Quim. Nova, Vol. 26, No.

4, 556-563, 2003 ESPECTROMETRIA DE MASSAS COM IONIZAO POR ELECTROSPRAY APLICADA AO ESTUDO DE ESPCIES INORGNICAS E ORGANOMETLICAS Maria Carolina B. Moraes Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de So Paulo, CP 96, 13400-970 Piracicaba - SP Claudimir Lucio do Lago* Departamento de Qumica Fundamental, Instituto de Qumica, Universidade de So Paulo, Av. Prof. Lineu Prestes, 748, 05508900 So Paulo - SP Recebido em 27/5/02; aceito em 20/11/02
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Divulgao

ELECTROSPRAY IONIZATION MASS SPECTROMETRY APPLIED TO STUDY INORGANIC AND ORGANO-METALLIC SPECIES. Although electrospray ionization mass spectrometry (ES-MS) has been extensively applied to study organic and biochemical species, it is also specially suitable to study inorganic and organo-metallic species. Such species, even those that are low-volatile or thermo-unstable, can be easily ionized or simply transferred from liquid to gas phase by electrospray. However, chemical transformations frequently occur during the process. This paper discusses the fundamental aspects of electrospray ionization as well as its analytical applicability to inorganic and organo-metallic species in order to spread the technique and make its characteristics more familiar to potential users. Keywords: mass spectrometry; electrospray; metal ions.

INTRODUO Um espectrmetro de massas pode ser entendido, via de regra, como um instrumento contendo uma fonte de ons, um separador ou filtro de massas na realidade, massa/carga (m/z) e um detector. Embora, existam vrias estratgias para separao e deteco, a etapa de ionizao aquela com o maior nmero de diferentes estratgias. Isso se deve grande variedade de tipos de amostras e espcies de interesse. Amostras slidas, lquidas ou gasosas contendo espcies volteis ou no e com interesses voltados desde a anlise elementar at a composio de protenas requerem diferentes processos de ionizao. Uma vez gerados os ons, os processos de separao e deteco podem ser escolhidos de acordo com caractersticas mais ou menos comuns como sensibilidade, resoluo e preciso de m/z e custo. Neste contexto, surgiu a ionizao por electrospray como uma alternativa para gerao de ons a partir de espcies pouco volteis presentes em fase lquida. Um levantamento na literatura mostra que, de 1980 a 2000, o nmero aproximado de artigos publicados usando electrospray passou de 100 para 7800, sendo que 80% destes esto relacionados com anlise de biomolculas e de compostos orgnicos, 10% so relativos instrumentao e estudos sobre os aspectos fundamentais da formao do electrospray e 10% das publicaes esto associadas a espcies organometlicas e inorgnicas nas mais diferentes formas. Apesar deste fato, vrios pesquisadores ainda desconhecem a potencialidade desta tcnica, o que motivou este artigo de divulgao. ASPECTOS FUNDAMENTAIS DA IONIZAO POR ELECTROSPRAY Embora seja normalmente considerada como uma fonte de ionizao, o electrospray , na realidade, um processo de transfe*e-mail: claudemi@iq.usp.br # endereo atual: Embrapa Cernagen PqEB, W/5 Norte (final), 70770-900 Braslia - DF

rncia de ons pr-existentes em soluo para a fase gasosa. Pode-se dizer que a efetiva ionizao (transformao de uma espcie neutra em um on) um efeito secundrio. De qualquer forma, fcil entender porque uma tcnica que permite a transferncia de ons de uma soluo para a fase gasosa para anlise por espectrometria de massas, em to pouco tempo, teve um impulso to grande: isto se deve ao fato da maioria dos processos qumicos e bioqumicos ocorrerem em fase lquida, envolvendo muitas vezes espcies pouco volteis. O electrospray foi sugerido como um possvel modo de ionizao para espectrometria de massas por Dole em 19681. No entanto, seus experimentos no foram convincentes pois estes visavam a anlise de espcies polimricas, como poliestireno, que no esto ionizados em soluo. Foi somente em 1984 que Yamashita e Fenn demonstraram a aplicabilidade da fonte de electrospray como um mtodo de ionizao branda2. Mtodos de ionizao anteriores ao electrospray, no qual ons so transferidos da fase lquida para a fase gasosa, tal como bombardeamento de tomos rpido (FAB) ou dessoro por plasma, provocam no s a dessolvatao dos ons, mas, muitas vezes, sua fragmentao e formao de ons a partir de molculas neutras. Isto se deve ao fato de que, nestas tcnicas, uma grande quantidade de energia fornecida de forma focalizada e em um curto perodo de tempo. A principal vantagem do electrospray sobre estas outras tcnicas que a dessolvatao ocorre gradualmente em temperaturas relativamente baixas (tipicamente, de temperatura ambiente at 80 C), de forma a no gerar fragmentos nem molculas ionizadas. Assim, muitos dos ons gerados na fase gasosa mantm exatamente a mesma estrutura e carga das espcies em soluo, o que perfeito para anlise de espcies no volteis e para estudos de especiao. No entanto, isto no ocorre para todas as espcies. Muitas vezes, uma espcie com carga maior ou igual a dois est estabilizada devido camada de solvatao. medida que a espcie dessolvatada, tende a se envolver em processos que levem reduo de sua carga. Alm disto, espcies neutras podem ser ionizadas por processos eletrolticos na fase lquida, formao de agregados inicos durante o processo de electrospray e por dissociao induzida por coliso

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(CID) j na fase gasosa. A preservao ou no dos ons originais est intimamente ligada ao processo de ionizao por electrospray3. A ionizao por electrospray envolve a formao de um spray eletrosttico, a partir do qual so geradas pequenas gotas carregadas e destas so liberados os ons. A implementao de uma fonte de electrospray relativamente simples, comparando-se com outras fontes para espectrometria de massas3. necessria uma fonte de alta tenso (1000 a 7000 V) que esteja em contato com a soluo contendo eletrlitos. Tipicamente, esta soluo bombeada atravs de um capilar (d.i. 50 a 100 m) com uma vazo inferior a 10 L/min. No caso de fluxos menores que 1 L/min, o processo chamado de nanoelectrospray. A Figura 1 mostra uma representao esquemtica da fonte de electrospray de um espectrmetro Platform II (Micromass, Inglaterra). Toda a regio da fonte est presso atmosfrica. Quando um potencial positivo, por exemplo, aplicado na soluo, os ons positivos tendem a se afastar para uma regio menos positiva, isto , em direo ao contra-eletrodo. Assim, a gota sendo formada na ponta do capilar estar enriquecida em ons positivos. Este tipo de separao de carga chamado de processo eletrofortico. Conforme a densidade de carga aumenta na gota, o campo eltrico formado entre o capilar e o contra eletrodo aumenta provocando a deformao da gota. A gota ganha a forma de um cone que denominado de cone de Taylor.

re ininterruptamente pela soluo, como nas clulas eletrolticas convencionais. Parte do transporte dos ons ocorre na fase gasosa. Uma reao de oxidao normal ocorre no eletrodo positivo, isto , na interface soluo/fio metlico. Esta reao fornece ons positivos soluo, convertendo tomos do metal em ons metlicos positivos e liberando eltrons (Equao 1). Outra alternativa remover ons negativos presentes na soluo atravs da oxidao (Equao 2) ou oxidao do solvente ou outra espcie neutra (Equao 3). A reduo das espcies ocorre no contra-eletrodo (Equao 4). Estes processos so vlidos se considerarmos o electrospray como fonte de ons positivos. Obviamente, com a reverso dos potenciais sobre os eletrodos, os processos de oxidao e reduo seriam invertidos. M(s) M2+(aq) + 2e (no metal) 4OH (aq) O2(g) + 2H2O + 4 e (na soluo) H2O 2H+ +1/2 O2 + 2 e (oxidao do solvente) A+ + e A (no contra eletrodo) (1) (2) (3) (4)

Figura 1. Representao esquemtica da fonte do electrospray: a- capilar, b- contra-eletrodo, c-cone de amostragem, d- skimmer, e- lentes do skimmer. A regio I est presso atmosfrica, a regio II, a presso intermediria e a regio III, sob alto vcuo

Como nas clulas eletrolticas convencionais, predominar a reao com menor potencial de oxidao. Isto vai depender da composio do eletrodo, do material na soluo e da natureza do solvente. Prova da ocorrncia de oxidao eletroqumica no capilar metlico foi fornecida por Blades e colaboradores4,5. Estes usaram um capilar de slica recoberta com um depsito de zinco como ponta do capilar. Quando o potencial foi aplicado, ons Zn2+ foram detectados. Resultados similares foram obtidos usando capilares de cido inoxidvel, quando ons Fe2+ foram detectados. O processo eletroqumico poder ter uma influncia desprezvel no espectro de massas da espcie em estudo. Por exemplo, no caso da maior parte dos estudos conduzidos por electrospray estudos de biomolculas como peptdeos, protenas e oligonucleotdoes , as alteraes eletroqumicas sobre estas espcies so desprezveis porque normalmente outras espcies comuns no sistema como eletrlitos, o metal do capilar e o prprio solvente sofrem muito mais facilmente o processo redox6-8. O mesmo tambm ocorre se, ao invs de aplicar o potencial diretamente no capilar, for utilizado um eletrodo imerso no reservatrio da soluo. Neste caso, devido ao grande volume de soluo comparado com a pequena extenso das transformaes eletrdicas, h uma diluio das espcies transformadas e pequena ou nenhuma alterao no espectro de massas acaba sendo observada. DESSOLVATAO DAS GOTAS Depois da liberao das gotas com alta densidade de carga do cone de Taylor, estas passam pela regio entre a ponta do capilar e o contra eletrodo e vo sofrendo dessolvatao. A evaporao do solvente favorecida pela energia trmica do ambiente e pelo auxlio de um gs secante, normalmente nitrognio. Conforme a gota perde solvente, a densidade de carga aumenta at um ponto em que as foras de repulso vencem a tenso superficial e gotculas so liberadas pela fisso da gota inicial. A carga mxima Q que uma gota de raio R pode manter antes de se fragmentar fornecida pela Equao 5. Q = 8 . (0 . . R3)1/2 (5)

Esta gota na forma de cone permanece presa ao capilar at o momento em que a densidade de carga na superfcie da gota e o aumento da repulso entre os ons venam a tenso superficial do lquido, ocorrendo ento a liberao de pequenas gotas com alta densidade de carga. A freqncia deste processo depende da magnitude do campo eltrico, da tenso superficial do solvente e da condutividade da soluo. A FONTE DE ELECTROSPRAY COMO UMA CLULA ELETROQUMICA Como foi relatado anteriormente, a fonte de electrospray pode gerar espcies eletroliticamente. Isto porque esta pode ser comparada a uma clula eletroltica de dois eletrodos. O capilar metlico ou um fio metlico em contato com a soluo um dos eletrodos da clula. Apesar de no estar diretamente em contato com a soluo, o contra-eletrodo completa o circuito. Devido ao potencial aplicado e proximidade entre a ponta do capilar e o contra-eletrodo, h um alto campo eltrico nesta regio que provoca a formao do cone de Taylor. O sistema de electrospray funciona como um tipo especial de clula eletroltica. Especial porque o transporte de ons no ocor-

onde 0 a permissividade livre no espao e a tenso superficial da gota. Esta deduo foi proposta por Lord Rayleigh (1882) e comumente conhecida como o limite de Rayleigh9. Este processo de dessolvatao e fisso das gotas vem sendo estudado por vrios grupos. Taflin e colaboradores7 observaram que as gotas para sofrerem fisso no precisam alcanar o limite de

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Rayleigh. A ruptura ocorre em torno de 80% deste limite e resulta na expulso de aproximadamente 20 gotas descendentes somando de 2 a 3% da massa e 10 a 18% da carga da gota ascendente. Assim, as gotas descendentes so bem menores que as gotas ascendentes e possuem uma razo massa/carga menor. A fissura precoce da gota deve estar relacionada a pelo menos dois fatores: (1) normalmente, as gotas vibram, o que estimula sua ruptura e (2) a gota que possui um desequilbrio de cargas sofre deformao por estar imersa em um intenso campo eltrico. Esta deformao pode ser entendida considerando-se o que ocorre originalmente com a soluo na ponta do capilar. A Figura 2 mostra uma representao esquemtica do processo de formao das gotas descendentes. As fisses subseqentes tambm so mostradas. A Figura 3 mostra esquematicamente o processo de deformao da gota quando esta inserida na regio com um alto campo eltrico. Estas ocorrem em tempos, progressivamente, mais curtos. O tempo de evoluo total e produo dos ons na fase gasosa em torno de microssegundos10.

Figura 3. Deformao e fisso de uma gota com excesso de carga. No estgio I, considerado o aspecto de uma gota com excesso de carga que acabou de ser introduzida em uma regio sob campo eltrico. No estgio II, observa-se que a gota comea a sofrer deformao e o excesso de carga, que estava uniformemente distribudo sobre sua superfcie, agora comea a concentrarse na direo determinada pelo campo eltrico. O estgio III mostra que, embora a maior parte do corpo da gota permanea intacto, h uma deformao significativa da regio de maior densidade de carga. Esta deformao acentua-se at o momento em ocorre a projeo das gotculas (IV), as quais devem, de fato, possuir maior densidade de carga que a gota me

Figura 2. Representao esquemtica do processo de produo das microgotas por electrospray. Os valores so resultados de simulaes realizadas por Kebarle e Tang30 e devem ser entendidos apenas como indicativos da ordem de grandeza daqueles que realmente ocorrem. As setas em branco indicam a evaporao; o tempo marcado sobre elas aquele necessrio para que o dimetro seja reduzido at o ponto em que a fisso da gota ocorre (indicado pela seta preta). Os valores numricos junto s gotas referem-se ao nmero de cargas (ctions ou nions) em excesso. No caso das gotculas, o nmero de cargas de cada uma est indicado ao lado do conjunto. O resultado da fisso sempre uma gota principal e vrias outras de pequeno tamanho. Deve-se notar que, aps uma reduo inicial do dimetro da gota at o ponto de ocorrncia da primeira fisso, as sucessivas fisses ocorrem em escala de tempo semelhante, gerando partculas com dimenses sucessivamente menores. O quadro em destaque mostra que o processo de fisso tambm ocorre com as gotas menores. No caso, apresentado o processo de fisso gerando gotculas com dimetro da ordem de 6 nm e duas cargas em excesso. Considerando, por exemplo, que o dimetro de um on sulfato hidratado da ordem de 0,4 nm, nota-se que, aps poucas fisses, as gotas j atingem o nvel molecular

mecanismo foi proposto por Dole em 1968 e foi denominado modelo da carga residual (CRM)1. O outro mecanismo foi proposto por Thomson e Iribarne modelo da evaporao do on (IEM)11,12 e sugere que a emisso dos ons ocorre diretamente de gotas muito pequenas e altamente carregadas. Para comear a ocorrer este processo, a gota precisa ter um raio de 8 nm e 70 cargas aproximadamente. Nestas condies, a gota no sofre ruptura mas pode emitir ons para a fase gasosa. Assim, a gota no precisaria atingir tamanhos to pequenos como 1 nm e podem existir outros solutos. O IEM foi proposto porque, em espectros de solues 1 mmol/L de NaCl em metanol:gua, o nico on detectado foi Na+ e espcies solvatadas. ons como Nan(NaCl)n+m, que deveriam ser formados caso o modelo CRM ocorresse, no foram observados em seus experimentos. Somente espcies solvatadas, protonadas e ons livres foram detectados. No entanto, os experimentos de Wang e Cole mostraram a existncia de ons como Cs+ e Cs(CsCl)+ em uma soluo 50:50 gua:metanol13. ainda provvel que ambos os processos estejam ocorrendo simultaneamente. DISSOCIAO INDUZIDA POR COLISO Depois de formado, o on alcana a regio do capilar ou cone de amostragem que tem um orifcio bem pequeno (da ordem de poucos micrometros). A partir da, o sistema passa para a regio de baixa presso. Na entrada, h um conjunto de lentes que conduzem os ons ao analisador de massas (Figura 1). O sistema de bombas e tica varia conforme o produtor do espectrmetro. A regio entre o capilar ou cone de amostragem, o skimmer e as lentes muito importante, pois nesta regio pode ocorrer dissociao induzida por coliso (CID). Esta regio contm ons formados no electrospray e o gs secante (nitrognio). Como h um campo eltrico, os ons so acelerados provocando a coliso entre estes e as molculas do gs secante. Assim, por exemplo, se um on solvatado entrar nesta regio ele pode

FORMAO DO ON NA FASE GASOSA Todo este processo de dessolvatao da gota at atingir o raio de aproximadamente 30 nm j est muito bem entendido. No entanto, ainda no se sabe exatamente como o on gerado na fase gasosa. H dvidas se o on expelido da gota ou se o processo de fisses sucessivas ocorre at restar um nico on. Existem dois diferentes mecanismos que foram propostos para a formao dos ons na fase gasosa. O primeiro depende da formao de gotas extremamente pequenas, R 1 nm, e que contenham somente um on. A evaporao do solvente da gota converter esta em um on na fase gasosa. Esse

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sofrer coliso e perder molculas do solvente ou at mesmo sofrer processos de rearranjo intramolecular ou fragmentao. O processo de CID pode ser interessante em alguns estudos, mas pode dificultar a visualizao das espcies na forma como elas se encontravam em soluo. O fenmeno de CID pode ser minimizado controlando a queda de potencial sentida pelo on na regio do cone de amostragem e o skimmer. INTENSIDADE DO PICO VERSUS CONCENTRAO Um dos grandes problemas no electrospray a falta de linearidade da intensidade com a concentrao. A vazo da amostra, do gs nebulizante, do gs secante e a distncia da ponta do capilar ao contra eletrodo so parmetros que afetam a estabilidade do electrospray e, portanto, a formao das espcies na fase gasosa. No entanto, estes so facilmente controlados para se obter um fluxo de amostra constante. J a presena de outros eletrlitos na soluo no to fcil de ser controlada e compromete a linearidade de resposta da intensidade de um pico em funo da concentrao. A seo linear do electrospray trabalha numa faixa estreita de concentrao (de 10-6 a 10-3 mol/L). Todavia, esta linearidade pode ser prejudicada se outros eletrlitos estiverem presentes na soluo. No solvente utilizado sempre h impurezas. Por exemplo, no metanol as impurezas so principalmente sais de amnio e sdio numa concentrao 10-5 mol/L3. Muitas vezes, essas impurezas so necessrias, porque no h formao do electrospray se a condutividade for menor do que 10-7 ohm-1 cm-1. Por exemplo, considerando um analito A+ e uma impureza B+, quando A+ estiver em baixas concentraes, B+ predominar na gota e ser transportado em maior nmero para a fase gasosa. Conforme a concentrao de A+ aumenta, este comea a dominar. Normalmente, para uma concentrao do analito acima de 10-5 mol/L, a intensidade de B+ (IB) comea a diminuir. Os ons A+ competem com os ons B+ no processo de converso para a fase gasosa. Baseando-se em tais consideraes, Kebarle e Tang propuseram a Equao 6. Esta foi elaborada para um sistema de dois eletrlitos, mas pode ser estendida para n eletrlitos10. kA[A ] IA = f . p . I . kA[A+] + kB[B +]
+

dessolvatao eficiente para gerar os ons na fase gasosa. Diminuio do fluxo de amostra e aumento da condutividade so dois parmetros que permitem obter gotas menores, aumentando a eficincia da dessolvatao. A supresso do on devido competio entre os ligantes pelo tomo central pode ser observada na Figura 4. Esta figura mostra o estudo14 de supresso usando solues com concentrao constante, 100 mmol/L, de Zn(NO3)2 e diferentes concentraes de iodeto, que variaram de 10 mol/L a 10 mmol/L. Quando o iodeto est numa concentrao inferior a 100 mol/L, a espcie favorecida o complexo Zn(NO3)3 , com o aumento da concentrao de iodeto h um favorecimento da espcie ZnI3.

Figura 4. Estudo sobre a supresso dos ons. Concentrao de Zn(NO3)2 constante em 100 mol/L e a concentrao de iodeto variando de 10 mol/L a 10 mmol/L

DESCARGA CORONA Um dos principais problemas enfrentados para se obter uma corrente constante de ons a ocorrncia de descarga corona, principalmente no modo de operao para ons negativos. O efeito de descarga corona ocorre quando eltrons livres presentes no gs so acelerados a uma velocidade suficiente para ionizar molculas de gases presentes na cmara de ionizao, provocando a ionizao destas e gerando ons como CH3O a partir do metanol e O2 do ar. A descarga corona diminui a intensidade dos ons do analito e os picos correspondentes s espcies geradas pela descarga aparecem com uma intensidade muito alta. A presena de espcies que capturam eltrons, como os gases O2, SF6 e os hidrocarbonetos policlorados, inibem a descarga corona1. A Figura 5 ilustra este problema. O on de m/z 32 (Figura 5a) indica a ocorrncia de descarga corona. Este espectro foi obtido de uma soluo 100 mol/L de NaNO 3 e NaCl em metanol:gua 50:50 (v/v) e com uma tenso de 4 kV aplicada no capilar. A Figura 5b mostra o espectro da mesma soluo obtida com a tenso no capilar em 2 kV, onde no se observa a formao de espcies caractersticas da descarga corona. Alm disto, pode-se observar na Figura 5a que h uma supresso do sinal do NO3 e do Cl comparativamente ao espectro da Figura 5b. TRANSFORMAES QUMICAS DOS ONS PRESENTES NA GOTA CARREGADA DURANTE O PROCESSO DE ELECTROSPRAY primeira vista, o electrospray deveria ser a tcnica ideal para se fazer especiao. Bastaria controlar os eletrlitos presentes na

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onde IA a intensidade do on A+ que foi detectada no espectrmetro de massas, [A+] e [B+] so as concentraes dos eletrlitos na soluo, f frao de cargas na gota que so convertidas para a fase gasosa e p a frao de ons detectados em relao aos ons gerados, kA e kB so constantes que expressam a taxa de transferncia de ons da gota carregada para a fase gasosa. A Equao 6 expressa a competio entre os ons em soluo pela transferncia para a fase gasosa. Assim sendo, a intensidade de uma espcie na fase gasosa, IA, no depender somente da sua concentrao na soluo e sim da razo entre kA / kB . Atravs da Equao 6 pode-se perceber que, aumentando a concentrao do analito A+, h um aumento da corrente, mas como esta tambm est no denominador, existe um limite para este aumento. O aumento da concentrao no altera a corrente devido a efeitos interinicos, o que diminui a mobilidade inica e provoca saturao da espcie na gota10. No geral, em concentraes acima de 1 mmol/L, a intensidade da corrente mantm-se constante e algumas vezes pode at diminuir. O raio das primeiras gotas formadas por electrospray deve ser da ordem de 0,5 a 1 m para sofrerem todo o processo de dessolvatao e gerarem os ons na fase gasosa (Figura 2). Para tanto, deve-se utilizar capilares com dimetro interno menor que 100 m e fluxo de amostra menor que 10 L/min. Gotas grandes no sofrem

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do metal permanea o mesmo, tais reaes podem conduzir formao de espcies diferentes daquelas encontradas na fase aquosa. Assim, difcil observar na fase gasosa ons metlicos livres com cargas +3 ou +2, a no ser que o on esteja complexado. Alm disto, a observao de ons com mltiplas cargas depender tambm do tipo de solvente utilizado. Lantandeos com carga +3 s podem ser observados com solventes como dimetilsulfxido (DMSO) e dimetilformamida3-5. Cu(II) tende a sofrer reduo na presena de solues preparadas com acetonitrila como solvente. ALGUMAS APLICAES DE ES-MS PARA ESPCIES INORGNICAS E ORGANOMETLICAS Existem diferentes tipos de analisadores de massas interfaceados com o modo de ionizao por electrospray. O mais comum, devido facilidade de manuseio e ao menor custo, o analisador quadrupolar. O electrospray com filtro quadrupolar est sendo amplamente utilizado para estudos do comportamento dos ons na fase gasosa, especiao de complexos metlicos e estudos sobre os processos fundamentais de ionizao. Outros tipos de analisadores de massa como tempo de vo, setor magntico, ion-trap e ressonncia ciclotrnica tambm j existem comercialmente9. A tcnica de electrospray permite a anlise de compostos com peso molecular de at 200.000 Da em equipamentos com pequeno alcance de massas (30 a 3000 u). Isto porque, no electrospray, molculas com alto peso molecular podem ter mltiplas cargas. Estas cargas podem ser adquiridas pela ionizao da macromolcula em diversos pontos da cadeia ou, mais comumente, pela incorporao de espcies inicas pequenas que estejam presentes na soluo. Este o caso, por exemplo, da incorporao de NH4+ ou Na+ no modo ons positivos ou de HCOO ou OH no modo ons negativos. Obviamente, com a incorporao destas espcies, alm do aumento de carga, h tambm o aumento de massa. As principais aplicaes da ionizao por electrospray tm sido os estudos na rea de bioqumica e qumica orgnica. No entanto, vem crescendo o interesse na tcnica para aplicao em estudos fundamentais, de organometlicos e complexos inorgnicos16-26. ES-MS vem sendo utilizado nos mais diferentes estudos como na investigao da acidez de diis27, estabilidade dos ons na fase gasosa28, identificao de ons organometlicos e ons inorgnicos16-29 e especiao28,33. No Brasil, os estudos para aplicaes bioqumicas e orgnicas tm avanado bastante nos ltimos trs anos, mas tem sido muito modesta a aplicao da tcnica para estudos eletroqumicos e de complexos inorgnicos, entre outros. Pesquisadores como Cole3, Fenn2 e Kebarle30 vm estudando intensamente o comportamento de ons relativamente simples como metais alcalinos e alcalinos terrosos a fim de tentar esclarecer o processo de transferncia dos ons da fase lquida para a fase gasosa31,4,5. Os estudos de Kerbale e Tang 30,31 e Ikomonou4,5 para o entendimento da formao da gota carregada e produo dos ons na fase gasosa foram realizados com ons inorgnicos simples como cloretos e iodetos de sdio, potssio e csio, contribuindo muito para o entendimento sobre o comportamento destes ons em ES-MS. Uma das questes a serem respondidas se os complexos observados no espectro de massas so formados na fase gasosa, durante o processo de electrospray, ou se j esto presentes na fase lquida. Existe uma srie de trabalhos que mostra que quando o on gerado no est no estado de oxidao esperado, este resultou da formao na fase gasosa. Moraes e colaboradores mostraram que espcies como NiI2, com nquel no estado de oxidao um, so formadas na fase gasosa32. Os estudos de Horlick e Agnes16-19 mostraram a possibilidade de se utilizar o electrospray para a especiao de metais e semimetais. Eles estudaram a dependncia da intensidade do sinal com a concen-

Figura 5. Estudo mostrando o efeito da descarga corona nos espectros de massas. Espectro de uma soluo de NaCl e NaNO3 em metanol:gua (1:1): (a) tenso no capilar 4 kV, (b) tenso no capilar 2 kV

soluo e facilmente poder-se-ia identificar qualquer espcie inica. Todavia, quando a gota comea a sofrer o processo de dessolvatao, a concentrao das espcies e o pH da gota podem ser significativamente alterados15. Alm disso, as mudanas posteriores na fase gasosa normalmente conduzem reduo de carga das espcies e dissociao induzida por coliso. A concentrao do soluto, que menos voltil do que o solvente, aumenta porque o volume da gota diminui com a evaporao do solvente. Mudanas na concentrao do soluto levam a mudanas do pH e, portanto, do espectro de massas, uma vez que o grau de ionizao das espcies depende do pH. possvel estimar a concentrao final do analito na gota atravs dos raios das gotas formadas conforme estas evaporam. Solutos no volteis como o NaCl e outros eletrlitos podem aumentar a sua concentrao em at 50 vezes na gota final. O processo de reduo da carga da espcie bastante complexo e pode ocorrer por CID, atravs da dessolvatao ou por influncia do solvente. A reduo da carga do complexo devido evaporao da gua mostrada nas Equaes 7 e 8. M(H2O)3+ n
2 M(OH)(H2O)n+ + H3O+ -2 1 M(OH)2(H2O)n+ + H3O+ -4

(7) (8)

2 M(OH)(H2O)n+ -2

Conforme as molculas do solvente so removidas, o complexo on-solvente no consegue mais estabilizar a carga devido diminuio da esfera de solvatao do on. Embora o estado de oxidao

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trao do analito e de outros eletrlitos presentes na soluo e a influncia dos parmetros de formao do spray na intensidade do sinal e na composio dos ons gerados. Os experimentos de Horlick e Agnes concordam com os experimentos de Kebarle e Tang e com a teoria por eles desenvolvida (Equao 6). Estes mostraram que a formao de ons por electrospray s gerada dentro de um mnimo de condutividade. Isto , necessria uma quantidade mnima de eletrlito na soluo para a formao de um electrospray estvel. No entanto, isto pode suprimir a ionizao da espcie de interesse. Por exemplo, entre as espcies I e Cl , a primeira apresenta uma sensibilidade muito maior. A quantificao e especiao das espcies por electrospray esto diretamente relacionadas com a supresso do sinal e respostas relativas das intensidades das espcies presentes na soluo. As diferentes espcies presentes na soluo, o analito, o solvente e as impurezas, podem vir a ter um comportamento completamente diferente do esperado, durante a formao do spray, como sofrer processos de oxi-reduo, agregao, fragmentao e supresso. Recentemente, diferentes trabalhos vm sendo publicados onde os autores demonstram a possibilidade de fazer especiao utilizando condies brandas no electrospray16-18,20. No entanto, tm-se observado que h algumas dificuldades. Obter ons estveis com mltiplas cargas no electrospray no uma tarefa fcil. Mesmo ons como [Fe(CN)6]4- e [Fe(CN)6]3- que em fase lquida permitem a estabilizao do ferro nos estados de oxidao II e III, apresentaram, em fase gasosa, predominantemente espcies com uma carga com o ferro em diferentes estados de oxidao: I, II, III e IV32. A especiao por electrospray favorecida no caso de complexos volumosos e com mltiplas insaturaes, o que ajuda a acomodar cargas maiores. A ionizao por electrospray de complexos pequenos e monoatmicos, ao contrrio dos complexos volumosos, sofre grande influncia dos processos eletroqumicos. Raymond e colaboradores33 demonstraram a possibilidade de utilizar o electrospray para identificao de espcies de poliselenetos em solues aquosas. Orians estudou a especiao de complexos de diferentes metais com ligantes orgnicos. Por exemplo, no caso do complexo de cobre com a 8-hidroxiquinolina, estes mostraram que em solues metanlicas a espcie predominante o complexo com Cu(II). No entanto, quando o solvente usado foi acetonitrila, a espcie predominante o complexo com Cu(I)20. O processo eletroqumico poder ter uma influncia desprezvel no espectro de massas se os ons produzidos, consumidos, ou alterados pelo processo eletroqumico no so convertidos para a fase gasosa. No entanto, como discutido por Van Berkel34, Fernandez de La Mora6 e outros22,23, o processo eletroqumico pode ter importncia crucial em alguns estudos. Como na especiao de solues de complexos metlicos que sofrem facilmente processos de oxi-reduo. Van Berkel34 e Moraes e colaboradores14 observaram que, durante o processo de electrospray usando-se um capilar de ao inoxidvel, no modo ons negativos, pode haver reduo do metal no capilar metlico. Isto tem duas conseqncias negativas: (1) alterao do estado de oxidao da espcie podendo inibir ou at impedir a sua deteco e (2) efeito de memria. Como o metal reduzido e depositado no capilar, ao mudar a soluo necessrio um longo tempo passando-se o solvente, com a polaridade positiva, para a limpeza do mesmo. O uso de um simples capilar de slica fundida ao invs do capilar de ao inoxidvel minimiza de forma significativa o processo de reduo e o efeito de memria14,35,36 . Alm deste fenmeno, outros processos durante o electrospray podem provocar alteraes eletroqumicas na soluo. Dependendo da tenso aplicada no cone de amostragem, alguns estados de oxidao so observados14. Um exemplo onde o estado de oxidao do metal no foi alterado devido formao do electrospray pode ser ilustrado pelo estu-

do para identificao de ftalocianinas sulfonadas de zinco, lutcio e disprsio no modo ons negativos37. Os espectros obtidos para as trs ftalocianinas apresentaram clusters do tipo [MPcs 2H] 3 , [MPcs2NaH2On]3, [MPcs2Na2H2On]3. A Tabela 1 mostra os principais ons identificados atravs do espectro obtido para uma soluo 1 mmol/L de ftalocianina de disprsio em meio metanol:acetonitrila no modo ons negativos. Acredita-se que as estruturas das ftalocianinas consigam estabilizar a carga do complexo e manter suas caractersticas mesmo na fase gasosa. Tabela 1. Principais espcies identificadas no espectro de massas de uma soluo de DyPcs2 Espcie [H2Pcs2] [H2Pcs2Na ][Dy(Pcs2)2H2]3[Dy(Pcs2)2H3]2[Dy(Pcs2)2HNa2]22-

m/z 336,1 359,1 502,3 753,5 764,4

Um exemplo contrrio o estudo realizado por Prada e colaboradores38 para a determinao da composio e especiao de complexos do agente quelante di-2-piridilcetonabenzoilidrazona (DPKBH) com ons de Cu(II), Fe(II) e Fe(III). Estes estudos mostraram que a composio do complexo Cu(II)/DPKBH 1:2 metal/ ligante. Os ons de m/z 667 e 669 indicam a presena do complexo com Cu(II) protonado, [Cu(DPKBH)2H]+. Alm disto, foi possvel observar os ons de m/z 666 e 668 que indicam a formao do complexo com Cu(III), [Cu(DPKBH)2]+. A oxidao do Cu(II) a Cu(III) pode estar ocorrendo durante a dessolvatao das gotas no processo de ionizao. O mesmo comportamento foi observado para o espectro com Fe(II), com a formao de [Fe II (DPKBH) 2 H] + e [FeII(DPKBH)2]+ (Figura 6). Para o complexo com Fe(III), somente o cluster de picos respectivos a [FeIII(DPKBH)2]+ foi observado. Estas espcies indicam a labilidade do complexo, uma vez que os espectros foram obtidos a baixas tenses do cone, quando no h favorecimento de dissociao por CID38. Apesar das estruturas destes compostos serem volumosas e apresentarem um nmero de stios que poderiam estabilizar a carga do complexo, o metal sofreu alterao do seu estado de oxidao. Na fase aquosa, seriam esperados somente os complexos com Cu(II).

Figura 6. Espectro obtido de uma soluo de 100 mol/L de Fe(II) e (DPKBH) em metanol

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Moraes e Lago

Quim. Nova

Importantes estudos vm sendo conduzidos para a identificao e quantificao de metalotionenas em fluidos biolgicos. Os primeiros estudos de complexos envolvendo metalotionenas foram conduzidos por Fenselau e colaboradores15, mostrando a possibilidade de se utilizar o electrospray para estudos envolvendo as metalotionenas nos organismos vivos. Eles monitoraram o fluxo de entrada e sada de cdmio e zinco das metalotionenas por ES-MS. A compreenso da importncia dos metais nos mecanismos moleculares e sua toxicidade e essencialidade nos seres vivos e nos ciclos biogeoqumicos depende de tcnicas analticas capazes de fornecerem informao da forma qumica na qual os elementos esto presentes nos organismos e na natureza. Muitos estudos relacionados biometilao de metais (principalmente mercrio, chumbo e cdmio) e semimetais (arsnio, selnio e telrio) tm sido feitos, uma vez que estes elementos podem apresentar um alto nvel de toxicidade, dependendo do estado de oxidao em que se encontram. O acoplamento de eletroforese capilar ES-MS, ou CE-ES-MS, uma poderosa ferramenta na especiao, pois associa as vantagens da separao eficiente das espcies em pequenos volumes por eletroforese capilar com a alta sensibilidade da espectrometria de massas. A proposta de uma interface para o acoplamento do sistema de CE-ES-MS tem sido objeto de estudo de vrias pesquisas em qumica analtica. Entretanto, certas consideraes com respeito ao acoplamento CE-ES-MS devem ser avaliadas tais como a diferena de intensidade de corrente operando no sistema. O circuito CE opera com uma corrente de dezenas de micro amperes, enquanto o electrospray opera com uma corrente em torno de centenas de nano amperes. Isto pode provocar uma mudana na tenso na ponta do capilar, o que altera a formao do spray. Hau e Roberts39 propuseram um sistema bastante simples para o acoplamento do sistema CE-ES-MS, onde este efeito minimizado aterrando-se o capilar do eletrlito auxiliar e usando um capilar para este fluxo com um dimetro bem maior do que o da eletroforese. Assim, h uma diminuio da resistncia e pode-se garantir que a tenso na ponta do capilar mantida constante. Estudos para especiao usando CE-ES-MS ainda no so muitos. Corr e Anacleto40 fizeram um estudo inicial para avaliar a interface para especiao de metais, o grau de formao de cluster e fragmentao. Os estudos foram realizados com solues padro de 29 ctions e 15 nions inorgnicos. Os espectros foram obtidos tanto no modo ons negativos como positivos. Schramel e colaboradores22 realizaram estudos com espcies metlicas usando um sistema comercial CE-ES-MS. No entanto, os autores relataram que o sistema comercial no produz electrospray estvel durante um perodo longo de aquisio. Assim, estes mudaram o capilar de amostragem do sistema comercial por um capilar de eletroforese de 50 m de dimetro interno. Inicialmente os autores estudaram os complexos CuEDTA, CuCl2, cloreto de trimetrilantimnio (TMSbCl2) e espcies como selenometionina e selenocistena sem o acoplamento. O sistema hifenado foi avaliado para a especiao de selenometionina, selenocistina e selenocistamina. Lintschinger e colaboradores41 investigaram a forma qumica do dicloreto de trimetilantimnio (TMSbCl2) em solues aquosas. Zheng e colaboradores42 mostraram a viabilidade do ES-MS sem acoplamento a tcnicas de separao para a especiao dos compostos TMSbCl2 e TMSb(OH)2, tanto no modo ons positivos como negativos e compostos inorgnicos de Sb(II) e Sb(V) no modo ons negativos. Um outro aspecto bastante relevante que o electrospray pode ser uma ferramenta alternativa s fontes de plasma acoplado indutivamente (ICP) e ionizao trmica para estudos de medidas isotpicas. Ketterrer e Guzowisk43, em 1997, foram os primeiros a propor o uso da tcnica para medidas de razo isotpica. No entanto, estes propuseram o uso do electrospray como uma tcnica para

gerao de espcies monoatmicas. Usando condies drsticas de ionizao, possvel gerar espcies monoatmicas, como em ICPMS. Estes mostraram a aplicabilidade da tcnica para prata, chumbo e tlio. No caso da prata e tlio no houve problema. No entanto, para o chumbo, foi detectada a espcie PbH+ que foi comprovada usando solvente deuterado, sendo detectada a espcie PbD+. Assim, no possvel usar o espectro de massas para obter diretamente o padro isotpico do chumbo. Uma alternativa seria determinar o padro isotpico do cluster do PbH+ e subtra-lo do padro isotpico do Pb+. Moraes e colaboradores desenvolveram um procedimento matemtico para eliminao de interferentes isobricos gerados pela perda de um ou mais tomos de hidrognio em conjuntos de picos45. Recentemente, Brito e Lago45 publicaram um outro procedimento matemtico bastante genrico para calcular o padro isotpico e eliminar interferentes isobricos em um determinado cluster. A tcnica de ES-MS assim como a espectrometria de massas com ionizao trmica (TIMS) permite a utilizao de espcies poliatmicas, aumentando as possibilidades de se trabalhar em regies de m/z livres de interferncias isobricas comuns. Moraes e colaboradores32 estudaram a viabilidade de se utilizar ES-MS para determinaes de padres isotpicos usando complexos de Zn, Cd, Ni, Fe, Hg, Cu, Tl e B47 usando ligantes monoatmicos, como I e F , que no interferem no padro isotpico. A Figura 7 apresenta o espectro de uma soluo 100 mol/L de Hg2+ e 1 mmol/L de NaI no modo ons negativos e o padro isotpico do mercrio, mostrando que, alm da boa concordncia, o espectro est livre de interferentes como observado por Ketterrer e Guzowisk43.

Figura 7. Espectro de uma soluo 100 mol/L de Hg2+ em NaI 1 mmol/L em metanol:gua 50:50 (v/v). O grfico de barras representa as intensidades esperadas considerando-se o padro isotpico natural do mercrio

CONCLUSES ES-MS uma tcnica bastante conveniente para estudos de compostos pouco volteis. Embora, em geral, os ons pr-existentes em fase lquida sejam observados atravs dos espectros, outros podem ser produzidos durante o electrospray. O surgimento destas novas espcies dependente da composio da soluo solvente, pH, presena de espcies ligantes e supressores e das condies da fonte de electrospray tenses no capilar, contra-eletrodo e lentes e vazes dos gases. Estes fatores devem ser cuidadosamente considerados j que estas alteraes costumam levar a uma interpretao equivocada da composio da soluo original. A tcnica de ionizao por electrospray apresenta uma enorme versatilidade e uma importante ferramenta nos mais variados

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Espectrometria de Massas com Ionizao por Electrospray

16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47.

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estudos desde a identificao e quantificao de espcies inorgnicas e organometlicos at medidas isotpicas e especiao. A tcnica acoplada a mtodos de separao apresenta uma alternativa aos mtodos espectroscpicos normalmente utilizados para deteco de metais, como ICP-MS. A tcnica bastante promissora mas ainda h muitos estudos a serem realizados e otimizados principalmente nos campos do acoplamento CE-ES-MS, das medidas isotpicas e do desenvolvimento da instrumentao. Uma das grandes vantagens da tcnica a relativa simplicidade da fonte de ionizao comparada a outras fontes utilizadas na espectrometria de massas, o que permite uma versatilidade grande de configuraes, dependendo da criatividade do pesquisador. REFERNCIAS
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