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LES PLASMIDES : STRUCTURE ,FONCTIONS ET METHODES DETUDE

PLAN : I. II. Introduction Structure et organisation des plasmides 1. Structure 2. Organisation A. Elements obligatoires B. Elements facultatifs Fonctions et types de plasmides Classification des plasmides 1. Taille et phnotype 2. Taille , conjugatife ou non , phnotype 3. INC 4. Type pilaire Physiologie des plasmides 1. Replication a. Theta b. En cercles roulants 2. Fonctions de l region OriV Mthodes detude des plasmides 1. Mthodes gntiques A. Transferts gntiques B. Cure plasmidique 2. Mthodes physiques a. Extraction et purification b. Revelation - Electrophorese - Hybridation Conclusion

III. IV.

V.

VI.

VII. VIII.

I.

INTRODUCTION : les plasmides sont des fragments dadn extrachromosomiques acultatifs pour la bacterie mais lui permettent une adaptation rapide en rponse des chngements environnementaux. En microbiologie mdicale les plasmides , par leurs proprits de transfert et de plasticit posent un grave probleme car ils sont le support de multirsistance aux antibiotiques et de dissmination dans le monde bacterien.

II.

STRUCTURE ET ORGANISATION DES PLASMIDES : 1. Structure


Les plasmides sont des molcules dADN extrachromosomique le plus souvent , la forme la plus rpondu est un ADN double brun , circulaire ferm super-enroul , on trouve des variants circulaires relchs avec un brun coup ou une forme linaire avec deux bruns coups. La taille est variable et va de 1 a plus de 400 kb 2. ORGANISATION : elle est variable et flexible en fonction du plasmide considr One rpartit les lments du plasmide en : a. Element obligatoire : represent par la zone de rplication b. Elements facultatifs : Rgion de transfert (Operon tra) dterminant des Plasmides conjugatifs ou rgion mob dterminant des plasmides mobilisables. Elements gntiques mobiles (tn , is) ou non (integrons) Divers gnes : R aux ATB , mtabolisme

III.

FONCTIONS ET DIFFERENT TYPES DE PLASMIDES :

Les plasmides sont des lments facultatifs a la survie bactrienne, mais trouvent toute leur importance dans des situation ou une adaptation a des changement relativement rapides de lenvironnement de la bactrie simpose. Parmi les fonctions apports par les plasmides :

1. Les transferts gntiques : La conjugaison CF partie amira 2. 3. 4. 5. Rsistance aux antibiotiques Chaines mtaboliques particulires supplmentaires Facteurs de virulence Production de bactriocines

Ceci conduit a 5 types de plasmides : 1. Plasmide mtabolique : permettent lutilisation de certains nutriments ex : citrate , AA soufrs , ure ) 2. Plasmides de fertilit : permettant les transferts gntiques. 3. Plasmides de rsistance : codent globalement pour des facteurs de rsistance dans lenvironnement (antibiotiques, poisons ) 4. Plasmides bacteriocinogenes : codant pour des antibiotiques tuant les autres bactries. 5.Plasmides de virulence : codent pour divers facteurs de virulence qui permettent la transformation de la bacterie en pathogne ex : pili , toxines VI. CLASSIFICATION DES PLASMIDES : 1. Taille , Phnotype : peu de valeur car ne tient pas compte de la plasticit des plasmides. 2. Taille , nombre de copies et phnotype : on distingue :

a. Les petits plasmides en grand nombre non conjugatifs pouvant etre mobilisables dont la rplication est relache b. Les gros plasmides conjugatifs en nombre de copies limit dont la replication est rigoureusement contrle. 3. LES GROUPES dincompatibilit (Inc) 4. Types pilaires : dans ce cas le pili sexuel peut servir de recepteur aux phages il en dcoule que des plasmides de meme type pilaires sont sensibles au meme phages. Mais cette classification est moins sensible que les Inc.

V. Physiologie des plasmides : 1. La replication : elle utilise les enzymes de la bacterie hote , il existe 2 types de replication plasmidique : A. La replication type theta : dans ce cas , a partir dune amorce dARN synthtise au niveau de la region OriV , une fourche de replication dans lunidirectionnelle , ou deux dans la bidirectionnelle vont ce dplacer le long de la molcule dADN pour ce rencontrer respectivement au niveau de la region OriV ou au niveau du site de terminaison B. La rplication en cercle roulant : dans ce cas la rplication a lieu aprs cassure dun brun au niveau de la rgion OriV , lextrmit 3 servira damorce a la rplication quand a lautre brun il servira de matrice a la synthse dADN. ce meme mcanisme est retrouv lors du transfert par conjugaison sauf que la cassure a lieu au niveau de la rgion OriT , le brun transfr dans la cellule rceptrice et celui restant dans la cellule donatrice vont etre rpliqus

A la fin de la rplication on assiste a la formation de polymres de plasmides au niveau du site de termnaison (concatemeres) qui subissent une rsolution via une recombinaison specifique . Grace au systme de partage (operon Par) chaque plasmide , en particulier les plasmides rigoureux seront distribus dans chaque cellule fille. Loperon Par code pour des proteines ralisant par polymerisation un filament portant a chaque bout un plasmide quil lie par sa rgion OriV. Plus la polymerisation avance plus les 2 plasmides seloignent , lorsque la cellule ce divise ce filament ce romp liberant le plasmide.

La rsolution des polymeres et le systme de partage empechent la perte des plasmides lors de la division (cure) 2. FONCTIONS DE LA REGION OriV : cette rgion joue un role cl dans plusieurs ont processus fonctionnels du plasmide a. Dtrmination du spectre dhote : en fonction du nombre dlments requis pour la rplication et cods par le plasmide , celui-ci dpondra plus au moins des fonctions de sa bactrie hote . plus celui-ci est dpendant plus son spectre dhote sera etroit et vice versa. b. Rgulation du nombre de copies du plasmide dans la cellule : le nombre de copies determines deux groupes : Les plasmides relachs ou en grand nombre de copies Les plasmides rigoureux ou en petit nombre de copies.

Parmi les systmes de rgulation du nombre de copies , on trouve la rgulation par lARN dans le plasmide ColE1 qui , dont une rgion code pour un ARN II qui lie lamorce ARN ncessaire a la replication , quand le nombre de copies est elev lARNII en exs lie lARNI et la rplication na pas lieu entraiant la limitation du nombre de rplicons. C. Rpartition des plasmides (en particulier des plasmides rigoureux) sur les bactrie filles via le systme PAR. D. Dtermination des groupes dincompatibilit via la rgulation des mcanismes de rgulation de rpartition des plasmides. En effet il est impossible pour certains plasmides de coexister , de manire stable dans une cellule , et il y aura perte dun des 2 plasmides , dans ce cas la les plasmides ont dis incompatible et font partie dun meme groupe dincompatibilit ..

Vi.METHODES DETUDE DES PLASMIDES :

Les mthodes peuvent etre rparties en mthodes gntiques et des mthodes physiques. 1. Mthodes gntiques : 2 principaux mthodes sont

a. Les transferts plasmidiques : consiste en lacquisition dun ou plusieurs caractres phnotypiques suite a une conjugaison entre de bactries porteuses dun marqueur de selection chromosomique (ex : rsistance a un ATB Ecoli K12NAL par ex ) ex : hmolyse , vie mtabolique , toxine , rsistance a un ATB autre que les marqueurs de selection b. La cure plasmidique : consiste en la perte dun plasmide par par croissance dans des conditions inhibant specifiquement sa replication. la perte du plasmide rsulte en la perte de certaines fonctions . dans ce cas le marqueur de selection peut etre le plasmide lui-mme. Ex : un plasmide codant pour une beta-lactamase , si perdu , il y aura restoration de la sensibilit de la bacterie a certaines betalactamines. NB : on peut proceder en couplant les 2 mthodes (conjugaison puis cure )

NB : lassociation des 2 mthodes donne 2. METHODES PHYSIQUES : A. EXTRACTION ET PURIFICATION DES PLASMIDES : Les bactries subissent un traitement dtergeant doux, suivi dune centrifugation pour sdimenter le chromosome lourd. Le surnageant subira ensuite un traitement de purification physique et chimique (lyse alcaline couple a une ultracentrifugation sur gradient Chlorure de csium ou plus moderne par chromatographie.

B. REVELATION :
-par lectrophorse conventionnelle sur gel dagarose sans ou aprs rstriction (typage plasmidique par RFLP) -Hybridation ADN-ADN (Southern blot)

VII. CONCLUSION : les plasmids sont des fragments dand extrachromosomiques ayant des proprieties gntiques unique dont la conaissance est primordiale afin de les utiliser ou de lutter contre