ELECTROFORESIS DE PROTEINAS PLASMATICAS EN ACETATO DE CELULOSA. Fundamento: La electroforesis es una tcnica de separacin de molculas por la carga elctrica.

Se basa en el movimiento de las molculas cargadas en un campo elctrico. Esta tcnica se aplica especialmente para la caracterizacin y anlisis de polmeros biolgicos cargados, como los cidos nucleicos y las protenas. La migracin de las molculas cargadas en un campo elctrico depende del tamao, forma, y carga neta de la molcula. Una molcula proteica en solucin, a un pH distinto al de su punto isoelectrico, presenta carga neta, y como consecuencia, se mueve bajo la aplicacin de un campo elctrico. Los distintos mtodos de electroforesis se diferencian fundamentalmente en el tipo de soporte que se utiliza. En esta practica se realizar la separacin de las protenas sricas utilizando como soporte tiras de acetato de celulosa. La separacin electrofortica de las protenas sricas es un tipo de determinacin que se efecta rutinariamente en clnica para detectar determinados estados patolgicos caracterizados por la alteracin en la cantidad total de protenas sricas o en alguna de sus fracciones. Material Fuente de alimentacin Cubeta de electroforesis. Aplicador. Tiras de acetato de celulosa. Cristal Estufa Reactivos Tampn Veronal sdico 0.04 M Colorante Negro Amido (0.5 g en 45 ml de metanol + 45 ml de agua + 10 ml de cido actico) Solucin transparentadora A y B. Frasco A: 870 ml de metanol + 30 ml de ciclohexanona. Frasco B: 100 ml de cido actico. Procedimiento Sumergir las tiras de acetato de celulosa en el tampn Veronal sdico 0.04 M durante 15 minutos. Montar las tiras sobre el puente. Colocarlas de manera que la esquina cortada quede hacia la derecha y abajo en el polo negativo y que los extremos de las tiras esten en contacto con el tampn en los dos compartimentos. Aplicar la muestra de suero con el aplicador en la lnea base. Poner la fuente de alimentacin a 200 V. Transcurridos 65 minutos sacar las tiras e introducirlas en una cubeta conteniendo la solucin de Negro Amido. Teir durante 5 minutos. Preparar la solucin transparentadora con 9 partes de la solucin A y una de la solucin B. Calcular el volumen suficiente para lavar dos veces las muestras. Despus del lavado, colocar las tiras sobre un cristal de manera que quede la esquina cortada de la tira abajo a la izquierda. Dejar en la estufa a 60 C hasta que quede transparente. Analizar la migracin de cada protena con respecto a la linea base. calculando su movilidad relativa (Rf).Preguntas 1. Cul es el principio de la electroforesis ? 2. Se puede aplicar la electroforesis a las protenas ? por qu ? 3. Porque se ha utilizado un tampn bsico ? 4. Qu protenas podemos observar en esta separacin ? 5. Definir lo que es la movilidad relativa (Rf) ?

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS La electroforesis de protenas es una metodologa que permite separar las protenas presentes en sangre (suero) o en orina. En esta tcnica se aplica una corriente elctrica para desplazar las protenas sobre una capa fina de agar similar a un gel. La distancia que recorre cada tipo de protena depende de su tamao, su forma, y su carga elctrica. Las protenas as separadas pueden detectarse mediante un colorante que se fija y tie las distintas protenas y pone de manifiesto un patrn de bandas caracterstico. Cada banda indica la presencia de una protena, mientras que el tamao de la banda aporta una aproximacin de la cantidad de protena. Este patrn de bandas se convierte posteriormente en un grfico, que muestra picos verticales all donde existe mucha cantidad de una determinada protena, y unos picos ms pequeos o valles donde existe menos. Un nuevo mtodo conocido como electroforesis capilar separa las protenas hacindolas pasar a travs de una columna fina y larga, dibujando un grfico muy similar al que se obtiene con la electroforesis en gel de agarosa. Protenas especficas que sean de inters pueden identificarse fijndolas en el gel mediante el uso de anticuerpos, procediendo despus a la tincin, previa eliminacin por lavado del resto de protenas. Este procedimiento es conocido como inmunofijacin (IF). Anteriormente se haba utilizado un mtodo ligeramente diferente, la inmunoelectroforesis, para identificar protenas especficas. Sin embargo, esta ltima tcnica ha quedado ampliamente desplazada por la IF, dado que la IF resulta ms fcil de realizar y de interpretar. Con una electroforesis, las protenas sricas quedan separadas en cinco o seis bandas principales. Estas fracciones son conocidas como albmina, alfa-1, alfa-2, beta, y gamma (la fraccin beta se encuentra a veces dividida en beta-1 y beta-2). La albmina, producida en el hgado, se corresponde con una nica banda y representa aproximadamente el 60% de las protenas sricas. Con el trmino globulinas se est aludiendo al resto de protenas diferentes de la albmina. A excepcin de las inmunoglobulinas y de algunas protenas del complemento, la mayor parte de protenas son tambin de sntesis heptica. Una descripcin ms amplia de todos estos grupos de protenas puede encontrarse en la tabla Grupos de Protenas. Las bandas que se visualizan en la electroforesis de protenas definen unos patrones caractersticos. Alteraciones de estos patrones se asocian a toda una serie de condiciones y enfermedades diferentes. Por ejemplo, en el mieloma mltiple (un tipo de cncer de las clulas plasmticas sanguneas) el crecimiento y la divisin descontrolados de las clulas plasmticas malignas conducen a la produccin de grandes cantidades de un nico tipo de inmunoglobulina monoclonal. Los anticuerpos (inmunoglobulinas) deben ser distintos entre ellos para asegurar as el reconocimiento de bacterias, virus y otras sustancias extraas para el organismo. Cada vez que el organismo est expuesto por ejemplo a un virus, una clula plasmtica se divide y da lugar a un grupo o clon de clulas plasmticas con capacidad para producir anticuerpos dirigidos a eliminar el virus. Dado que el conjunto de inmunoglobulinas de nuestro organismo es el resultado de los anticuerpos fabricados por gran cantidad de distintos clones, se suele hablar de patrn policlonal. Cuando existe un cncer de clulas plasmticas, slo se produce un tipo de anticuerpo por estas clulas cancerosas, conocido como protena monoclonal. Esta protena anmala puede visualizarse como una banda caracterstica en el patrn electrofortico.

ALBUMINA: Su principal funcin es la estabilizacin del volumen sanguneo y la regulacin del intercambio de fluidos vasculares. Es responsable del 75% de la presin osmtica, transporta pigmentos, colorantes y drogas, contribuyendo a su excrecin solubilidad y difusin a los tejidos. Casi todas las enfermedades muestran cierto grado de depresin de albmina. Valores marcadamente bajos indican enfermedad heptica, renal o sistmica significativa. ALFA 1 ANTITRIPSINA: Normalmente responsable por 70% de la fraccin Alfa-1 Inhibe a la tripsina; cuando est deprimida, los pacientes sufren enfisema pulmonar y cirrosis juvenil ALFA 1 GLICOPROTEINA ACIDA. Normalmente es responsable por menos del 30% de la fraccin Alfa 1pero generalmente es responsable de la elevacin de esta fraccin. Se encuentra elevada en enfermedades inflamatorias crnicas y degenerativas y muy elevadas en varias enfermedades malignas. ALFA MACROGLOBULINA ( 2 M): Responsable del 25% del valor de la fraccin alfa-2 elevada en sndrome nefrtico, gastroenteropatas con prdida de protenas, cirrosis heptica y diabetes mellitus.

HAPTOGLOBINA: Normalmente responsable por 25% del valor de alfa -2. La anormalidad observada ms comnmente es una elevacin de su valor. Es una protena de fase aguda, y se eleva inespecficamente en presencia de inflamacin, necrosis o destruccin tisular. Sin embargo por evaluacin del grado de elevacin, cambios en otras fracciones e historia clnica, se pueden inteligentemente considerar un diagnstico diferencial. Valores bajos se observan en anemias hemolticas. TRANSFERRINA: Normalmente un 60% de beta-1 importante en el transporte de hierro y en la regulacin y control de su absorcin BETA LIPOPROTEINA: Normalmente responsable por 60% de beta -2 Transporta la mayor parte de lpidos sricos. Debido al bajo contenido proteico (25%), marcados cambios reflejan poca alteracin en el valor de Beta- 2 IgA: Normalmente responsable del 12% del valor de gamma. Esta fraccin puede estimarse observando el grado de depresin entre beta-2 y gamma. Sus componentes mejor conocidos son antitoxina, aglutininas, antibacterianas, isoaglutininas y crioaglutininas. Se observa marcadamente elevada en cirrosis heptica y moderadamente elevada en endocarditis bacteriana sub-aguda, tiroiditis autoinmune, linfogranuloma venreo y varias enfermedades del colgeno. IgG: Normalmente responsable del 85% del valor de gamma. Una buena forma de estimarla es observando la altura del pico gamma. Un poco a la derecha del centro. Contiene anticuerpos contra bacterias, virus y toxinas. Elevacin se observa en numerosas enfermedades sub-agudas crnicas inflamatorias y proliferativas, incluyendo neumonas, tuberculosis, cistitis, pielitis, colecistitis, endocarditis, procesos poli artrticos, enfermedades del colgeno, triquinosis, mononucleosis infecciosa, psitacosis, tifus, sfilis y hepatitis viral. Estas elevaciones se observan en todas las curvas y no deben confundirse con aquellas que se muestran en una sola zona estrecha y que representa gamopatas monoclonales. HEMOPEXINA, C3, IgM: Muchas otras protenas afectan la apariencia de la pendiente de los picos, algunas de ellas son hemopexina, C3 eIgM, ests lo afectarn en los sitios indicados de la figura.

Valores normales

Protena total: 6.4 a 8.3 g/dL Albmina: 3.5 a 5.0 g/dL Alfa-1 globulina: 0.1 a 0.3 g/dL Alfa-2 globulina: 0.6 a 1.0 g/dL Beta globulina: 0.7 a 1.2 g/dL Gammaglobulina: 0.7 a 1.6 g/dL

Nota: g/dL= gramos por decilitro El principal uso de este test es para la deteccin de estados fisiopatolgicos tales como inflamacin, prdida de protenas, gamapatas monoclonales, que usualmente se encuentran asociadas con neoplasmas hematopoyticos, especialmente el mieloma mltiple y la macroglobulinemia de

Waldenstrm. Esto tambin ocurre en otras condiciones malignas y benignas. Cualquier protena detectada deber ser identificada por una tcnica alternativa, tales como inmunofijacin o inmunoelectroforsis. Otras aplicaciones de la electroforsis en suero incluyen lo siguiente: *Evaluacin de protenas sricas, estado nutricional. *Estudio de enfermedades hepticas, incluyendo cirrosis y hepatitis crnica activa. En las enfermedades del hgado la albmina se disminuye. La alfa2 puede estar baja. Las gama son a menudo policlonales en muchos casos de cirrosis. La depresin normal entre el rea beta y gama puede estar ausente en la cirrosis heptica; esto es llamado puente beta-gama y son raramente encontrados juntos, an en pacientes quienes tienen una cirrosis heptica obvia. Las gamapatas policlonales ocurren en un amplio rango de entidades las cuales tienen en comn una estimulacin inmunolgica crnica (ejemplo: sarcoidosis, leishmanisis visceral y otras entidades). *Las gama globulinas pueden estar elevadas aisladas. Las fracciones incluyen Ig.G, Ig.A, Ig.M, Ig.D e Ig.E. El aumento policlonal difuso indica un proceso inmunolgico crnico tal como aquel encontrado en las enfermedades del hgado (cirrosis, hepatitis crnica activa), enfermedades del colgeno (lupus, artritis reumatoidea), enfermedades infecciosas (osteomielitis, bronquiectasis, leishmaniasis visceral, lepra), otros estados inflamatorios (sarcoidosis), neoplasmas (algunos estados de la enfermedad de Hodgkin), y leucemia mielomonoctica crnica. Muchas pequeas bandas (oligoclonales) son observadas en pacientes con hepatitis, enfermedades del complejo inmune, sndrome de inmunodeficiencia adquirida y linfoadenopata angioinmunoblstica. *Gamapata Monoclonal (Proteina M) los patrones pueden ser benignos, especialmente cuando son pequeos y aumentan, pero las gamapatas monoclonales, relatan, especialmente en el mieloma, amiloidosis primaria, macroglobulinemia de Waldenstrm y linfomas malignos ocasionales. Estos picos son altos, oscuros, con forma de agujas. Tambin pequeas gamapatas pueden encontrarse en enfermedades benignas, que pueden ser tambin detectadas tempranamente o desarrollar enfermedades linfoproliferativas malignas. Adems, tales gamapatas son consideradas como "gamapatas monoclonales de significado indeterminado". Todos los pacientes con gamapata monoclonal debern tener un seguimiento con determinacin peridica de electroforsis de protenas para diferenciar el aumento de picos M. El aumento de protenas M requiere adems evaluacin de aspirado de medula, estudios de rayos X, electroforesis de protenas, estudios de inmunofijacin e inmunoelectroforticos. *Gamaglobulinas bajas: Tambin las gama globulinas pueden disminuir ligeramente con el aumento de la edad, cualquier disminucin mayor del rango normal sin explicaciones por causas obvias de prdida de protenas (tales como enfermedad renal conocida), adems se debe determinar inmunofijacin en orina para detectar posibles cadenas libres monoclonales (protenas de Bence Jones). La hipogamaglobulinemia es tambin observada en muchos pacientes con desordenes linfoproliferativos con clulas B tales como leucemia linfoctica crnica. Estas pueden disminuirse terapia citotxica o inmunosupresora (utilizando esteroides por tiempo prolongado, quimioterapia antineoplsica), enfermedades linfoproliferativas malignas, mieloma mltiple y sndrome de inmunodeficiencia variable en adultos. Si existe historia clnica familiar o en pacientes, de susceptibilidad a infeccin, la determinacin de cuantitativa de Ig.G, Ig.A e Ig.M por inmunodifusin o por nefelometra pueden ser de gran ayuda. Especial cuidado en los linfocitos en sangre perifrica, presencia o ausencia de hepatoesplenomegalia y pacientes mayores de 40 aos, presencia o ausencia de cadenas livianas en orina por inmunoelectroforsis o inmunofijacin pueden ser relevantes (enfermedad de cadenas ligeras). *Alfa 2 aumentada: Incluye fracciones reactivas-inflamatorias y pueden estar aumentadas en neoplasmas (carcinomas de clulas renales), infecciones agudas, fiebre reumtica, artritis, sndromes nefrticos y otros estados inflamatorios. La macroglobulina alfa2 est aumentada en el embarazo y con la diabetes mellitus. Nios sanos tienen niveles ms altos que los del adulto. * Alfa2 disminuida: Una de las fracciones ms importantes es la Haptoglobina y su depresin puede indicar hemlisis. Adems pueden estar disminuidas cuando hay dao hepatocelular. Traumas y transfusiones pueden causar tambin su disminucin. *Alfa 1 globulinas: estn

aumentadas en enfermedades inflamatorias activas o neoplasias. *Alfa 1 bajas o: la alfa-1 antitripsina es responsable en un 90% de la actividad de la serina antiproteasa en el suero. Esta deficiencia es debida a una anormalidad gentica la cual deber ser investigada, porque causa enfisema y cirrosis. Si el paciente tiene enfisema, con historia familiar de enfisema, o enfermedad heptica desconocida, los ensayos de alfa-1 antitripsina y fenotipo son recomendados. *Albumina: es mejor determinarla por electroforesis que por mtodos qumicos. La electroforesis permite diagnosticar entidades raras tales como analbuminemia y bisalbuminemia. La albmina est aumentada en pacientes deshidratados y est disminuida en una amplia variedad de enfermedades subagudas, subcrnicas y crnicas hepticas, renales y gastrointestinales, adems en pacientes con desnutricin. *Disminucin total de las protenas con patrn normal esencial: puede indicar deficiencia en la dieta o hemodilucin. *Protenas totales significativamente elevadas con patrn normal esencial: puede ser debido a una deshidratacin secundaria. *Protenas totales y albmina significativamente baja, alfa2 aumentadas y gama disminuidas: es el prototipo tpico de sndrome nefrtico.

Limitaciones: La electroforesis de protenas en suero detecta algunas pero no todas las enfermedades del hgado. La electroforesis de protenas y la inmunoelectroforsis o la inmunofijacin en orina o en suero son utilizadas en estudios de pacientes con mieloma o macroglobulinemia de Waldenstrm. Los estudios en orina pueden ser tiles an si la electroforesis de protenas en suero no es notable. Hay varias formas de interpretar adecuadamente los resultados de una electroforesis. Una de ellas es por simple comparacin de los resultados del paciente con aquellas de patrones patolgicos que muestren los cambios caractersticos de las 5 protenas sricas bsicas en enfermedades especficas. Este mtodo ofrece gran ayuda al mdico, pero una mejor comprensin de las protenas que forman cada fraccin as como su funcin fisiolgica aumenta mucho la utilidad de la electroforesis. Se ha establecido que cada una de las 5 fracciones esta compuesta de 1-3 protenas especficas. Cmo un ejemplo, Alfa-2 est compuesta de 2 M y haptoglobina. Aumento o disminucin de la pendiente delantera (+) de ella refleja variaciones en contenido de 2 M mientras que cuando se altera el centro o la parte posterior (-) de esta curva, refleja variaciones en haptoglobina. El grfico muestra la localizacin de algunas protenas, alteraciones de forma en estas zonas se relacionan con cada una de ellas. Para evaluar los resultados apropiadamente usted debe familiarizarse con estos patrones y considerar el contenido en gm % que la grfica representa.

Resumen del Significado de los resultados anormales

La disminucin de la protena total puede indicar:

Desnutricin Sndrome nefrtico Enteropata por prdida de protenas gastrointestinal

El aumento de las protenas alpha-1 globulina puede indicar:

Enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES) Enfermedad inflamatoria aguda Malignidad

La disminucin de las protenas alfa-1 globulinas puede indicar:

Deficiencia de alfa-1 antitripsina

El aumento de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar:

Inflamacin aguda Inflamacin crnica

La disminucin de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar:

Hemlisis

El aumento de las protenas beta globulinas puede indicar:

Hiperlipoproteinemia (por ejemplo, hipercolesterolemia familiar) Terapia de estrgenos

La disminucin de las protenas beta globulinas puede indicar:

Trastorno de coagulacin congnito Coagulopata de consumo Coagulacin intravascular diseminada

El aumento de las protenas gama globulinas puede indicar:

Mieloma mltiple

Enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES) Hiperinmunizacin Infeccin aguda Macroglobulinemia de Waldenstrom Enfermedad heptica crnica

PTAlb 1 2 + + Infeccin aguda

PTAlb 1 2 - - Linfoma y leucemia linfoctica ++Macroglobulinemia

- Asma y otras alergias + con respuesta pobre a terapias Carcinomatsis +Infeccin crnica +Crioglobulinemia + - + + + + +

- - - -

+ +

+Mieloma +Miastenia +Mixedema - Nefrosis (mxima elevacin de 2) Fiebre reumtica +Artritis reumatoidea

+ + Diabetes mellitas + Glomerolunefritis +Cirrosis heptica (puente entre ) + ++Hepatitis Viral +Enfermedad de Hodgkin - Hipogamaglobulina +Leucemia mielocitica + +Lupus Eritrematoso

+ ++Sarcoidis

+ = Aumento - = Descenso