PRACTICA DE LABORATORIO 7 COPROCULTIVO El paciente afectado de diarrea emite heces lquidas o blandas, mucosas o hemorrgicas.

La diarrea puede ser aguda o crnica, con o sin fiebre. Se debe recordar que no todos los episodios diarreicos tienen una etiologa infecciosa y que todas las diarreas infecciosas no se deben a la presencia de bacterias. En esta prctica solamente nos enfocaremos a las diarreas de origen infeccioso. El objetivo principal consiste en la bsqueda de microorganismos patgenos responsables de diarrea y para esto el coprocultivo intenta aislar del seno de una flora compleja, un nmero limitado de especies patgenas. El coprocultivo se practica sobre heces lquidas, blandas, mucosas o hemorrgicas o bajo indicaciones muy precisas en heces slidas. En medio hospitalario, se puede investigar en las heces, bacterias de infecciones nosocomiales (i.e P.aeruginosa en el recin nacido, una cepa con una resistencia particular a un antibitico (i.e Enterococos resistentes a la vancomicina o una enterobacteria productora de una betalactamasa de espectro extendido). En el caso habitual y en ausencia de criterios especficos de orientacin se buscar sistemticamente: Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., adicionalmente sembraremos un medio no inhibidor para la bsqueda de bacterias de las familias Vibrionaceae y Pseudomonadaceae (oxidasa positivas) y un medio para valorar dismicrobismo de la flora fecal (puresa o predominancia del cultivo) MATERIALES 1 Muestras de heces fecales lquidas o blandas 2 Una caja de agar por grupo de los siguientes medio: - Agar MacConkey - Agar Hektoen - Gelosa alcalina - 1 tubo con Mueller Kauffmann (puede ser reemplazado por caldo selenito, tetrationato o medio Rappaport) 3 Placas portaobjetos (3 por grupo) 4 Placas cubreobjetos (2 por grupo) 5 Hisopos 6 Pipeta Pasteur 7 Asa redonda para estriado 8 Solucin salina (1 tubo con 10 mL)

PROCEDIMIENTO Primer da 1 Abrir el recipiente conteniendo la muestra y seleccionar el sitio de donde se tomar una porcin (presencia de moco o sangre) 2 Con el hisopo tomar una cantidad del tamao de un frjol y colocarla en el tubo que contiene la solucin salina (dilucin aproximada 1/10)

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Con otro hisopo tomar otra porcin de muestra y realizar dos frotis finos y dejar secar al ambiente. Realizar una coloracin gram y un Ziehl modificado para visualizacin de coccdeos. La tercera placa portaobjetos ser utilizada para realizar un coproparasitario con suspensiones en solucin salina y lugol Colocar en el medio de enriquecimiento previo a la siembra cuatro gotas de solucin Yodo-yodurada (oxidacin del tiosulfato en tetrationato para inhibicin de crecimiento de coliformes). Tomar una porcin de heces con el hisopo y sembrar el medio de enriquecimiento para Salmonella (dilucin aproximada 1/10), incubar a 35C durante 18 a 24h Con la suspensin de heces en solucin salina sembrar los medios Hektoen, MacConkey y Gelosa alcalina (una gota en la superficie y estriar). Incubar a 35C durante 18 a 24h

Segundo da 1 Retirar las cajas y el tubo de enriquecimiento del incubador 2 Buscar en el medio Hektoen colonias lactosa negativas (sospecha de Salmonella o Shigella) 3 Hacer la prueba de oxidasa en varias colonias del medio gelosa alcalina en bsqueda de bacterias sospechosa de pertenecer a las familias Vibrionaceae o Pseudomonadaceae. 4 Observar el agar MacConkey y anotar las caractersticas de las colonias (si evidencia presencia pura de un solo tipo de colonias, es un dismicrobismo que deber ser reportado) 5 Tomar una gota del tercio superior del caldo de enriquecimiento y sembrar otro agar Hektoen. Incubar a 35C durante 18 a 24h 6 Sobre las colonias sospechosas se deber realizar una galera de pruebas bioqumicas (Citrato, Kligler, LIA, SIM, MRVP, Urea) Tercer da 1 Retirar el segundo Hektoen sembrado a partir del medio de enriquecimiento y buscar colonias lactosa negativas (sospechosa de Salmonella spp.) 2 Reportar los resultados

IMGENES

Hektoen con colonias lactosa positivas (color salmn)

Hektoen con colonias lactosa negativas (color verde con o sin punto negro)

Detalle de las colonias lactora negativas productoras de H2S (punto negro)

PRACTICA DE LABORATORIO COLORACION DE ZIEHL NEELSEN MODIFICADA (CRYPTOSPORIDIUM CICLOSPORA) REACTIVOS: Solucin A: Solucin B: 15g de Fucsina bsica en 100 ml de etanol 95. Disolver en un mortero Agua fenicada a 5%

La Fucsina de Ziehl: 100 ml de solucin A + 900 ml de solucin B. Dejar unos das, filtrar y fechar el frasco obscuro. Acido sulfrico al 2% Azul de metileno al 5% TECNICA: 1.Realizar un frotis fino de heces frescas bien extendidas sobre la lmina e identificarla. Secar sobre la platina o al ambiente. Fijar 5 con alcohol metlico al 95%, descartar el excedente y secar al medio ambiente. Colorear la lmina con Fucsina de Ziehl durante 30. Lavar con agua rpidamente. Diferenciar en el Acido Sulfrico al 2% durante 30 segundos. Limpiar con agua. Contracoloracin con Azul de Metileno al 5% durante 1 minuto. Limpiar con agua. Dejar secar la preparacin al ambiente. La lectura se debe realizar con el objetivo 40x colocando sobre el frotis una gota de aceite de inmersin en extensin. Confirmar a 100x.

2.3.-

4.5.6.7.8.9.10.11.-

12.-