Pirosecuenciacin La Pirosecuenciacin fue inventada por Mostafa Ronaghi basndose para ello en el trabajo previo de Robert J.

Melamede refirindose en este a la secuenciacin automatizada de cidos nucleicos. Se trata de una tcnica de secuenciacin de ADN basada en la deteccin del pirofosfato (PPi) durante la sntesis del cido nucleico. En una cascada de reacciones enzimticas se libera luz que es proporcional a la cantidad de nucletidos que se incorporan a la cadena por la accin de la ADN polimerasa(fragmento Klenow de ADN Pol I de E. coli, es decir, es un producto de la digestin de polimerasa mencionada carente de actividad de exonucleasa). De esta tcnica hay dos variantes que son la de Fase Slida y la de Fase Lquida, siendo la diferencia el total de enzimas utilizadas pues en la de fase lquida es agregada la Apirasa (obtenida de la papa), gracias a esta enzima no se necesitan los constantes lavados para eliminar los nucletidos no incorporados as como el ATP no reaccionante que en la Pirosecuenciacin de Fase Slida son requeridos; los nucletidos se degradan de nuclesidostrifosfato a difosfato hasta monofosfato. En Fase Slida se requiere una base en la cual colocar el ADN que ser secuenciado, esta es partculas magnticas cubiertas de estreptavidina. En el sistema de cuatro enzimas, de Fase Lquida, todo se procesa en un solo tubo con el inconveniente de la acumulacin de sustancias inhibitorias que reducen la eficiencia de la Luciferasa y la Apirasa; se da preferencia a la Pirosecuenciacin de Fase Slida al ser ms limpia pues entre cada lavado se eliminan las sustancias inhibitorias anteriormente mencionadas. El procedimiento inicia con la preparacin de las libreras de ADN, estas se preparan mediante la nebulizacin (fraccionamiento) de la cadena original en fragmentos de 200 a 800pb a los cuales se acoplan pequeas secuencias de 44 bases de largo que se conocen como Adaptador A y B, un Adaptador B de una de las dos hebras est biotinilado por lo que se unir a la partcula con estreptavidina; aquellas que solo tengan Adaptador A no se unirn y se desecharan en los lavados, las que solo tienen B se unirn por los dos extremos a la partcula y no podrn aislarse las cadenas simples por lo que lo ideal es que formen cadenas con Adaptadores A y B, el ltimo paso de la preparacin de las libreras es la alcalinizacin con NaOH para la generacin de cadenas simples. Amplificar las cadenas simples es el siguiente paso por lo que se realiza una PCR por Emulsin; la emulsin de agua-aceite se conforma de Span 80, Tween 80 y Triton X-100. Las cadenas simples obtenidas anteriormente se hibridan a partculas afines al adaptador A con lo que se aaden a la emulsin partculas con una nica secuencia que se aslan en pequeas gotas conteniendo todos los reactivos necesarios para la PCR, estas se llaman Microreactores; al final de la PCR se tendrn partculas con mltiples copias de la secuencia que tuvieran adherida que se someten otra vez a alcalinizacin para obtener nuevas cadenas simples.

Por ltimo la secuenciacin requiere previamente de hibridar a la cadena simple los cebadores necesarios para la polimerizacin as como aadir los cofactores y la polimerasa; las partculas son distribuidas en placas con pocillos de 44m, donde solo cabe una partcula por pocillo que se complementan con ms partculas que contienen la Sulfurilasa y la Luciferasa. Se procede a aadir los dNTPs con lo que da inicio la secuenciacin. Reacciones: Al aadir uno por uno los dNTPs y si son polimerizados liberaran PPi. El PPi es procesado por la ATP Sulfurilasa formando a partir de APS (adenosin 5-fosfosulfato) ATP en ~1.5 segundos. El ATP ahora se procesa por la Luciferasa oxidando la Luciferina a Oxiluciferina con la resultante liberacin de luz (<0.2 segundos), esta es proporcional a la cantidad de nucletidos polimerizados siendo detectada por una cmara CCD (Charge-CoupledDevice) de forma paralela para cada uno de los pocillos producindose al final un pirograma donde se est resolviendo la secuencia exacta de los nucletidos. De tratarse de Pirosecuenciacin en Fase Lquida, despus de cada adicin de nucletidos la Apirasa se encarga de degradar los nucletidos y el ATP no reaccionantes. La enzima degradadora de nucletidos debe cumplir con las siguientes propiedades: hidrolizar todos los dNTPs a la misma frecuencia, hidrolizar el ATP para evitar su acumulacin entre cada ciclo y la frecuencia de degradacin debe ser menor a la de incorporacin por la polimerasa. Aplicaciones para la Pirosecuenciacin pueden ser: la Genotipificacin de Polimorfismos, la Tipificacin Microbiana, Resecuenciacin y el Marcaje de Secuencias.

BIBLIOGRAFA
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LINK AL ARTCULO PRINCIPAL: http://genome.cshlp.org/content/11/1/3.full

QIAGEN.(2011). Principle of Pyrosequencing Technology. [enlnea]. Recuperado el 28 de agosto de 2011 de http://www.pyrosequencing.com/DynPage.aspx?id=7454 (VIDEO DE LAS REACCIONES) Roche Applied Science. Genome Sequencer FLX.[en lnea]. Recuperado el 28 de agosto de 2011 de http://www.rocheapplied-science.com/publications/multimedia/genome_sequencer/flx_multimedia/wbt.htm

(EXPLICACIN DE

FASE SLIDA)

Williams R., Peisajovich S. G., Miller O. J., Magdassi S., Tawfik D. S., Griffiths A. D. (2006). Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR.Nature Publishing Group. 3:545-550 [en lnea]. Recuperado el 28 de agosto de 2011 de NatureMethods. DOI: 10.1038/NMETH896. Medicina Molecular. (2009). Pirosecuenciacin. [en lnea]. Recuperado el 28 de agosto de 2011 de http://www.medmol.es/tecnicas/85/