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Produo de Antibiticos BetaLactmicos por Streptomyces sp.

em Escala de Bancada
Sb, 23 de Janeiro de 2010 Carlos O. Hokka, Maria Lcia G. C. Arajo, Marlei B. Pasotto, Alberto C. Badino Infeces bacterianas tm sido tratadas com antibiticos por mais de 60 anos. A descoberta da penicilina por Fleming, em 1928, certamente est entre os mais importantes marcos da humanidade. No entanto, entre a descoberta do princpio ativo e o uso difundido deste medicamento, passaram-se mais de 15 anos, o que mostra a dificuldade do desenvolvimento de bioprocessos para a produo de produtos deste gnero. Devido complexidade do tema, mesmo com todas as facilidades geradas pelos avanos tecnolgicos nos vrios setores ao longo dos anos, observa-se ainda na atualidade dificuldades no desenvolvimento de tecnologias associadas com a produo de novos bioprodutos. Dentre os antibiticos mais comercializados mundialmente, destacam-se os betalactmicos, merecendo destaque as penicilinas, cefalosporinas e cefamicinas, naturais e semi-sintticas. Penicilinas e cefalosporinas naturais so produzidas industrialmente por via biossinttica a partir de linhagens dos gneros Penicillium e Cephalosporium. Esses antibiticos so denominados beta-lactmicos por apresentarem na sua estrutura molecular um anel homnimo, e vm sendo utilizados como matrias-primas na produo de antibiticos semi-sintticos (Vandamme, 1984). Segundo Elander (2003), o mercado mundial de antibiticos beta-lactmicos gira em torno de 15 bilhes de dlares, correspondendo a 65% do mercado global de antibiticos. Desse montante, cerca de 5 bilhes de dlares so devidos s penicilinas e 10 bilhes de dlares s cefalosporinas e cefamicinas. Informaes obtidas junto ao Ministrio de Desenvolvimento, Indstria e Comrcio (http:/www.aliceweb. gov.br) , mostram que nos ltimos 5 anos (2002 2007), o Brasil importou cerca de 71 milhes de dlares (aprox. 1,7 ton) em medicamentos baseados em penicilinas naturais e derivados e cerca de 174,5 milhes de dlares (aprox. 1,6 ton) em compostos com base em cefalosporinas e cefamicinas naturais e semi-sintticas. Embora os antibiticos beta-lactmicos tradicionais apresentem grande eficcia no combate maioria das bactrias patognicas, ao longo dos anos algumas linhagens foram desenvolvendo resistncia a estes antibiticos. Uma das formas de resistncia microbiana a penicilinas e cefalosporinas deve-se capacidade de algumas bactrias patognicas de sintetizar Betalactamases, enzimas responsveis pela clivagem do anel beta-lactmico, resultando na perda da ao antibacteriana desses compostos.

Os antibiticos esto perdendo a luta contra as bactrias, o que pode ser notado pelo ressurgimento de epidemias de pneumonia no mundo inteiro e do aumento de casos de tuberculose. A razo disso que os mecanismos de resistncia fazem parte do prprio genoma das bactrias, o que faz com que haja mutao espontnea seguida de seleo natural das Mais aptas (Prof. Edmar Chartone de Souza - UFMG, 49a Reunio da SBPC, Folha de So Paulo, 16/07/97). Na dcada de 1970, dada a preocupao com o crescente aumento da resistncia bacteriana a antibiticos beta-lactmicos, duas grandes frentes de pesquisa foram organizadas, uma na busca de novos compostos antibiticos resistentes a beta-lactamases e a segunda na descoberta de substncias inibidoras de beta-lactamases para serem administradas em conjunto com antibiticos beta-lactmicos. Como resultado da primeira frente de pesquisa, foi descoberta a cefamicina C ou 7-alfa metoxi-cefalosporina C de culturas de Streptomyces sp. Por pesquisadores da Merck. A descoberta da cefamicina C representa um marco no desenvolvimento dos antibiticos. Pela primeira vez, uma molcula com atividade antibacteriana mostrou-se resistente beta-lactamases de bactrias Gram negativas. A cefamicina C no utilizada clinicamente, porm a molcula precursora de vrios antibiticos de importncia teraputica, chamados de cefmicos (Elander, 2003). Paralelamente, um grupo de pesquisadores da ento Beecham Pharmaceutical Research Divison elaboraram um programa de seleo e isolamento de culturas microbianas produtoras de inibidores de beta-lactamases. Foram realizados testes de inibio do crescimento da bactria Klebsiella aerogenes, resistente benzilpenicilina, utilizando-se este antibitico em conjunto com culturas supostamente produtoras de inibidores de beta-lactamases. Uma das culturas microbianas que apresentou uma resposta positiva foi a da bactria Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 (ATCC 27064) (Brown et al., 1976). Foi constatado que, embora a estrutura qumica do componente ativo da cultura filtrada apresentasse alguma semelhana das cefalosporinas sintetizadas por linhagens desta bactria, seu modo de ao antimicrobiana era significativamente diferente. Este novo composto biologicamente ativo foi denominado cido clavulnico (Reading e Cole, 1977). Dada a importncia da cefamicina C e do cido clavulnico, amplamente utilizados como matrias-primas para a produo de diversos produtos comerciais empregados no combate de infeces, e em virtude dos vultosos nmeros relacionados com a importao de antibiticos beta-lactmicos, o desenvolvimento de tecnologias nacionais para fins industriais, relacionadas com processos de produo desses compostos, pode ser considerado como estratgico para o Pas. Nesse sentido, os componentes do Grupo de Pesquisa do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), Engenharia dos Processos Biolgicos, envolvendo o grupo de Engenharia Bioqumica do Departamento de Engenharia Qumica da Universidade Federal de So Car los (DEQ/UFSCar) e pesquisadores do Instituto de Qumica da Universidade Paulista Jlio de Mesquita (IQ/UNESP) Araraquara e Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade de Campinas (FEA/UNICAMP), baseando-se em sua experincia e competncia na rea, acordaram em desenvolver o projeto de pesquisa Produo e purificao de cido clavulnico, cefamicina C e outros metablitos bioativos de Streptomyces O Projeto iniciou-se em 2006, com forte apoio financeiro da Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) e, tambm, por meio de Bolsas e Taxas de Bancada do CNPq e da Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES).

Esse grupo desenvolve atividades em linhas de pesquisa sobre Produo de Antibiticos Beta-Lactmicos em Biorreatores Convencionais e no Convencionais, iniciados em 1989, bem como sobre Separao e Purificao de Antibiticos Beta-Lactmicos, desde 2001. Estuda tambm Biorreatores como Operao Unitria desde 1999, destacando-se trabalhos em biorreatores no convencionais, e.g., tipo torre com clulas imobilizadas e tipo air-lift de circulao interna. A experincia adquirida e os bons resultados alcanados levaram o grupo a decidir pela proposio de um projeto temtico buscando o desenvolvimento de tecnologias, para fins industriais, de produoe purificao de cido clavulnico e cefamicina C, molculas recentemente incorporadas ao mercado mundial de frmacos. Tambm buscar isolar, identificar e caracterizar novos compostos de Actinomicetos do gnero Streptomyces, que se caracterizam por produzir metablitos secundrios com uma ampla diversidade estrutural incluindo no s substncias antibacterianas, antifngicas, antivirais e antitumorais, como tambm molculas com propriedades imunossupressoras, antihipertensivas e anti-hipercolesterolmicas. Streptomyces uma excelente fonte de metablitos secundrios em que intermedirios comuns na clula (aminocidos, carboidratos, cidos graxos etc.) so condensados a estruturas complexas por meio de passos bioqumicos definidos (Omura et al., 2001.) A produo de metablitos secundrios produzidos por Streptomyces podem ser associados morfologia durante fase especfica de seu crescimento, tal como descrito por Giudici et al. (2004), na produo de importante substncia antitumoral, salientando-se a importncia de modelos que expliquem o processo de produo e que, portanto, auxiliem na otimizao do mesmo. cido clavulnico O cido (2R,5R,Z))-3-(2-hidroxietilideno)-7-oxo-4-oxa-1-azabiciclo-[3,2,0]-heptano-2carboxlico nomeado cido clavulnico de acordo com a International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC). Este possui uma estrutura molecular formada por dois anis, o beta-lactmico e o anel oxazolidnico. A massa molar do cido clavulnico de aproximadamente 199 Da. O mecanismo mais importante que confere resistncia a vrios microrganismos patognicos aos antibiticos beta-lactmicos a ao de betalactamases produzidas por estes microrganismos. O cido clavulnico, apesar de possuir uma fraca atividade antibitica um potente inibidor de beta-lactamases, reagindo irreversivelmente com o stio ativo destas enzimas, sendo a nica substncia comercialmente disponvel para reverter o fenmeno da resistncia a antibiticos beta-lactmicos. Desta maneira tornou possvel a cura de vrias infeces recalcitrantes a terapias convencionais, sem necessitar de utilizao de medicamentos com fortes efeitos colaterais. O cido clavulnico comercializado no mercado farmacutico por aproximadamente 1500 US$/ kg, tal como citado por Roubos (2002). Como reagente qumico, a Sigma Aldrich (Prod.Nb P3494) iniciou este ano sua comercializao 100mg de Clavulanato de Potssio de S. clavuligerus ao preo de US$128,80. Atualmente s o cido clavulnico representa um mercado de multi-billion-US$ per annum product segundo cita literalmente Jensen et al. (2004) em seu trabalho com colaborao de pesquisadores da GlaxoSmithKline Pharmaceuticals da Inglaterra. Neste mesmo trabalho citam que a espcie Streptomyces clavuligerus utilizada industrialmente para sua produo. Saliente-se tambm que este frmaco produzido apenas em alguns pases da Europa, e.g.

Portugal, Reino Unido e Sucia. O mtodo de uso teraputico deste produto, qual seja, quatro partes de amoxicilina (penicilina semi-sinttica) com uma parte de clavulanato de potssio (500mg/125mg, por exemplo), est patenteado no exterior pela GlaxoSmithKline (GSK), onde comercializado com o nome de Augmentin cujas vendas em 2004 atingiram quase 2,6 bilhes de dlares, sendo este medicamento responsvel por 87% das vendas de antibiticos desta empresa (http://www.gsk.com/financial/rpt_q42004. htm, acesso em 18/02/2005). Atualmente, no Brasil, comercializado pela SmithKline Beecham do Brasil Ltda. com o nome de Clavulin. S. clavuligerus foi relatado pela primeira vez como nova espcie por Higgens e Kastner (1971), que descreveram a nova espcie como capaz de produzir dois novos antibiticos cefalospornicos, tendo sido isolada de amostras de solos da Amrica do Sul. Em junho de 1976, pesquisadores da ento Beecham Pharmaceuticals, Research Division, Inglaterra, em uma Communication to the editor relatam o isolamento de certas substncias de ocorrncia natural com atividade inibidora de betalactamases (Brown et al. 1976). Os isolados foram chamados de MM 141151, MM 4550 e MM 13902 (Belgian Patents 827.926, 827.331 e 827.332), sendo que o isolado MM 141151, produzido por S. clavuligerus ATCC 27064, foi chamado de cido clavulnico, devido sua origem. Cerca de uma dcada depois, inicia-se o processo de sua produo e comercializao. Estudos recentes, envolvendo incorporao de precursores marcados com istopos, isolamento de enzimas juntamente com a obteno de mutantes auxotrficos argB-2 e argC-2, revelaram uma seqncia biossinttica completamente diferente daquela de outros betalactmicos, isto , no envolve a formao do trpetdeo alfa aminoadipato-cistena-valina (ACV), intermedirio comum nos passos metablicos de penicilinas, cefalosporinas e cefamicinas. Estudos qumicos, bioqumicos, genticos e de biologia molecular ainda so devidos para comprovar definitivamente os passos metablicos e elucidar os mecanismos regulatrios de sua biossntese (Thomas, 2004). Cefamicina C A cefamicina C uma substncia beta-lactmica inicialmente isolada de S. clavuligerus como um inibidor da sntese de parede celular (Omstead et al., 1985). Posteriormente verificou-se que, alm de possuir alguma atividade contra bactrias Gram negativas, era resistente a ao de beta-lactamases. Esta resistncia deve-se a presena do grupo 7-alfametxico que estabiliza a estrutura do anel beta-lactmico. Antibiticos semi-sintticos derivados da cefamicina C como a Cefoxitina e Cefotetan, possuem um amplo espectro de ao antimicrobiana, tornando-se ativo tambm contra bactrias Gram positivas. Em virtude da alta resistncia ao de beta-lactamases e da potente atividade antibacteriana, pode at ocorrer que as cefamicinas superem as penicilinas e as cefalosporinas no mercado de antibiticos (Sridhar, 2002). A descoberta da cefamicina C representa um marco no desenvolvimento dos antibiticos. Pela primeira vez, uma molcula com atividade antibacteriana mostrou-se resistente a beta-actamases de bactrias Gram negativas. A cefamicina C no utilizada clinicamente, porm o precursor de vrios antibiticos de importncia teraputica, chamados de cefmicos. S. clavuligerus, amplamente estudado por Liras (1999), dos mais utilizados industrialmente, tendo a capacidade de sintetizar tambm o cido clavulnico. Porm, diferentemente do cido clavulnico, o passo metablico de sua sntese j conhecido,

tendo vrias etapas em comum com aquelas da sntese de cefalosporina, incluindo a formao do tripepitdeo ACV como intermedirio (Liras, 1999). Alm disso, Tunca et al. (2004), j inicia estudos visando compreender melhor o mecanismo regulatrio de sua sntese. Industrialmente, a cefamicina C produzida por grandes empresas farmacuticas como a Eli Lilly & Co., Merck & Co., Takeda Industries e Otsuka Pharmaceuticals (Sridhar, 2002). Segundo Demain e Elander (1999), a maioria dos processos de produo de cefamicina C utilizam agentes da ordem dos Actinomyces, sendo que apenas a Merck & Co., Inc. emprega Nocardia lactamdurans. Ressalte-se que a cefamicina C um produto que, segundo Demain (2005), produzido por fermentao, para depois ser transformado quimicamente. Alm do mais no est disponvel comercialmente nem mesmo sob a forma de reagente, tornando imprescindvel seu isolamento e caracterizao para viabilizar estudos de processos de produo.

Desenvolvimento de processos fermentativos


Os processos industriais que envolvem a produo de bioprodutos por fermentao, entre os quais se incluem as produes de diversos antibiticos, envolvem uma seqncia ordenada de etapas at a obteno do produto final com grau de pureza necessrio. A etapa de produo propriamente dita, onde constituintes do meio de cultura so convertidos em clulas e produto, ocorre em equipamentos denominados biorreatores ou fermentadores. A seqncia de etapas que precedem a etapa de fermentao so denominadas etapas de preparao ou up-stream e as etapas posteriores a de gerao do produto so denominadas etapas de separao e purificao ou down-stream. Dentre as vrias etapas de preparao, pode-se citar o preparo e a esterilizao do meio de cultura, a esterilizao do ar e o preparo do inculo. Aps a etapa fermentativa, seguem as etapas de separao e purificao do produto, envolvendo operaes unitrias como centrifugao, filtrao, ultrafiltrao, microfiltrao, extrao por solvente orgnico, adsoro e cristalizao, entre outras. O desenvolvimento tradicional de processos fermentativos usualmente executado em trs estgios ou escalas, a saber, escala de bancada, escala piloto e escala industrial. Na escala de bancada, tendo em vista sua maior flexibilidade e menor custo de operao, os dados bsicos sobre o processo devem ser levantados dentro do maior nvel de detalhes possvel. No que diz respeito etapa fermentativa, nessa escala so realizadas tarefas bsicas como a seleo do microrganismo e o desenvolvimento do meio de cultura ideal. So tambm escolhidas as condies de temperatura e pH para o processo, assim como a forma de operao do biorreator. Caso o processo seja aerbio, deve-se conhecer a velocidade de consumo de oxignio a fim de que se possa dimensionar adequadamente o sistema de transferncia de oxignio. Ainda, este levantamento de dados deve permitir a elaborao de modelos matemticos, a fim de se poder visualizar o desempenho do processo em condies no pesquisadas experimentalmente, por meio da simulao do modelo, o que tambm auxilia o raciocnio nas etapas subseqentes (Badino e Schmidell, 2001). Nessa escala tambm so estudadas em detalhes as diferentes operaes de separao e purificao na busca de uma seqncia otimizada de operaes que defina um protocolo de isolamento para o produto, para ser aplicado em escalas de trabalho superiores como a piloto e a industrial. So escolhidos os tipos de membranas e colunas mais apropriadas, obtidas informaes termodinmicas da etapa de extrao por solventes, bem como definidas as melhores

condies experimentais com base em parmetros do processo como presso transmembrana, temperatura, concentraes e vazes de operao, entre outros. Uma vez que se tenha acumulado suficiente experincia sobre o processo fermentativo em questo, e desde que se tenha atingido desempenho adequado do ponto de vista econmico, pretende-se ampliar a escala para uma escala piloto. Como agora a operao mais onerosa, deve-se manter constante grande parte das variveis. Com base no conhecimento acumulado do processo, deve-se definir determinados critrios ou parmetros de ampliao de escala, ou seja, determinadas grandezas que devero manterse constantes na escala piloto em relao aos valores empregados na escala de bancada. Como exemplo, durante a etapa fermentativa pode-se pensar em manter constante o cisalhamento no reator, caso as clulas sejam sensveis a ele, ou manter-se constante a transferncia de oxignio, no caso de cultivos de clulas aerbias. A escala industrial, devido prpria dimenso, visa o lado econmico do processo, ou seja, a produo em grande escala, onde se procura operar o processo sob condies similares s ajustadas na escala piloto, as quais permitiram a obteno de um desempenho adequado das vrias etapas envolvidas. Em suma, embora cada uma das escalas tenha sua devida importncia no desenvolvimento de processos fermentativos, pode-se constatar que o sucesso do desenvolvimento de um bioprocesso tem sua origem na escala de bancada, onde so obtidas as informaes cruciais das vrias etapas envolvidas.

Produo de antibiticos betalactmicos em escala de bancada


O projeto que vem sendo desenvolvido desde 2006 tem como objetivo o estudo das diversas etapas necessrias para o desenvolvimento de biotecnologia de produo de produtos bioativos obtidos de Streptomyces, entre eles o cido clavulnico e a cefamicina C, para os quais pretende-se propor alternativas de todo o processo de produo, envolvendo desde melhoramento gentico, desenvolvimento de bioprocessos e biorreatores, at o desenvolvimento de sistemas de separao, extrao e purificao. Pretende-se realizar a anlise, modelagem e simulao do processo fermentativo e das etapas de downstream. As possveis tecnologias a serem desenvolvidas sero disponibilizadas para explorao comercial pelo setor produtivo. Espera-se tambm que algumas dessas alternativas possam ser utilizadas para outros compostos bioativos a serem isolados. Para tanto quatro instituies estaro diretamente envolvidas: IQ/UNESP, FEA/UNICAMP, DEQ/UFSCar e AB/IPT. Alm disso, atuaro como colaboradores em reas especficas, o DQ/UFSCar e instituies no exterior. Na seqncia so apresentados os subprojetos (SP) que compem o projeto temtico proposto, bem como o objetivo de cada uma das etapas a serem desenvolvidas. SP1. Melhoramento gentico de linhagem produtora por mtodos clssicos e utilizando tcnicas baseadas na biologia molecular Objetivos: melhoramento da produo de cido clavulnico por Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 por meio da obteno de clones melhorados geneticamente por via clssica. Investigao de mutantes com baixa produo de cido clavulnico com

relao produo de cefamicina C. Estudo da linhagem Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 por meio de tcnicas de biologia molecular, em relao aos genes regulatrios da via biossntetica do cido clavulnico e cefamicina C. Deteco de outros metablitos bioativos a partir de Streptomyces: antibiticos beta-lactmicos, substncias com atividade anti-beta-lactamase e substncias com atividade antitumoral. SP2. Isolamento, purificao e caracterizao e de cido clavulnico e cefamicina C outros compostos bioativos de estreptomicetos Objetivos: escolha de solventes para extrao, avaliao por cromatografia de camada delgada do caldo, separao e purificao por cromatografia em colunas e por HPLC para fins de caracterizao e caracterizao por anlise instrumental. SP3. Desenvolvimento de bioprocessos para produo de cido clavulnico, de cefamicina C e de metablitos secundrios bioativos Objetivos: Produo de cido clavulnico e de cefamicina C em processo contnuo com reciclo celular e comparao de seu desempenho com processos em batelada, batelada alimentada e contnuo, em biorreatores convencionais e no convencionais e ampliao de escala. Produo de outros metablitos bioativos em frascos agitados e em biorreator de bancada. SP4. Estudo de alternativas para processo de separao e purificao de cido clavulnico e cefamicina C envolvendo extrao por solvente; extrao em sistema de duas fases aquosas, purificao em colunas com resinas de troca inica e neutras, utilizao de zelitas como peneira molecular e utilizao de microfiltrao, ultrafiltrao e nanofiltrao Objetivos: estabelecimento de mtodos eficazes de extrao e purificao de compostos beta-lactmicos, de modo a se constiturem em tecnologias para produo industrial. A participao da indstria farmacutica nacional seria muito interessante para o pleno desenvolvimento do projeto, pois possibilitaria adequar as alternativas tecnolgicas a serem desenvolvidas ao tamanho de mercado que se espera atingir, bem como de que produtos especficos estaria mais interessada em explorar.