Enzymologie en milieu homogne

Karim El Kirat

structure de la N-acyl-L-homoserine lactone hydrolase

Cours de BL17 - A2010 1

V. Cintique enzymatique
dmonstration de l'quation de Michaelis-Menten

VI. Enzymes deux substrats

1) Mcanisme enzymatique squentiel au hasard 2) Mcanisme enzymatique squentiel ordonn 3) Mcanisme non squentiel: ping pong

VII. Dtails de mcanismes enzymatiques

Remarque: illustration de la thorie de l'ajustement induit de Koshland

Ajustement induit de l'hexokinase (EC 2.7.1.1). (a) L'hexokinase possde une structure en "U" (PDB ID 2 YHX). (b) Les extrmits se rapprochent par modification de la conformation de l'enzyme lors de l'interaction avec le substrat (D-glucose; PDB ID 1HKG et PDB ID 1GLK).

V. Cintique enzymatique
La fonction des enzymes est d'acclrer les vitesses des ractions:

k+1

k+2

E + S
k-1

ES
k-2

E + P

dC = vitesse de formation - vitesse de disparition dt d[E] (1) : = k - 1[ES] + k + 2[ES] - k + 1[E][S] - k 2[E][P] dt d[ES] (2) : = k + 1[E][S] + k 2[E][P] - k - 1[ES] - k + 2[ES] dt d[S] (3) : = k - 1[ES] - k + 1[E][S] dt d[P] (4) : = k + 2[ES] k 2[E][P] dt (5) : [E]totale = [E] + [ES] quation de conservation de la quantit d' enzyme
4

phase pr-stationnaire ([ES] croissante)

phase stationnaire ([ES]=constante)

S0
concentrations

[E]tot

ES

E S
temps

La phase stationnaire est d'autant plus longueque le rapport [S0]/[E]totale est lev. En tude enzymatique, on se place dans le cas de la phase stationnaire avec [S0] >> [E]totale.

Thorie d' Henri-Michaelis-Menten

Sept postulats de base: 1) L'enzyme est un catalyseur 2) L'enzyme et le substrat ragissent rapidement pour former un complexe (ES) 3) Un seul substrat intervient, un seul complexe (ES) est form e il se dcomose directement en E libre et produit P 4) L'enzyme, le substrat et le complexe (ES) sont en quilibre: la vitesse de dcomposition de (ES) en E+S est plus rapide que la dcomposition en E+P (hypothse de l'quilibre, restrictive mais non-ncessaire) 5) La concentration du S est trs suprieure celle de E, donc la formation du complexe (ES) ne modifie pas significativement la concentration de S libre 6) La vitesse globale de la raction est limite par celle de l'tape de dcomposition du complexe ES en E + P 7) La vitesse est mesure dans les instants initiaux de la raction: donc la raction inverse ne se produit pas (condition de vitesse initiale, tant que [P]<5% de [S0]
6

Dmonstration de l'quation de vitesse grce la thorie d' Henri-Michaelis-Menten Six tapes sont ncessaires pour obtenir l'quation dans l'hypothse de l'quilibre:

k+1 (1)

E + S
k-1

ES

k+2

E + P
et k + 2 = constante catalytique

constante de dissociation de (ES): Ks =

[ E ][S ] k - 1 = [ ES ] k +1

(2) : [E]totale = [E] + [ES] (3) : v = k + 2[ES] c' est donc la vitesse de l' tape limitante et Vmax = k + 2[E]totale (4) : v k + 2[ES] = [E]tot [E] + [ES] [S] Ks

(5) : exprimer [ES] = f([E]libre) : [ES] = [E] k + 2 [E]

[S] [S] v v v Ks = = = Ks (6) : k + 2 [E]tot Vmax 1 + [S] [E]tot [E] + [E] [S] Ks Ks Vmax [S] v= avec Ks = constante de dissociation Ks + [S]

Thorie de Briggs et Haldane (de l'tat stationnaire) k+1

E + S
k-1

ES

k+2

E + P

d[ES] (1) : formation du complexe (ES) : + = k + 1[E][S] dt d[ES] disparition du complexe (ES) : = k 1[ES] + k + 2[ES] dt d[ES] d[ES] et, l'tat stationnaire: + = dt dt d' o k + 1[E][S] = k 1[ES] + k + 2[ES] k +1 donc [ES] = [E][S] (quation 1) k 1+ k + 2 (2) : [E]totale = [E]libre + [ES]complexe
8

(3) : v = k + 2[ES] et v k + 2 [ES] (4) : = [E]tot [E] + [ES] (5) : v = k + 2 [E]tot

Vmax = k + 2 [E]totale

[S] k 1+ k + 2 + [S] k +1 Vmax [S] k 1 k + 2 k+2 v= avec KM = + = Ks + KM + [S] k +1 k +1 k +1 k 1 = Ks k +1

deux possibilits :

si k + 2 << k - 1 : thorie de l' quilibre (H - M - M) : KM = k+2 k + 2 >> k - 1 : thorie de Van Slyke et Cullen : KM = k +1

VI. Enzymes deux substrats

Lorsque l'on a deux substrats A et B, pour obtenir la Vmax, il faut que [A] ET [B] soient saturantes. Pour obtenir le KM, il faut que [A] OU [B] soit saturante.

On parle de mcanisme squentiel losrsque tous les substrats se fixent sur l'enzyme avant que les produits soient relargus. Il ya alors deux possibilits pour la fixation des substrats: - au hasard ou - ordonne

Les mcanismes non-squentiels correspondent aux ractions pendant lesquelles il y a libration d'un produit avant la fixation de tous les substrats (ex: ping pong).
10

1) Mcanisme enzymatique squentiel au hasard

EA A E B
KA KB KA KB

B
kp

EAB

EPQ
et

[E] [A] KA = [EA ] [EB] [A] KA = [ EAB]

EB A
EA et EB sont dits complexes binaires ce sont des complexes intermdiaires et EAB est un complexe ternaire
11

[A][B] v = Vmax KAKB + KB[A] + KA[B] + [A][B] si A est le substrat variable : [A] v = Vmax KB KB KA 1 + [ B] + [A] 1 + [ B] si B est le substrat variable : [B] v = Vmax KA KA KB 1 + [A] + [B] 1 + [A] N.B. : en principe, on doir constater que KA KB = KA KB
12

En fixant [B] pendant que [A] varie:

En double inverse

KB 1 KA KB 1 1 = 1 + [B] [A] + Vmax 1 + [B] v Vmax

si < 1 :
donc quand un des substrats est fix sur E, l'affinit pour l'autre substrat est augmente

1 v

[B] croissante

1 KA

1 [A ]

13

Reprsentations secondaires

KA KAKB 1 pente = + Vmax Vmax [B]

1 KB 1 ordonne l' origine = + Vmax Vmax [B]

14

En fixant [A] pendant que [B] varie:

En double inverse

KA 1 KB KA 1 1 = 1 + [A] [B] + Vmax 1 + [A] v Vmax

si < 1 :
donc quand un des substrats est fix sur E, l'affinit pour l'autre substrat est augmente

1 v

[A] croissante

1 KB

1 [B]

15

Reprsentations secondaires

KB KAKB 1 pente = + Vmax Vmax [A]

1 KA 1 ordonne l' origine = + Vmax Vmax [A]

16

En double inverse

KA 1 KB KA 1 1 = 1 + [A] [B] + Vmax 1 + [A] v Vmax

si = 1 :
les fixations des deux substrats sur E sont indpendantes

1 v

[B] croissante ou [A] croissante

1 1 ou KA KB

1 1 ou [B] [A]

17

Reprsentations secondaires

1 1 KB 1 = + app Vmax Vmax Vmax [B]

1 app Vmax

1 Vmax

1 KB

1 [B]
18

En double inverse

KA 1 KB KA 1 1 = 1 + [A] [B] + Vmax 1 + [A] v Vmax

si > 1 :
la fixation de l'un des substrats sur E diminue l'affinit pour l'autre substrat.

1 v

[B] croissante ou [A] croissante

1 1 ou [B] [A]
19

2) Mcanisme enzymatique squentiel ordonn

Ici le substrat B se fixe uniquement sur le complexe intermdiaire EA

EA A E
KA KB

B
kp

EAB

EPQ
et

[E] [A] KA = [EA ] [EA] [B] KB = [ EAB]

N.B.: la fixation de B dplace la raction de formation de EA vers la droite => la prsence de B (2e substrat) augmente l'affinit apparente de l'enzyme pour A (1er substrat).

20

[A][B] KAKB + KB[A] + [A][B] si A est le substrat variable : [A] v = Vmax KB KAKB + [A] 1 + [ B] [ B] v = Vmax si B est le substrat variable : [B] v = Vmax KA KB 1 + [A] + [B]

21

En fixant [B] pendant que [A] varie:

En double inverse

KB 1 KA KB 1 1 = + 1 + [B] v Vmax [B] [A] Vmax

1 v
Ne permet pas de distinguer du mcanisme au hasard

[B] croissante

caractristique

1 Vmax

1 KA

1 [A ]

22

Reprsentations secondaires

1 KB 1 1 = + app Vmax Vmax [B] Vmax

1 1 1 = [B] + app KAKB KA KA

23

En fixant [A] pendant que [B] varie:

En double inverse

1 KB KA 1 1 = 1 + [A] [B] + Vmax v Vmax

1 v

[A] croissante

1 Vmax

1 [B]

24

Reprsentations secondaires

KB KAKB 1 pente = + Vmax Vmax [A]

K app B

1 = KAKB + KB [A]

25

3) Mcanisme non squentiel: ping pong

k+1 k+2

E+A
k-1 k+3

EA

FP

F+P

F+B
k-3

FB

EQ

k+4

E+Q

Les quilibres d'isomrisation sont considrs comme trs rapides

A
k+1 k-1

P
k+2 k+3

B
k-3

Q
k+4

EA

FP

E FB EQ

Exemple: phosphorylases, transaminases Dans le cas des transminases, E est une amine et F est une imine
26

En double inverse en fixant [A] pendant que [B] varie: en fixant [B] pendant que [A] varie:

KA 1 KB 1 1 = + 1 + [A] v Vmax [B] Vmax

KB 1 KA 1 1 = + 1 + [B] v Vmax [A] Vmax

1 v

[B] croissante ou [A] croissante

Caractristique

d'un

mcansime Ping-Pong

1 1 ou KA KB

1 1 ou [B] [A]

27

Reprsentations secondaires

1 KB 1 1 = + app Vmax Vmax [B] Vmax

1 KB 1 1 = + app KA [B] KA KA

28

VII. Dtails de mcanismes enzymatiques

Reprsentation bidimensionnelle d'un dipeptide glycyl-tyrosine li au site actif de la carboxypeptidase A (EC 3.4.2.1).
29

Mcanisme catalytique de la fructose 2,6-bisphosphatase (EC 2.7.1.105). (1) Les rsidus Lys356 et Arg257, 307 et 352 stabilisent les 4 charges ngatives du substrat. Glu327 stabilise la charge + de l'His392. (2) His392 ralise une attaque nuclophile sur le groupe phosphate du C2 et le transfre sur l'His258 pour former un intermdiaire phosphorylenzyme. (3) L'attaque nuclophile par une molcule d'eau, assiste par Glu327 agissant en tant que base, forme du Pi. (4) Le Pi est libr de l'interaction charge-charge avec les rsidus Arg257 et Arg307.
30

Mcanisme catalytique de l'nolase (EC 4.2.1.11). (1) La Lys345 ragit comme une base en prenant un proton au 2-PGA. L'intermdiaire nolique form est stabilis par les ions Mg2+. (2) L'limination de l'OH est facilite par le rsidu acide Glu211.

31

Mcanisme catalytique d'une protase acide aspartique (protase du HIV). Les flches incurves indiquent la direction des mouvements d'lectrons. (1) L'Asp X agit comme une base pour activer une molcule d'eau en attirant un de ses protons. (2) La molcule d'eau active "attaque" la liaison peptidique pour former un intermdiaire ttradrique transitoire. (3) L'Asp Y agit comme un acide en facilitant la conversion de l'intermdiaire ttradrique et la libration des produits. Puis un proton est transfr du rsidu Asp X Asp Y pour restaurer l'tat initial de la protase.
32

Mcanisme catalytique d'une protase srine: la Chymotrypsine (EC 3.4.21.1). (1) Le relai de charges de la triade HSD permet de retirer le proton labile de la Ser qui devient ainsi un nuclophile plus fort. (2) La Ser195 active "attaque" la liaison peptidique pour former un intermdiaire ttradrique transitoire. (3) La libration du peptide aminoterminal est facilite par le don d'un H par His57 , ceci produit un intermdiaire acylSer195. (4) His57 et Asp102 activent une molcule d'eau qui attaque ainsi l' acyl-Ser195 pour former un deuxime intermdiaire ttradrique. (5) Le relai de charges de la triade HSD cde un proton la Ser195 et facilite la libration du peptide carboxyl-terminal (6).

33

Triade catalytique de la Chymotrypsine (EC 3.4.21.1). Le relai de charges de la triade HSD permet de convertir la Ser195 en nuclophile fort: l'ion alcoxyde.

Comparaison de la structure des sites actifs de la chymotrypsine, la trypsine et l'lastase. Certains rsidus n'interviennent pas directement dans le mcanisme catalytique mais jouent un rle dterminant pour la spcificit des enzymes.

34

Les stratgies d'activation de trois classes de protases. Le groupe carbonyl du peptide est attaqu par (A) une Cys active par une His chez les protases cystine; (B) une molcule d'eau active par un Asp dans le cas de protases aspartate; (C) une molcule d'eau active par un ion mtallique complex par les mtalloprotases. La lettre B reprsente une base (souvent le glutamate) qui aide la dprotonation de l'eau lie au mtal.

35

Enzymologie en milieu htrogne

micrographe SEM de butyryl-cholinestrase immobilise sur un gel de silice

Karim El Kirat

Cours de BL17 - A2010 36

I. Gnralits II. Mthodes d'immobilisation

1) Adsorption 2) Inclusion 3) Rticulation et co-rticulation 4) Fixation sur support activ 5) Consquences de l'immobilisation

III. Effets diffusionnels

37

I. Gnralits
L'enzymologie en milieu htrogne correspond l'tude de systmes prsentant au moins deux phases: solide et liquide (avec en plus gazeux dans certains cas). Les cellules vivantes sont des systmes compartiments: prsence de nombreuses interfaces. => conditions physico-chimiques locales variables d'un point l'autre de la cellule, il faudra prendre en compte les concentrations locales.

De nombreuses applications industrielles comportent des enzymes immobilises (biocapteurs, racteurs enzymatiques, ).
38

Dans un milieu homogne, on peut connatre [E] et [S] au temps initial, elles sont constantes en tout point de la solution

Dans un milieu htrogne, sur un support membranaire o les enzymes sont fixes: [E] = 0 M au niveau du bcher, et elle est trs difficile estimer au niveau du stamp et on peut estimer dans une 1re approximation que [S] et la mme jusqu' un point trs proche de la surface du stamp

39

En ralit, il y a formation d'un gradient de [S] par transformation de S en P et formation d'une zone de dpltion:

S E E E E E E S S PP PP P P P

S S S S S S S S P P P

40

II. Mthodes d'immobilisation

1) Adsorption
C'est la technique la plus simple. L'adsorption de l'enzyme est ralise dans une solution de pH loign de son pHi. La protine possde alors une charge globale positive ou ngative pour permettre son interaction lectrostatique avec la surface. => liaisons faibles labiles suivant les conditions opratoires de mesure d'activit: - variation de [S] - variation de la force ionique - variation de la temprature - variation du pH - agitation mcanique => dsorption importante de l'enzyme (relargage)
41

2) Inclusion
Dans des gels de polyacrylamide par exemple. Dans ces conditions, les molcules d'enzyme sont piges dans les mailles du gel. Selon le degr de rticulation, on aura plus ou moins de relargage et l'accessibilit des sites actifs dpendra fortement de l'inclusion. coeur du gel surface

E E

E E E

E E E E E E E E

E E E E E

E E

contraintes de diffusion

42

3) Rticulation et co-rticulation
C'est dire raliser un pontage chimique entre: - les molcules d'enzyme (rticulation) - les molcules d'enzyme et une autre protine, par ex BSA (co-rticulation) L'agent pontant est en gnral le glutaraldhyde: de bases de Schiff). On obtient ainsi un rseau d'enzymes pontes: E E E E mais risque de pontage de l'enzyme au niveau (ou proximit) de son site actif => perte d'activit possible
43

OHC-(CH2)3-CHO

qui ralise des pontages entre protines par raction avec les Lys- NH2 (formation

E E

4) Fixation sur support activ

En gnral, les supports proviennent de la chromatographie: Sephadex, Agarose, Sepharose, etc Ces supports sont plus ou moins poreux, il pourra donc il y a avoir fixation dans les pores: d'o deux niveaux de contrainte (diffusion externe et interne). Hydrazide CONH-NH2 NH2-NH2

CH3OH/H+ COOH estrification COOCH3

Hydrazine

H2N-Protine CONH-Protine

Azoture CON3 NaNO2/H+

support activ
44

5) Consquences de l'immobilisation
- Consquences possibles lies l'enzyme:

dformation

Changement de conformation - Consquences possibles lies au support:

Encombrement strique

Phnomnes de partage par interaction des molcules avec le support: substrat, produits, inhibiteurs, protons, Le coefficient de partage s'crit alors: Partage Ext

[A]m KA = [A]M

M
support

Int

avec m=microenvironnement=tout ce qui est proximit de l'Enzyme l'chelle molculaire et M=Macroenvironnement= tout ce qui est loin de l'Enzyme l'chelle molculaire
45

III. Effets diffusionnels

Schma de base

E E E E E E
surface active

M [S]

si tous les sites actifs de E sont bloqus => [S] constante

si E est active => gradient de [S]

limite micro- et macroenvironnement

Trois tapes sont ncessaires: - diffusion de S de M vers m - catalyse enzymatique - diffusion de P de m vers M

La consommation de S dans le microenvironnement induit la formation d'un gradient de diffusion de M vers m. On aura donc une vitesse de diffusion qui s'tablit et l'quilibre: la vitesse de diffusion est proportionnelle au nombre de molcules S consommes. Les paramtres ne sont en gnral mesurs qu'au niveau du macroenvironnement. On ne mesure donc que la cintique apparente de l'enzyme.
46

Remarque: Exemple d'influence du support sur le pH optimum de l'activit enzymatique

=0 C

CO-NH-Protine 0 + H2N-Protine COOH

C= 0

Couplage d'une protine des anhydrides d'acide polymriques activit Les H+ sont attirs par les COO- d'o: [H+]m > [H+]M et pHm < pHM pH intrinsque pH optimum pH apparent
47

Diffusion externe
Flux de diffusion: quantit de matire passant par unit de temps au travers d'une surface d'aire unitaire normale au mouvement.

dC J = D dx
1re loi de Fick:

diffusion linaire

J = -D

([A]plus concentr - [A]moins concentr) x D h= d

x tant la distance parcourue par A

en enzymologie htrogne : vitesse de diffusion avec le coefficient de transfert

= v = h([S]M - [S]m)

avec d l'paisseur de la couche limite

d
E E E [S] m
48

[S]M

(D)

Dans l'hypothse de l'tat stationnaire en catalyse htrogne, on peut crire qu'il y a autant de S qui accde l'enzyme que de S consomm:

v = h([S]M - [S]m) =
donc en ordre 1 :

Vmax [S]m KM + [S]m

d' o

Vmax [S]m KM v = h([S]M - [S]m) = kE [S]m v = h([S]M - [S]m) =

Da = kE h

On dfinit Da (ou ) le nombre de DAMKHLER:

qui traduit l'importance relative raction/diffusion

Da =

V max = module de diffusion pour le substrat KM h

h h([S]M - [S]m) = kE [S]m [S]m = et [ S ]M kE + h 1 h kE [ S ]M = Da [ S ]M = 1 [ S ]M d' o, en ordre 1 : [S]m = h 1 1 + Da 1+ 1+ kE Da

49

D'aprs l'quation :

[S]m =

1 [ S ]M 1 + Da

[S]m est une fraction de [S] M dpendant essentiellement de Da et Da dpend de kE et de h, composantes catalytique et diffusionnelle respectivement.

v = kE
Rgimes limites Da 0,1

1 [ S ]M 1 + Da

en ordre 1

[S]M

E E

E 2 E 5 E E 10
50

D'aprs l'quation :

v = kE

1 [ S ]M 1 + Da

en ordre 1

- si kE << h => Da < 0,1 d'o [S]m#[S]M => rgime enzymatique (vitesse de diffusion non limitante) - si kE >> h => Da >10 d'o [S]m << [S]M => rgime diffusionnel (dpltion en S dans la couche limite) => la cintique n'est plus michaelienne On peut ainsi calculer le facteur d'efficacit:

e =

vitesse observe en prsence de limitations diffusionn elles vitesse observe en absence de limitations diffusionnelles

donc

Vobs = e Venz

et

Vm [S]m KM + [S]m e = Vm [S]M KM + [S]M

dans le cas particulier de l' ordre 1 :

kE Vm [S]m [S]M 1 1 + Da KM e = = = Vm [S]M kE [S]M 1 + Da KM

51

v Vmax Venz

Vdiff=h[S]M

Influence de Venz et Vdiff

Vmax 2

KM

S0,5

[S]M

52

v Vmax Da=0 10 20

Vmax 2

100

KM S0,5 S0,5

S0,5 S0,5

[S]M

Da S0,5 = KM 1 + 2

53

linarisation de Lineweaver-Burk

1 v

100 20 10 Da=1

1 KM + h Vmax
1 Vmax KM Vmax

1 KM

1 [ S ]M

54

linarisation de Eadie-Hofstee

Vmax

KM

100

20

10

Da=1

Vmax KM

v [S ]M
55

Dtermination de h:

v = h ([ S ]M - [S]m) donc : [S]m = [ S ]M v h

est toujours valable

d ' o :

v Vm [ S ]M - h v= v KM [ S ]M - h 1 [ S ]M 1 1 = (Vm - v) v KM h KM

aprs dveloppements :

56

Dtermination graphique de h:

1 Vm v

1 [ S ]M 1 1 = (Vm - v) v KM h KM

1 pente = KM

1 h
1 h KM

[ S ]M v

57

Mthode graphique pour dduire la courbe sans contraintes de diffusion:

v = h ([ S ]M - [S]m) donc : v = -h [S]m + h [ S ]M

est du type : y = - a x + b donc pente = - h et ordonne l' origine = h [ S ]M

h* [S]M4 h* [S]M3 v4 h* [S] v3

M2

v2 h* [S]M1 v1 -h

[S]m1 [S]m2 [S]m3 [S]m4

[S]M1

[S]M2

[S]M3

[S]M4 58

Reprsentation d'Arrhnius
rgime intermdiaire (diminution apparente de [E])

log(activit )

contrle diffusionnel

contrle cintique

tempratures leves

tempratures basses

1 T

en

K -1

59

60