco giratrio umedecido com o solvente. A eluio com solvente gera bandas circulares de separao dos componentes que so removidos juntamente com o solvente para um tubo de recepo.
Substitue as CCD preparativas, pequenas colunas e HPLC. Com dimensies ~ 30 cm.
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Chromatotron
Capacidade: 500 mg por componente, cerca de1 g total. Adsorventes: Silica gel, alumina e silica gel - nitrato de prata. Solventes: Compatvel com todos os solventes comumente usados nas outras tcnicas cromatogrficas, inclusive cido actico. No apropriada para uso com cidos minerais. Vantagens especiais: * No raspagem de bandas. * Separaes so rpidas, cerca de 20 min. * Permite a observao direta por UV ou de compostos coloridos durante a eluio. * Camadas finas de 1, 2 or 4 mm apresentam alta capacidade. * Utiliza-se pouco solvente e a eluio por gradiente fcil. * Compacta (facilmente removida de um laboratrio para outro), poucos controles e no necessita altas presses. * Baixo preo. Chromatotrons custam menos que um simples HPLC preparativo
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Formas de desenvolvimento
Cromatografia ascendente
Solvente deve cubrir a base da placa em regio inferior a aplicao da amostra Cuba bem vedada: evaporao/condensao Mltiplo desenvolvimento: diversas subidas
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Formas de desenvolvimento Formas de desenvolvimento

Desenvolvimento ascendente bidimensional Sobe uma vez, retira secar e girar 90 graus e subir novamente em outro sistema de solvente
Desenvolvimento circular Posio horizontal Amostra em um crculo ao redor do centro Chromatotron Preparativa.
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Revelao Consiste em tornar visvel as substncias incolores presentes na amostra
Reativos Universais: reagem com a maioria dos compostos orgnicos, indiferente`a classe ou a funo qumica.
Fsicos Lmpada de Ultra-violeta compostos que absorvem (cromforos) tornam-se fluorescentes quando excitados por essas radiaes, comprimento de onda selecionado (254 a 360 nm) emitem manchas escuras (arroxeadas).
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Mtodos : Fsicos Qumicos Biolgicos
Vapores de iodo- formam complexos com os compostos orgnicos, geralmente de cor marrom.
Vantagem: que o iodo pode ser eliminado por aquecimento da placa, podendo-se borrifar a placa com outro revelador. Isso possvel porque o iodo se une apenas fisicamente s substncias, exceto em compostos insaturados , pode se somar as insaturaes
cido sulfrico/metanol- oxida todos os compostos orgnicos, produzindo manchas coloridas aps aquecimento(~100 0C)
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Reativos especficos Anisaldedo sulfrico- usado na deteco de esterides e terpenides. Apresentam manchas rosadas aps aquecimento (~100 oC).
Reativos especficos Reativo de Dragendorff- usado para deteco de alcalides. Produz manchas alaranjadas intensas.
Cloreto frrico (FeCl3)- deteco de grupo hidroxila (OH) aromtico, como compostos fenlicos em geral ( flavonides, taninos, fenis, etc.). Produz manchas coloridas (azul, verde, marrom,etc).
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OBS: Devido este reativo dar falso positivo com sesquiterpenos e outros compostos, deve-se confirmar a presena de alcalides usando outros reativos( p. ex. Mayer, Wagner, etc.)
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Rf= distncia percorrida pela mancha desde a origem (b)

distncia percorrida pelo solvente desde a origem (a)
DETERMEINAO DO FATOR DE RETENO (RF) Linha do solvente
Rf= distncia percorrida pela mancha desde a origem (b)

distncia percorrida pelo solvente desde a origem (a)
b3 b2 b1
a
Origem
Rf adequado~ 0,4 - 0,6
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Vantagens
Fcil compreeno e execuo Separaes em breve espao de tempo Repetitividade Baixo custo
Usada em: Reaes orgnicas Fitoterapia
Pureza Acompanhamento rx
Controle de qualidade Pureza dos compostos
Aplicaes
Presente em todos os laboratrios de qumica ou biologia Anlise de substncias orgnicas e inorgnicas Acompanhamento de reaes de sntese e de processos de purificaes
Fitoqumica
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Natureza qumica Identificao

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1) Um acadmico realizou uma reao entre os compostos A e B, procurando obter C. Verificou experimentalmente os seguintes perfis em CCD, visualizados por lmpada de UV. Discuta os resultados.
10 min. 30 min. 1 hora 2 horas
MTODOS 2) Foram realizados estudos DE ANLISE - CROMATOGRAFIA visando o controle de qualidade de fitoterpicos disponveis no mercado. A equipe adquiriu 4 amostras de tintura de camomila produzidas por distintas indstrias. Aps o tratamento adequado das amostras, a equipe obteve os perfis cromatogrficos mostrados abaixo. Discuta os resultados.
UV
FeCl3
Dragendorff Anisaldedo
sulf.
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Cromatografia em papel
um mtodo fisico-quimico de separao dos componentes de uma mistura, em funo do deslocamento diferencial do soluto arrastados por uma fase mvel, sendo retidos seletivamente por uma fase estacionria lquida.
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A separao: relaciona-se com as diferentes solubilidades na fase mvel e na fase estacionria. A celulose: mais de 2000 unidades de acar anidro ligadas por Oxignio. A gua tem afinidade pelo oxignio e forma pontes de hidrognio com o acar, ficando retido e funcionando como fase estacionria.
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Cromatografia ascendente
Utiliza tira de papel Marca-se com lpis o ponto de aplicao da amostra (2 cm da margem) e o ponto de chegada da fase mvel. A tira de papel deve ser suspensa na vertical dentro de uma cuba, com solvente que deve ficar abaixo ponto de aplicao da amostra e estar bem vedada. A fase mvel move-se por capilaridade Verifica-se o Rf.
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Papel
Suporte Deve ser uniforme em composio e superfcie. Existem vrios tipos e caractersticas da amostra. a escolha depende das
Fase mvel Influencia muito na separao Deve ser escolhida de acordo com a natureza qumica das substncias da amostra, assim com pela viscosidade e polaridade da fases mvel. Ex: ter de petrleo, hexano, tolueno, acetona etc
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Tambm podem ser modificados: Papel acetilado: til para separar substncias hidrofbicas Papel impregnado ; Com silicona, parafina etc. Para separao de substncias moderadamente hidrfobas
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Fases estacionria
Fase estacionria normal Fase aquosa: o papel saturado com vapor de gua ou vapor de gua mais outro solvente, no interior de uma cuba fechada antes de iniciar o desenvolvimento. Fase estacionria no-aquosa: trata-se o papel em soluo de acetona e dimetilformamida, por 10 a 15 min e depois deixa-se secar.
Fases estacionria Fases estacionria fase reversa O papel tratado com substncias hidrofbicas (parafina lquida, leo etc)
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Aplicaes Identificao e separao de compostos polares, substncias hidrofbicas como antibiticos hidrossolveis, cidos orgnicos e ons metlicos Mais pratica que cromatografia em camada delgada e de fcil reproduo do Rf para caracterizao. til para acompanhar a seqncia de uma reao qumica
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Cromatografia em Coluna
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Coluna
Vidro
Extremidade aberta
Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plstico, preenchida com um adsorvente adequado.
Torneira
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Coluna
Dimenses Depende da quantidade do material a ser cromatografado Dimetro interno Preparativas (6- 50 mm) Anliticas (2-6 mm) Microdimetro (1-2 mm) Capilares (< 1 mm)
Adsorventes
Os mesmos da cromatografia plana: A diferena est no tamanho das partculas (63 a 200 m) enquanto que na cromatografia planar ( 5 a 40 m)
Ex: slica , alumina
Silicato de magnsiopropriedades intermedirias entre a slica e a alumina; separao de esterides, lipdios e derivados de acar. Carvo uma mistura de carvo grafitizado, cuja superfcies polar, e carvo ativo obtido pela oxidao de material orgnico baixa temperatura, que contm grupos funcionis apolares.
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Processo de adsoro
As substncias eluiro da coluna segundo a polaridade. Slica e alumina: polares retm substncias polares
CO2H > OH > NH2>SH > CHO >C=O > CO2R > OCH3> CH=CH
Processo de adsoro
Deve-se evitar que o movimento da substncia adsorvida na coluna seja lento e que a banda se torne larga
Apolar
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POLAR
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Reaes na coluna
Fase mvel
Funo do solvente: devem ser levadas em considerao as relaes de solubilidade dos componentes da mistura a ser cromatografada.
Adsorventes podem catalizar reaes Exemplo: alumina alcalina condensao de aldedos e cetonas Slica pode levar a isomerizao de terpenos e esterides
Funo de eluente: promover o desenvolvimento da mistura na coluna e remover esses componentes do adsorvente seletivamnete.
Devem ter baixo ponto de ebulio ( 35-85 C) para que sejam evaporados facilmente.
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A escolha do eluente pode ser baseada em CCD

Eluentes : ordem crescente de polaridade
Hexano ter de petrleo Cicloexano Tolueno Diclorometano Clorofrmio ter etlico Acetato de etila Piridina Acetona Etanol Metanol cido actico
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Enchimento da coluna
Uniformidade= eficincia
Dificuldades ar retido forma canais Para evitar agitar o adsorvente num frasco com a fase mvel at formar uma pasta Coloca-se a pasta na coluna contendo pelo menos um tero de solvente sob vibrao As partculas da fase estacionria devem ser o mais homogneo possvel Evitar deixar a coluna secar
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Aplicao da amostra
Eluio
Conveniente fixar a coluna na posio vertical Ao da gravidade e evita canais de ar
Colocada no topo da coluna Slida ou lquida Aps adiciona-se fase mvel E fase estacionria
Proporo de fase estacionria no mnimo 25/1 da amostra
A fase mvel passa pelo adsorvente componentes da amostra.
trs consigo
os
Quanto mais fracamente o componente for adsorvido mais rapidamente passar pela coluna
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12
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Para ocorrer uma completa separao, a fase mvel deve ser :

Fracamente adsorvida No ser afetada quimicamente Possibilitar realmente o desenvolvimento de uma corrida cromatogrfica, ocasionando por um determinado grau de adsoro.
Vantagens
Tecnicamente simples Facilmente aplicada para fins preparativos
Vizualizao
Desvantagens:
Produo de caudas No totalmente reprodutvel
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Aplicaes:
Laboratrio de qumica orgnica: separao e purificao de reagentes e materiais obtidos por sntese
Cromatografia por excluso
Laboratrios de produtos naturais: escala preparativa
Laboratrio de anlise clnicas: para separa esterides da urina ou do sangue

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O recheio ou gel constitudo por macromolculas que
A cromatografia por excluso promove uma seletiva e dinmica distribuio das molculas do soluto entre duas fases lquidas separadas, dependentes de uma estrutura estacionria contendo poros de tamanho controlado.
tem ligaes cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que nele so insolveis. Fase estacionria gel, no-carregado, e inchado com o mesmo lquido. Uma molcula dentro da fase estacionria no se move na direo do fluxo do lquido.
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Fases
O gel no realmente uma fase estacionria, ele apenas fornece os poros nos quais se d o mecanismo de distribuio, essa distribuio do soluto entre a fase mvel dentro e fora dos poros. Gel material elstico, contendo gua, com estrutura tridimensional contendo ligaes cruzadas. Homogneomais moles e permitem entrada de partculas com baixo peso molar Heterogneoregies concentradas e outras quase vazias, entrada de molculas maiores.
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Caractersticas de um gel adequado

Inrcia qumica Estabilidade Baixo teor de ons Quimicamente definido, permitindo variaes para o fracionamento de diferentes intervalos de massa molar. Deve conter partculas distribuio controlados de tamanho e
Rigidez mecnica para no se deformar pelas foras do fluxo
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Tipos de gel Gel de dextrana
Sephadex (PHARMACIA)
Quimicamente estvel; Vrios graus cruzadas; de ligaes
um polissacardeo com unidades de glicose, obtido por fermentao da sacarose. Em contato com a gua incha e forma um gel.
G-10 ou G-25 peptdeos; LH-20pode ser usado com solventes polares, fracionamento de pequenas molculas.
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14
Gel de gar e agarose

Indicados para separao de substncias de alta massa molar, com vantagem de apresentar estabilidade mecnica. gar Obtido de algas, contm grupos carregados negativamente. Agarose um componente do gar, sem grupos carregados.
Equipamento
Coluna cromatogrfia Amostra lquida (1 a 5% do volume da coluna) No empacotar a coluna Sistema de solvente
So sensveis a temperatura.
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Vantagens
Simplicidade tcnica Insensibilidade a temperatura e solvente Versatilidade
Cromatografia por Bioafinidade
Aplicaes
Separao de molculas que diferem no tamanho Remoo de fenol de preparaes de cidos nuclicos Remoo de substncias radio ativas Determinao da massa molar
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Suporte insolvel ou matriz

Baseia-se nas propriedades biolgicas ou funcionais das espcies que interagem: a substncia a ser separada e a fase estacionria. Princpio do mtodo Isolamento seletivo de macromolculas, atravs das propriedades dessas substncias de unirem-se reversivelmente a ligantes especficos Propriedades Ser mecnica e quimicamente estveis Uniformes Rgidas Esfricas Porosas Interagir fracamente com as macromolculas
Exemplos: celulose, agarose, dextrana etc

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Preparao das fases estacionrias

Ativao da matriz ligao de grupos reativos a matriz inerte
Preparao da coluna
Montagem igual aos demais Preferir plstico ou ao inox Colunas pequenas (seletiva) 3x 0,8 cm
M-OH + A-R-B M-OH-B + HA

Acoplamento do ligante matriz ativada. Tempo de acoplamento de poucas horas, a temperatura ambiente.
Preparao da amostra
Dissolvida no eluente que iniciar o processo Se especfica a ligao o volume no crtico, se no deve-se usar 5 % do volume da coluna Vazo alta pode diminuir a eficincia A temperatura diminui a afinidade
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M-OR-B +H-Ligante M-OR-Ligante + HB
Mtodos de eluio Aplicaes

Agentes de eluio especficos ligao preferencial da substncia nesse agente, em vez de ligar-se a fase estacionria Purificao de macromolculas anticorpos, receptores) ( protenas, enzimas,
Agentes no especficos variao de pH e /ou fora inica do tampo de eluio pode provocar alteraes no complexo macromolcula-ligante, por ionizar ou modificar estruturalmente molculas que participam do processo.
Purificao de micromolculas (peptdeos)
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94
Cromatografia de troca inica
A fase estacionia altamente carregada, e solutos com cargas de sinais contrrios a esta so seletivamente adsorvidos da fase mvel.
Os solutos adsorvidos podem ser subsequentemente eludos, por deslocamento com outros ons, com o mesmo sinal, mas maior fora de interao com a fase estacionria A diferena de afinidade entre os ons da fase mvel e a matriz devido a diferena de cargas e pode ser controlada utilizando fatores como o pH e a fora inica
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Matriz
Material poroso Inerte Insolvel em gua e em solventes orgnicos Apresentando ligaes covalentes a grupos trocadores inicos Podem ser inorgnica, orgnica , naturais ou sintticas Ex:Celulose, dextrana, agarose etc
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Aplicaes Trocadores
Liga-se covalentemente a matriz Aninico trocam nions e apresentam grupos positivos ligados a matriz Catinicotrocam ctions e apresentam grupos negativos ligados a matriz Laboratrios de pesquisa Desionizao da gua e de muitos licores aucarados de frutos e sua despigmentao Analise e eliminao de ons quando estes esto interferindo na dosagem de determinada substncia Laboratrios bioqumicos: dosagem de aminocidos Separao de frmacos
99
100
Referncias
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Fundamentos de Cromatografia. Editora Unicamp. 2007.
OBRIGADA!!!
101
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