4UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE NIJTRICION Y BROMATOLOGIA ITt (HIGIENE Y TECNOLOOIA DE LOS ALIMENTOS)

OBTENCION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTE A LAS CASEINAS DE LA LECHE DE CABRA Y SU UTILIZACION EN LA DIFERENCIACION DE MEZCLAS LCTEAS Y QUESOS

Memoria que para optar al grado de Doctor en Veterinaria presenta la Licenciada Ana Isabd Haza Duaso. Madrid, noviembre de 1995.

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE VETERINARIA

OPTO. DE NUTRICION Y BROMATOLOGA III HiGI~Nt Y TECNOLOGA DE LOS AUMENTOS CIUDAD UNIVERSITARIA 28040 MADRID

PALOMA MORALES GOMEZ, PROFESORA TITULAR DE NUTRICION Y BROMATOLOGIA DE LA FACULTAD DE VETERTINARIA DE LA UNiVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID, CERTIFICA: Que la tesis doctoral titulada Obtencin de anticuerpos monoclonales frente a las casenas de la leche de cabra y su utilizacin en la diferenciacin de mezclas lcteas y quesos, de la que es autora la Licenciada en Veterinaria Ana Isabel Haza Duaso, ha sido realizada en el Departamento de Nutricin y Bromatologa III (Higiene y Tecnologa de los Alimentos) bajo la direccin conjunta de los catedrticos D. Bernab Sanz Prez y D. Pablo E. Hernndez Cruza y de la que suscribe, y cumple las condiciones exigidas para optar al ttulo de Doctor en Veterinaria.

Madrid, 13 de noviembre de 1995

Fdo: Paloma Morales

Fdo: Bernab Sanz

Edo: Pablo E. Hernndez

INDICE

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1. EXPOSICION GENERAL DEL PROBLEMA A INVESTIGAR II. INTRODUCCION 11.1. LALECHE PAGINA 1

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1. 1. Generalidades 1.2. Diferencias de composicin de las leches de vaca, oveja y cabra 1. Leche deoveja 2. Leche de cabra 11.2. COMPOSICION PROTEICA DE LA LECHE 2.1. Nomenclatura de las proteinas lcteas 2.2. El polimorfismo gentico de las lactoproteinas 1, Estructura y localizacion de los genes que codifican las casenas 2. Estructura y localizacion de los genes que codifican las protenas sricas 2.3. Modificaciones post-traduccionales responsables de la heterogeneidad de las protenas 11.3. CASEINAS 3.1. Micela de casena 3.2. Caractersticas moleculares de las casenas 3.3. Obtencin y fraccionamiento de las casenas 1. Mtodos de solubilidad diferencial 2. Mtodos electroforticos 3. Mtodos cromatogrficos 1. Tcnicas crimatogrficas clsicas 2. Fraccionamiento por tcnicas cromatogrficas de alta resolucin 11.4. TIPOS DE CASEINAS 4.1. Casena a5~ 4.2. Casena afl 4.3. Casenap

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4.4. Casefna~ 11.5. DIFERENCIAS EN LA COMPOSICION CASEIINICA DE LAS LECHES DE VACA, OVEJA Y CABRA 5.1. Casefna~s1
5.2. Casena a5~

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5.3. Casefnap 5.4. Casefnaic 11.6. OTRAS PROTEINAS LACTEAS 6. 1. Protenas del lactosuero 1. f3-Lactoglobulina 2. a-Lactoalbdmina 3. Albmina srica bovina 4. Immunoglobulinas 6.2. Protenas de la membrana del glbulo graso 6.3. Protenas minoritarias 6.4. Enzimas 11.7. QUESOS 7.1. Clasificacin de los quesos espaoles: tipos y familias 1. Quesos de Espaa con denominacin de origen y genrica 7.2. La leche para la fabricacin del queso 7.3. Comportamiento de las protenas lcteas durante la la fabricacin del queso 1. Coagulacin 2. Maduracin 1. Accin del cuajo 2. Proteasas nativas de la leche 3. Proteasas de las bacterias lcticas 7.4. Degradacin de las protenas del queso 11.8. TECNICAS ANALiTICAS EMPLEADAS PARA DETERMINAR EL ORIGEN ESPECIFICO DE LA LECHE Y DERIVADOS LAC~EOS 8.1. Mtodos cromatogrficos

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8.2. Mtodos electroforticos 8.3. Mtodos inmunolgicos 1. Tcnicas clsicas 2. Tcnicas inmunoenzimticas (ELISA) 1. Inmunodotting 2. Inmunoblotting 3. Tcnicas ELISA IILMATERIAL Y METODOS 111.1. MATERIAL GENERAL 1. 1. Material de laboratorio 1.2. Material biolgico 1. Animales de experimentacin 2. Origen de las muestras 1.3. Productos y reactivos 111.2. METODOS 2. 1. Preparacin de las muestras 1. Obtencin de las casenas 2. Mezclas lcteas 3. Mezclas de quesos 2.2. Determinacin de la protena 2.3. Fraccionamiento de la casena de la leche de cabra por cromatografa de intercambio inicc 1. Cromatografa lquida rpida de protenas (FPLC) 1. Preparacin de la casena 2. Fraccionamiento 2. Cromatografa de intercambio aninico con DEAE-celulosa 1. Preparacin de la celulosa y relleno de la columna 2. Preparacin de la casena 3. Fraccionamiento 3. Cromatografa de intercambio catinico en una matriz de S-Sepharose Fast-Flow 1. Preparacin de la matriz y mileno de la columna

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2.4.

2.5. 2.6.

2.7.

2. Preparacin de la casena 3. Fraccionamiento Caracterizacin de las fracciones caseinicas purificadas 1. Electroforesis en presencia de agentes desnaturalizantes (SDS-PAGE) 1. Preparacin de las muestras 2. Electroforesis 3. Teido y desteido del gel Caracterizacin inmunolgica parcial de las fracciones caseinicas purificadas Produccin de anticuerpos policlonales 1. Protocolo de inmunizacin 1. Comprobacin de la inmunizacin 2. Sangra final. 3. Obtencin y conservacin del suero 2. Purificacin parcial de los inmunosueros 1. Precipitacin de las inmunoglobulinas con sulfato amnico Obtencin y produccin de anticuerpos monoclonales 1. Protocolo de inmunizacin 1. Comprobacin de la inmunizacin 2. Medios de cultivo y soluciones empleadas 3. Obtencin de los hibridomas 1. Obtencin de los linfocitos esplnicos de los ratnes inmunizados 2. Clulas de mieloma 1. Mantenimiento y propagacion de las clulas 3. Preparacin de las clulas para la fusin 4. Preparacin del agente fusionante 5. Fusin celular 4. Seleccin y mantenimiento de los hibridomas 1. Medio selectivo 2. Preseleccin de los hibridomas productores de anticuerpos de inters

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5. Clonacin de los hibridomas de inters

1. Expansin de los clones

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2. Conservacin de los clones 6. Produccin de Acm en gran escala 1. Cultivo de los hibridomas 2. Produccin de liquido ascltico 7. Caracterizacin isotpica de los anticuerpos monoclonales 8. Determinacin de la concentracin de protena de los anticuerpos monoclonales 9. Especificidad 10. Conjugacin de los anticuerpos purificados con la biotina 2,8. Tcnicas Inmunoenzimticas (ELISA) 1. Tcnica del ELISA Indirecto 2. Tcnica del ELISA Sandwich 3. Tcnica del ELISA Competitivo 4. Tcnica del Inmunoblotting IV. RESULTADOS IV. 1. FRACCIONAMIENTO DE LA CASEINA DE LA LECHE DE CABRA POR CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO 1.1. Cromatografa lquida rpida de protenas (FPLC) 1. Caracterizacin electrofortica de las fracciones caseiicas purificadas por FPLC 1.2. Cromatografa de intercambio aninico con DEAE-celulosa 1.3. Cromatografa de intercambio catinico en una matriz de S-Sepharose Fast-Flow 1, Caracterizacin electrofortica de las fracciones caseinicas purificadas por cromatografa de intercambio catinico IV.2. CARACTERIZACION INMUNOLOCIICA PARCIAL DE LAS FRACCIONES CASEINICAS PURIFICADAS IV.3. PRODUCCION DE ANTICUERPOS POLICLONALES IV.4. OBTENCION Y PRODUCCION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
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4.1. Fusin celular 4.2. Seleccin de los de anticuerpos monoclonales de inters 4.3. Caracterizacin isot.lpica de los anticuerpos monoclonales seleccionados 4.4. Actividad de los anticuerpos monoclonales seleccionados, frente a las casenas de la leche de cabra utilizando un ELISA Indirecto 4.5. Determinacin de la especificidad y actividad del anticuerpo monoclonal B2B IV.5. DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA EN MEZCLAS LACTEAS, UTILIZANDO METODOS INMUNOENZIMATICOS (ELISA) 5.1. Deteccin y cuantificacin de leche cruda de cabra en la leche cruda de oveja A. Tcnica del ELISA Indirecto B. Tcnica del ELISA Sandwich C. Tcnica del ELISACompetitivo D. Tcnica del ELISA Indirecto utilizando el sistema de amplificacin biotina-avidina 5.2. Deteccin y cuantificacin de leche cruda de cabra en la leche cruda de vaca A. Tcnica del ELISA Indirecto B. Tcnica del ELISA Competitivo 5.3. Influencia del tratamiento trmico en la deteccin y cuantificacin de leche de cabra en leche cruda de oveja A. Tcnica del ELISA Indirecto B. Tcnica del ELISA Competitivo 5.4. Influencia del tratamiento trmico en la deteccin

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y cuantificacin de leche de cabra en leche cruda de vaca A. Tcnica del ELISA Indirecto B. Tcnica del ELISA Competitivo 165 165 168

IV.6. DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA, EN QUESOS MADURADOS DE OVEJA Y VACA, UTILIZANDO METODOS ]INMUNOENZIMATICOS (ELISA) 6.1, Deteccin y cuantificacin de leche de cabra en quesos madurados de oveja A. Tcnica del ELISA Indirecto B. Tcnica delELISA Competitivo 6.2. Deteccin y cuantificacin de leche de cabra en quesos madurados de vaca A. Tcnka del ELISA Indirecto B. Tcnica del ELISA Competitivo y. DISCUSION V.1. OBTENCION, FRACCIONAMIENTO Y PURiIFICACION DE LAS CASEINA DE LA LECHE DE CABRA V.2. CARACTERiIZACION INMUNOLOGICA PARCIAL DE LAS FRACCIONES CASEINICAS PURIFICADAS V.3. OBTENCION DE LOS INMUNOSUEROS FRENTE A LA CASEINA as2 DE LA LECHE DE CABRA 3.1. Obtencin de anticuerpos policlonales 3.2. Obtencin de anticuerpos monoclonales V.4. DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHEDE CABRA EN MEZCLAS LACTEAS, UTILIZANDO 178 181 181 187 173 174 177 173

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METODOS INMUNOENZIMATICOS (ELISA) 4.1. Deteccin y cuantificacin cte leche cruda de cabra en leche cruda de oveja 4.2. Deteccin y cuantificacin de leche cruda de cabra en leche cruda de vaca 4.3. Influencia del tratamiento trmicoen la deteccin y cuantificacin de leche de cabra en leche cruda de oveja 4.4. Influencia del tratamiento trmico en la deteccin y cuantificacin de leche de cabra en leche cruda de vaca y .5. DETECCIONY CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA EN QUESOS MADURADOS DE OVEJA Y VACA UTILIZANDO METODOS INMUNOENZIMATICOS (ELISA) 5.1. Deteccin y cuantificacin de leche de cabra en quesos madurados de oveja 5.2. Deteccin y cuantificacin de leche de cabra en quesos madurados de vaca V.6. COMPARACION DE LOS RESULTADOS DE ESTE TRABAJO CON LOS DE OTROS INVESTIGADORES VI. CONCLUSIONES VII.TRABAJO FUTURO VIII. BIBLIOGRAFIA

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CAPITULO 1

EXPOSICION GENERAL DEL PROBLEMA A INVESTIGAR

Exposicin General

Debido a la estacionalidad de la produccin de las leches de oveja y cabra, as como al mayor precio de las mismas, ha sido frecuente la utilizacin fraudulenta de leche de vaca en la fabricacin de quesos de oveja y cabra. Igualmente, el aumento creciente de la produccin de leche de cabra, as como su menor coste en relacin a la de oveja, ha determinado su incorporacin en los quesos elaborados con leche de oveja. En nuestro pas, tiene gran inters por tanto, no slo la deteccin de leche de vaca, sino tambin la de leche de cabra en los quesos de mezcla. El poder determinar la materia prima (tipo de leche) que se ha utilizado en la fabricacin de los quesos tiene gran importancia, no slo para garantizar la genuidad de los quesos con Denominacin de Origen o los quesos fabricados con leches puras, sino tambin en la determinacin de los porcentajes de leche en los quesos de mezcla como, por ejemplo el Ibrico, que requiere un mnimo de un 25% de leche de las tres especies, ya que la legislacin espaola establece normas de composicin, debiendo declarar el porcentaje de los distintos tipos de leche empleados en su fabricacin. El tema tiene gran repercusin econmica ya que la Comunidad Europea es en estos momentos excedentaria en la produccin de quesos, mientras los pases comunitarios exigen estrictos controles de calidad, preocupando sobremanera la genuidad de los quesos de oveja y cabra. Para establecer la procedencia animal de las leches en mezclas lcteas y quesos se han utilizado mtodos cromatogrficos (Prager, 1989), electroforticos (Ramos y col., 1985; Addeo y col., 1989 b) e inmunolgicos, basados en la utilizacin de tcnicas como la de inmunodifusin en geles, recientemente modificada en nuestro departamento bajo la denominacin de test de COMIT (Garca y col., 1989), inmunodifusin radial, inmunoelectroforesis en cohete (Radford y col., 1981), inmunoelectroforesis cruzada (Elbertzhaghen y Wenzel, 1987), contrainmunoelectroforesis (Bernhauer y col., 1983), inhibicin de la hemaglutinacin (Levieux, 1980) e inmunodotting (Aranda y col., 1988). El inconveniente de las tcnicas citadas es que requieren materiales y equipos costosos, el realizarlas requiere mucho tiempo o una gran cantidad de anticuerpos purificados y, la mayora de ellas, son slo cualitativas o semicuantitativas. Actualmente el desarrollo de tcnicas inmunolgicas basadas en la conjugacin de marcadores sensibles a los anticuerpos, entre las que se incluyen las inmunoenzimticas (ELISA), constituyen una alternativa interesante a las tcnicas fsico-qumicas de anlisis de alimentos. Las ventajas ms sobresalientes de las tcnicas inmunolgicas son: a) su elevada sensibilidad, debido al empleo de marcadores que potencian su capacidad de deteccin, b) elevada selectividad debido a la especificidad de las reacciones antgeno-anticuerpo, c) pequeo coste del material utilizado, en comparacin con el de otras tcnicas y d) la rapidez y posibilidad de automatizacin del mtodo, lo que permite analizar un nmero elevado de muestras en poco tiempo.
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Exposicin General

La mayora de los mtodos inmunoenzimticos descritos para la identificacin de especies en mezclas lcteas y en quesos, utilizan anticuerpos policlonales frente a las protenas sricas de la leche (Garca y col., 1990; 1991), las casenas totales (Rodrguez y col,, 1990; 1993), inmunoglobulinas bovinas (Sauer y col., 1991) o pptidos sintticos (Rolland y col., 1993; 1995). Sin embargo, los inconvenientes asociados a la utilizacin de anticuerpos policlonales radican en la disponibilidad limitada de los mismos y en la necesidad de purificarlos para eliminar reacciones cruzadas y que posean una especificidad adecuada. Adems, la purificacin de los inmunosueros por afinidad es larga y costosa y los anticuerpos purificados constituyen una mezcla de inmunoglobulinas, que pueden variar en su afmidad por el antgeno. Es por ello, que el objetivo principal de nuestro trabajo ha consistido en la obtencin y caracterizacin parcial de anticuerpos monoclonales especficos frente a las casenas de la leche de cabra, con el fin de utilizarlos posteriormente en el desarrollo de tcnicas inmunoenzimticas (ELISA) que permitan la deteccin y cuantificacin de la leche de cabra en mezclas lcteas frescas y quesos madurados. No obstante, para alcanzar el objetivo propuesto, deben cumplirse los siguientes objetivos parciales: (1). Fraccionamiento de las casenas de la leche de cabra por cromatografa lquida rpida (FPLC) y cromatografa de intercambio inico, e identificacin de las fracciones ms reactivas frente a los inmunosueros anti-casenas de leche de cabra (anti CC), purificados por cromatografa de afinidad frente a los extractos liofilizados de casenas de vaca y oveja. (2). Inmunizacin de ratones Balb/c, con la fraccin caseinica ms inmunoreactiva de la leche de cabra y fusin de los linfocitos, extrados del bazo de los ratones mejor inmunizados, con clulas de mieloma de ratn. (3). Identificacin de los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales y donacin, expansin y congelacin de los especficos frente a la leche de cabra, as como identificacin de la clasey subclase de los anticuerpos monoclonales de inters. (4). Produccin a gran escala de los anticuerpos monoclonales especficos y purificacin de los mismos por precipitacin selectiva con sulfato amnico o utilizando tcnicas cromatogrficas especficas.
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Exposicin General

(5). Utilizacin de los anticuerpos monoclonales purificados para detectar y cuantificar la presencia de leche de cabra en mezclas lcteas frescas y quesos madurados, mediante el desarrollo y puesta a punto de diversas tcnicas inmunoenzimticas (ELISA>.

CAPITULO H

INTRODUCCION

Introduccin

11.1. LA LECHE
11.1.1. GENERALIDADES Segn el Reglamento de Centrales lecheras y otras industrias lcteas (B.O.E,, 240 del 7 de Octubre de 1966) y el Cdigo Alimentario Espaol vigente, la leche se define como: El producto integro, no alterado ni adulterado y sin calostros, procedente del ordeo higinico, regular, completo e ininterrumpido de las hembras maanlferas domsticas sanas y bien alimentadas, indicando que esta denominacin se refiere exclusivamente a la leche de vaca; para designar las leches producidas por hembras de otros animales se indicar el nombre de la especie correspondiente. La leche es desde el punto de vista qumico un sistema complejo formado por 2 fases lquidas fsicamente homogneas: una fase lipidica y una fase acuosa entre las que se reparten los diversos constituyentes. La composicin do la leche determina su calidad nutritiva, su valor como materia prima para fabricar productos alimenticios y muchas de sus propiedades. Los principales componentes de la leche son el agua, lpidos, carbohidratos, protenas, sales y una gran lista de componentes miscelneos, que se encuadran en cuatro categoras: componentes especficos del rgano y de la especie (la mayora de las protenas y de los lpidos), componentes especficos del rgano pero no de la especie (la lactosa), componentes especficos de especie pero no del rgano (algunas protenas) y componentes no especficos (agua, sales y vitaminas) (Jeness, 1988).

11.1.2. DIFERENCIAS DE COMPOSICION DE LAS LECHES DE VACA, OVEJA Y CABRA La composicin qumica de la leche vara segn la especie animal. En la Tabla 11.1., se muestra una clasificacin de los principales componentes de la leche. Es interesante destacar que adems de las variaciones debidas a la especie, los distintos componentes de la leche se encuentran en proporciones variables dependiendo de numerosos factores y condiciones como la raza, el estado fisiolgico del animal (etapa de lactacin, edad, estado nutricional, variaciones estacionales) y factores ambientales, si bien se considera que la composicin y propiedades de la leche son cualitativamente constantes. Las leches de vaca, oveja y cabra se diferencian en algunas caractersticas, unas facilmente observables y otras relacionadas con sus particularidades fsicas y qumicas. La

Introduccin

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introduccin

leche de vaca es un lquido opaco, blanco mate, ms o menos amarillento segn el contenido en p-caroteno de la materia grasa. Tiene un olor poco marcado y su gusto es agradable y dulzn (Assenat, 1991). Teniendo en cuenta que la leche de vaca se considera, si no como referencia, si como la ms estudiada y conocida, las comparaciones entre las leches de inters se establecern especialmente con ella. 11.1.2.1. LECHEDE OVEJA La leche de oveja es de un color blanco nacarado, semejante a la porcelana. Su opacidad es mayor que la de las leches de vaca y cabra y su viscosidad es mayor que la de la leche de vaca. La leche de oveja tiene un olor sui gneris, caracterstico del animal que la produce y poco marcado en la leche recogida en buenas condiciones. La grasa es el componente de la leche de oveja que muestra mayores variaciones. Parkash y Jeness (1968) determinaron que el dimetro del glbulo graso es de 3,30 micras en la leche de oveja y de 4,55 en la leche de vaca. El color de la leche de oveja es netamente blanco, debido a la poca presencia de p-caroteno (Laxminarayana y Dastur, 1968). Los lpidos de la leche de oveja se caracterizan por su elevado contenido en cidos grasos saturados de 6 a 12 tomos de carbono, con una proporcin particularmente elevada del cido caprlico, de 1,7 a 4% en peso de los cidos grasos totales en la leche de oveja, frente a slo el 1-1,8% de la leche de vaca. Lo mismo sucede con el cido cprico, de 4 a 11% en la leche de oveja frente al 2,1-3,5% de la leche de vaca (Assenat, 1991). El anlisis de los cidos grasos, revela algunas diferencias, que parece que son especificas de la leche de oveja (Kuzdzal-Savoie y Kuzdzal, 1970). Los cidos comprendidos entre el mirstico (C14) y el pentadenoico (CiS) se encuentran en pequea cantidad, lo que se ha considerado por diversos autores en la deteccin de posibles fraudes. El olor y gusto caracterstico de la leche de oveja estn es estrecha relacin con el contenido de cidos grasos de 6 a 12 tomos de carbono. El aroma particular de los quesos de leche de oveja se debe a la composicin de los lpidos de esta leche. En la leche de oveja existen menos triglicridos de cadena larga y ms de cadena corta que en la leche de vaca mientras la proporcin de fosfolipidos de la leche de oveja parece ser ligeramente mayor en la leche de oveja que en la de vaca. Ya se ha mencionado que los quesos obtenidos con leche de oveja presentan, la mayora de ellos, caractersticas especificas de sabor y gusto, lo que parece deberse fundamentalmente a la lipolisis del componente graso. Los cidos caprlico y cprico se encuentran en la leche de oveja en cantidades relativamente importantes, por lo que es posible que influyan en este proceso, bien como sustancias activas o como precursores de otras sustancias (Assenat, 1991). 8

introduccin

La leche de oveja es especialmente rica en componentes queseros. Es habitual decir que, para cantidades de leche idnticas, se obtiene de media dos veces ms de queso con la leche de oveja que con la de vaca. La leche de oveja produce una cuajada dura y la pasta es, en general ms blanca, siendo relativamente difcil la oposicin de sabores amargos, lo que se atribuye a la menor proporcin de casenas as respecto a la casena total, Lo ms notable en cuanto a la composicin de la leche de oveja, en comparacin con la de vaca y cabra, es que es unas 2 veces ms rica en grasa y en nitrgeno total. Su contenido en lactosa es igual o inferior al de la leche de vaca. 11.1.2.2. LECHE DE CABRA La leche de cabra es de un color blanco mate, debido a que no contiene 3-caroteno; recin ordeada tiene un olor neutro, aunque a veces al final de la lactacin se aprecia un denominado cprico. El sabor dulzn es particular de esta leche. La viscosidad de la leche de cabra es ms baja que la de vaca (Parkash y Jeness, 1968). Como las concentraciones de grasa y protenas de la leche de cabra son inferiores a las de la leche de vaca, su valor energtico es ms bajo. En cuanto a su valor vitamnico, la leche de cabra no contiene carotenos y se caracteriza por la ausencia o la presencia de una cantidad pequea de vitamina E. Los glbulos grasos de la leche de cabra son ms pequeos que en la de vaca, pero la composicin y propiedades de ambas membranas son similares. Un 65% de los glbulos grasos tienen un dimetro inferior a 3 micras frente a un 43% en la leche de vaca, con un dimetro medio muy prximo al de la leche de oveja, de 3,5 micras y de 3,3 micras respectivamente. A igualdad de concentracin de grasa, la leche de cabra tiene un nmero de glbulos grasos dos veces mayor que la leche de vaca y un dimetro medio inferior de 3,53 micras y de 1,99 micras para la leche de vaca y de cabra, respectivamente (Fahmi y col., 1956). Los triglicridos representan el 98,99% de los lpidos de la leche, siendo los mono y diglicridos poco frecuentes, representando un 0,5% del total. La leche de cabra tiene un contenido en cidos grasos prcticamente doble que el de la leche de vaca (16,6% frente al 8%). El porcentaje de cidos grasos saturados vara entre el 65,9% y el 7 1,9%. Si se estudian los cidos grasos en funcin de la longitud de su cadena de tomos de carbono de C4 a C12, la leche de cabra y la de oveja son similares, con un 20% y un 24%, respectivamente, frente al 14% de la leche de vaca. La diferencia entre las leches de cabra y vaca se encuentra esencialmente en la proporcin de los cidos grasos CS, CO y C12, que

Introduccin

para la leche de vaca y cabra son de 1,8 y 3,6%, de 4,0 y 3,2% y dc 8,7 y 4.7%, respectivamente. En la leche se distinguen dos grupos de compuestos nitrogenados: las protenas y las sustancias no proteicas o nitrgeno no proteico (NNP), que en la leche de vaca representan, respectivamente, el 95% y el 5%. La leche de oveja es pobre en NINP, siendo en esto similar a la de vaca (6,8%). Por el contrario, en la leche de cabra la concentracin de NNP es ms elevada que en las otras dos, del orden del 8,7% (Mahieu y col., 1976, 1977; Mohrand-Fehr y Flamant, 1983). 11.2. COMPOSICION PROTEICA DE LA LECHE Las protenas lcteas tienen una gran importancia en la nutricin humana e influencian el comportamiento y las propiedades de los productos que las contienen, por lo que se han estudiado ampliamente. La mayora de los estudios se han realizado en la leche de vaca, extrapolando los resultados a las dems especies. La fraccin proteica de la leche se encuentra en la fase acuosa, bien en estado soluble, constituida por diferentes polimeros proteicos hidrfilos (protenas del lactosuero) o bien en estado coloidal, constituida por partculas slidas, en suspensin, que difunden la luz y dan un color blanco opaco (micelas de casena). Las micelas de casena son complejos orgnicos constituidos por protenas laxas y enmarafladas, mientras que las protenas solubles se encuentran como cadenas enrolladas y cerradas (Walstra y Jeness, 1987). El grupo denominado casenas consta de 4 tipos de cadenas polipeptidicas sj, sa, f3 y c, adems de algunos derivados procedentes de la proteolisis de estas cadenas. El 95% de la caselna de la leche se encuentra agrupada en las micelas de casena de 20-300 hm de dimetro, asociada con iones calcio y fosfato. En el otro grupo de protenas, denominado protenas del lactosuero se incluyen la a-lactoalbmina, la p-lactoglobulina, la albmina srica bovina, las inmunoglobulinas, las protenas de la membrana del glbulo graso, los enzimas y otras protenas minoritarias como transferrina, lactoferrmna y 132microglobulina (Tabla 11.2.). 11.2.1. NOMENCLATURA DE LAS PROTENAS LCTEAS A lo largo del siglo XIX y principios del actual, las protenas conocidas se limitaron a las casenas y a la -lactoalbmina y p-lactoglobulina, aunque posteriormente se han

lo

introduccin

Tabla 11.2. Clasificacin y Distribucin de las Protenas de La Leche de Vaca (30-35 g/l)

1. CASEINAS (24-28 ID Casenas Casenas Casenas Caseina& a51 52 ~

JC

2-lSg/l) (l gIl) (3-4 (9-11 gIl) (2-4 g/l)

2. PROTENAS DEL LACTOSUERO 3 -Lactoglobulina -Lactoalbmina Seroalbmina bovina Inmunoglobulinas (2-4 gIl) (0,6-1,7 gIl) (0,2-0,4 gIl) (0,5-1,8 gil)

3. PROTENAS DE LA MEMBRANA DEL OLOBULO GRASO 4. PROTENAS MTNORITARIAS Transferrina

Lactoferrina Pz -Microglobulina Glicoproteinas

Ceruloplasmina Inhibidor de Tripsina Quiningeno Protena ligante de Folato

Protena ligante de Vitamina ~12 &ENZLfrIAS

Fuente: Whitney, 1988

11

Introduccin

identificado y caracterizado numerosas protenas. El Comit de la Asociacin Americana de Ciencia de la Leche y Productos Lcteos (ADSA), ha desarrollado un sistema de clasificacin de las protenas de la leche para su nomenclatura y clasificacin (Eigel y col., 1984), incluyendo las protenas minoritarias y los enzimas. Excepto para la seroalbniina bovina, las inmunoglobulinas y las protenas de la membrana del glbulo graso, la nomenclatura empleada en esta clasificacin consiste en una letra griega, con o sin subndice, que identifica la familia de protenas. Las variantes genticas se indican por una letra arbiga mayscula, con o sin superndice y las modificaciones post-craduccionales, se indican por una notacin alfanumrica seguida de la letra que designa la variante gnica. Un problema importante para denominar a las protenas lcteas, de especies distintas a la bovina, es determinar su homologa. En biologa donde el trmino homologa significa ancestros comunes, se dice que las protenas de especies distintas son homlogas si proceden de un ancestro comn. Otro criterio de homologa es la existencia de inmunoreactividad cruzada, por lo que las protenas homlogas muy prximas poseen determinantes comunes y por lo tanto exhiben reacciones inmunolgicas cruzadas, pero la ausencia de reactividad cruzada no implica necesariamente la carencia de homologa. La homologa puede deducirse de la funcin biolgica y de la inmunoreactividad cruzada, aunque el criterio definitivo es homologa en la secuencia aminoacdica (Swaisgood, 1982). Las casenas, la cx-lactoalbmina y la 3-lactoglobulina, se nombran de acuerdo a sus homlogos en la especie bovina, mientras la albmina srica se identifca por su movilidad electrofortica, inmunoreactividad y su tamao molecular. Las inmunoglobulinas se identifican y denominan por su inmunoreactividad y los enzimas se identifican y nombran por su especificidad biolgica. Est claramente establecido que la heterogeneidad de una familia de protenas de la misma especie, deriva de las modificaciones post-traduccionales (fosforilacin incompleta de las casenas, glicosilacin de la casena ic, proteolisis parcial por la plasmina) y del polimorfismo gentico. Todas las protenas de la leche presentan polimorfismo gentico (Martn, 1993); hasta ahora todas las variantes conocidas difieren en los radicales ionizables y, originalmente, se detectaron por variaciones en la migracin electrofortica de las protenas de leches de vacas distintas. En la mayora de los casos, la localizacin de las sustituciones se ha establecido con tcnicas de secuenciacin de los pptidos de inters. En algunas de las protenas de la leche existen tambin variantes no genticas, debido a diferencias en el nmero y localizacin de los grupos fosfato y glicosilo, que se unen a las cadenas polipeptdicas despus de la traduccin.

12

Introduccin

11.2.2. EL POLIMORFISMO GENETICO DE LAS LACTOPROTEINAS

El estudio de los determinantes genticos de las protenas de la leche es relativamente reciente, (Bonsing y Mackinlay, 1987; Rosen, 1987; Mercier y col., 1991 y Mercier y Vilotte, 1993). El polimorfismo gentico de las casenas se traduce en la posibilidad, para cada una de ellas, de existir bajo diversas formas derivadas de la misma forma original por mutacin. Estas variantes designadas por las letras A, B, C, etc., se diferencian entre si por modificaciones mnimas en la estructura de las cadenas polipeptidicas donde por ejemplo, un aminocido es reemplazado por otro. Sin embargo,. estas pequeas modificaciones pueden traducirse en cambios importantes de sus propiedades: la sustitucin de un aminocido por otro puede acarrear una modificacin de las estructuras secundaria o terciaria de la protena. Las variantes genticas pueden poseer, por tanto, implicaciones interesantes. En una poblacin, se habla de polimorfismo gentico cuando existen, en un locus de estructura determinada, al menos 2 alelos. El polimorfismo gentico de las protenas en general y de las lactoproteinas en particular, se detecta por electroforesis en geles que permiten la separacin de 2 formas de una misma protena (o 2 variantes) cuando difieren en su carga o su tamaflo, lo que ocurre como consecuencia de mutaciones en las secuencias codificantes de un gen (una parte de los exones) y que no representan ms que una dbil parte (3 a 7% para los genes de las casenas) de la totalidad del gen. El polimorfismo observado en una protena solamente refleja parcialmente el polimorfismo existente a nivel genmico. Solamente 3 mutaciones de cada 4 originan la sustitucin de un aminocido por otro. Adems, alrededor de dos tercios de las sustituciones de las protenas no modifican su carga neta y no pueden ser revelados por electroforesis. Evidentemente, las mutaciones se producen igual y estadsticamente en nmero ms elevado, en las secuencias no codificantes de los genes (intrones, secuencias promotoras y reguladoras), que no son identificables por el anlisis estructural de la protena, pero que pueden tener un efecto considerable sobre su sntesis, como ocurre en el caso de las casenas caprinas (Martn, 1993). Es, en la especie bovina, donde ms se ha estudiado el polimorfismo de las lactoproteinas, por la importancia econmica de la leche de esta especie. Sobre el reparto y la frecuencia de las diversas variantes genticas, se han realizado recientemente diversas revisiones (Mercier y Grosclaude, 1992; Ng-Kwai-Hang y Grosclaude 1992).

13

Introduccin

11.2.2.1. ESTRUCTURA Y LOCALIZACION DE LOS GENES OUE CODIFICAN LAS CASEINAS El fuerte vinculo existente entre los genes que codifican las casenas si, y 3 fue demostrado en 1964 por Grosclaude y col, (1964). Los estudios mendelianos sobre el polimorfismo gentico de las casenas (Grosclaude y col., 1964, 1965, 1978; Larsen y Thymann, 1966) permitieron establecer que las casenas se encuentran codificadas en 4 genes estrechamente ligados. Estos 4 locus secomportan como una nica entidad gentica, en la que la combinacin de los alelos, casi indisociables, se denomina haplotipo. Estas observaciones, fin de la gentica clsica, se han confirmado recientemente por el anlisis de los fragmentos de ADN genmico, por electroforesis en geles de agarosa (Threadgill y Womack, 1990; Ferreti y col., 1990). Estos autores han desarrollado el mapa de un fragmento de 250 a 300 Kb (Figura 11.1.), que posiciona los 4 locus en el siguiente orden:
as, asz,

13 y ic. Estos 4 genes se han localizado posteriormente, por tcnicas de hibridacin

fn situ, en el cromosoma 4 de los bovinos, ovinos y caprinos (Hayes y col., 1993a).

Los genes que codifican las casenas sensibles al calcio (asj, 82 y 13), poseen una organizacin similar y dominios estructurales comunes, confirmando la hiptesis de un origen filogentico comn, como se desprende de la comparacin de las protenas resultantes de su expresin (Gaye y col,, 1977). Un anlisis ms detallado y su comparacin interespecifica, revelan una organizacin estructural muy conservada. As, independientemente de la especie considerada, la unidad de transcripcin del gen de la casena 13 est formada, invariablemente, por 9 exones, Las nicas diferencias notables derivan del tamao de algunos intrones, debido a la presencia de secuencias repetidas. La determinacin de la organizacin estructural de los genes de las casenas si y s2 es muy reciente (Koczan y col., 1991; Groenen y col., 1993). Sus unidades de transcripcin se componen, respectivamente, de 19 y l8exones. Sin embargo, la estructura del gen de la casena ic bovina es sensiblemente diferente de la de los genes de las casenas sensibles al calcio as, 82 y 13. 11.2.2.2. ESTRUCTURA Y LOCALIZACIONDE LOS GENES QUE CODIFICAN LAS PROTEIINAS SERICAS El gen que codifica la -lactoalbmina bovina y caprina se ha localizado en el cromosoma 5 (Hayes y col., 1993 b), mientras que el cromosoma portador del gen

14

Introduccin

especifico de la 3-lactoglobulina se ha identificado en el cromosoma 11 (Hayes y Pctit, 1993). Las unidades de transcripcin de los genes que codifican la -lactoalbmina (Villote y col,, 1987) y la 3-lactoglobulina (Alexander y col., 1993) son de un tamao relativamente pequeo (2 y 4,7 Kb respectivamente), comparadas con las las de los genes especficos de las casenas, comprendidos entre 8,5 kb para la casena 3 (Bonsing y col., 1988) y 18,5 Kb para la casena as (Groenen y col., 1993) (Figura 11.2.).
11.2.3. MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES RESPONSABLES DE LA HETEROGENEIDAD DE LAS PROTENAS

En algunas protenas lcteas, existen tambin variantes no genticas debido a diferencias en el nmero y localizacin de los grupos fosfato y glicosilo que se unen a las cadenas polipeptidicas despus de la traduccin. Las modificaciones post-traduccionales de las que son objeto las casenas (fosforilacin, glicosilacin y proteolisis> son, en parte, responsables de la multiplicidad de los productos observados. Las principales protenas de la leche, las casenas si, 52, 3 y 1< as como las protenas solubles 13-lactoglobulina y -lactoalbmina, se sintetizan en los ribosomas unidos al retculo endoplsmico, bajo la forma de una pre-proteina con una extensin suplementaria de 15 a 21 residuos aminocidicos en la parteN-terminal. Este fragmento, o pptido seal, permite el paso a travs de la membranalipoproteica del retculo y despus es eliminado. La protena lctea sintetizada migra entonces hacia el aparato de Golgi, del que se liberan las vacuolas que contienen protenas, progresando hacia la membrana plasmtica del acinus, con la que se fusionan. Despus, se abren para verter su contenido en la luz del acinus y dar lugar a la leche (Ribadeau-Dumas, 1981). Durante el desplazamiento intracelular se produce la fosforilacin o la glicosilacin de las protenas implicadas, Las protenas del lactosuero presentan una estructura globular compacta mientras que por el contrario, la estructura tridimensional de las casenas parece permitir su asociacin en partculas esfricas estructuradas, las micelas, en las cuales que el ensamblaje y la cohesin estn asegurados reversiblemente por las uniones fosfoclcicas. El carcter reversible de esta estructura, que asegura el transporte bajo forma soluble de los iones fosfato y calcio, requiere la fijacin covalente de grupos prostticos. Estas modificaciones post-traduccionales, realizadas enzimticamente en el aparato de Golgi, son en gran parte responsables de la fuerte heterogeneidad que caracteriza alas casenas.

15

Introduccin

Cromosoma 4
250 Kb

Casenas

a51

13

1<

Casena si (17, ~ kb)

48-53? 63 33 3924242424 33 24 54 4224 42 27 24
34 45

382/3*8

Casena s2 (18, 5 kb)

44

63 II

271

2142272127 2445123 27

~1HI~

27

I ~ Dl
2445 120

45

Casena 3(8,5 kb)

Casena ic (13 kb>

68

m
m
62 ,IJ 33

ZZZ~==r~j

Figura IL 1. Estructura y localIzacin de los genes que codifican las casenas (MartIn, 1993)

fr-lactoglobulina (4,7 Kb)

136

140

74

111

105 42

180

-lactosibmina (2 kb)
160 159 76

330

Figura 11.2. Organizacin estructural de los genes que codifican las dos principales lactoproteinas sricas (MartIn, 1993)
16

Introduccin

La fosforilacin de las casenas tiene lugar post-traduccionalmente en el aparato de Golgi, donde se han identificado los enzimas casein-quinasas (Hingham, 1979). La comparacin de los lugares de fosforilacin en varias casenas, permite conocer que la fosforilacin de las casenas se encuentra catalizada por una quinasa que reconoce especficamente la secuencia tripeptidica Ser/Thr-X-A, donde A representa un residuo cido, preferentemente de tipo glutmico (Glu), raramente asprtico o un sern-fosfato y la X corresponde a un residuo aminoacidico cualquiera (Mercier, 1981). Por otra parte, el reconocimiento de esta secuencia no es suficiente para determinar una modificacin, siendo conveniente que estos residuos estn accesibles para la interaccin con las casein-quinasas, es decir, expuestos en estructuras desordenadas como sucede en el caso de las casenas, mientras que estas secuencias en la -lactoalbmina (Ser 76) y 3-lactoglobulina (Ser 110), se encuentran ordenadas en su estructura. Todas las casenas se encuentran fosforiladas en mayor o menor grado y todos los residuos fosforilados se han identificado como serna, excepto en el caso de la a51D que contiene, adems, un residuo fosfotreonilo. Los lugares de fosforilacin estn dispersos o concentrados en uno (si y 13) 2 (52) segmentos cortos de cadenas polipeptdicas, para formar los lugares de fosforilacin mltiple, conteniendo de 3 a 5 residuos fosfoserilo consecutivos. Estos lugares de fosforilacin mltiple son los responsables de la sensibilidad al calcio de las casenas a~, 82, y 3, y constituyen, verdaderamente, los puntos de anclaje de los puentes fosfoclcicos que unen a las submicelas entre s. La familia de las casenas 82 tiene ms variabilidad en cuanto a la extensin de la fosforilacin ya que su nmero vara de 10 a 13 residuos (Brignon y col,, 1977). El carcter hidrfilo de la casena K se encuentra reforzado por la glicosilacin, lo que contribuye a incrementar la complejidad del sistema, identificndose al menos 10 formas diferentes en la especie bovina (Vreeman y col., 1988) y, al menos, 5 en la especie caprina (Addeo y col., 1988). La glicosilacin de la casena ic tiene lugar probablemente en el aparato de Golgi (Loucheaux-Lefebvre y col., 1978). Como conclusin, conviene sealar que las lactoproteinas se sintetizan en forma de precursores y que durante su traduccin en el retculo endoplsmico las cadenas polipeptdicas son amputadas de su pptido seal (15-21 residuos aminocidos). La estructura de estos pptidos es extremadamente conservada (Mercier y Gaye, 1980), en particular en las casenas sensibles al calcio (as, sz y Ii). Por otra parte durante el almacenamiento de la leche en refrigeracin, a menudo se observa la aparicin de productos de degradacin y de fracciones caseinicas minoritarias: las casenas y, R, S y TS que
17

Introduccin

proceden de la proteolisis de la casena 13 (Gordon y col., 1972) por la plasmina (Eigel y col., 1979).

11.3. CASEINAS
Es difcil definir las casenas de forma que se incluyan todas las protenas que pertenecen a esta clase y se excluyan las dems, aunque la propiedad comn de su escasa solubilidad a pH 4,6, sirve de base para una definicin conveniente y operativa. A este pH precipitan todas las casenas, salvo algunos derivados proteoliticos, mientras su solubilidad en estas condiciones es mucho menor que la de cualquier protena del suero, lo que permite una neta separacin entre unas y otras. Bajo el punto de vista de su composicin, todas las cadenas polipeptidicas de casena tienen al menos un enlace ster-fosfato por molcula, mientras que ninguna de las protenas del suero los tiene. Las casenas representan la fraccin mayoritaria de las protenas de la leche y se distinguen por una serie de propiedades estructurales caractersticas importantes por lo que respecta a su comportamiento qumico y tecnolgico (Jaubert y Martn, 1992). La aptitud de la leche a la coagulacin, la reologia de las cuajadas y ciertos comportamientos del afinado, estn directamente ligados con la estructura y composicin de la micela de casena Debido a su alto contenido en fosfato, las casenas ag, 5~ y 3 se unen fuertemente al calcio y precipitan aconcentraciones de Ca2~ superiores a 6 mM. Sin embargo, la casena ic, con slo un residuo fosfato, es soluble a elevadas concentraciones de Ca2~ y reacciona hidrofbicamente con el resto de las casenas, llegando a estabilizar hasta 110 veces el peso de las casenas sensibles al calcio, evitando su precipitacin mdiante la formacin de agregados coloidales llamados micelas, 11.3.1. MICELA DE CASENA Ms del 95% de las casenas de la leche se encuentran agrupadas en micelas, formadas por un 94% de protena y un 6% de otras sustancias, principalmente calcio, fosfato, algo de magnesio y citrato. Las micelas son esfricas, de un dimetro de entre 30-50 nm y un tamao molecular de unos 108 daltons, formadas por subniicelas esfricas de unos 106 daltons, unidas mediante enlaces de fosfato clcico, interacciones hidrofbicas y puentes de hidrgeno. Aunque la estructura exacta de las submicelas se desconoce, uno de los ltimos modelos (Schmidt, 1982), propone que las casenas sensibles al calcio, las si,
52

y 13, interaccionan hidrofbicamente formando el ncleo de la submicela, mientras

18

Introduccin

que la casena ic se localiza predominantemente en la superficie (Figura 11,3.). Cerca de 2/3 de la molcula de la casena ic es hidrofbica y reacciona hidrofbicamente con las protenas del ncleo de la submicela, mientras que la regin C-terminal, hidrofflica, se orienta hacia el exterior. Las submicelas se agregaran, de modo que aquellas ms ricas en casena K se concentran en la superficie. Se cree que las micelas se estabilizan mediante un potencial elctrico y por el impedimento estrico que causan los segmentos C-terminales de la casena c, que impiden su agregacin.
11.3.2. CARACTERSTICAS MOLECULARES DE LAS CASENAS

De las proteiinas alimentarias, las protenas de la leche de vaca, son probablemente las mejor caracterizadas qumica, fsica y genticamente. Las casenas, aunque con una estructura menos ordenada y ms flexible que las tpicas protenas globulares del suero, poseen una estructura secundaria y terciaria. La estructura primaria de la mayora de las variantes genticas de cada una de las fracciones caseinicas mayoritarias, se ha establecido, bien por secuenciacin de la protena o del DNA cromosmico (Swaisgood, 1992). La composicin qumica de las variantes genticas mayoritarias de cada una de las casenas, se muestra en la Tabla 11.3., de la que se deduce que una caracterstica diferencial de las casenas respecto de las protenas globulares del lactosuero, es la presencia de residuos de fosfoserina y un nmero elevado de residuos prolina. Asimismo, destaca la ausencia de residuos de cisteina en las casenas as y 13. El conocimiento de la composicin aminoacidica permite el clculo de un nmero de parmetros fsico-qumicos, como la carga molecular, que se muestra en la Tabla 11.4. Otra caracterstica que, adems, es responsable de sus propiedades funcionales es el carcter anftero de sus estrucuturas primarias (Swalsgood, 1982), fundamentalmente de las casenas sensibles al calcio (si, 5~ y 13) debido a la fosforilacin y a la existencia de agrupamientos aninicos de residuos de serma y treonina en sus dominios polares, alternando con secuencias hidrofbas con pocos residuos cargados, divididos casi por igual entre cationes y aniones, por lo que la estructura terciaria de las casenas estara constituida por dos dominios, uno hidrofbico globular y otro polar muy cargado (Swaisgood, 1982). En cambio, el dominio polar de la casena 1<, aunque fuertemente aninico, no contiene fosfoserina, por lo que esta caracterstica estructural sera la responsable de las interacciones con el calcio que definen la estructura micelar. Debido a que la observacin directa de la estructura de las casenas por cristalografa con rayos X no es posible, se han utilizado tcnicas espectrales y algoritmos para predecir 19

!ntroduccin

E
o

r
o o
cNJ
00

a
QN QN

e
u

1
o
PC

1
PC

1
te
~<

0 a o
<a
<U

CC
<4

1
o

PC

r
O

It-

20

Introduccin

Tabla 11.3. Composicin Qumica de las Variantes Genticas Mayoritarias de las Casenas Segn su Estructura Primaria

AMIINOACIDOS Asp
Asn

cL51B-8P 7 8
5 8

52A-I1P
4

KB-IP 3 8
14

2-5P ~3A
4 5 9

Thr Ser SerP Glu Gn Pro Gly Ala Cys Val

14 15

6
11 24 16 lo 2 8 2 14
4

12 1 12
14

8 25 14 17 9 9 o 11 5 11 17 10
8 2 14

11 5 19 20 35
5

20 2
15

5 o 19 6 lo 22 4
9

2 11 2 13 8 9
4

Met
Ile Leu Ty.r Phe Trp Lys His Mg Pyr o GIu Residuos totales
Peso molecular

11 13 12
6

2
24 3 6 o 207 25,238

1 9 3
5

1 11 5
4

5
6 o
199

1
169 19,006

23,623

o 209 23,988

Fuente: Swaisgood, 1993

21

Introduccin

Tabla 11.4. Caractersticas Fsico-Qumicas de las Casenas Segn

su Composicin
PROTENA CARGA a pH 6,6 pH ISOIONICO

0(5

A-SP B-8P C-SP D-9P

-21 -21,9 -20,9 -23,5

4,94 4,94 4,97 4,88

A-1OP A-hP A-12P A-13P

-12,2 -13,8 -15,5 -17,1

5,45
5,37 5,3 5,23

[3

A3.5P

-13,8
-13,3 -12,8 -11,8
-9,2

5,07
5,14 5,22 5,29
5,46

A2-SP A-5P B-5P

C-4P K

A-lP B-1P

-3 -2

5,61 5,9

Fuente: Swaisgood, 1993

22

Introduccin

su estructura secundaria a partir de su estructura primada. Los resultados obtenidos sugieren que la afirmacin frecuente de que las casenas carecen de estructura secundaria es incorrecta (Swaisgood, 1982), Recientemente, tambin se han realizado intentos para predecir su estructura terciaria a partir de su estructura primaria mediante el desarrollo de modelos moleculares (Kumosinsky y col,, 1991 a, 1991 b). Las estructuras obtenidas sugieren que los agrupamientos de residuos similares y la presencia de un gran nmero de residuos de prolina uniformemente distribuidos, hacen que las estructuras secundaria y terciaria de las casenas sean abiertas y desordenadas. La flexibilidad de la estructura de las casenas se refleja por su susceptibilidad a la proteolisis, lo cual origina dramticos cambios funcionales (Swaisgood y Catignani, 1987). La estructura de la casena 13 es aparentemente abierta y flexible en la regin entre el N-terminal del dominio polar y el C-terminal del dominio hidrofbico, por lo que la accin de la plasmina sobre esta casena (Eigel, 1977, 1981) da lugar a las casenas y y a las proteasas-peptonas de la leche. Las casenas y derivan del dominio hidrofbico y son extremadamente apolares, extrayndose con solventes orgnicos (Reimerdes y Herlitz, 1979); por el contrario, la fraccin proteasa-peptona que deriva del dominio polar est altamente cargada y es muy estable t&micamente, Las casenas sensibles al calcio tambin sufren proceolisis por proteinasas alcalinas o neutras, produciendo pptidos amargos (Matoba y col., 1970; Minamiura y col., 1972; Shinoda y col., 1985), derivados mayoritariamente de la regin C-termina.l de la casena 3. Por otra parte, en estudios recientes se han aislado pptidos bloactivos por digestin in vivo de las casenas sensibles al calcio (Loukas y col,, 1983; Meisel, 1986; Yoshilcawa y col,, 1986). Las interacciones de las casenas con el calcio son necesarias para la formacin de las micelas, mientras que los agrupamientos aninicos de residuos de fosfoserina son los lugares de unin al calcio (Holt y Hukins, 1991). En consecuencia, la solubilidad de las casenas al calcio depender de la concentracin de calcio y del nmero de agrupamientos de estos residuos por molcula, por lo que el orden de solubilidad ser ~ 1< 52 < 13 <K con 3, 2, 1 y O agrupamientos, respectivamente (Aoki, 1985; Swaisgood, 1982). Tambin se han evaluado los efectos del pH, temperatura y fuerza inica en la solubilidad de las casenas detenninndose que la solubilidad de las casenas en presencia de calcio disminuye cuando se incrementan la temperatura y el pH, y se incrementa con la fuerza inica (Dalgleish y Parker, 1980; Farrel y col., 1988>.

23

Introduccin

11.3.3. OBTENCION Y FRACCIONAMIENTO DE LAS CASENAS Ya que se han empleado numerosos mtodos analticos para el fraccionamiento de las casenas, nuestro propsito no es hacer una revisin de todos los mtodos existentes, sino realizar una breve descripcin de los ms utilizados. Las casenas totales, que son a menudo el material de partida para el aislamiento de las casenas individuales, pueden obtenerse por varios procedimientos (McKenzie, 1971), aunque el mtodo ms utilizado es la precipitacin isoelctrica, ajustando el pH de la leche desnatada a 4,6 y 20 0C con HCI. La casena de la leche tambin puede obtenerse por sedimentacin de las micelas, centrifugando a diferentes temperaturas en presencia o ausencia de iones calcio, o por precipitacin salina con (NH Baldwin, 1961). 11.3.3.1. METODOS DE SOLUBILIDAD DIFERENCIAL Para obtener una o ms de las distintas fracciones caseinicas a partir de las casenas totales o de la leche desnatada, se han desarrollado un nmero de mtodos basados en su diferente solubilidad (Thompson, 1971; Mackinlay y Walce, 1971>, Debido a las fuertes interacciones entre las casenas, es necesario utilizar un agente disociante, siendo histricamente el ms utilizado la urea. Hipp y col, en 1952, desairrollaron dos procedimientos que, posteriormente, se han utilizado, total o parcialmente, incorporados a otros mtodos. El primero, se basa en la diferente solubilidad de las casenas en etanol al 50% en presencia de acetato amnico y con variaciones en la temperatura, pH y fuerza inica. El segundo, se basa en la dispersin de las casenas totales en urea 6,6 M y la separacin de las fracciones caseinicas por dilucin, ajuste de pH y, finalmente, la adicin de sulfato amnico. El orden de precipitacin de las casenas en ambos mtodos es a, 13 y i casenas. La fraccin caseinica s se puede obtenerse de la casena total por precipitacin con CaCl2 (Waugh y col., 1962), mientras la casena ic se obtiene del sobrenadante por precipitacin con Na2SO4 seguido por reprecipitacin al 50% de etanol con acetato amnico (Mckenzie y Wake, 1961). En la precipitacin de las casenas as, tambin se han utilizado el ajuste del pH de una dispersin caseinica en urea (Zittle y Custer, 1963; Fox y Guiney, 1972 ) y la adicin de cido tricloroactico (Swaisgood y Brunner, 1962).
24

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Introduccin

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Figura 11.4. Separacin de las casenas por electroforesis alcalina en geles de poliacrilamida (Swaisgood, 1982>. 1. Casena total c51-B, B-A y K-AB; 2. Casena a51-BC; 3. Casena a52; 4. icA; 5. Casena total tratada con quimosina

26

Introduccin

El componente mayoritario de la casena 3 se obtiene por una modificacin del mtodo de la urea de Hipp y col. (Aschaffenburg, 1963), en el que la casena total se dispersa en urea y se ajusta a pH 4,6 precipitando el grueso de las casenas a~ y ~; el sobrenadante se ajusta a pH 4,9, se diluye en urea 1M y se calienta a 300<2, precipitando la mayor parte de la casena
3.

11.3.3.2. Ni fQDQStI~Q1E~EQR L~QS

La identificacin y, en muchos casos, la nomenclatura de las protenas de la leche se basaron originalmente en su movilidad electrofortica. Se han desarrollado diversos procedimientos electroforticos de fraccionamiento y purificacin de las casenas (Thompson, 1971; Mckenzie, 1971). El mtodo ms utilizado ha sido el de la electroforesis alcalina con urea en geles de poliacrilarnida (Eigel y col, 1984 ; Swaisgood, 1975; Andrews, 1981; Swaisgood, 1982), donde los patrones tpicos obtenidos para las casenas totales y varias de las fracciones se muestran en la Figura 11.4. y en la que dependiendo de la variante gentica de la si, sta, puede o no, resolverse de la 52. Para la resolucin de la casena 1<, lo ms eficaz es observar el efecto de la quimosina en la muestra (Kim y col., 1969), ya que este enzima hidroliza especficamente esta protena. La casena 3 y sus variantes genticas tampoco se separan bien por este mtodo, por lo que sus variantes se descubrieron e identificaron por electroforesis cida con urea en geles de poliacrianiida (Peterson y Kopfler, 1966). Las ltimas tendencias en los mtodos electroforticos se dirigen hacia la tcnica del isoelectroenfoque, por su mayor sensibilidad, precisin y repetibilidad (Trieu-Cuot y Grippon, 1982). Utilizando esta tcnica, la separacin depende slo del punto isoelctrico de la protena y no de su carga y tamalio. Los puntos isoelctricos se extienden en orden creciente de pH 4,9 a 6,5 para las casenas ~, 3 y x, y de 6,7 a 8,0 para las casenas y. Pearce y Zadow (1978) han modificado este procedimiento, utilizando un 5% de poliacrilamida en los geles, urea 6M y un 2% de anfolitos en presencia de mercaptoetanol. 11.3.3.3. frI~ID~S..CEDMAI~EAU.CQS Como se ha descrito previamente, existen procedimientos qumicos de separacin de las casenas por diferencias en su solubilidad, que permiten obtener fracciones enriquecidas respecto a las casenas individuales, pero solamente las tcnicas cromatogrficas proporcionan fracciones homogneas. La cromatografa de filtracin en gel, cuya 25

Introduccin

separacin se basa en el tamao de las molculas, resulta insatisfactoria debido a que los pesos moleculares de las casenas son similares. Haasnot y col, (1987) emplearon dos columnas de filtracin en serie con un tampn 0,1 M Na2SO4 + 0,02 M H2P04, pH 6,8 y urea 6 M, obteniendo dos picos de absorbancia a 280 nm, el primero de ellos conteniendo las casenas st, 3 y -y, y, el segundo, con otros componentes no bien definidos. Recientemente, las tcnicas de cromatografa de intercambio inico se han utilizado con xito en la identificacin, aislamiento y cuantificacin de las casenas individuales, permitiendo la separacin de molculas que presentando tamaos similares, difieren ligeramente en su punto isoelctrico. La naturaleza anftera de las molculas de casena hace posible su adsorcin tanto a intercambiadores aninicos como catinicos. La elucin se consigue modificando el pH, la fuerza inica o ambos, empleando un gradiente lineal o discontinuo. Debido a la tendencia de las casenas a agregarse, deben utilizarse agentes disociantes como la urea y reductores (debido a la existencia de puentes disulfuro en la casena ic) como el mercaptoetanol. Si bien la elucin se consigue normalmente incrementando la concentracin de cloruro o de fosfato, Yaguchi y Rose (1971) describieron cuatro tipos de elucin que han facilitado el xito de esta tcnica: soluciones tampn no disociativas y no reductoras, soluciones tampn con urea sin agentes reductores, soluciones tampn con urea y 2-mercaptoetanol y soluciones tampn con dimetilformamida. 11,3.3.3.1. Tcnicas cromatogrficas clsicas Algunas separaciones se han realizado con soluciones tampn sin agentes disociantes ni reductores. No obstante, debido a que la asociacin de las casenas es dependiente de la temperatura, Tarrasuck y col. (1965), determinaron el efecto de la temperatura en la cromatografa de intercambio aninico de las casenas en columnas de Dietilaminoetil (DEAE)-celulosa. Como se esperaba, las casenas eluyeron a menores concentraciones de 0C que a 2512. Tambin se han utilizado columnas de Trietilaminoetil NaC a 4 (TEAE)-celulosa y DEAE-Sephadex (Igarashi y Saito, 1970; Gordon y col,, 1972). Groves y col. (1962) y Groves y Gordon (1969), consiguieron en una columna de DEAE-celulosa y empleando como eluyente una solucin tampn no disociativa y no reductora, el aislamiento de las casenas y~, ~ y 3, de la casena entera a pH 8,3, La cromatografa de intercambio aninico con urea como agente disociante pero sin

27

Introduccin

agentes reductores, se ha utilizado tambin por numerosos investigadores en el fraccionamiento o purificacin de las casenas. Ribadeau-Dumas y col. (1964) cromatografiaron casena entera en DEAE-celulosa con urea a pH 7 y un gradiente de CNa de O a 0,6 M, obteniendo casenas as y 3 de forma moderadamente puras, pero con la casena x como principal contaminante. El mismo procedimiento se ha utilizado para la separacin de las diferentes variantes de la casena a~ (Thompson y Kiddy, 1964) y en la caracterizacin de las casenas 3 (Tripathi y Gehrke ,1969> y las casenas K (Tripathi y Gehrke 1970; Gordon y col., 1972). Otra tcnicautilizada para facilitar el fraccionamiento cromatogrfico de las fracciones caseinicas, comprende la reduccin y alquilacin posterior de las casenas antes de su cromatografa. Adems de la fuerte asociacin de las casenas 3 y K, lo que dificulta su separacin durante el fraccionamiento cromatogrfico (Swaisgood y Brunner, 1962), el aislamiento de las diferentes casenas ic constituye un problema especial debido a la incorporacin de cantidades variables de residuos de cido silico. La alquilacin bloquea los grupos sulfhidrilo, lo que con propsitos cromatogrficos resulta similar a la reduccin de los grupos disulfuro. Rose y col. (1969) redujeron la casena bruta con mercaptoetanol, alquilaron el producto con iodoacetamida en una columna de DEAE-celulosa y eluyendo las casena con un gradiente continuo de NaC en un tampn tris-citrato-urea, consiguieron separar y cuantificar las fracciones caseinicas a~, 3 y K. Davies y Law (1977) modificaron este procedimiento utilizando Wathman DEll, un intercambiador de mayor capacidad de unin a protenas y mejores propiedades cinticas y eluyendo las casenas con un gradiente lineal de ClNa en un tampn tris-HCI-urea, obtuvieron una estimacin cuantitativa de las principales casenas fraccionadas.
Otra alternativa utifilizada en el fraccionamiento de las casenas, es el uso de

soluciones tampn con urea y mercaptoetanol (Hoagland y col., 1971; Yaguchi y Rose, 1971; El-Negoumy, 1976). Thompson (1966) aadi mercaptoetanol al eluyente, observando que en una columna de DEAS-celulosa, la casena K reducida se separaba de las casenas a5 y 3 a fuerzas inicas bajas (0,005 M NaC). Mercier y col. (1968) y El-Negoumy (1976) emplearon este mismo mtodo variando los eluyentes, obteniendo un fraccionamiento similar de las diferentes fracciones caseinicas. Creamer (1974), utiliz este mtodo para separar la astA de la casena total que contena las variantes A y B. La variante E se degrad con pepsina y la A se aisl de los productos de degradacin, por cromatografa en columna con DEAE-celulosa con un gradiente de CiNa de O a 0,5 M en un

28

Introduccin tampn de 4,5 M urea y pH 5,5, conteniendo un 0,1% de mercaptoetanol. La sustitucin de

la urea por la dimetilformamida tambin se ha utilizado por diversos autores (Yaguchi y Rose, 1971; Mackinlay y Wake, 1965) pero presenta el inconveniente de que libera vapores muy txicos. En los procedimientos descritos anteriormente, se emplearon gradientes salinos a pH constante durante la elucin de las fracciones caseinicas, mientras Vreeman y col. (1977) demostraron una mejor separacin de la casena x en columnas de DEAE-celulosa con un
gradiente de pH en el tampn de elucin. Otro mtodo utilizado ha consistido en la

utilizacin de columnas cromatogrficas en sede. Wei y Whitney (1985) utilizaron un procedimiento en serie para separar la casena entera en 5 fracciones (casenas y, K, 3, a52 y as), facilitando la obtencin de cantidades del orden de gramos de las principales fracciones individuales. La cromatografa de intercambio catinico tambin se ha utilizado en la separacin de las diferentes fracciones caseinicas, Annan y Manson (1969) utilizando columnas de Sulfoetil-Sephadex con un tampn formato, fraccionaron el complejo a~, utilizndose tambin columnas con otras mareices como las de carboxy-metil-celulosa (CMC) y carragenato potsico (Kim y col., 1969, Kopfler y col,, 1969; Snoeren y col., 1977). 11.3.3.3.2. Fraccionamiento por tcnicas cromatogrficas de alta

resolucin
Aunque los mtodos de separacin descritos anteriormente poseen exactitud y
precisin, resultan lentos y requieren disponer de gran cantidad de muestra. Para solucionar

este problema se ha recurrido a la utilizacin de la cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) y cromatografa lquida rpida de protenas (FPLC), utilizando columnas de intercambio inico. Estos procedimientos permiten separar las casenas en pocos minutos, mediante el empleo de grandes presiones y requieren la aplicacin de muy poca cantidad de muestra, obteniendo resultados comparables a la electroforesis en cuanto a la resolucin de los componentes individuales, con la ventaja de permitir su recuperacin para su
caracterizacin ulterior.

Entre los soportes cromatogrficos empleados destacan las columnas de TSK-gel DEAE-5PW (Humphrey y Newsome, 1984; Visser y col., 1986), resistentes en un amplio intervalo operativo (pH 2-12) ; columnas Mono Q FPLC de cromatografa de intercambio

29

introduccin

aninico (Barrefords y col., 1985; Andrews y col., 1985; Dalgleish, 1985; Davies y Law, 1987 y Guillou y col., 1987) y columnas de cromatografa de intercambio catinico Mono S FPLC (Hollar y col., 1991). En la Tabla 11.5., se resumen los mtodos ms utilizados en el fraccionamiento de las casenas, utilizando tcnicas cromatogrficas de HPLC y FPLC. Humphrey y Newsome (1984), utilizando columnas de intercambio aninico TSH-DEAE-5PW y Mono Q HR 5/5, consiguieron mejores resultados que los obtenidos en DEAE-celulosa (Mercier y col., 1968) y en un perodo de tiempo menor (1 hora para TSK y 25 minutos para Mono Q, comparados con las 20 horas para la DEAE). La elucin se realiz con un gradiente lineal de CINa y las muestras de casena se disolvieron en el tampn inicial, despus de adicionar ditiotreitol o mercaptoetanol, para permitir su disociacin y prevenir la agregacin caseinica. Utilizando estas condiciones Andrews y col. (1985) y Guillou y col. (1987), separaron adems de las casenas si. <152 y 3 , 5 6 componentes de la casena K. Adems, utilizando la columna Mono Q HR 5/5, Guillou y col. (1987) separaron la variante C de la casena 13 de las otras variantes (Al, A2 y B) y las variantes A y B de la casena ic, siendo el mtodo empleado reproducible en la cuantificacin de las casenas de la leche de vaca. Tambin es satisfactoria la separacin de las casenas por cromatografa de intercambio inico en fase reversa (Barrefords y col., 1985; Visser y col., 1986 y Mikkelsen y col., 1987), siendo posible con este mtodo una mejor resolucin de las casenas a~ y 52 que con la columna Mono Q (Visser y col., 1986), lo que tambin sucede cuando seutilizan columnas de interaccin hidrofbica (Chaplin, 1986). Actualmente, el desarrollo de nuevos intercambiadores ha hecho posible realizar
separaciones cada vez ms rpidas, al mismo tiempo que permiten el tratamiento de una

gran cantidad de muestra. Ng-Kwai-Hang y Pelissier (1989) utilizando cartuchos de QAE ZetaPrep 250 consiguieron una excelente recuperacin de las fracciones, aunque no resultaron muy eficaces en la separacin de las casenas a~ y a52 entre si. La creciente introduccin de fases estacionarias y eluyente que posibilitan separaciones cada vez ms rpidas, proporcionando fracciones bien resueltas y puras respecto de las casenas individuales, hacen de la cromatografa de intercambio inico el procedimiento idneo de aislamiento y purificacin de las diferentes fracciones caseinicas, lo que posibilatar un conocimiento cada vez ms amplio de sus propiedades f~ico-qumicas.

30

introduccin
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Introduccin

11.4. TIPOS DE CASENAS

El grupo de protenas lcteas denominado casenas, consta de cuatro tipos de polipptidos : si, 52, 3 y ic, adems de algunos derivados procedentes de la proteolisis de estas cadenas,

11.4.1, CASENA a~ Esta casena, junto con las casenas as~ y la [3,forman el grupo de casenas sensibles
al calcio. La casena si es el componente mayoritario en la leche de vaca, mientras la variante B de esta casena ha sido la primera cuya estructura primaria se ha establecido

(Mercier y col,, 1971, Grosclaude y col., 1973). Dicha estructura (Figura 11.5.), consta de 199 aminocidos con un peso molecular de 23.614 daltons y se encuentra formada por das regiones predominantemente hidrofbicas (restos 1-44 y 90-199) y una zona polar muy cargada (45-89). Es relativamente rica en fsforo, 8 tomos por molcula, situndose todos menos uno en el segmento 45-89 y posee un gran nmero de residuos de prolina (8,5%), los cuales se encuentran uniformemente distribuidos a intervalos en los segmentos hidrofbicos, por lo que esta protena puede considerarse como una cadena polipeptidica laxa y flexible, Estas circunstancias permiten la existencia de un numero de grupos no polares, termodinmicamente inestables, expuestos en la superficie, lo que debido a las uniones hidrofbicas provoca la asociacin o formacin de polimeros (Creamer y col,, 1982; Dosaka y col., 1980; Kato y Nakai, 1980). Creamer y col. (1981) y Herskovits (1966) han determinado que la molcula de casena as~ tiene aproximadamente un 70% de estructura desordenada, con una pequea estructura secundaria en forma de a hlice o estructura 13. Esta casena es sensible al calcio al pH normal de la leche, pudindose producir su precipitacin acualquier temperatura, de ah la utilizacin del subndices. En la actualidad se conocen 5 variantes genticas de la casena a~ bovina: A, E y C detectadas por Thompson y col. (1962) y la variante D detectada por Grosclaude y col. (1966), siendo las variantes B y C las ms extendidas; la mutacin responsable de la variante F no se conoce todava. El polimorfismo parece ser especifico de raza, con la variante B predominando en lina 1~nnz y la C en fina j~~jg~ y fina gaanns (Thompson 1971, Grosclaude y col., 1974). En la Figura 11.6., se muestra el polimorfismo gentico de las 6 lactoproteinas mayoritarias bovinas, observndose que en la s las variantes C y D no difieren de la B ms que por la sustitucin de un residuo aminoacidico aminado

34

Introduccin

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Figura 11.5. Estructura primaria de la casena a51 (Withney, 1988)

13-SP

bovina

35

Inroduccin

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192 Gly---Glu
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Deleccin: 14-26 -rA D 53Ala---ThrP

cx -CnC si

Deleccin: 51-59
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122 Ser---Arg 67 Pro---His 106 His---Gln

j3-Cn A2

rA1K
rA3
rE

37 Glu---Lys
35 SerP---Ser

36 Glu---Lys

K-CflA

148 Asp---Ala 136 Thr---Ile

97 His---Arg

C
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155 Gly---Ser

a-LaB

l0Arg--~GIn
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68 Gly---Asp 118 Ala--Val

j3-LgB

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59 Gn--His

45 Glu---Gln

c
D

Figura 11.6. PolImorfismo gentico de las 6 lactoprotefnas bovinas (Martn, 1993)

36

Introduccin

afectando respectivamente a las posiciones 192 Glu---Gly) y 53 Ala---ThrP (Grosclaude y col., 1969; 1972) mientras la variante A se caracteriza por una deleccin en un segmento de 13 aminocidos (residuos 14 a 26, Grosclaude y col., 1970), En la leche existe una pequea cantidad de pptidos, llamados casena X (El Negoumy, 1973), con mapas peptdicos y pesos moleculares idnticos a los producidos por la plasmina de la leche fresca sobre la casena a~ (Aimutis y Bigel, 1982), por lo que dichos pptidos parecen ser fragmentos de la casena a~, los cuales se encuentran en la
leche como resultado de la proteolisis de la casena si por la plasmina.

11.4.2. CASENA x52

Esta familia de casenas posee 5 componentes con movilidades electroforticas entre las de las casenas si y 3 y en la leche de vaca se designaron iicialmente como 52, s3, s4,
55

y a~ o casenas minoritarias segn su movilidad decreciente (Annan y Manson,

1969, Whithney y col., 1976), aunque trabajos posteriores indicaron que todas ellas tienen
la misma secuencia aminoacidica con diferentes grados de fosforilacin post-traduccional (Brignon y col., 1976; 1977). Debido a estas modificaciones post-traduccionales, Eigel y col. (1984) las nombraron como sigue s2 (52. X 13P), ~ (82- X 12P), 84 (52- X 1 1P), y s6 das2. X 1OP), aunque por su composicin aminoacidica y el efecto del mercaptoetanol sobre sus propiedades electroforticas, la a~5 ha sido identificada como un dmero de los componentes hP y 12P, enlazados por un puente disulfuro (Hoagland y col., 1971). La estructura primaria de la casena 82 A-llP (Figura 11.7.), consta de una cadena polipeptdica de 207 residuos aminoacidicos con un peso molecular de 25.230 daltons (Brignon y col., 1977), conteniendo 2 residuos de cisteina y 10, 11, 12 y 13 grupos fosfato. Es la ms hidroflica de todas las casenas y tiene una estructura dipolar manifiesta con las cargas negativas cerca del N-terminal y las positivas cerca del C-terminal. Una pequea proporcin de esta casena aparece como un dmero unido por puentes disulfuro, Sus propiedades no se han investigado con la misma profundidad que las de otras casenas, pero sin duda liga fuertemente el calcio y es ms sensible a la precipitacin por calcio que la as. A pH neutro y en ausencia de calcio se autoasocia, dependiendo la asociacin de la fuerza inica; dicha asociacin, como la de la casena as, se equilibra rpidamente y a medida que aumenta su concentracin origina polmeros de tamao creciente. 37

Introduccin

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Figura 11.7. Estructura primaria de la casena ~ (Witbncy, 1988)

A4iP bovina

38

Introduccin

La casena a52 parece menos polimorfa que la si y en los bvidos slo se han detectado 2 variantes, la A y la D. Las movilidades electroforticas de algunas variantes D son menores que las bandas corvespondienes en la variante A a pH 8,6 <Grosclaude y col., 1978; 1979). Las variantes A y D se han observado en razas europeas (fin& taurus) y se diferencian por una deleccin interna de un segmento de 9 residuos aminoacidicos conteniendo uno de los 2 sitios de fosforilacin mltiple de esta casena.

11.4.3. CASENA fi 2 (Figura 11.8.) indica una cadena polipeptidica de 209 residuos aminoacidicos con un peso molecular calculado de 23,983 (Ribadeau-Dumas y col., 1972, Grosclaude y col., 1973) con 5 fosfoserinas (excepto en una variante) y ninguna cisteina. Adems, dicha casena posee dominios hidrofbicos e hidroflicos claramente separados y es la casena ms hidrofbica con una zona N-terminal cargada negativamente y el resto de la cadena, sin carga neta, rica en residuos hidrofbicos. Esta casena consta de un componente mayoritario, con al menos siete variantes gnicas y 8 componentes minoritarios, los cuales, son fragmentos proteolticos del componente mayoritario.

La secuencia aminoacidica completa de la casena 3 A

En electroforesis alcalina con urea, las variantes A, A2, A3 migran con la misma movilidad pero ms rpidamente que las otras variantes, que lo hacen en el orden siguiente: B > D, E > C (Thompson 1970, Voglino, 1972). Para diferenciar las variantes A, sus movilidades deben determinarse en electroforesis cida con urea (Thompson 1970; Kiddy, 1975), en el que las variantes gnicas se mueven en el siguiente orden: C > E = D > A =E > A2 > A3. Las variantes A son los polimorfos predominantes en todas las especies, as como en las especies del gnero lina investigados (Thompson, 1971). Las variantes A, 13 y C se diferencian de las otras dos (A2 y A3), por una sustitucin His---Pro en posicin 67, mientras la variante 13 se caracteriza por una sustitucin Glu---Lys en posicin 37, lo que conleva la no fosforilacin del residuo Serma 35. La variante A3 se caracterizada por una sustitucin His---Gln, en posicin 106, mientras las 2 variantes ms repartidas en los
bovinos, son la A1 y A2.

La accin de las proteinasas sobre la casena 3 es muy interesante: se sabe desde hace algn tiempo que un grupo de casenas denominadas casenas ~ corresponden a porciones C-terminales de la secuencia caseinica [3, procedentes de la accin de la plasmina sobre la casena 3 en las posiciones 28/29, 105/106 y 107/108. Los fragmentos ms pequeos

39

Introduccin

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Figura .8. Estructura primaria de la casena ~ A2-SF bovina (Withncy, 1988)

40

Introduccin

resultantes de la escisin aparecen en el suero al precipitar la casena por un cido y forman parte de lo que se ha llamado desde hace mucho tiempo fraccin proteasa-peptona del suero. Los fragmentos 1-10 y 1-107 se llamaron componentes 5 del suero, el fragmento 1-28 componente 8 rpido y los 29-105 y 20-107 componente 8-lento del suero.

11.4.4, CASENA K Esta casena por su composicin y las propiedades que de ella emanan, es uno de los componentes ms interesantes de la casena bruta. La familia de la casena ic tal y como se aisla en la leche, comprende una mezcla de polimeros unidos por enlaces disulfuro, siendo la nica glicoproteina del grupo. La forma nativa puede reducirse a un monmero formado por una cadena polipeptidica de 169 residuos aminoacidicos (Figura 11.9.), con dos residuos de cisteina en las posiciones 11 y 88 y uno de fosfoserina en la posicin 149 (y algunas veces en 127) y diversos grados de glicosilacin. Su peso molecular es de 19,007 daltons. La casena ic es pobre en fsforo (0,2%), lo que representa de 1 a 2 tomos de fsforo por molcula. Por el contrario, su contenido en serma y treonina es elevado y es notable la presencia de cisteina. Esta casena como se ha mencionado, es la nica que contiene una fraccin glucsido, formada por una o varias secuencias de acetilgalactosaminagalactosa-cido-N- acetilneuramlnico o silico. Las secuencias gilcosidicas comienzan con la unin de la galactosa al grupo hidroxilo de la treonina, siendo comn la prolongacin de la cadena glicosidica por la unin de otros azcares a la galactosa. Su extremo C-terminal es fuertemente aninico, resultando en una molcula muy anfiptica. La casena ic, que impide la precipitacin de las otras casefnas en presencia de calcio, juega un papel determinante en el mantenimiento de la estructura de las micelas. La hidrlisis del enlace Phe 105-Met 106 (MacDonald y Thomas, 1970; Polzhofer, 1972) por la quimosina, escinde la molcula en dos segmentos peptdicos, la para-K-caseina (1-105>, fragmento N-terminal contiene todos los grupos fosfato y carbohidratos adems de las sustituciones gnicas, con una parte central rica en aminocidos aromticos (fuertemente hidrfoba) y el caseinomacropptido (fraccin 106-169 o 106-17 1 en el caso de la cabra), rica en aminocidos alcohlicos ehidrfila y soluble. La reaccin descrita constituye la base de la coagulacin de la leche por la renina, y por lo tanto, de la fabricacin del queso. La coagulacin de la leche por el cuajo o enzimas de origen fngico depende de numerosos factores (reenfriamiento, contenido en iones calcio, riqueza en casenas, etc.) y de la tecnologa utilizada. 41

introduccin

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(Withney, 1988)

42

Introduccin

De la casena ic bovina se conocen 4 variantes genticas de las que las ms repartidas son la A y la B (Thompson, 1970, Mackinlay y Wake, 1971), siendo la variante A la predominante en la mayora de las razas (Aschaffenburg, 1968). Las variantes A y B se diferencian por 2 sustituciones Asp---Ada en posicin 148 y Thr---Ile en posicin 136, con la ltima mutacion afectando a un sitio de glicosilacin. La introduccin de tcnicas electroforticas ms resolutivas como la del isoelectroenfoque (IEF), ha permitido la deteccin de 2 nuevas variantes: la C (Di Stasio y Merlin, 1979) y la E (Erhardt, 1989), cuya caracterizacin bioqumica es reciente (Miranda y col., 1993), las cuales difieren, respectivamente, de las variantes 13 y A por una sustitucin His---Arg en posicin 97 y otra Gly---Ser en posicin 155.

.5. DIFERENCIAS

EN LA COMPOSICION

CASEINICA

DE LAS LECHES DE VACA, OVEJA Y CABRA

Segn las especies, la composicin de la leche difiere cualitativa y cuantitativamente, segn la especie animal considerada. Se ha determinado que un litro de leche de vaca contiene como trmino medio 32 gIl de protena, que se descomponen en 26 g de casenas (80%) y 6 g de protenas solubles (20%), mientras el contenido total, as como las proporciones relativas de cada casena son caractersticas de la especie. As, en la leche de oveja las casenas representan el 83% y en la de cabra el 77 % de la protena total, Las casenas si, asz. ~3 1< se encuentran en la leche de vaca en las proporciones 4:1:4:1, y respectivamente, mientras que las leches de oveja (2:2:5:1) y cabra (1:2:5:2) se consideran leches ricas en casena 3 (Assenat, 1985; Remeuf y Lenoir, 1986). La composicin de la fraccin caseinica influencia las caractersticas estructurales y las propiedades de las micelas y es responsable de variaciones en sus propiedades tecnolgicas (Remeuf y col., 1989). La informacin disponible sobre las protenas de las leches de oveja y cabra es ms limitada (Ramos y Jurez, 1981; Anifantakis, 1986; Jeness 1980; 1982; Amigo, 1989a), aunque el desarrollo de la tecnologa del DNA recombinante ha permitido dilucidar las estructuras primarias de las protenas de la leche de la mayora de las especies (Bonsing y Mackinlay, 1987). Los estudios realizados con las casenas de la leche de vaca, oveja y cabra (Assenat, 1985; Ono y col., 1989) indican diferencias significativas en la distribucin de las diferentes casenas de la leche, as como en su migracin electrofortica, composicin aminoacidica, composicin de minerales, nmero de residuos, su comportamiento ante la proteolisis y en el nmero de variantes genticas. En un estudio comparativo efectuado entre

43

Introduccin

las leches de vaca, oveja y cabra (Assenat, 1991), se ha determinado que: 1) El porcentaje de casenas ~ y 52 es ms elevado en la leche de oveja que en la de cabra: 30,2% frente al 12,6%, pero ms bajo que en la leche de vaca, en la que representa el 45,5%, 2) en la leche de oveja, las casenas 3 constituyen cerca del 50% de las casenas, mientras en la leche de cabra constituyen los 2/3 dcl porcentaje total y 1/3 en la leche de vaca.
Las diferencias observadas en la composicin de la fraccin caseinica permiten

explicar (Richardson y Creamer, 1974), el que la composicin de las micelas en las tres especies sea similar, aunque existen diferencias en el tamao y distribucin de las submicelas. Las casenas de la leche de cabra contienen un porcentaje menor de cido glutmico que la de vaca, que, por el contrario, posee ms histidina, mientras la mayor concentracin de minerales y la menor hidratacin de la micela de la leche de cabra, le confieren una dbil estabilidad trmica. Asimismo, el contenido de calcio y fsforo de las
micelas de las tres especies son similares y aunque la leche de oveja tiene un contenido en calcio algo mayor que la leche de vaca, los contenidos de calcio y fsforo de las leche de

cabra y vaca, son parecidos (Irlam y col., 1985). Tambin conviene conocer que la leche de oveja es especialmente rica en componentes queseros, ya que es ms rica en casenas totales que la de vaca y cabra (Assenat, 1985). Es
habitual decir que, para cantidades de leche idnticas, se obtiene unas dos veces ms de

queso con la leche de oveja que con la de vaca. La eche de oveja produce una cuajada dura y la pasta es, en general, ms blanca. Las diferencias en las casenas de la leches de diferentes especies, influyen en el tiempo de coagulacin por enzimas y en la firmeza del cogulo. As, la leche de oveja coagula 1,56 veces antes que la leche de vaca y la firmeza del cogulo es 2 veces mayor. Finalmente, el bajo contenido de casenas del grupo s de la leche de oveja se relaciona con la casi ausencia de sabores amargos en los quesos fabricados con esta leche, lo que tambin se observa en la leche de cabra, con un contenido muy bajo de casenas s.

11.5.1. CASENA

cz51

El contenido de casena ~ de la leche de cabra es menor que en la de vaca. Richardson y Creamer (1975) fraccionaron y analizaron los componentes de la casena caprina, encontrando que el componente a~ caprino tena ms homologa con el componente
82 bovino que con el a~, por lo que se pens que esta ltima protena se encontraba

44

Introduccin

ausente de la leche de cabra. Actualmente se conoce por estudios electroforticos (SDS-PAGE alcalina) y de FPLC, que la variabilidad existente en la literatura sobre el porcentaje de esta casena (5%-25% de la protena total), se debe a que en la cabra el locus a~ es extremadamente polimorfo y se encuentra asociado a una variabilidad allica cuantitativa (Boulanger y col., 1984; Grosclaude y col., 1987; Mah y Grosclaude, 1989; Law y Tziboula, 1992), con al menos 7 alelos que se distribuyen en 4 clases cuantitativas. Tambin se conoce que los alelos ~ A, B, C se encuentran asociados a una tasa elevada de casena a~ (3,6 g/por alelo), el alelo
~i

E se asocia a una tasa media (1,6 gIl, por

alelo), los alelos si E y D se encuentran asociados a una tasa reducida (0,6 g/l, por alelo) y el alelo si O confiere el fenotipo nulo, es decir, que la leche de animales homocigotos para el alelo O/O en el locus a~, carece de casena as (Martn, 1993). Asimismo, la variacin en la cantidad relativa de casena s de la leche de cabra, origina una variacin considerable de las cantidades relativas de as2, 3 y x. Generalmente, si el contenido de ~ se incrementa, el de la casena ic tambin es importante; sin embargo, si la muestra contiene as E el contenido de casena x se reduce, aumentando el contenido de casena 3, En la Tabla 11.6., se muestra la composicin caseinica de las leches de vaca, oveja y cabra determinada por FPLC en columnas Mono 8.
La estructura primaria de las variantes de la casena si caprina ya se conoce (Brignon

y col., 1989; 1990). Las variantes A, B, C y E se diferencian slo en algunas sustituciones aminoacidicas, mientras que la~ variantes D y E presentan alteraciones estructurales ms profundas, como 2 delecciones enteras de 11 y 37 aminocidos, respectivamente, incluyendo el lugar de fosforilacin mltiple de esta casena (Figura 11.10.). La variante A se diferencia de la 13 por las sustituciones Pro---Leu en posicin 16 y Glu---Gln en posicin 77, las variantes C y E poseen un residuo lisina en posicin 100 y un residuo alanina en posicin 195, mientras que los otros alelos presentan, respectivamente, en estas 2 posiciones un residuo Arg y uno Thr. La variante C, se diferencia de las otras por la presencia de un residuo isoleucina en posicin 8. En la leche de oveja se han detectado electroforticamente varios componentes de la casena
~,

algunos de los cuales pueden ser variantes genticas y que se han identificado

como componentes caseinicos as, asa y as~; su composicin en aminocidos es idntica entre si (difieren slo en un grupo fosfato) y similar a la si bovina, pero se diferencian de sta por su mayor sensibilidad al calcio (Richardson y Creanier, 1976>. Por otra parte, el
45

Introduccin

Tabla 11.6. Composicin Caseinica de las Leches de Vaca, Oveja y Cabra, determinada por FPLC en Columnas Mono 5

VACA

OVEJA

CABRA

CASEINA

% CASEINA TOTAL

a51 a52

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1C

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2,8

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6,9- 15

Fuente: Law y Tziboula, 1992

46

Introduccin

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64 Glu---Lys 62 SerP---Ser
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B C

167 Lys---Ile 77 Glu---Gln Deleccin: 59-69 A Deleccin: 59-95

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100 Arg---Lys 195 Thr---Ala

13-Cn A, B, O tc-Cn A, B a-La A, B 13-Le A, B

Figura iria Polimorfismo gentico de las 6 lactoproteinas caprinas (Martn, 1993)

47

Introduccin

componente 82 presenta 11 residuos aminoacidicos diferentes respecto de la variante gentica a~ B bovina, mientras el componente 53 presenta 12 residuos diferentes si se compara con la misma variante (Jeness, 1982). Al evaluar la accin de la quimosina en la casena s de las leches de vaca y cabra, Addeo y col. (1988) determinaron que la si bovina es ms sensible a la accin de la

y 3, que la casena si de cabra se hidroliza cerca de la regin N-terminal (igual a la de vaca) y que los productos de degradacin son iguales en ambas
quimosina que las
52

casenas; tales productos se conocen como pptidos si-I, cuya formacin se debe a que el

enlace peptidico Phe (23)-Phe (24) de la casena s bovina, es tan lbil a la quimosina como el enlace Phe (23)-Val (24) de la casena caprina.

11.5.2. CASENA asz

de la leche de cabra es tambin polimorfa y se encuentra en mayor proporcin que en la leche de vaca. Su estructura primaria se diferencia de la de vaca por
52

La casena

una insercin de un residuo Asn entre los residuos Ile 14 e Ile 15 de la casena

52

bovina,

por lo que su composicin aminoacidica es de 208 aminocidos (uno ms que en la bovina). De esta casena se conocen dos variantes, A y 13 detectadas por Boulanger y col, (1984) y cuyo anlisis bioqumico indica que las sustituciones aminoacdicas que las diferencian son una sustitucin Glu---Lys en la posicin 64, que afecta a un lugar de fosforilacin (Ser 62)
y una sustitucin Lys---fle en posicin 167 (Bouniol y col., 1993).

11.5.3. CASENA 13

Es la protena mayoritaria de la leche de cabra, encontrndose en mayor proporcin que en la leche de vaca. Su estructura primada se diferencia de la de vaca por una deleccin del dipptido Pro 179-Tyr 180, destacando de la casena 3 caprina, que al contrario que su homloga bovina, existe bajo dos formas Pi y 32 (Richardson y Creamer, 1974), en proporciones sensiblemente iguales y que no difieren ms que en el nmero de residuos fosforilados (6 para la 3 y 5 para la 32 ). Esta casena se ha considerado monomorfa durante mucho tiempo, hasta que DalOlio y col. (1989) determinaron la existencia de un alelo probablemente nulo. Recientemente, Mah y Grosclaude <1993) han detectado la existencia de 4 alelos diferentes de esta casena.

48

Introduccin

La casena 3 de la leche de oveja, al igual que su homloga caprina, tiene 2 componentes con la misma composicin aminoacidica, que slo se diferencian porque la Pi tiene un grupo fosfato ms que la 32 y es ms sensible a los iones calcio (Richardson y col., 1978), mientras su secuencia aminoacidica se diferencia de su homloga bovina en al menos 15 aminocidos (Richardson y Mercier, 1979). De la leche de oveja tambin se han aislado protenas similares a las yde la leche de vaca (Jeness, 1982).

11.5.4. CASEINA ic
La casena c caprina consta de 171 aminocidos frente a los 169 de su homloga bovina, debido a la insercin de un dipptido Val-His entre los residuos Thr-131 y Ser-132. Los 2/3 de las diferencias observadas entre las casenas K bovina y caprina, se localizan en la zona C-terminal de la molcula correspondiente al caseinomacropptido (bovino 106-169

y caprino 106-17 1), es decir, en la regin ms hidrfila de la molcula que se libera en la coagulacin enzimtica de la leche por la quimosina (Figura 11.11.), Se conocen dos variantes genticas de la casena c caprina, que se diferencian por una sustitucin localizada en la porcin N-terminal de la molcula (para-K-caseina) y que se denominan A y B por analoga con las variantes bovinas (Di Luccia y col., 1990). Adems, debido a la glicosilacin de esta casena, Addeo y col. (1988) identificaron al menos 5 formas diferentes en la especie caprina. Alais y Jolles (1967), encontraron algunas diferencias en la casena ic ovina en relacin a la bovina, tanto en la composicin aminoacidica, como en el grad de glicosilacin; sin embargo ambas comparten el papel estabilizador de la estructura micelar. Las para-K-caseinas de vaca, oveja y cabra se han secuenciado completamente, con diferencias en la posicin de algunos aminocidos en la de entre vaca-oveja, vaca-cabra y oveja-cabra (Tabla 11.7.). La sustitucin de aminocidos en las para-ic-caseinas bovina, caprina y ovina, principalmente en la posicin 19 (Ser en bovina y Asp en ovino) hace que la carga negativa aumente de la bovina a la caprina, siendo intermedia en la ovina, lo que permite diferenciarlas por isoelectroenfoque (Amigo, 1989a). La estructura correspondiente del enlace sensible a la quimosina se encuentra conservado en las 3 especies (Mercier y col., 1976).

49

Introduccin

NH 2

COOH

Figura fUl. Comparacin de las secuencias aminoacdicas de las casenas wc Bovina y Caprina (Martn, 1993)

50

Introduccin

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5I

Introduccin

11.6. OTRAS PROTEINAS LCTEAS

11.6.1. PROTENAS DEL LACTOSUERO

El trmino protenas del suero se emplea para designar aquellas protenas solubles a pH 4,6 y 20 0C, que se caracterizan por ser protenas globulares sujetas a la desnaturalizacin por calor. No obstante, tambin se incluyen bajo esta denominacin fragmentos de la casena 3, como las proteosas-peptonas 5, 8-lento y 8-rpido, que son estables al calor y se encuentran formando parte de las micelas de casena al pH normal de la leche (Eigel y col., 1984). Las protenas ms significativas de este grupo: -lactoalbmina, 3-lactoglobulina, seroalbmina e inmunoglobulinas son protenas globulares debido a la distribucin uniforme de sus restos polares y no polares, a la ausencia de fsforo y a su bajo contenido en prolina. Estas caractersticas, unidas a un alto contenido en cistina, cisteina y metionina, hacen que sean ms inestables trmicamente que las casenas y que al calentar la leche pierden solubilidad (Walstra y Jeness, 1987). Las protenas citadas no estn sometidas a las modificaciones post-traduccionales que sufren las casenas (glicosilacin y fosforilacin), aunque se conocen variantes genticas de la -lactoalbmina y la 3-lactoglobulina (Grosclaude, 1988). La separacin de los componentes individuales de las protenas del suero, se realiz originalmente por fraccionamiento, debido a diferencias de solubilidad y por cristalizacin. Actualmente, los mtodos de fraccionamiento preferidos, tanto con fines analticos como preparativos, son los de cromatografa de filtracin en geles y de intercambio inico. 11.6.1.1. 3-LACTOGLOBULINA La 3-lactoglobulina por sus caractersticas estructurales y su aptitud para fijar el retinol, parece ser que estara implicada en el transporte de este precursor de la vitamina A hacia unos receptores situados en la superficie de las clulas de las vellosidades intestinales (Papiz y col., 1986; Monaco y col., 1987>. Es la protena soluble cualitativamente ms importante, ya que se encuentra en la leche a una concentracin de unos 3 gIl, tiene 162 aminocidos y un peso molecular de 18,277 daltons (Grosclaude y col,, 1976), con 5 cisteinas que le permiten crear puentes disulfuro (-S-S- ) intra o intermoleculares, que estabilizan la dimerizacin de esta protena al pH normal de la leche. La unin entre la casena ic y la 3-lactoglobulina de la leche calentada, se debe a un enlace disulfuro entre estas dos molculas. En la [3-lactoglobulina han detectado 4 variantes genticas, seconoce que se la variante B se diferencia de la C por una mutacin en la posicin 59 (Gln---His); de la D 52

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por una sustitucin en la posicin 45 (Glu---Gln) y de la variante A por dos mutaciones en las posiciones 64 (Gly---Asp) y 118 (Ala---Val).

11.6.1.2. rt-LACTOALBUMINA

La cz-lactoalbmina interviene en la sntesis de la lactosa, al modificar la actividad de

la galactosiltransferasa, permitiendo que la uridn difosfato (UDP)-galactosa con la glucosa origine la lactosa (Ebner y Brodbeck, 1968; Rood y Thomas, 1980). Esta protena se encuentra en la leche de vaca an una concentracin de 0,7 gIl. La variante B consta de 123 aminocidos, de los que 8 son cisteinas, que forman 4 puentes disulfuro y tiene un peso molecular de 14, 174 da]tons. La variante A difiere de la E por una sustitucin aminoacidica en la posicin 10 (GIn en la A y Arg en laR). 11.6.1.3. ALBUMINA SERICA BOVINA Esta protena, uno de los componentes mayoritarios del suero sanguneo, que se sintetiza en el hgado y llega a la leche por las cllulas secretoras supone solamente el 1,2%, aproximadamente, de las protenas lcteas totales, siendo idntica en todas las propiedades a la albmina del suero sanguneo (Polis y col., 1950). Su estructura primaria consta de 582 aminocidos con un peso molecular de 66,267 dalbons (Brown, 1975; Reed y col,, 1980). Se desconoce la funcin especfica que pueda desempear en la glndula mamaria, y es poco lo que se sabe de su comportamiento en la leche y en los productos lcteos as como de su posible influencia en las propiedades de estos alimentos. 11.6.1.4. INMI.I=1QGLOIIIILINS Estas protenas no son especificas de la secrecin lctea, puesto que se sintetizan por los linfocitos B(Ribadeau-Dumas, 1981) y se transportan por la sangre a todos los fluidos del cuerpo. Todas las inmunoglobulinas son glicoproteinas, que son monmeros o polimeros de una molcula de cuatro cadenas formada por dos cadenas ligeras (20,000 peso molecular) y dos cadenas pesadas (50,000-70000) unidas por puentes disulfuro (Buter, 1974; Lascelles, 1977). Las principales inmunoglobulinas en la leche son la IgM, la IgA y la IgO, que es la mayoritaria (Guidry y col., 1980),

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11.6.2. PROTENAS DE LA MEMBRANA DEL GLOBULO GRASO

Los glbulos grasos de la leche estn rodeados de una fina membrana (King, 1955>, formada por una mezclacompleja de lpidos y protenas y aunque algunas de estas protenas son enzimas, es todava difcil estimar la proporcin de componentes enzimticos y no enzimtico. Dichos glbulos contienen un 50% de protena, lo que supone, aproximadamente, un 1% del total de la protena de la leche. Las protenas de la membrana del glbulo graso son difciles de resolver y separar analticamente, porque interactan fuertemente entre si y con los lpidos; la mayora son insolubles. 11.6.3. PROTENAS MINORITARIAS En la leche existen pequeas cantidades de dos protenas ligantes de hierro: la transferrina y la lactoferrina, que son cadenas polipeptdicas sencillas de peso molecular de 600 a 700 daltons y que ligan dos moles de hierro por molcula (Jeness, 1982). La transferrina parece ser idntica a la existente en el plasma sanguneo y su peso molecular es de 75,000 a 77,000 daltons (Leger y col., 1977), mientras la lactoferrina tiene un peso molecular, que vara segn los autores, de 77,000 a 93,000 daltons (Leger y col., 1977). Ambas protenas son significativamente diferentes, tanto en su composicin aminoacidica como inmunolgicamente (Gordon y col,, 1963). Otras protenas minoritarias del suero de la leche son la familia de las M-I glicoproteinas aisladas por Bezkorovainy (1965; 1967) de la leche y el calostro; una protena ligante de cobre se detectable por inmunodifusin (Hanson y col., 1967); un inhibidor de la tripsina encontrado en el calostro (Laskowski y Laskowski, 1950; 1951); un quiningeno aislado del suero de la leche por Leach y col. (1967) y una protena ligante de folato (FBB), aislada de la leche de vaca (Salter y col., 1972).
11.6.4. ENZIMAS

En la leche se han detectado numerosos enzimas, asociados a las micelas de casena, a los glbulos grasos o a los leucocitos, mientras otros se encuentran dispersos en el suero. Una descripcin ms detallada de los mismos puede encontrarse en Walstra y Jeness (1987). En el caso que nos ocupa, merece destacarse que la actividad del enzima xantln-oxidasa es 10 veces superior en la leche de vaca que en la de cabra, por lo que esta caracterstica se ha empleado para diferenciar las leches de ambas especies (Amigo, 1989a).

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11.7. QUESOS Segn el Real Decreto 503/1086 del 21 de febrero de 1986 (B.O.E., 14/11111986), los quesos se definen como: El producto fresco o madurado, slido o semislido, obtenido por separacin del suero despus de la coagulacin de la leche natural, de la desnatada total o parcialmente, de la nata, del suero de mantequilla o de una mezcla de algunos o de todos estos productos, por la accin del cuajo u otros coagulantes apropiados, con o sin hidrlisis previa de la lactosa. Asimismo, se entiende por queso fundido: El producto obtenido por molturacin y/o mezcla, fusin y emulsin con tratamiento trmico de una o ms variedades de queso con o sin la adicin de agentes emulgentes, de leche y productos lcteos y de otros productos alimenticios. 11.7.1. CLASIFICACION DE LOS QUESOS ESPAOLES Espaa es un pas de contrastes que sin duda se reflejan en su cultura, sus gentes y como, expresin gastronmica, en sus quesos. De la complejidad de la elaboracin de los quesos y de los factores a considerar en la descripcin de los mismos, es comprensible que resulte difcil establecer una clasificacin general de todos los tipos de quesos. Por ello, existen varios criterios para su clasificacin. Una modalidad muy extendida es la basada en el tipo de leche utilizada en su elaboracin, por lo que puede hablarse de queso de vaca, oveja o cabra. Sin embargo, el criterio de clasificacin ms aceptado es aquel que se establece en funcin de su maduracin: quesos frescos y quesos fermentados, maduros o curados. La legislacin espaola, consciente de la dificultad de los criterios de clasificacin pero a su vez considerando necesario establecer unas normas mnimas de regulacin de la calidad, ha establecido una clasificacin basada en uno de los componentes del mismo: el contenido graso. Siguiendo este criterio, la legislacin espaola los clasifica los quesos de la forma siguiente: a) Extragraso: contenido en grasa sobre extracto seco como mnimo del 60%; b) Graso: contenido graso mnimo del 45% sin llegar al 60%; c> Semigraso: mnimo del 25% sin llegar al 45%; d) Semidesnatado: mnimo del 10% sin llegar al 25% y e) Desnatado: menor del 10%. De entre los numerosos sistemas de clasificacin de los quesos, que obedecen a criterios distintos, nosotros vamos a seguir una clasificacin comercial (Herrero, 1992) por ser prctica y sencilla (Tabla 11.8).

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Tabla 11.8. Quesos Espalioles TIPO DE QUESO VACA

Fr~cos Burgos

ESPECIE PRODUCTORA OVEJA CABRA Alicante

Cdiz

MEZCLA Cassoleta La Nucia Mat Pido Pornia TeneHfe Beyos Flor de Gula Quesuco Servilleta

Villaln

Camerano Murcia

Cantabria (D. O.) AIuegal Pitu Ulloa o Arzda Cebreiro Del Len Pasiego La Selva TeUlla Vidiago Semicuradosv
curados

La Bureba Cceres Torta delCasar

Babia Laclana Garrotxa Miaga La Vera

Benasque Casin Mahn (D. O,) San Simn Valle de Arn

Anso-Hecho Castellano Idiazba] (D. O.) Manchego (1). 0.) Oropesa Pedroches Roncal <D. O.) La Serena Serrat Zamorano

Acebuche Ahumado de Aliva Albarracn La Calahorra Alhama de Granada Genes toso de la Gomera Aracena C}razalema Bu elles Herreno Conejero Mallorqun Gata.Hurdes Peflamellera Ibores Tronchn Majorero Ibrico Montsec Hispnico Murcia al vino De la Mesta Balmero Quesalla Siena Morena Titar Vaidetejo

Azules
esreciales

Cabrales (D. O. ), Gamonedo, La Peral, Picn, Valden, La Armada, IJrbMs, Cremas de Queso Azul (Valden), Cremas de coagulacin lctica con o sin sabores, con especias, etc, sabores, con especias, etc.

D.O. : Denominacin de Origen Fuente: Herrero, 1992 56

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11.7.1.1. OUESOS DE ESPAA CON DENOMINACION DE ORIGEN Y GENERICA Para proteger nuestros productos y asegurar la calidad de los quesos, en Espaa se han creado las Denominaciones de Origen, definidas segn ley 25/1970 en su artculo 69 como: Se entiende por denominacin de origen el nombre geogrfico de la regin, comarca, lugar o localidad empleado para designar un producto procedente de la respectiva zona, que tenga cualidades y caracteres diferenciales debidos principalmente al medio natural y a su elaboracin, De esta definicin se desprende que ha de existir una doble conexin entre el nombre geografico constitutivo de la denominacin de origen y el producto diferenciado por ella. Por tanto, ese nombre geogrfico ha de emplease para designar quesos producidos exclusivamente en la regin o comarca que le da nombre y, adems, dicho queso deber poseer determinadas cualidades y caracteres que han de ser debidas principalmente a ese medio geogrfico. Esquemticamente, se puede decir que los criterios generales a tener en cuenta para el reconocimiento y reglamentacin de una denominacin de origen son: a) La existencia de un queso conocido por el nombre geogrfico de su regin de procedencia; b) La delimitacin de una zona de produccin; c) El empleo de unos mtodos de produccin y elaboracin tradicionales y locales; d) La presencia en el queso de unos caracteres diferenciales, ligados a la zona de produccin y a los sistemas de elaboracin locales, y e) Un sistema de control y garanta suficiente. Para asegurar el cumplimiento de estos criterios, cada denominacin de origen est regulada por un Reglamento, aprobado por la Comunidad Autnoma correspondiente y ratificado por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin. Este reglamento establece la composicin y fundamento del Consejo Regulador, que es el rgano interprofesional encargado del control y la defensa de la denominacin de origen. En la Tabla 11.9,, hemos recogido los quesos de Espaa con Denominacin de Origen y Genrica.

11.7.2. LA LECHE PARA LA FBRICACION DEL QUESO

La leche de todos los mamferos puede destinarse a la produccin de quesos, pero por razones puramente prcticas, la leche de los mamferos domsticos ha dominado la produccin quesera. La fuente primaria depende de la zona de produccin, ya que mientras la leche de vaca domina la produccin en las zonas llanas, en las zonas de montafta se utiliza la leche de oveja o de cabra en la produccin de quesos. Aunque existen diferencias de composicin de la leche dependiendo de la especie productora,lo que puede afectar la

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Introduccin

Tabla 11.9. Quesos Espafloles con Denominacin de Origen y Genrica QUESO ZONA LECHE ORDEN MINISTERIAL

Roncal Mahn Cabrales

Navarra (valle de Roncal)

Menorca

Oveja (Rasa y Lacha) Vaca (cruda o pasterizada)

11/3/91
24/11/93 29/6/90

Cabrales y algunas localidades Mezcla (vaca, oveja y cabra) de Peflamerana Alta

Cantabria

Cantabria, excepto las cuencas Vaca (Frisona pasterizada) hidrogrficas de Urdn y Cervera Ciudad Real, Albacete, Cuenca
y Toledo

29/10/85

Manchego

Oveja (Manchega)

21/12i84

Idiazbal

Pas Vasco

Oveja (Lacha y Carranzana) Oveja (Chorra y Merina) Oveja (Merina), leche cruda o pasterizada Bovina (Tudanca, Pardo Alpina
y Frisona); Ovina (Lacha); Caprina

30/11/93
6/5/93 14/4/9 3

Zamorano La Serena

Zamora Comarca de La Serena

Picn-Bejes-Tresvijo

Comarca de Libana

6/10/87

Quesucos de Libana

(Pirenaica y Cabra de los Picos

de Europa>

Fuente: Industrias Lecheras, 1993

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!ntroduccin

calidad del queso producido, en muchos aspectos las leches tienen mucho en comn. Las dos formas mayoritarias de protenas de la leche (casenas y protenas del suero) son esenciales en la fabricacin del queso y, de estas dos, la fraccin caseinica es la ms

importante. Las casenas no slo representan aproximadamente el 70-80% de las protenas de la leche sino que, adems, forman la matriz de la cuajada quesera y en ltima instancia el queso por si mismo. Slo si el queso procede de leche sometida a ultrafiltracin o a tratamientos severos de calor, las protenas del suero se consideran una fraccin importante. En el primer caso, las protenas sricas quedan atrapadas duranteel procesado de la leche, mientras que en el segundo son desnaturalizadas y se adsorben en la superficie de las casenas (Robinson, 1995). La fraccin caseinica consta de cuatro tipos de protenas y cada una de ellas es una fosfoproteina diferente, La presencia de residuos fosforilados es importante por dos razones: a) influencia los puntos isoelctricos alrededor de pH 4.5-5.0, y b) los residuos fosforilados pueden unirse a los iones calcio. Las molculas de casena permanecen aisladas o combinadas con iones calcio o fosfato clcico, formando las llamadas micelas de casena. Estos complejos contienen miles de unidades de casena y la parte central de los mismos est formada por casenas a y ji, mientras que en la superficie se encuentra la casena i< (Dalgleish y col., 1989). Es la presencia de la casena ic hacia el exterior de las micelas, lo que impide que las a y ji casenas formen agregados y precipiten espontneamente. Por otra parte, cuando se produce la coagulacin de la leche durante la fabricacin de queso, el enzima quimosina, presente en el cuajo, escinde la casena c, dejando a las otras casenas desprotegidas. Corno consecuencia, las micelas comienzan a agruparse en presencia de iones calcio. El efecto de este enzima sobre las otras casenas es despreciable en un perodo de tiempo corto, pero en quesos con un periodo de maduracin largo las casenas a y ji pueden ser hidrolizadas por enzimas proteoliticos, presentes en el cuajo con la quimosina. Esta accin puede ser importante en relacin con el desarrollo del sabor (Fox, 1989), lo que tambin depende de la especie lechera. En la leche de vaca, las casenas a5j y ji son los componentes mayoritarios, pero en la leche de oveja y de cabra las dos formas de casena ji son las principales fracciones y, ambas, son diferentes a la casena ji de la leche de vaca, Asimismo, la casena as2 se encuentra en mayor proporcin en las leches de oveja y cabra que en la de vaca y estas diferencias pueden ser importantes en el sabor de un queso determinado. Cuando en la legislacin de los quesos se utiliza slo la coagulacin cida, como sucede en la India y Sudamrica la casena ic permanece intacta y es la inestabilidad de las casenas alrededor de su punto isoelctrico lo que determina su precipitacin. El resultado es un gel blando manipulable para modificar las propiedades organolpticas del

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Introduccin

producto final. La naturaleza de las casenas es importante respecto de la fuerza (resistencia) del gel; las casenas 3 que dominan en la leche de cabra, originan un gel ms fuerte que el obtenido con la leche de vaca (Robinson, 1995). El otro componente mayoritario de los quesos es la fraccin lipidica, en la que algunos valores tpicos de esta fraccin en las diferentes especies lecheras son: leche de vaca 3,5-5,0%, leche de oveja 5,8-9% y leche de cabra 2,8-6,5% (Tamime y col., 1991). La fraccin lipidica est formada mayoritariamente por triglicridos, aunque los cidos grasos libres estn ampliamente repartidos por la leche, Durante la fabricacin del queso, los lpidos de la leche son retenidos junto con las protenas, por lo que en los quesos de pasta dura alrededor del 45% de los slidos totales corresponde a la grasa, mientras el resto son protenas con niveles bajos de lactosa y sales minerales. Aunque la mayora de la lactosa se pierde con el suero durante la fabricacin del queso, este disacrido es esencial durante los primeros estadios de la fabricacin quesera, ya que este azcar es utilizado por los cultivos iniciadores en la produccin de cido lctico. La lactosa soporta, al menos en parte, el crecimiento de los mohos, levaduras y bacterias asociadas con la maduracin de variedades queseras como el Erie, as como el de las bacterias formadoras de gas en los quesos con ojos. Algunos minerales, como el calcio y el fsforo, son tambin esenciales en la coagulacin de la leche y los iones calcio en particular juegan un papel importante en la agregacin de las micelas de casena, lo que hace que el queso sea una fuente excepcional de calcio en la dieta (Robinson, 1995).
11.7.3. COMPORTAMIENTO DE LAS PROTEINAS LACTEAS

DURANTE LA FABRICACION

DEL QUESO

Las diversas fases de elaboracin de los quesos influyen decisivamente en la estructura y conformacin de las prteinas de la leche y, en particular, de las casenas. Durante la transformacin de la leche en queso, ocurre una deshidratacin en la que la grasa y las protenas se concentran de 6 a 10 veces, dependiendo de la variedad. La deshidratacin se consigue mediante una coagulacin cida o isoelctrica de la casena, aunque la mayora de los quesos madurados proceden de una coagulacin enzimtica producida por el cuajo. La proteolisis, adems de ejercer un papel fundamental durante la manufactura, se considera por muchos autores como el proceso ms importante en el desarrollo del sabor y la textura del queso, con la excepcin de los quesos azules y algunas variedades italianas, en los que predomina la lipolisis y la oxidacin de los cidos grasos, aunque la proteolisis tambin es importante (Fox, 1989).

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Introduccin

11.7.3.1. COAGULACION La coagulacin consiste en la conversin de la leche lquida en un gel, lo que se debe a la ruptura del equilibrio coloidal en el que se encuentran las partculas de fosfocaseinato clcico, lo que origina que precipiten las micelas de casena y formen un gel tridimensional que retiene grasa, agua, sales, etc. La coagulacin puede ser por acidificacin (coagulacin cida) o por la accin de enzimas coagulantes (coagulacin enzimtica) (Lpez-Fandiflo, 1992). La coagulacin cida se produce por una disminucin progresiva del pH de la leche, debido al cido lctico originado por la degradacin microbiana de la lactosa por las bacterias lcticas o por la adicin a la leche de un cido mineral u orgnico. El descenso del pH disminuye la ionizacin de los radicales cidos de las casenas, con un desplazamiento progresivo del calcio y del fosfato inorgnico de las micelas hacia la fase acuosa (lactosuero) y una desmineralizacin de las mismas a PH menores de 5. La salida del calcio y del fosfato, se acompafla de una desintegracin de la estructura micelar (Brule y Lenoir, 1990), La temperatura ptima del proceso es de 200C y la velocidad de acidificacin debe ser progresiva, si se desea obtener un cogulo liso y homogneo. La coagulacin enzimtica la realizan muchos enzimas proteoliticos, pero el que se utiliza ms frecuentemente es el cuajo de rumiantes lactantes (cabritos, terneros y corderos) cuyo principio activo mayoritario es la quimosina o renina. La coagulacin de la leche por el cuajo se considera un proceso constituido por dos etapas. La primera comprende la ruptura enzimtica de la casena ic en para-ic-caseina y pptidos. La casena ic se hidroliza por la ruptura del enlace PhelO5-MetlO6, que es el ms susceptible a la hidrlisis por proteinasas cidas que cualquier otro dentro de las protenas lcteas; se cree que, la estructura que lo rodea es tambin importante para una ruptura eficaz por los enzimas proteoliticos (Fox, 1989). La ruptura de este enlace divide a la protena en dos partes muy diferentes, la para-tc-caseina (1-105), ligeramente catinica a pH 6,6, hidrofbica, pero soluble y que posee una estructura secundaria relativamente estable y lo que se conoce como caseinomacropptido o glicomacropptido (GMP), polar, poco estable y que contiene todas las modificaciones post-translacionales y genticas; su contenido en aminocidos y azcares lo hacen fuertemente polar, por lo que difunde hacia la fase acuosa, eliminndose duranteel desuerado con el suero de quesera (Swaisgood, 1982>. La hidrlisis de la casena ic depende de muchos factores como el pH, la fuerza inica, la temperatura, el grado de glicosilacin o el tratamiento trmico de la leche.

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Introduccin

La segunda etapa deriva de que la proteolisis de la casena ic reduce el potencial zeta y la estabilizacin estrica de las micelas de casena. La prdida del caseinomacropptido, que posee la mayor parte de la carga negativa de la molcula, convierte la superficie de la micela, donde permanece la para-K-caselna en una zona muy hidrofbica. Cuando el 85% de la casena ic se ha hidrolizado, las micelas comienzan a agregarse y gelificar en presencia de calcio y a temperaturas superiores a los 200C (Dalgleish, 1987). La cuajada enzimtica es de consistencia blanda, gelatinosa, flexible, elstica, compacta, casi impermeable y expulsa el suero al fraccionara. La cuajada idnea es, en la mayora de los casos, la que posee propiedades intermedias entre el cohgulo enzimtico y el cido. La produccin de cido lctico por las bacterias del fermento tiene numerosas repercusiones (Amigo, 1989b): proporciona el pH adecuado para la accin del cuajo, facilita la expulsin del suero (lo que determina el nivel de humedad durante la maduracin); mantiene los niveles de cuajo residual en al cuajada y controla, tambin, los de la plasmina retenida; confiere a la cuajada ciertas caractersticas fsicas de las que depende la textura final, controla el crecimiento microbiano e influye en la actividad de los enzimas que participan en la maduracin. 11.7,3.2. MADIIRCIQN Los procesos proteolfticos que tienen lugar durante la maduracin, adems de contribuir al gusto y aroma del queso, potencian el sabor al favorecer la liberacin de compuestos spidos durante la masticacin. Por otra parte, determinan el desarrollo de la textura, debido a la ruptura de la malla de casena y al aumento de pH que originan a travs de la formacin de amoniaco (Figura 11.12.). En el queso viene la actividad proteolitica determinada por los agentes proteoliticos presentes (bacterias del fennento y sus enzimas, proteasas lcteas nativas, enzimas exgenos aadidos como coagulantes y las proteasas producidas por las bacterias contaminantes) y por las condiciones fsico-qumicas del proceso de maduracin (relacin sal-humedad, temperatura, pH, potencial de xido-reduccin y el contenido de calcio) (Lpez-Fandiflo, 1992). 11.7.3.2.1. Accin del cuajo Durante la maduracin de los quesos, el agente coagulante enzimtico hidroliza los
enlaces Phe23-Phe24 o Phe24-Val25 de la asl, dando lugar al pptido a 5~-I (Creamer y

Richardson, 1974; Hill y col., 1974), cuya concentracin aumenta con la edad del queso

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(Creamer y Richardson, 1974), aunque simultneamente sufre degradaciones posteriores por el cuajo u otras proteasas, llegando incluso a desaparecer al final de la maduracin (Reville y Fox, 1978). En el caso de la quimosina, las otras fracciones caseinicas resultan ms resistentes a la proteolisis, destacando dos factores (Visser, 1981): la especificidad del enzima (que ataca fundamentalmente los enlaces Leu-X y Phe-X) y la accesibilidad del enlace peptidico. El nivel de NaC induce la agregacin de la casena 3 y reduce la disponibilidad de los enlaces de esta protena sensibles a la quimosina. lo que en el caso de la casena as, depende de su grado de entrecruzamiento por la formacin de enlaces disulfuro. Tanto la czs2 como la para-ic-caseina, son resistentes a la quimosina (Green y Foster, 1974). El tipo de coagulante utilizado posee gran importancia, sobre todo en lo que respecta a la textura del queso (Birkkjaer y Johnk, 1985). 11.7,3.2.2. Proteasas nativas de la leche De modo natural, la leche contiene una proteasa alcalina y, en menor proporcin, una proteasa cida y aminopeptidasas, pero es la proteasa alcalina o plasmina, la que ejerce una actividad predominante. En la leche fresca, la plasmina se encuentra asociada a las micelas de casena, disocindose a medida que disminuye el pH (Richardson y Elston, 1984). Cuanto menor es el pH durante el desuerado, menos plasmina quedar retenidaen el queso. La plasmina es la responsable de la ruptura inicial de las casenas, sobre todo en quesos cuya cuajada se calienta, inactivndose el cuajo (Matthesson, 1981). En casi todos los tipos de quesos se acumulan importantes cantidades de casenas y, lo que es indicativo de la actividad de la plasmina, aunque este enzima es particularmente activo en aquellas variedades cuyo pH aumenta durante la maduracin (Trieu-Cuot y Oripon, 1982). El hecho de que el pptido 81-1 se encuentre en todos los tipos de quesos durante las primeras etapas de la maduracin, incluso en aquellos en los que el cuajo es inactivo, se atribuye a la accin de la proteasa cida de la leche, cuya especificidad hacia las casenas es similar a la del cuajo (Kaniinogawa y col., 1980). 11.7.3.2.3. Proteasas de las bacterias lcticas Las bacterias lcticas ejercen una actividad endopeptidsica, fundamentalmente sobre la casena ji (Visser y de Oroot-Mostert, 1977), aunque tambin actan sobre la as y su principal producto de degradacin, el pptido as-I (Desmazeaud y col., 1976), aunque esta actividad es poco significativa en relacin con la del cuajo. En cuanto a los microorganismos no constituyentes del cultivo iniciador, los mohos del gnero Penicillium

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ejercen una actividad intensa y liberan tanto pptidos de bajo peso molecular como aminocidos (Desmazeaud y Zevaco, 1979). En quesos de pasta blanda, como el Brie o el Camembert, Penicillium camemberil produce dos endopeptidasas exocelulares que degradan profundamente las casenas s y 3, alternndose su importancia a lo largo de la maduracin (Trieu-Cuot y col., 1982 a y b). En el caso de los quesos azules, la accin de la proteasa cida de Penicillium roqueforti es dominante, degradando fuertemente los pptidos, y liberando elevadas cantidades de aminocidos que se encuentran en la pasta de estos quesos.

11.7.4. DEGRADACION DE LAS PROTENAS DEL QUESO

La degradacin de las principales cadenas polipeptidicas que originan pptidos de tamaflo molecular intermedio y alto, se conoce como proteolisis primaria (Grappin y col., 1985) y afecta fundamentalmente al desarrollo de la textura del queso. El conjunto de reacciones catalizadas por las exopeptidasas de los microorganismos que complementan la accin de las proteinasas, dando pptidos de cadena corta y aminocidos (Rank y col., 1985), se denomina proteolisis secundaria. El metabolismo de los aminocidos da lugar, mediante reacciones enzimticas y qumicas, a la aparicin de sustancias aromticas voltiles y spidas no voltiles. En la Figura 11.13., se esquematizan las transformaciones que sufren las casenas durante la maduracin del queso. Numerosos investigadores han evaluado la proteolisis de las diferentes casenas durante la maduracin de los quesos (Calvo y col., 1992a; 1992b), observando que el nivel de las s disminuye ms del 80% durante las primeras 5 semanas de maduracin ,mientras que la hidrlisis de la casena ji es ms lenta, lo que confirma las diferencias en la estabilidad de las casenas a~ y ji (Lay y col., 1991). Carretero y col. (1992) estudiando el efecto de la maduracin en las protenas del lactosuero del queso de cabra determinaron que la ji-lactoglobulina no es sensible a la proteolisis mientras que la -lactoalbmina y la seroalbmina se degradan durantela maduracin.

64

Introduccin

LECHE

CITRATO

LACTOSA

PROTENAS

LPIDOS

cido lctico cido actico diacetilo acetaldehido etanol cido propinico

pptidos aminocidos aminas comp. azufrados

cetonas lactonas aldehidos cidos grasos

tiosteres QUESO

Figura 11.12. Vas principales de formacin del aroma y sabor del queso -(Law, 1984)

cuajo

CASE~NA 4< ~ Floral0y20 ~ plasmina

PEPTIDOS DE ALTO PESO MOLECULAR cuajo 4 Flora 10y20 PEPTIDOS DE BAJO PESO MOLECULAR +
Flora 10 y 20 Flora 20, reacciones no enzimticas

AMINO cmos

AMINAS

ALDEHIDOS ALCOHOLES

COMPUESTOS AZUFRADOS

Figura 1113. Degradacin de las casenas durante la maduracin del queso (Law, 1987)

65

Introduccin

11.8.

TECNICAS

ANALTICAS

EMPLEADAS

PARA

DETERMINAR EL ORIGEN ESPECIFICO DE LA LECHE Y DERIVADOS LCTEOS

Para garantizar la calidad de la leche utilizada en la elaboracin de quesos, cuya denominacin de origen incluye como exigencia que la materia prima sea de las especies oveja, cabra o vaca, son necesarias tcnicas analticas precisas que permitan detectar bajos niveles de mezcla. En los ltimos aflos, se han conseguido avances importantes en la metodologa empleada para diferenciar mezclas de leche de diferentes especies, aunque queda mucho trabajo por realizar para disminuir los mrgenes de error y lograr una mayor sensibilidad y rapidez de los ensayos. En este trabajo se revisarn algunos mtodos empleados en la diferenciacin de mezclas de leche de las especies vaca, oveja y cabra, mientras en la Tabla 11.10., se resumen los mtodos analticos ms recientes. 11.8.1. METODOS CROMATOGRAFICOS Tradicionalmente, la cromatografa en capa fina y en fase gaseosa, han sido las tcnicas ms ampliamente utilizadas en el anlisis de los componentes de la leche, fundamentalmente de la fraccin lipidica. Actualmente el desarrollo espectacular de las tcnicas de cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) han mejorado los resultados obtenidos. Los mtodos cromatogrficos presentan, frente a las tcnicas electroforticas, la ventaja de su posible utilizacin en los quesos muy madurados, ya que salvo en los quesos madurados con mohos, son escasas las modificaciones que experimenta la grasa durante el proceso de maduracin (Ramos y col., 1977). Sin embargo, estos mtodos carecen de utilidad cuando se emplea como adulterante la leche desnatada. La cromatografaen fase gaseosa se ha utilizado para determinar los cidos grasos de la grasa total o de las fracciones de mayor inters, as como una serie de relaciones porcentuales entre los diversos cidos grasos (Benassi, 1963; Lotito y Cucurachi, 1967; Palo, 1975; Kuzdza.l-Savoie y Kuzdzal, 1970; Ramos y col., 1977; Gattuso y Fazio, 1980; Smeyers-Verbeke y col., 1977). Iverson y Sheppard (1989), utilizando esta tcnica han detectado la presencia de leche de vaca en mezclas con la de oveja o cabra, en proporciones prximas al 10%. El estudio de los triglicridos por tcnicas HPLC y el anlisis de algunas fracciones por cromatografa en fase gaseosa han mostrado diferencias entre las leches de vaca, oveja y cabra (Barron y col., 1990), que quiz en un futuro podran utilizarse en la identificacin y cuantificacin de estas mezclas.

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Introduccin
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68

Introduccin

Aunque en el campo de las protenas en general y de las lcteas en particular, la cromatografa de filtracin en geles y la cromatografa de intercambio inico en DEAE-celulosa se han utilizado ampliamente para aislar y fraccionar protenas, estas tcnicas no se han utilizado en la identificacin del origen de la leche. Sin embargo, durante la ltima dcada la cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) ha destacado por su facilidad, rapidez y exactitud en el anlisis de muchos componentes orgnicos. Por ello, Kaiser y Krause (1985) utilizando la tcnica de HPLC en fase reversa demostraron que los cromatogramas de los pptidos trpticos (derivados de la accin de la tripsina sobre la casena) eran diferentes en los quesos de vaca, cabra, oveja y bfala, indicando que con este mtodo se detecta la adicin de un 1% de leche de vaca en quesos de cabra, aunque en su estudio no se hace referencia a la maduracin de los quesos empleados. Hasnoot y col. (1986) utilizando tambin tcnicas de HPLC detectaron un 2-4% de leche de vaca en quesos de oveja y cabra, empleando como indicador de las mezclas lcteas la casena si bovina y en el caso de quesos madurados, el pptido a~i-I, aunque en este caso el indice deteccin fue del 10%. Frutos y col. (1991), han utilizado la tcnica de HPLC en fase reversa para separar las protenas del suero de la leche de vaca, oveja y cabra; la identificacin y cuantificacin de las p-lactoglobulinas permiti identificar adiciones del 2% en un tiempo muy corto. Kaminarides y Anifantakis (1993) utilizando la tcnica de HPLC con columnas de intercambio aninico, realizaron un estudio comparativo de la separacin de las casenas de las leches de vaca, oveja y cabra, indicando que la elucin de la casena as bovina sucede ms tarde que la de sus homlogas ovina y caprina bajo las mismas condiciones cromatogrficas, por lo que la cantidad de leche de vaca adicionada en las de oveja y cabra podra calcularse determinando el rea de la fraccin cromatogrfica de la casena as bovina, utilizando una curva standar. 11.8.2. METODOS ELECTROFORETICOS De los mtodos fsico-qumicos utilizados en la deteccin de mezclas de leche de diferentes especies, las tcnicas electroforticas pueden considerarse las ms adecuadas, ya que presentan limites de sensibilidad comparables a los de los mtodos biolgicos y no requieren reactivos especiales, aunque como contrapartida deben utilizarse equipos sofisticados. Los mtodos electroforticos se han utilizado tanto para la separacin de las casenas, como para las protenas sricas. La separacin de las casenas por tcnicas electroforticas es la tcnica ms recomendable ya que esta fraccin no se afecta por los tratamientos trmicos. De esta
69

introduccin

manera, Aschaffenburg y Dance (1968) por electroforesis de las casenas en geles de poliacrilamida observaron que la casena s~ bovina presentaba mayor movilidad que sus homlogas ovina y caprina y utilizaron esta mayor movilidad para detectar la presencia de niveles prximos al 2% de leche de vaca en mezclas con las de oveja y cabra.lo que ha dado lugar a la realizacin de otros estudios con el mismo fin (Pierre y Portinann, 1970; Ramos y col., 1985). En Espaa esta tcnica se utiliza como mtodo oficial en la deteccin de leche de vaca en mezclas con leche de oveja, teniendo como lmite de deteccin un 2% (iB.O.E., 301X/1991, Figura 1.14.). Sin embargo, esta tcnica no es vlida para el anlisis de mezclas en quesos madurados, ya que la degradacin de las casenas como consecuencia de la proteolisis que tiene lugar durante la maduracin del queso, hace que la sensibilidad del mtodo disminuya y la interpretacin de los resultados cuantitativos sea ms difcil. El estudio de las protenas del suero por electroforesis en geles de pollacrilamida tiene la ventaja de que estas protenas no se degradan durante la maduracin del queso, aunque tiene el inconveniente de que pueden verse afectadas por el tratamiento trmico. Amigo y col. (1986; 1989) se han basado en la diferente movilidad electrofortica de las 3-lactoglobulinas bovina, ovina y caprina en geles de poliacrilamida, para detectar mezclas del 1-2% en los quesos madurados. La 3-lactoglobulina bovina posee mayor movilidad electrofortica que la -lactoalbmina y las 3-lactoglobulinas ovina y caprina. Los mismos autores (Amigo y col., 1991), tambin han evaluado el efecto de distintos parmetros tecnolgicos sobre la deteccin de la leche de vaca utilizando el procedimiento citado; el mtodo es vlido para la deteccin y cuantificacin del 1% de leche de vaca en quesos, incluso empleando como agente coagulante cuajo vegetal. Durante la fabricacin industrial del queso, la leche se somete temperaturas de pasterizacin y este tratamiento puede desnaturalizar las protenas del suero, lo que puede alterar los resultados obtenidos en la determinacin cuantitativa de la leche de vaca. Calvo y col. (1989), han evaluado el efecto del tratamiento trmico en los quesos~ determinando que temperaturas de 9O~(2 durante 30 segundos no afectan a la determinacin de leche de vaca en leche de oveja o cabra por este mtodo. La electroforesis de las protenas sricas en geles de poliacrilamida es el mtodo oficial en Espaa para la determinacin de la leche de vaca en la de oveja o cabra y para la determinacin de leche de cabra en la de oveja (la p-lactoglobulina caprina presenta una menor movilidad electrofortica que la -lactoalbminay la 3-lactoglobulina ovina), siendo en ambos casos el lmite de deteccin del 2%. Tambin es un mtodo oficial para la deteccin de la leche de vaca en el queso de oveja o cabra y para la deteccin de la leche de cabra en el queso de oveja, teniendo como limite de deteccin un 3% <B.O.E., 30/X/91,

70

Introduccin

Figura 11.15.). En los ltimos aos, la tcnica del isoelectroenfoque (IEF) ha reemplazado a la de la electroforesis en geles de poliacrilamida. El IEF consiste en una electroforesis en un gradiente de pH (3,5-9,5) con un gran poder de resolucin y en la que los componentes se separan por diferencias en su punto isoelctrico. Addeo y col. (1986) basndose en las diferencias en la secuencia de las para-K-caseinas bovina, caprina y ovina, y utilizando la tcnica del isoelectroenfoquehan detectado la presencia simultnea de leche de vaca, oveja y cabra, en mezclas lcteas y quesos madurados en concentraciones prximas al 0,5%, utilizando nitrato de plata como reactivo de tincin. En general este mtodo es vlido para el control, tanto de la leche como del queso madurado; sin embargo, si se intenta comprobar la genuidad de un queso muy proteolizado, como el de Roquefort, pueden obtenerse resultados errneos por sobreestimacin, ya que algunos pptidos formados durante la maduracin pueden tenerel mismo punto isoelctrico que la para-ic-casena bovina (Addeo y col., 1989a y b). Krause y Belitz (1985>, han descrito la deteccin de porcentajes del 1-2% de leche de vaca en mezclas de oveja y cabra por electroforesis de las casenas y~. Sin embargo, en los quesos madurados los pptidos formados con el mismo punto isoelctrico de la casena bovina Y2, pueden interferir en su determinacin. Esto puede resolverse con el tratamiento del queso, previo al anlisis, con plasmina bovina, lo que origina la hidrlisis de las casenas y y permite una mejor separacin de las casenas bovinas 12 de los pptidos descritos. El mtodo tambin es vlido en la identificacin de mezclas de leche de vaca y bfala, en el queso Mozzarella (Addeo y col,, 1989b>. El procedimiento mejora en su sensibilidad y tiempo de anlisis utilizando geles ultrafinos, preparados comercialmente y realizando la electroforesis y tincin de los geles en un equipo Phast-System (Pharmacia). Este mtodo ha sido recomendado recientemente por la CEE como mtodo de referencia en la deteccin de casenas de la leche de vaca en quesos de oveja (Diario de las Comunidades Europeas, N0 174/23-32 de 20/3/1992). La tcnica del ISP tambin se ha utilizado en el anlisis de las fracciones sricas de la leche. Ruiz y Santillana (1986) utilizando geles de poliacrilamida con un gradiente de pH de 3,5-9,5 consiguen un limite de deteccin de un 3% de leche de vaca o cabra en la de oveja, utilizando las prtotelnas sricas como las indicadoras de la sustitucin. Con este mismo mtodo Rispoil y col. (1991), concluyen que la determinacin cualitativa y cuantitativa de la leche de vacaes aplicable en quesos muy proteolizados, como el de Roquefort. Moio y col. (1990) proponen la utilizacin geles pequeos de poliacrilamida con urea y el sistema Phast-System, como un mtodo rpido de deteccin de leche de vaca en la leche o quesos de oveja, cabra y bfala o quesos. Ortn y col. (1992a) analizando por 1SF las protenas

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Introduccin

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OVEJA

CABRA

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Figura 1114. Separacin de las casenas de la leche por electroforesis en geles de poliacrilamida

VAGA

OVEJA

CABRA

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~-Lactoglobulina a-Lactoalbmina ~-Lactoglobulina a-Lactoalbniina

Seroalbmina

Figura 1115. Separacin de las protenas del lactosuero por electroforesis en geles de poliacrilamida
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Introduccin

sricas de quesos con mezclas de leche de vaca, oveja y cabra, determinan porcentajes de sustitucin del 5-40% con una gran precisin. Estos autores describen que en los quesos frescos y de corta maduracin, fabricados con mezclas de leche de oveja, cabra y vaca, la tcnica del EF en microgeles de poliacrilamida de capa muy fina (Phast-System), es un mtodo analtico fcil y rpido, si bien los medios precisos son de coste elevado, con una resolucin e identificacin seguras de las protenas sricas especificas presentes en las mezclas de leche. Los mismos autores (Ortin y col,, 1992b), utilizan este mtodo para determinar los puntos isoelctricos de las casenas K de oveja, cabra y vaca y en la cuantificacin de mezclas binarias y terciarias con las protenas indicadoras teidas con el nitrato de plata, concluyendo que, como las casenas ic en los quesos se degradan a para-K-caseinas y estas no se degradan durante la maduracin del queso ni se afectan por el tratamiento trmico, representan un marcador potencial de las mezclas de leches en los quesos, considerando aceptables los resultados obtenidos. De lo expuesto es posible concluir, que del estudio de las para-K-caseinas o las casenas y por EF, o del estudio de las p-lactoglobulinas por electroforesis en geles de poliacrilamida o IEF, utilizando nitrato de plata como reactivo de tincin, permite detectar niveles muy bajos de leche de las especies vaca, oveja y cabra en mezclas lcteas y quesos madurados. 11.8.3. METODOS INMUNOLOGICOS

La investigacin y desarrollo de las tcnicas inmunolgicas como tcnicas analticas

comenz hace aproximadamente 25 aos, emplendosesobre todo en el diagnstico clnico para el anlisis de hormonas, medicamentos y marcadores tumorales (Rittenburg, 1990>. En la ltima dcada (8-10 aos), se han utilizado con xito en la industria alimentaria en la deteccin y cuantificacin de antibiticos, pesticidas, microorganismos, micotoxinas, hormonas, adulterantes y componentes naturales de los alimentos (Samarajeewa y col., 1991; Oazzaz y col., 1992), aunque su mayor desarrollo se ha producido durante los ltimos cinco aos. Estas tcnicas poseen frente a otras tcnicas fsico-qumicas o biolgicas, las ventajas de su sensibilidad, bajo coste, especificidad, rapidez y la ausencia de equipos instrumentales complejos (Rodrguez y Jurez, 1995). Adems, la disponibilidad de kits comerciales ahorra tiempo y elimina la necesidad de analizar las muestras en laboratorios sofisticados (Men, 1990; Saniarajeewa y col., 1991), por lo que se diferencian de otras tcnicas en que su tecnologa reside en las molculas y no en los equipos de deteccin utilizados.

73

Introduccin

Todos los mtodos inmunolgicos pretenden la visualizacin objetiva de la interaccin especfica entre un antgeno y su correspondiente anticuerpo. Por antgeno se entiende toda sustancia a la que se une un anticuerpo especifico en los lugares reactivos de la molcula antignica, denominados epitopos. El trmino inmunogenicidad se refiere a la capacidad de un antgeno para inducir la formacin de anticuerpos, lo que depende entre otros factores de su peso molecular, su composicin qumica y su capacidad para ser reconocido como extrao por el organismo receptor. Un buen inmungeno deber tener al menos 3.000-5.000 daltons para inducir una buena respuesta inmune mientras las sustancias con menos de 1000 daltons (haptenos), pueden convertirse en inmungenas si se conjugan previamente a molculas vehiculadoras (carriers). Los anticuerpos que utilizados en las tcnicas inmunolgicas son de dos tipos: policlonales o monoclonales. Los anticuerpos policlonales se obtienen de ratones, conejos, ovejas, cabras o caballos, mientras los monoclonales se obtienen de ratones. La especificidad de un inmunoensayo depende, en gran medida, del tipo de anticuerpo utilizado (Hefle, 1995). Sn la Tabla 11.11. se comparan algunas caractersticas asociadas a la obtencin de ambos tipos de anticuerpos. Para la obtencin de anticuerpos policlonales, los animales se inmunizan peridicamente con los antgenos de inters (Figura 11.16.). Las inmunoglobulinas resultantes se detectan en la sangre, aproximadamente una o dos semanas despus de la primera inyeccin, mientras la concentracin de anticuemos en el suero puede llegar a superar la de 1 mg/ml. Cuando el animal alcanza el ttulo de anticuerpos deseado, se obtiene el suero sanguneo. Una preparacin de anticuerpos policlonales puede contener hasta 50 protenas diferentes, adems de las de inters por lo que para obtener inmunosueros con una concentracin elevada de inmunoglobulinas especificas, stos deben purificarse por tcnicas de precipitacin selectiva o por cromatografa de afinidad (Hefle, 1995; Gazzaz y col., 1992). S ratn es el animal de eleccin en la obtencin de anticuerpos monoclonales y desde que en 1975 KtShler y Milstein desarrollaran la metodologa para su obtencin, se han utilizado con xito en los inmunoensayos. Los ratones se inmunizan con el antgeno de inters y cuando se detecta un ttulo suficiente de anticuemos policlonales en el suero, el animal se sacrifica. Los linfocitos se aislan del bazo y se fusionan con clulas inmortales o mielomas que crecen indefinidamente como cultivos celulares. Las clulas resultantes de la fusin denominadas hibridomas, adquieren la capacidad de sobrevivir in vitro de la clula de mieloma y la de producir anticuerpos especficos del linfocito hiperinmune. Cuando los

hibridomas crecen como cultivos celulares los anticuerpos se secretan al medio de cultivo
74

Introduccin

Tabla 11.11. Caractersticas de Inters de la Produccin de Anticuerpos Monoclonales y Policlonales

CRITERIO
Pureza del AntfEenn

MONOCLONALES
No es significativa Inicialmente altos

POLICLONALES
Significativa Bajos 1-2 meses >lmg/ml

Ikm~c~ilrin CQnh1m~in
Reactividad cruzada Afinidad

2-3 meses l~25.tg/mla 0,5-5 mgimb

Ninguna Homogneos

Alguna Heterogneos

a. Sobtnadante de los hibridonias cultivados b. Liquido asctico Fuente: Hefle, 1995

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Introduccin

Inmunizacin del animal con la mezcla antgeno-adyuvante

+
Inyecciones repetidas

EREER
Obtencin del suero del animal

Purificacin de las Inmunoglobulinas del suero

Figura 11.16. Produccin de anticuerpos policlonales

76

Introduccin

mientras que cuando se inoculan en la cavidad peritoneal de los ratones inducen la produccin de liquido asctico (Figura 11.17.). Debido a que una clula hbrida procede de una clula de bazo que secreta un nico tipo de inmunoglobulinas, los anticuerpos monoclonales son qumicamente idnticos y homogneos en su estructura y especificidad, por lo que por su pureza y su fcil obtencin son idneos para su utilizarlos en los inmunoensayos (Hefle, 1995). Los hibridomas pueden almacenarse en nitrgeno lquidoo en congelacin a ~g5O durante largos perodos de tiempo y recuperarlas ms tarde para producir anticuerpos (produccin ilimitada de anticuerpos). Los adyuvantes son preparaciones que incrementan la inmunogenicidad de los antgenos y se utilizan tanto en la produccin de anticuerpos policlonales como monoclonales, siendo estimuladores no especficos de la respuesta inmune y la mayora forman un depsito que protege al antgeno de un rpido metabolismo y destruccin, permitiendo la utilizacin de pequeas cantidades de inmungeno. El ms utilizado es el adyuvante de Freunds que consiste en una emulsin agua-aceite que contiene clulas inactivadas de Mycobacterium tuberculosis y como ingrediente activo un pptido de su pared celular que estimula el sistema inmune del animal inespecificamente. Otros adyuvantes utilizados son las sales de aluminio, polimeros no inicos, pptidos poliinricos y otros (Hefle, 1995). Las tcnicas inmunolgicas basadas en las reacciones de precipitacin entre protenas del suero, y anticuerpos especficos se han utilizado ampliamente en la identificacin de la especie animal de la leche en mezclas lcteas y quesos madurados (Ramos y Jurez, 1986; Garca, 1991; Rodrguez, 1992), por lo que en este trabajo se describirn escuetamente para centrarnos, posteriormente, en el desarrollo y utilizacin de las tcnicas inmunoenzimticas (ELISA) que por ser ms recientes y eficaces y por constituir un soporte experimental fundamental en el desarrollo de este trabajo investigador, merecen una mencin especial. 11.8.3.1. TECNICAS CLASICAS La Inmunoprecipitacin en Medio Liquido desarrollada por Pinto (1966) fue la primera tcnica inmunolgica empleada en la deteccin de leches de diversas especies animales en mezclas lcteas, siendo eficaz en las leches crudas y pasterizadas, pero no en las leches esterilizadas, en polvo y condensadas, donde no es posible observar la reaccin de precipitacin, ya que los precipitados son poco aparentes y desaparecen rpidamente una vez formados.

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Introduccin

Inmunizacin del animal con la mezcla antfgeno-adyuvante

e eClulas del bazo

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Clulas de mieloma

Mx
Fusin celular

Seleccin de los hbridos formados

GO 8 GOS GO 8G O

@GOGo@oeeo

0 8 00 8 00 0O@GO@0O800 G0800@G0tGO 000 .3 0 0.300 0 0 O 00 0 0 0 000 0 0

Seleccin y clonaje de los hbridos productores de anticuerpos especficos Produccin a gran escala

>7

Cultivo iii vitro

Cultivos lii vivo <ascitis)

Figura 11.17. Produccin de anticuerpos monoclonales

78

Introduccin

En 1974, Durand y col, utilizando la tcnica de Inmunodifusin Doble en geles de agarosa, consiguieron detectar un 2,5% de leche de vaca en la de cabra y oveja. Este mtodo sencillo tiene el inconveniente de que es semicuantitativo, aunque la proteolisis del queso no influye en el resultado siendo un mtodo todava empleado en las queseras. Actualmente, los inmunosueros se obtienen comercializados, siendo utilizados por algunos investigadores en diferentes tipos de queso (Ramos y Jurez, 1986). Utilizando esta tcnica, Oombocz y col. (198 la) detectaron hasta un 5% de leche de vaca en la de oveja. En nuestro Departamento, Garca y col. (1989) han desarrollado un test (COMIT) para la identificacin de leche de vaca (3-100%) en la de oveja. El ensayo utiliza anticuerpos policlonales frente a las protenas sricas de la leche de vaca. La diferencia ms significativa con las tcnicas de inmunodifusin convencionales, radica en que los reactivos utilizados se distribuyen embebidos en discos de papel de filtro liofilizados, lo que permite la difusin de su contenido por el gel. Adems, los geles poseen un colorante y una concentracin adecuada de polietilenglicol, lo que permite una mejor visualizacin de las lineas de precipitacin Antgeno/Anticuerpo. En Espaa la tcnica de Inmunodifusin Radial, desarrollada por Levieux (1977), es una tcnica oficial en la deteccin de leche de vaca en mezclas lcteas y de leche de cabra en leche de oveja, siendo su limite de deteccin del 1% (B.O.E,, 30/X/1991), utilizndose en la leche cruda o la pasterizada a740C, durante 30 minutos, aunque algunos investigadores tambin la han utilizadoen la identificacin de mezclas lcteas en quesos madurados (Barbosa y Gon9alvez, 1985; Amigo y col., 1989). Calvo y col. (1989) evaluando el efecto de los tratamientos trmicos en la determinacin de la leche de vaca en mezclas con la de oveja y cabra, determinaron que, temperaturas de pasterizacin (740C, 30 segundos) no afectan la determinacin cuantitativa de las protenas sricas utilizando el mtodo electrofortico o el de inmunodifusin, mientras el calentamiento de la leche a temperaturas de 9ffC durante 30 segundos, slo permite la deteccin de leche de vaca con el mtodo electrofortico. Amigo y col. (1989), comparando el mtodo electrofortico en geles de poliacrilamida con el de la inmunodifusin radial en la deteccin de las leches de vaca y cabra en quesos madurados, determinaron que el mtodo elctrofortico era ms fiable. Los mismos autores (Amigo y col., 1992), comparando el mtodo electrofortico, el de isoelectroenfoque y el de la inmunodifusin en la deteccin de leche de vaca y cabra en el queso Serra de Estrela, concluyeron que los resultados obtenidos por electroforesis e isoelectroenfoque eran similares, mientras que, con la inmunodifusin se obtenan falsos negativos.

79

Introduccin

Utilizando la tcnica de la Inhibicidn de la Hema2lutinacin, Levieux (1980), consigue detectar hasta un 1% de leche de vaca en la de cabra. La combinacin de las tcnicas electroforticas con las inmunolgicas ha dado lugar a las tcnicas de Inmunoelectroforesis en Cohete e Inmunoelectroforesis Cruzada. La primera de ollas fue utilizada por Radford y col. (1981) en la deteccin de un 1-5% de leche de vacaen leche de cabra y, la segunda, por Elbertzhagen yWenzel (1982, 1987> que detectaron un 0,1-0,2% de leche de vaca en quesos de oveja o cabra, utilizando un inmunosuero frente a las casenas y protenas del suero de la leche de vaca. Krause y col. (1988), utilizando esta misma tcnica e inmunosueros anticaseinas de la leche de vaca, han detectado un 0,1-0,2% de leche de vaca en leche y quesos de oveja y cabra, sealando, que ni la maduracin de los quesos ni los tratamientos trmicos modifican la sensibilidad del mtodo. Bernhauer y col. (1983) utilizando la tcnica de ~i iw.sin~msi han detectado un 0,1-1% de leche de vaca en la de cabra y oveja y un 0,1-2% de la misma leche en los quesos madurados. No obstante, la sensibilidad del mtodo vara cuando la leche se somete a tratamientos trmicos mayores que la pasterizacin y cuando en la maduracin de los quesos se produce una proteolisis intensa. 11.8.3.2. Los inconvenientes asociados a la utilizacin de las tcnicas descritas, es que requieren mucho tiempo o una gran cantidad de anticuerpos purificados y que la mayora son slo cualitativas o semicuantitativas. El desarrollo de las tcnicas inmunoenzimticas (ELISA) ha supuesto una alternativa interesante a los mtodos convencionales utilizados en la identificacin de leche de diversas especies animales, debido a su especificidad, sensibilidad y sencillez. La utilizacin en las tcnicas inmunolgicas de marcadores que se conjugan a uno de los componentes de. la reaccin, permite detectar y cuantificar los complejos antgeno-anticuerpo formados. Estos marcadores pueden ser radioistopos, enzimas, molculas fluorescentes o luminiscentes y bacterifagos (Gazzaz y col., 1992). Las tcnicas ms utilizadas son el radioinmunoensayo (RIA) y el enzimoinmunoensayo, siendo Yalow y Berson (1959) los primeros que sescribieron un mtodo de RA para la deteccin de la insulina; sin embargo, debido a los inconvenientes asociados a la utilizacin de marcadores radioactivos, stos se sustituyeron por enzimas iniciando el desarrollo de las tcnicas inmunoenzimticas (Engvall y Perhnann, 1971; Van Weemun y Schuurs, 1971).

so

Introduccin

Los enzimoinmunoensayos pueden ser de dos tipos: homogneos y heterogneos. En los homogneos, la actividad del marcador enzimtico est modulada por la interaccin antgeno-anticuerpo y no se requiere la separacin de los reactivos, aunque este tipo de ensayos no se utilizan normalmente en el anlisis de alimentos. Los heterogneos requieren la separacin de los complejos antgeno-anticuerpo de los componentes libres y la inmovilizacin de uno de los componentes de la reaccin a una fase slida, lo que facilita la separacin de los componentes libres. La mayora de las tcnicas inmunoenzimticas (ELISA) utilizadas en el anlisis de los alimentos son heterogneas. En las tcnicas ELISA el antgeno o el anticuerpo se fijan a un soporte slido, generalmente placas de poliestireno, polivinilo, polipropileno o nylon, que permiten su adsorcin pasiva y la eliminacin de los compuestos libres mediante lavado (Clark y Sngvall, 1980). En algunas aplicaciones, como fase slida se utilizan membranas, generalmente de nitrocelulosa a las que se unen las protenas mediante enlaces hidrofbicos, denominndose este tipo de ensayo como Inmunodotting. A diferencia de esta tcnica , la del Inmunoblotting, es una tcnica que combina la separacin previa de las proteinas por electroforesis y su transferencia a una membranade nitrocelulosa, en la que los antgenos de inters se identifican por un ELISA. En cuanto al enzima utilizado en la conjugacin al antgeno o anticuerpo es conveniente que est purificado, que sea activo, fcil de obtener y que al reaccionar con el sustrato origine un producto fcilmente observable y cuantificable. Los enzimas ms utilizadoscon este fin son la peroxidasa de rbano, la p-galactosidasa, la glucosa oxidasa y la fosfatasa alacalina (Voller y col., 1986), La eleccin del sustrato del enzima es tambin importante en las metodologas ELISA. S sustrato debe ser estable y soluble, antes y despus de su degradacin. El enzima peroxidasa de rbano, uno de los ms empleados, utiliza como sustrato el perxido de hidrgeno y como donantes de hidrgeno la 0-fenildiamina (OPD), el cido 2, Vazino-di (3-etil-benzotiazolina) sulfnico (ABTS), el cido 5-aminosaliclico y la 3, 3 5, 5-tetrametilbenzidina. En el caso de la p-galactosidasa, el sustrato ms utilizado es el o-nitrofenil-13-D-galactopiransido (O-NPG) y para la fosfatasa alcalina el p-nitrofenil (P-NPP) (Tyssen, 1985). Los compuestos donantes de hidrgeno, al oxidarse en presencia del sustrato, originan compuestos coloreados cuantificables espectofotomtricamente.

81

Introduccin

11.8.3.2.1. Irimunodotting

Se trata de una tcnica inmunoenzimtica que visualiza las interacciones Ag/Ac en un papel de nitrocelulosa. El antgeno se absorbe en este soporte y se pone en contacto con el anticuerpo; en caso de correspondencia, los anticuerpos unidos al antgeno se detectan con un segundo anticuerpo obtenido frente al anterior y conjugado con un enzima. La reaccin se visualiza al aadir el sustrato del enzima, por lo que en el papel de nitrocelulosa se desarrollan manchas coloreadas de intensidad variable. Aranda y col. (1988) utilizando esta tcnica y un inmunosuero anti-caseinas de la leche de vaca detectan un 0,1% de leche de vaca en la de oveja. Este mtodo tambin se ha utilizado en los quesos, aunque los resultados son slo seniicuantitativos. Garca (1990) empleando esta tcnica y un inmunosuero anti-proteinas sricas de la leche de vaca, consiguen la deteccin de un 3% de leche de vaca en la de oveja. Calvo y col. (1989) han utilizado tambin el inmunodotting y anticuerpos policlonales frente a las casenas bovinas o frente a las inmunoglobulinas de especie, para detectar la presencia de leche de vaca en la de oveja con indices de deteccin del 0,1%. Recientemente, Aranda y col. (1993) han utilizado este mtodo para detectar la presencia de leche de cabra o vaca en leches y quesos de oveja. 11.8.3.2.2. Inmunoblotting Esta tcnicacombina la electroforesis con las tcnicas inmunoenzimticas, basndose en la transferencia electrofortica de las protenas separadas por electroforesis a una membrana sinttica, donde los antgenos de inters se detectan por un ELISA Indirecto. Mojo y col. (1992) combinando la tcnica del isoelectroenfoque con un inmunoblotting en Phast-System y utilizando anticuerpos policlonales frente a la II-casena bovina, consiguen la deteccin de un 5% de leche de vaca en quesos Roquefort de 10 das a 5 meses de maduracin. 11.8.3.2.3. Tcnicas ELISA S SLISA es el mtodo inmunolgico ms ampliamente utilizado en el anlisis de los alimentos debido a su bajo coste y rapidez, facilidad de utilizacin y posible automatizacin, permitiendo el anlisis de un gran nmero de muestras en un corto espacio de tiempo (Men, 1990). Dichas tcnicas se basan en la fijacin del antgeno o del anticuerpo en un soporte slido y en la visualizacin objetiva de la interaccin antgeno-anticuerpo mediante

82

Introduccin

la conjugacin de uno de los componentes de la reaccin con un enzima. Los mtodos inmunoenzimticos (ELISA) permiten el diseo de diversas variantes metodolgicas, de las que las ms utilizadas son el ELISA indirecto, sandwich y competitivo. En la tcnica del ELISA Indirecto (Figura 11.18.), el antgeno se fija por adsorcin pasiva a una superficie inerte (a); a continuacin se adicionan los anticuerpos especficos, que reconocen al antgeno (b) y se unen a l formando un complejo que se detecta mediante la incorporacin de un segundo anticuerpo marcado con un enzima (c). La reaccin se visualiza porque el enzima, al actuar sobre el sustrato (d), libera un compuesto coloreado. Una consideracin importante acerca de este formato es que durante la fijacin del antgeno por adsorcin pasiva a la placa, ste puede sufrir cambios estructurales que si afectan a los epitopos pueden hacerles irreconocibles para los anticuerpos (Reile, 1995) En la tcnica del ELISA Sandwich (Figura 11.19.), el anticuerpo especifico (anticuerpo de captura) se fija a una fase slida (al) y a continuacin se aade el antgeno problema, el cual es capturado por el anticuerpo fijado (b). El complejo anticuerpo-antgeno se detecta generalmente con el mismo anticuerpo marcadocon un enzima (c) (anticuerpo de deteccin). Finalmente, se aade el sustrato (d) y el compuesto coloreado liberado por el enzima, permite visualizar la reaccin. Como anticuerpos de captura y de deteccin puede utilizarse el mismo anticuerpo o dos tipos diferentes de anticuerpos, como uno policlonal y otro monoclonal. Esta ltima combinacin incrementa la sensibilidad del ensayo ya que el policlonal reconoce epitopos diferentes en el mismo antgeno. El ELISA Competitivo puede ser directo (cuando se mide la cantidad de anticuerpo) o indirecto (si se mide el antgeno), siendo este ltimo es el ms utilizado en los alimentos. En la tcnica del ELISA Competitivo (Figura 11.20.), el anticuerpo (directo) o el antgeno especifico (indirecto) se fija a una superficie inerte (1), y, a continuacin, se aade el antgeno o el anticuerpo mezclado con la muestra problema, con un segundo anticuerpo marcado con un enzima (2a). Utilizando como control otro pocillo carente de muestra (2b) y tras adicionar el sustrato (3a y 3b), se observa la diferencia de color entre ambos pocillos, lo que refleja la concentracin de antgeno de la muestra problema. En los ltimos aos, se ha comprobado que el complejo avidina-biotina es un mediador muy til y verstil en una gran variedad de aplicaciones analticas, incluidas las tcnicas inmunoenzimticas (Wilchek y Bayer, 1988). Utilizando las propiedades de este complejoes posible amplificar las reacciones inmunoenzimticas debido a la elevadsima afinidad (l0~ M1) de la avidina por la biotina y a la gran estabilidad de la interaccin no covalente. En el caso del ELISA Indirecto (Figura 11.21.), despus de fijar el antgeno a una 83

Introduccin

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Introduccin

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85

Introduccin

1. Antgeno adsorbido al pocitio

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2a. Adicin del conjugado anticuerpo-enzima

y de la muestra problema

2b. Adicin del conjugado

anticuerpo-enzima (control)

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3b. Adicin del sustrato
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3a. Adicin del sustrato enzlmtico

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Lectura espectrofotomtrica a 405 nm

Figura 11.20. Esquema de la tcnica del ELISA Competitivo

86

Introduccin

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87

nrxoduccin

superficie slida (a), se aaden los anticuerpos especficos de la reaccin conjugados con la biotina (b) y, acontinuacin, el complejo antgeno-anticuerpo se detecta con un conjugado de avidina-enzima (o), en lugar de las anti-inmunoglohulinas de la especie de la que procede el anticuerpo unido al enzima. La reaccin se visualiza porque el enzima, al actuar sobre el sustrato (d), libera un compuesto coloreado. La mayora de los mtodos inmunoenzimticos descritos en la identificacin y cuantificacin de la leche de diversas especies animales en mezclas lcteas y en quesos madurados, utilizan anticuerpos policlonales frente a las protenas del suero de la leche (Garca y col., 1990; 1991) o frente a las casenas totales (Rodrguez y col., 1990; 1993), inmunoglobulinas bovinas (Sauer y col., 1991) o pptidos sintticos (Rolland y col., 1993; 1995). En nuestro Departamento, se posee una amplia experiencia en la obtencin de reactivos y en el desarrollo de tcnicas inmunoenzimticas (ELISA) en la diferenciacin de la leche de diversas especies animales. As, Garca (1990) utilizando un ELISA Indirecto y anticuerpos policlonales frente a las protenas del suero de la leche de vaca, oveja y cabra, neutralizados o purificados por cromatografa de afinidad, detect un 1% de leche de vaca y cabra en la de oveja, mientras con la tcnica del ELISA Sandwich detect y cuantific el 1-30% de sustitucin de leche de oveja por la de vaca y cabra. Posteriormente, Rodrguez (1992), utilizando un ELISA Indirecto y anticuerpos policlonales frente a las casenas totales bovinas, ovinas y caprinas, neutralizados o purificados por cromatografa de afinidad, detect y cuantific la presencia de un 1 al 50% de leche de vaca en las leches y quesos de oveja y cabra y la sustitucin de un 1 al 25% de leche o queso de oveja por la de cabra. Asimismo, utilizando la tcnica del ELISA Sandwich le fue posible detectar y cuantificar un 0,1 al 25 % de leche de vaca en las leches y quesos de oveja y cabra y del 1 al 100% de leche de cabra en las leches y quesos de oveja. No obstante, algunos inconvenientes asociados a la utilizacin de anticuerpos policlonales radican en la disponibilidad limitada de los mismos y en la necesidad de purificarlos para eliminar reacciones cruzadas y que posean una especificidad adecuada, Adems, la purificacin de los inmunosueros por afinidad es larga y costosa y los anticuerpos purificados constituyen una mezcla de inmunoglobulinas quepueden variar en su afinidad por el antgeno, lo que representa un problema a largo plazo. Recientemente, Rolland y col. (1993), han desarrollado un ELISA Competitivo utilizando anticuerpos policlonales frente a un pptido sinttico del fragmento 140-149 de la casena cx~ bovina, detectando y cuantificando del 0,125% al 64% de leche de vaca en

88

Introduccin

leche de oveja y del 0,5 al 15% en quesos. Dichos anticuerpos policlonales han mostrado tambin su utilidad en la deteccin de leche de vaca en la leche y los quesos de cabra (Rolland y col., 1995). Asimismo, el desarrollo de la tecnologa de la obtencin de anticuerpos monoclonales (Khler y Milstein, 1975), ha proporcionado el medio adecuado para la produccin continuada de anticuerpos especficos de actividad biolgica conocida y especificidad determinada, lo que ha permitido la obtencin de anticuerpos monoclonales frente a las diferentes casenas bovinas (Feng y Cunningham-RundleSS, 1989; Kuzmanoff y col., 1990a, 1990b, 1991; Leung y col., 1991; Nagaune y col., 1988; Oudshoorn y col., 1994), pero que no se han utilizado en la identificacin del origen de la leche de diversas especies animales. No obstante, Levieux y Venien (1994) han obtenido anticuerpos monoclonales frente a la p-lactoglobulina bovina y utilizando tcnicas ELISA, han conseguido la deteccin de leche de vaca en leche de cabra u oveja en cantidades de 1 parte de leche de vaca/100.OO0 partes de leche de cabra u oveja. En nuestro Departamento se han obtenido anticuerpos monoclonales frente a la caseina p de la leche de vaca purificada por FPLC (Anguita y col., 1995), que utilizados en un ELISA Indirecto han permitido la deteccin y cuantificacin de un 0,1-10% de leche de vaca en la leche de oveja y cabra (Anguita y col., 1995). El mismo anticuerpo monoclonal se ha empleado en una tcnica ELISA de paletas (inmunostick) para la deteccin y cuantificacin del 1% de leche de vaca en la de oveja y del 0,5% en quesos madurados (Anguita y col., 1995).

89

CAPITULO Hl

MATERIAL YMETODOS

Material y Mtodos

111.1. MATERIAL GENERAL

111.1.1. MATERIAL DE LABORATORIO Todas las disoluciones acuosas se prepararon en agua destilada obtenida en un destilador lPobel mod. 706 y desmineralizada en un intercambiador inico Set? mod. R-600.(l) Las pesadas ordinarias se efectuaron en balanzas monoplato ii4~p4fla mod. Ex -3000 A y EW-600 A. En las pesadas de precisin se utilizaron balanzas analticas aa~~ya mod. ER-120 A. Para equilibrar las muestras a centrifugar se utiliz una balanza biplato Cobos mod. 28. Las centrifugaciones se realizaron en centrfugas Sorvall RG-513, equipadas con rotores 55-34 y OSA. Las microcentrifugaciones se efectuaron en una Biofuge A de alHeraeusaa mod. Christ. Los pHlmetros utilizados fueron Crison mod. Digit 501, aRadiometer~ mod. 28 y aMetrohm? mod. 654.

Las esterilizaciones se realizaron en autoclaves Selecta mod. Autotester G y 43-O.

La esterilizacin del material de vidrio se efectu por calor seco en una estufa de aire forzado Heraeusa mod. KFTU-K. Para la pasterizacin de las leches se emple un bao termosttico Bunsen mod.

EA- 12.
Las determinaciones espectrofotomtricas se llevaron a cabo en espectofotmetros

aKontrona mod. Uvilcon 820 e iHitachial mod. U-2000 de doble haz, registrndose los resultados en una impresora trmica Uvilcon LS-4B yen un registrador Uvilcon 21. Las homogeinizaciones de las muestras se realizaron con ayuda de homogeinizadores mod. Stomacher 4~J y a5~~~j~a Omno-mixer 17106.

alCajworffila

Las liofilizaciones se realizaron en un aparato Teruzzi-Mevilsa mod. TP-3 con superficie til de carga de 0,3 m2,dotado de equipo de registro, dispositivo de termovacio y programador.

91

Material y Mtodos

Las muestras se filtraron en diversos modelos de filtro Whatmant y se dializaron en membranas de dilisis Serva mod. Visking dialysis tubing, type 27/32. La cromatografa de intercambio aninico se realiz en una columna de Bio-Rad mod. 2,5 x 37 cm. y las fracciones cromatogrficas se recogieron en un colector de fracciones LKB Broruma mod. Helirac, Para la cromatografa de intercambio catinico se utiliz un equipo de Pharinacia, compuesto de una columna mod. XK 26/20, una bomba peristltica mod. P-1 y un colector de fracciones Redifrac. La cromatografa lquida rpida de protenas se (FPLC) se realiz en un FPLC de Pharmacia, provisto de una unidad de control mod. LCC-500 Plus, dos bombas de alta presin P-500, un inyector MV-7, un monitor mod. Uy-Mil, un registrador mod. Reo 2, una columna Mono Q HR 5/5 y un colector automtico de fracciones mod. FRAC-100. Los tampones utilizados en las diferentes cromatografias se filtraron a vacio utilizando bombas elctricas Eyela mod. A-38 y filtros de Millipore de 0,22 y 0,45 iim y, posteriormente, se sonicaron en un bailo de limpieza por ultrasonidos Selecta. Las muestras y reactivos se conservaron en arcones de congelacin Kelvinator mod. ACK-55 y Liebherr, as como en frigorficos Liebherr y Kelvinator mod. AKR-20 y en un armario frigorfico Kelvinator termostatado a 4 1 0C, construido por una firma local. En las incubaciones se utilizaron estufas Heracus mod. KB-500 y Selecta mod. Termotronic 338, termostatadas a la temperatura deseada. Las electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sdico (SDS-PAGE), se realizaron en un Phast~SystemTM de Pharmacia que se utiliz conjuntamente con un Phast~TransferrM de la misma firma para los inmunoblottings. La obtencin de anticuerpos monoclonales se realiz en una sala estril con una antesala, lmparas de luz ultravioleta en los techos, una unidad de aire acondicionado Interdinet y un filtro de aire positivo Telstar. Adems, en su interior se encontraban ima campana de flujo laminar Teistar mod. AV-lOO, un incubador Heraeus mod. 6000 con controlador de temperatura y CO 2, un microscopio Nikon mod. TMS, una centrfuga Heraeus Megafuge 1.0 y un bailo termostatado Grant mod. W 14. El gas utilizado para 92

Material y Mtodos

en el incubador fue CO2 de calidad N-40 de alto grado de pureza y comercializado por la SEO. El material de plstico estril utilizado fue de las marcas Nunc y LabSystem. Las clulas de mieloma y los hibridomas se conservaron en un arcn congelador Sanyo ultralow mod. MDF-392 y en bombonas deN2 liquido mod. CDB 35 y CDB 18. Las placas de ELISA utilizadas en los ensayos inmunoenzimticos fueron de la marca Costar mod. 3590 de 96 pocillos. Su agitacin se realiz en un agitador de placas de ELISA marca WalIac, mod. 1296.001 Plateshake y para su lectura se utiliz un lector espectrofotomtrico Titertek Multiskan Plus, versin 1.4. Como material general de laboratorio se utilizaron pipetas y micropipetas automticas de la marca Gilson modelos p-SOOO, p-l000, p-200 y p-20, as como pipetas multicanales Labsystem y Titertek, agitadores, mecheros de gas, termmetros, jeringuillas, hojas de bistur, etc. El material de vidrio empleado en las experiencias descritas fue siempre de la marca Pyrex.

111.1.2. MATERIAL BIOLOGICO

111.1.2.1. ANIMALESflEEXPEBMtIENIACIQN En la obtencin de anticuerpos policlonales se emplearon conejos machos de raza Nueva Zelanda, de 3-3,5 Kg. de peso, mantenidos en el animalario de nuestro departamento y alimentados con dieta de mantenimiento para conejos y agua potable ~4

liN~m.
Para la obtencin de anticuerpos monoclonales se emplearon ratones Balb/c de ocho semanas de edad, alimentados con dieta de mantenimiento rata-ratn y agua potable ~

libutum.
111.1.2.2. ORIGEN DE LAS MUESTRAS En este trabajo se han utilizado las siguientes muestras: A) Muestras de leche cruda

L.e~k..d~sm: tuvo tres procedencias diferentes. Leche de cabra de la raza Serrana,

93

Material y Mtodos

suministrada por la empresa Queserias Luxtor de Mstoles (Madrid), leche de cabra de cruce de autctonas con Murciana, procedente de una granja diplomada de Talavera de la Reina (Toledo) y leche de cabra de raza Gran Mezcla, procedente de una granja diplomada de Fuenlabrada (Madrid).

L~b~x~i: leche de oveja de la raza Manchega, procedente de una granja diplomada de Benavente (Zamora).

l~~.dkx~a: leche de vaca de la raza Frisona, procedente de la empresa Queserias

Luxtor de Mstoles (Madrid). Las muestras de leche se recogieron directamente del tanque de refrigeracin y se transportaron al laboratorio en botellas de vidrio estriles, que se introdujeron en un recipiente hermtico isotermo que contena hielo en bolsas impermeables. B) Muestras de quesos: Se adquirieron en diversos centros comerciales de Madrid: se utilizaron tres tipos diferentes dependiendo del perodo de maduracin, siendo estos un queso fresco de origen francs, otro tierno de la marca Garrotxa y otro, con seis meses de maduracin, procedente de la provincia de Cceres.
Qja~sn..4~sta:

Qu~sa4~nx~.ja: De denominacin de origen Roncal (O. M., 11/3/91 y B.O.E., 14/3/9 1).

Qu~sask..xna: De denominacin de origen Mahn4 (O. M., 5/7/85 y B.O.E.,

24/6/85). C) Clulas de Mielotna Las clulas de mieloma de la lnea celular P3X63-Ag 8.653 fueron cedidas generosamente por el Instituto LLorente (Madrid).
111.1.3. PRODUCTOS Y REACTIVOS

Los productos qumicos y biolgicos utilizados en este trabajo fueron suministrados por alguna de la siguientes firmas: Merck, Sigma, Bio-Rad, Oxoid, PhM~acia Difco, Panreac, Dako y Fluka y Boehringer. Los medios de cultivo utilizados

durante la obtencin y produccin de anticuerpos monoclonales fueron de la marca Gibco

94

Material y Mtodos

y Boehringer

111.2. METODOS
111.2.1. PREPARACION DE LAS MUESTRAS De las muestras de leche de cabra, vaca y oveja, transportadas a nuestro Departamento en condiciones de refrigeracin, se procedi a la preparacin de los extractos antignicos correspondientes. 111,2.1.1. OBTENCION DE LAS CASEINAS de la leche de Para la obtencin de los extractos antignicos denominados casenas vaca (CV), se cabra (CC), casenas de la leche de oveja (CO) y casenas de la leche de procedi como se describe a continuacin (Figura 111.1.). 1) Desnatado de la leche cruda por centrifugacin a 13.000 g durante 4 0C, y filtracin de las mueastras por un filtro con lana de vidrio. 10 minutos a

2) Precipitacin de las casenas por calentamiento de la leche desnatada a 37 0C, seguido de acidificacin de la misma hasta un pH de 4,6 con HCl 0,2 M. En el caso de la leche de cabra, la leche desnatada se calent a 45 0C y se acidific hasta un pH de 4,47 (punto isoelctrico de las casenas de la leche de cabra). 3) Mantenimiento de la leche a 40 oc durante 30 minutos y centrifugacin de la muestra a 6000 g durante 30 minutos, bara separar las casenas precipitadas. 4) Lavado de las casenas precipitadas durante tres veces con agua destilada, para eliminar las protenas residuales. 5) Liofilizacin y mantenimiento de las casenas a -20 0C, hasta su utilizacin. El contenido proteico de los extractos antignicos obtenidos, determinado por el procedimiento descrito en la seccin 111.2.2., fue:
-

CC: 753 .tg de protena/mg de extracto liofilizado.

CO: 730 ~.tg protena/mg de extracto liofilizado. de 95

Material y Mtodos

LECHE CRUDA DE CABRA

c4SEYM4s

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ContrltigacEn (13.000 gIlOj

400

flitraein por ana de ~4drio

Oaieritamiento a

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Awcrad&, &M (pH=4,47; L~2M/cO

Carnervacldn (4000/30)

Centrifugacin (tflg/3O~)

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Lsvwpw cwbMigaM&, ~ son)

Lbflar4&i

Figura LI. Esquema de trabajo en la obtencin de las casenas de la leche de cabra

96

Material y Mtodos
-

CV: 620 gg de protena/mg de extracto liofilizado.

El contenido de caseus por ml de leche utilizada fue de 13,9 mg en la de cabra (CC>, de 21,9 mg en la de oveja (CO) y de 18,5 mg en la de vaca (CV). 111.2.1.2. MF7CT AS 1 .ArYRA.~ Se prepararon 3 mezclas experimentales de leche cruda de cabra/oveja y 3 mezclas de leche cruda de cabra/vaca, dependiendo de la procedencia de la leche de cabra. Asi la mezcla 1 se realiz con la leche de cabra de la raza Serrana, la mezcla 11 con la leche de cabra de la raza autctona-Murciana y la mezcla m con la leche de cabra de la raza Gran Mezcla, como se refleja a continuacin:

Mezcla 1 Mezcla 11 Mezcla m

Serrana Autctono-Murciana Oran Mezcla

Manchega

Frisona

Asimismo, la leche cruda de cabra se someti tambin a los tratamientos trmicos de pasterizacin y esterilizacin. La pasterizacin se realiz calentando la leche de cabra a 62 0C durante 30 minutos en un bailo de agua termostatado, mientras la esterilizacin se realiz manteniendo las muestras de leche en un autoclave a 121 0C durante 20 minutos, Posteriormente, se prepararon 6 mezclas experimentales de leche de cabra pasterizada/oveja y /vaca, y de leche de cabra esterilizada/oveja y /vaca. En todos los casos, la leche de la especie citada en segundo lugar se sustituy por la primera en los porcentajes de sustitucin del: 0,0,125,0,250, 0,500, 0,750, 1,2,5,5,10, 15, 25, 50, 75 y 100%. Las muestras resultantes se repartieron en alcuotas de 1 ml y se conservaron a -20 oc hasta el momento de su empleo. 111.2.1.3. MEZCLAS DE OUESOS Se utilizaron tres tipos de queso de cabra dependiendo del perodo de maduracin 97

Material y Mtodos (fresco, tierno y madurado), que se mezclaron con quesos de oveja y vaca para la obtencin de seis mezclas experimentales de quesos de cabra/oveja y cabra/vaca.

Cahm
Mezcla 1 Mezcla 11 Mezcla 111 Fresco Tierno Madurndo

~eia Roncal Mahn

Para la obtencin de los extractos antignicos de queso se utilizaron 25 granos de queso puro o de la mezcla correspondiente, que se homogeneizaron en 250 ml de tampn fosfato salino (PBS) de pH 7,2 en el stomacker y que, posteriormente, se filtraron por lana de vidrio. Igual que en las mezclas lcteas, los quesos de la especie citada en segundo lugar se sustituyeron por los de la primera, en los porcentajes del 0, 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50, 75 y 100%. Las muestras se repartieron en alcuotas de 1 ml y se conservaron a -20 0C hasta el momento de su empleo. 111.2.2. DETERMINACION DE LA PROTENA El contenido proteico de los extractos antignicos y de las fracciones caseinicas purificadas, se determin utilizando la tcnica de Lowry modificada por Markwe]I y col., (1978). Lowry en 1951, desarroll un mtodo de para la cuantificacin de protenas basado en la utilizacin del reactivo de Folin-Ciocalteau, empleado generalmente para detectar grupos fenlicos. Este mtodo es ms sensible que el de Biuret y es til para la deteccin de 10 p.tg y 100 ~g protena/ml de muestra. La tcnica se basa en la cuantificacin del color desarrollado al poner en contacto las protenas con los reactivos que posteriormente se detallan. El desarrollo del color se debe a una combinacin de reacciones: a) En condiciones alcalinas, el cobre (Cu2~) forma un complejo con los enlaces peptdicos de las protenas (reaccin de tipo Biuret) reducindose a Cu~. b) El Cu~, junto con la tirosina y el triptfano, reacciona con el reactivo de Folin-Ciocalteau, originando un compuesto inestable que lentamente se reduce para dar 98

Materiay Mtodos lugar al reactivo molibdeno-tdngstico de color azul. La intensidad del color depende del contenido en tirosina y triptfano de las protenas. Debido a que esta tcnica se basa en la reactividad de los grupos fenoles de las protenas, es necesario obtener los resultados de una curva patrn construida en cada ensayo. En nuestro caso, como protena standar para construir la curva patrn se emple la fraccin caseinica p comercial (Sigma) de la leche de vaca.

Solucin A: Na2CO3 al 2%, NaOH al 0,4%, dodecil sulfato sdico (SDS) al 1% y Solucin B: CuSO4 (5H20) al 4% en agua destilada.

tartrato sdico potsico (NaKC4H4O6) (4H20) al 0,16% en agua destilada.

-

Solucin C: Se obtiene mezclando 100 volmenes de la solucin A con 1 volmen de la solucin B. Solucin D: Reactivo comercial de Folin-Ciocalteau ,dlluido en agua destilada en la proporcin 1:1 (y/y).
-

~ocedimiento A 1 ml de la muestra que contenga entre 10 y 100 jig de protena se le aaden 3 mIde la solucin C, se agUa y se deja en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuacin, se adicionan 0,3 ml de la solucin D, se agita y la mezcla se mantiene a temperatura ambiente durante 45 minutos. Finalmente, el aumento de la absorbancia a 660 nm se mide con referencia a un blanco preparado de la misma manera, pero con agua destilada.

111.2.3. FRACCIONAMIENTO DE LA CASEINA DE LA LECHE DE CABRA POR CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO IONICO

La cromatografa de intercambio jnico es una tcnica ampliamente utilizada en la separacin de los componentes proteicos de la leche. Esta tCcnica permite la separacin de molculas que, presentando tamaos similares, difieren ligeramente en su punto isoelctrico. La separacin por cromatografa de intercambio inico se basa en las interacciones que tienen lugar entrelas molculas de soluto y los ligandos inmovilizados en una matriz cromatogrfica. Este proceso se realiza en dos fases: la primera comprende la 99

Material y Mtodos

aplicacin de la muestra ionizada y la adsorcin de los iones al intercambiador; en la segunda fase, los componentes adsorbidos por el intercambiador son eluidos selectivamente de la columna, ocurriendo su separacin en funcin de sus distintas afinidades hacia el mismo. Un intercambiador inico consiste de una matriz insoluble, a la cual que se unen covalentemente grupos cargados asociados con contraiones mviles. El tipo de grupos cargados determina la clase y fuerza del intercambiador con intercambiadores cargados positiva o negativamente. Los primeros se denominan intercambiadores aninicos y los segundos catinicos. Los trminos, fuerte y dbil, se refieren a la extensin de la variacin de la ionizacin con el pH. 111.2.3.1. CROMATOGRAFIA LIOUIDA RAPIDA DE PROTEINAS (EPLO La cromatografa lquida rpida de protenas (FPLC), se diferencia de las tcnicas clsicas de cromatografa de intercambio inico en columna abierta en la naturaleza de la fase estacionaria, que debe permitir mayores velocidades de flujo y soportar presiones elevadass. En este trabajo se utiliz un equipo automatizado de FPLC de Pharmacia, consistente en: una unidad de control, 2 bombas de alta presin, un inyector, un monitor de UV a 280 nm, un registro y un colector automtico de fracciones LKB Frac-l00. La columna utilizada fue la Mono Q HR 5/5 (Pharmacia) que es un intercambiador aninico fuerte basado en una resma hidroflica cuyo grupo funcional en el gel es -CH2-N~(CH3)3. El fraccionamiento de las casenas de la leche de cabra se realiz segn el mtodo descrito por Davies y Law (1987) para el fraccionamiento de las casenas bovinas (Figura 111.2.), con ligeras modificaciones. 111.2,3.1.1. Preparacin de la casena Se tomaron 10 mg de la casena liofilizada de leche de cabra (CC) que se disolvieron en 10 ml del tampn Bis-tris-propano-HCl 5 mM conteniendo 3,3 M urea (tampn 0C. A continuacin, se ajust el pH de cromatogrfico) y se agitaron durante 5 minutos a 20 la muestra a 7,0 y se aadieron 10 111 de 2-mercaptoetanol 14 mM, tras lo que se mantuvo en agitacin durante 1 hora a 20 oc en la oscuridad a temperatura ambiente, Finalmente, esta solucin se filtr por un filtro de 0,22 gm de tamao de poro (GV Millipore).

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Material y Mtodos

111.2.3.1.2. Fraccionamiento La columna se equilibr con 2,5 ml de 5 mM Bis-ris-propano-HCl (BTP) pH 7,0, seguidos de 3 ml de BTP conteniendo CINa 1 M y dc nuevo, 5 ml de BW. A continuacin, se inyectaron 200 g de la solucin de casena que se eluyeron en un gradiente discontinuo de CNa en tampn cromatogrfico de O a 0,4 M, que se alcanz como se especifica a continuacin: a los 2,5 ml de elucin, 0,10 M; a los 9 m, 0,11 M; a los 14 m, 0,22 M; a los 17,5 m, 0,23 M; a los 20,5 m, 0,25 M, a los 22,5 m, 0,28 M; a los 29 m, 0,295 M y a los 35 ml 0,40 M. El fraccionamiento de las casenas se realiz a temperatura ambiente y con un flujo de 1 ml/mm. El eluato se recogi, segn el perfil cromatogrfico, en fracciones de 1 ml que se dializaron exhaustivamente durante 48 horas y se liofilizaron. La concentracin de protena de las muestras se determin segn el mtodo descrito en el apartado 111.2.2. identificando las protenas presentes por electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (SDS-PAOE), en un equipo automatizado Phast~SystemTM de la manera descrita en el apartado 111.2.4,1.

111.2.3.2. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO ANIONICO CON DEAE-ET1 w1

CELULOSA
Las casenas de leche de cabra se fraccionaron por cromatografa de intercambio aninico dbil en una columna de dietil-amino-etil-celulosa (DEAE-celulosa), segn el mtodo descrito por Mercier y col. (1968) para el fraccionamiento de las casenas de la leche de oveja. 11L2.3.2.l. Preparacin de la celulosa y relleno de a columna Para ello se emplearon 21 g de DEAS-celulosa (Sigma D-8257), que se resuspendieron en agua desionizada, se filtraron y lavaron con NaC 0,5 M y NaOH 0,1 M hasta un pH bsico; con agua desionizada hasta pH neutro y con HOl 0,75 M hasta un pH cido. Finalmente, el soporte cromatogrfico se lav con agua destilada hasta que el filtrado qued libre de HCl, depositndolo en una columnade vidrio de Bio-Rad (2,5 x 37 cm), que se equilibr con 2 litros de tampn imidazol-HCl 0,02 M, pH 7,0. Como germicida, se aadio azida sdica al 0,01% y la columna se mantuvo a 40 C hasta su utilizacin.

102

Material y Mtodos

111.2.3.2.2. Preparacin de la casena

Se parti de 1 g de casena liofilizada de cabra (CC) se disolvi en 25 ml del tampn imidazol-HCl 0,02 M, con urea 3,3 M y un 0,1% de 2-mercaptoetanol, pH 7,0. Esta solucin se dializ frente a 500 ml del mismo tampn durante 24 h a 4 0C. 111.2.3.2.3. Fraccionamiento Immediatamente antes de su uso la columna se lav con 1 litro de tampn cromatogrfico (imidazol-HCl 0,02 M, conteniendo urea 3,3 M y un 0,1% de 2-mercaptoetanol, pH 7,0),tras lo cual la solucin de casena se deposit en la parte superior de la columna. Cuando la muestra penetr en el lecho cromatogrfico, se hicieron pasar 150 ml de tampn cromatogrfico, seguidos de un gradiente continuo de NaC de O a 0,3 M en 2,5 litros del mismo tampn. El fraccionamiento de las casenas se realiz a temperatura ambiente con un flujo del tampn de elucin de 2 m/mm. El eluldo se recogi en fracciones de 20 ml y la absorbancia de las mismas se determin espectrofotomtricamente a 280 nm. La mezcla de las fracciones cromatogrficas de inters se realiz segn los datos del perfil cromatogrfico, y las fracciones resultantes se dializaron exhaustivamente durante 48 horas, se liofilizaron y congelaron. 111.2.3.3. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO CATIONICO EN UNA MATRIZDE S-SBPHAROSE FAST-FLOW Las casenas de la leche de cabra tambin se fraccionaron en una columna con una matriz de S-Sepharose Fast Flow, que es un intercambiador catinico fuerte con un soporte de agarosa con los grupos funcionales -CH 2-S03-. La tcnica se realiz esencialmente de la manera descrita por Jaubert y Martn (1992) (Figura 111.3.). 111.2.3.3.1. Preparacin de la matriz y relleno de la columna Se emplearon 225 ml de S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) hidratada, con los que se rellen una columna de vidrio de Pharmacia (XK 26/20) y se equilibr con 700 ml de un tampn cromatogrfico que contena 0,064 mM dithiothreitol (UIT), 75 mM formato sdico y 7,5 M urea, pH 4,0. Como germicida se aadi azida sdica al 0,01%.

103

Material y Mtodos

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Material y Mtodos

111,2.3.3.2. Preparacin de la casena Se tom 1 g de casena liofilizada de leche de cabra (CC) que se disolvi en 25 ml de un tampn que contena 0,8 mM Dr!, 25 mM formato sdico y 7,5 M urea, pH 4,0. Esta solucin se dializ frente a 250 ml del mismo tampn, durante 2 horas a 24 C. 111.2.3.3.3. Fraccionamiento La muestra con las casenas se deposit en la parte superior de la columna y cuando penetr en el lecho cromatogrfico se hicieron pasar 100 ml del tampn cromatogrfico, seguidos por un gradiente continuo de NaC de O a 0,3 M en 2 litros del mismo tampn. La elucin se efectu a temperatura ambiente, con un flujo de 2 ml/mm con la ayuda de una bomba peristltica. El eluido se recogi en fracciones de 20 ml y la absorbancia de las mismas se determin a 280 nm en un espectrofotmetro. La mezcla de las fracciones cromatogrficas de inters se realiz segn los datos del perfil cromatogrfico y las fracciones resultantes se dializaron exhaustivamente durante 48 horas, se ajust su pH a 7,0, se liofilizaron y se determin su concentracin de protena segn el mtodo descrito en el apartado 111,2.2. Una vez obtenido el contenido proteico de las fracciones caseinicas resultantes, se caracterizaron electroforticamente (SDS-PAGE) en un equipo automatizado Phast~SystemTM de la manera descrita en el apartado 111.2.4.1, 111.2.4. CARACTERIZACION DE LAS FRACCIONES CASEINICAS PURIFICADAS Las fracciones caseinicas purificadas por FPLC y cromatografa de intercambio catinico sesometieron aelectroforesis en geles de poliacrilamida con dodedil sulfato sdico (SDS-PAGE) para identificar las protenas presentes en las muestras de inters.

111.2.4.1. ELECTROFORESIS EN PRESENCIA DE AGENTES DESNATU-ET1 w18 RALIZANTES (SDS-PAGE El dodecil sulfato sdico (SDS) es un detergente que, como otros agentes como el mercaptoetanol y el calor, interviene en la disociacin de las protenas en subunidades. 105

Material y Mtodos

Todas las subunidades polipeptdicas poseen la misma cantidad de SDS por unidad de peso (1,4 g SDS/g de protena) confiriendo a las cadenas polipepUdicas una carga negativa por lo que todos los polipptidos tendrn, por lo tanto, la misma densidad de carga y, su separacin se realizar en funcin de su tamao. De esta forma, cuando el complejo SDS-proteina se somete a electroforesis en un gel de poliacrilamida con SDS, su velocidad de migracin vendr determinada principalmente por la masa de la partcula SDS-polipptido, segn el principio de exclusin molecular. El campo elctrico, en este caso, slo suministra la fuerza impulsora. La electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (SDS-PAOE), se realiz empleando un equipo de electroforesis Phast~System~M (Pharmacia), dotado de una unidad de separacin y control y otra unidad de tincin. Para ello se utilizaron geles comerciales polimerizados (Phast Gel Homogeneous 20) y tiras de tampn (Phast Gel SDS) de Pharmacia. Descripcin y composicin del Phast Gel Romo 2eneous 20 (Pharmacia~ Rango de separacin Dimensiones (mm) Material Gel de concentracin Longitud (mm) Composicin (%T,%C) Gel de resoluci n Longitud (mm) Composicin (%T,%C) Tampn 2 150 KDa 43 x 50 x 0.45 Acrilaniida
-

13 7/ 3

32

20/2 O,112M acetato, 0,112 M Tris, pH 6,4

Siendo % T = g acrilamida g bisacrilamida 100 ml de solucin x 100 y % C = g bisacrilamida / % T. Descripcin y composicin de las tiras de tampn Phast Gel SDS (Pharmacia Dimensiones (mm) 41 x 10 x 6 Material 3 % Agarosa IEF

106

Material y Mtodos

Tampn

0.20 M Tricina, 0,20 M Tris, 0,55 % SDS, pH 8,1 111.2.4.1.1. Preparacin de las muestras

Las muestras con las casenas se disolvieron en un tampn que contena 10 mM Tris-ClH, 1 mM EDTA, pH 8,0, 2,5 % SDS, 5% 2-mercaptoetanol y 0,01% azul de bromofenol. Las muestras se calentaron hasta ebullicin durante 5 minutos y se enfriaron durante 1 hora a temperatura ambiente antes de depositar 5 1 cada solucin (10 gg de de protena) en el extremo catinico del gel. 111.2.4.1.2. Electroforesis Una vez colocadas las muestras, las condiciones programadas en el equipo automatizado Phast-System~ fueron de 250 voltios, 10 miliamperios, 3 watios, durante 90 voltios/hora a 15 0C, segn el manual de instrucciones del equipo ( Pharmacia, nota de aplicacin n0 111). 111.2.4.1.3. Teido y desteido del gel Terminada la electroforesis, los geles se tieron y destieron automticamente en la unidad de tincin con Coomassie R-350 (Phast Gel Blue R) durante 40 minutos a 50 0C, siguiendo las condiciones descritas en el manual de instrucciones (Pharmacia, nota de aplicacin n4 200). La composicin de las diferentes soluciones se describe acontinuacin Solucin de Uncin Phast Gel Blue R Metanol Agua destilada

0,1 % 30% 10%

Esta solucin debe filtrarse por papel (Whatman n4 1) antes de su uso. Solucin de Fijacin Glicem Acido Actico Agua desfilada

85%
107

5% 10%

Material y Mtodos

La solucin final de Uncin se obtuvo mezclando la solucin de tincin con la solucin de fijacin al 50% (y/y). Solucin decolorante Metanol Acido actico Agua destilada
30%

10% 60%

111.2.5. CARACTERIZACION INMUNOLOGICA PARCIAL DE LAS FRACCIONES CASEINICAS PURIFICADAS Las fracciones caseinicas de la leche de cabra obtenidas por FPLC y cromatografa de intercambio catinico, se caracterizaron immunolgicamente utilizando la tcnica immunolgica del ELISA Indirecto descrita en el apartado 111.2.8.1. La fraccin caseinica a5~ de la leche de cabra purificada por cromatografa de intercambio catinico result ser la fraccin ms inmungena y por esta razn, se ha utilizado en la obtencin de Anticuerpos Policlonales y Monoclonales. 111.2.6. PRODUCCION DE ANTICUERPOS POLICLONALES III.2.6.l.EE.QI.XKQLOfl~j.1,&1LfrllZACIQN Para la produccin de anticuerpos policlonales se emplearon 2 conejos machos de la raza Nueva Zelanda, de 3-3,5 Kg. de peso. La inmunizacin de los animales se reallz con 1,3 mg del extracto antignico emulsionados en una mezcla a partes iguales (0,5 m) de Adyuvante Completo de Freund y de solucin salina estril. Las inoculaciones se realizaron durante tres meses a intervalos de siete das, sustituyendo, a partir de la segunda inyeccin el Adyuvante Completo de Freund por el Incompleto. La va de inoculacin elegida para la primera dosis fue la intradrmica, repartida en varios lugares de la espalda del animal previa depilacin de la zona. Esta va se repiti una vez al mes, siendo las restantes dosis administradas por va intramuscular. 111.2.6.1.1. Comprobacin de la Inmunizacin Antes de la primera inoculacin y para comprobar la ausencia de reactividad de los 108

Material y Mtodos

animales frente al antgeno utilizado, se realiz una sangra inicial con extraccin de la sangre de la vena marginal de la oreja de los animales. Asimismo, cada 15 das se realizaron sangras parciales para verificar la eficacia del proceso de inmunizacin, determinando la reactividad de los inmunosueros utilizando la tcnica del ELISA Indirecto descrito en el apartado 111.2.8.1.

111.2.6.1.2. Sangra Final A los 115 das de comenzado el proceso de inmunizacin y una vez comprobado que el titulo de los inmunosueros era el adecuado, se efectu la sangra final de los animales por puncin intracardiaca, recogindose aproximadamente 150 ml de sangre de cada animal. 111.2.6.1.3. Obtencin y conservacin del suero La sangre obtenida se trasvas lentamente a tubos de ensayo limpios y se mantuvo durante 1 hora a temperatura ambiente para facilitar la formacin del cogulo. A continuacin, se separ cuidadosamente el cogulo de las paredes de los tubos con ayuda de una esptula y se mantuvo a 4 0C para favorecer su retraccin. El suero resultante se trasvas a tubos de centrfuga estriles y se centrifug durante 10 minutos a 2000 g a una temperatura de 4 0C. El sobrenadante obtenido se distribuy en fracciones de 2 ml alas que se aadi una solucin de azida de sodio al 0,0 1% como agente conservador. Los viales se mantuvieron en congelacin a -20 4C hasta el momento de su utilizacin.

111.2.6.2. PURIIFICACION PARCIAL DE LOS INMUNOSUEROS Los inmunosueros obtenidos se purificaron parcialmente por precipitacin selectiva con sulfato amnico. 111.2.6.2.1. Precipitacin de las inmunoglobulinas con sulfato amnico La precipitacin de las protenas con sulfato amnico es uno de los mtodos ms utilizados para la separacin de las protenas de una solucin. El mtodo se basa en que las protenas solubles forman puentes de hidrgeno con las molculas de agua a travs de sus grupos polares, por lo que cuando se aaden concentraciones elevadas de iones fuertemente cargados como el sulfato y el amonio, estos compiten con las molculas de agua. As, las 109

Material y Mtodos

protenas al perder su unin con las molculas de agua, disminuyen su solubilidad, lo que origina su precipitacin. La concentracin a la cual precipita cada protena depende de numerosos factores como el nmero y la posicin de los grupos polares, el peso molecular de la protena, el pH de la solucin y la temperatura a la cual se realiza la precipitacin. Adems, la concentracin de sulfato amnico necesaria para precipitar las inmunoglobulinas varia con la especie animal de la que proceden, aunque la ms conveniente en la mayora de los casos es una solucin al 50% (p/v) (Harlow y Lane, 1988). La precipitacin de las immunoglobulinas de los inmunosueros obtenidos frente a la fraccin caseinica as2 de la leche de cabra, se realiz segn el protocolo de Harlow y Lane (1988), que se describe a continuacin:
-

Centrifugar 5 ml de suero a 3000 g durante 30 minutos. A los sobrenadantes obtenidos se le aadieron, gota a gota y en agitacin, 5 ml de

una solucin saturada de sulfato amnico (76,1 g de (NH4)2 504 en 100 ml de agua destilada) cuyo pH se haba ajustado a 7,4 con NaOH lN immediatamente antes de su empleo. 0C y se centrifug a 3000 La mezcla resaltante se mantuvo durante toda la noche a 4 g durante 30 minutos para recuperar las inmunoglobulinas precipitadas. Eliminado el sobrenadante, las inmunoglobulinas del sedimento se resuspendieron en 2,5 ml de tampn fosfato salino (PBS, de pH 7,2) y, a continuacin, se dializaron durante 16 horas a 4 4C con tres cambios de PBS. Finalizada la dilisis, las inmunoglobulinas se distribuyeron en alcuotas de 2 ml mantenindose a -20 oc hasta su utilizacin.
-

111.2.7. OBTENCION Y PRODUCCION MONOCLONALES

DE

ANTICUERPOS

La obtencin de hibridomas productores de anticuerpos de especificidad definida, se describi por primera vez por K6hler y Milstein en 1975. La tcnica consiste en fusionar clulas secretoras de anticuerpos del un bazo de los animales inmunizados con clulas de mieloma (un tipo de clula B tumoral) de ratn. Las clulas secretoras aportan al hbrido la capacidad de produccin de anticuerpos especficos para el antgeno utilizado en la inmunizacin y las clulas de mieloma, la posibilidad de un crecimiento continuo iii vitro. Esta tcnica permite, en principio, inmortalizar cualquiera de los linfocitos B con distinta
110

Material y Mtodos

especificidad, de un ratn o de humanos respectivamente, de forma que secreten en torno a l0~ molculas de anticuerpo por segundo, fuera del control de elementos del sistema inmune distintos de los que tiene el propio hibridoma. Los anticuerpos producidos por las clulas hbridas o hibridomas reciben el nombre de anticuerpos monoclonales (Acm). 111.2.7.1. PROTOCOLO DE INMUNIZACION En la obtencin de Ac~ frente a la fraccin casena as~ de la leche de cabra, se emplearon ratones Balb/c de ocho semanas de edad. La inmunizacin de los ratones comenz con la inoculacin intraperitoneal de la casena as2 (0,1 mg) emulsionados en una mezcla a partes iguales (0,1 m) de Adyuvante Completo de Freund y de solucin salina estril. Las inoculaciones se realizaron durante 2 meses a mtervalos de 7 das, sustituyendo, a partir de la segunda inyeccin el Adyuvante Completo de Freund por el Incompleto. Cuatro das antes de la fusin, al ratn con un ttulo mayor de anticuerpos se le inyectaron intraperitonealmente 0,1 mg de la fraccin caseinica a5~ disueltos en 0,2 ml de solucin salina estril. 111.2.7.1.1. Comprobacin de la inmunizacin Durante la inmunizacin de los ratones se realizaron varias sangras parciales, para lo cual, se extrajo sangre de la base de la cola de los ratones mediante incisin perpendicular al eje mayor, la cual fue recogida Sor capilaridad. De la sangre obtenida se obtuvo el suero resultante, cuya reactividad frente al antgeno de inters se determin utilizando la tcnica del ELISA Indirecto descrito en el apanado 111,2.8.1

111.2.6.2. MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES EMPLEADAS Medio de cultivo completo (CRPMD

a
RPMI-1640 sin glutamina (Gibco) L-Glutamina (lOOx) (Gibco) Solucin de Penicilina-Estreptomicina (Gibco) Suero Fetal Bovino (Gibco) lii

arXLni
100 1 1 15

Material y Mtodos

Las botellas de suero fetal bovino se mantuvieron a 56 4C durante 30 minutos para inactivar el complemento. Medio de cultivo sin suero Es medio de cultivo completo (CRPMI) pero sin suero fetal bovino, Medio de cultivo comneto suplementado con hipoxantina. aminopterina y timidina (HAT-CRPMI~ Contiene medio de cultivo completo suplementado con un 2% del medio BAT (50 x, Gibco) Medio de cultivo completo suplementado con hipoxantina
y

timidina ELCEEMI=

Contiene medio de cultivo completo suplementado con un 2 % del medio NT (50 x, Gibco)
fi~Jj~~jR

Hl Bt5ehringer Mannheim Biochemica)

El medio BM~CondimedR Hl consta de una mezcla compleja de factores de crecimiento y citoquinas, los cuales estimulan el crecimiento de los hibridomas despus de la fusin y durante el clonaje. Utilizado como suplemento, evita la necesidad de utilizar clulas acondicionadoras de los medios de cultivo empleados, Se aade al 10% a los medios de cultivo de los hibridomas CRPMI, HAT-CRPMI y HT-CRPMI. Soluciones de Uncin Clulas de Mieloma: Se tien con una solucin de tripn azul al 2% en agua destilada. Linfocitos: Se tien con una solucin de tripn azul al 0,2% en agua destilada. El azul tripn es un colorante vital que tie de azul las clulas no viables, por lo que stas no deben ser contadas. Mezcla de congelacin Consiste en una solucin de dinietil sulfxido (DM50, Merck) al 10% en suero fetal 112

xi

Material y Mtodos

de ternera descomplementado. 111.2.7.3. OBTENCION DE LOS HIBRIDOMAS Para la obtencin de los hibridomas, se procedi a la fusin de los linfocitos esplnicos de los ratones inmunizados con las clulas de mieloma. 111.2.7.3.1. Obtencin de los linfocitos esplnicos de ratones inmunizados los

Para la obtencin de los linfocitos esplnicos se procedi a la extraccin del bazo del animal mejor inmunizado. Tras el sacrificio del animal por dislocacin cervical, se le sumerge al mismo en un bao de alcohol al 70% para su desinfeccin y se coloca en posicin de decbito lateral izquierdo, para con las tijeras y pinzas estriles escindir primero la piel y luego el peritoneo. La pieza anatmica extrada se deposit en una placa de Petri que contena 10 ml del medio de cultivo sin suero y con una hoja de bistur estril se dimin la grasa existente para evitar que los adipocitos distorsionen la imagen de los linfocitos o de los hibridomas al microscopio, al mismo tiempo que se realizaron pequeos cortes en el bazo. Realizada esta operacin, el bazo se recogi con una pipeta Pasteur estril de plstico y se coloc sobre una malla estril situada sobre un vaso de precipitados (tambin estril), para macerarlo con el mbolo de una jeringuilla de 5 ml. Los linfocitos suspendidos en el medio se recogieron con una pipeta Pasteur de boca ancha y se transfirieron a un tubo de centrfuga, centrifugndolos a 1500 rpm durante 5 minutos. El sedimento resultante se lav con 10 ml del medio de cultivo sin suero, estimando su concentracin celular mediante recuento con el hemocitmetro de Neubauer y tincin con tripn azul (Figura 111.4.). 111.2.7.3.2. Clulas de mielonia Utilizamos la lnea celular P3X63-Ag 8,653, que son clulas de mieloma de ratones Balb/c, con mutaciones que mactivan el enzima hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasa (HGPRTj y que tienen las siguientes caractersticas: crecimiento contnuo in XLIIQ dividindose en las condiciones ptimas de cultivo cada 24 horas, alta eficacia de donacin, alta eficiencia de fusin con los linfocitos de ratn y que no producen cadenas de inmunoglobulinas por si mismas. Estas clulas deben descongelarse unos 15 das antes de la fusin para su aclimatacin y para comprobar la viabilidad celular, posible existencia de 113

Materialy Mtodos

Dislocacin cervical

4
Bazo (10 ml RPMI)

Maceracin

Centrifugacin <1.500 rpm, 5>

4
Recuento de linfocitos

Figura 111.4. Obtencin de los linfocitos esplnicos de los ratones

inmunizados

114

Material y Mtodos

contaminaciones, etc. 111.2.7.3.3. Mantenimiento y propagacin de las clulas Se parti de un vial de clulas de mieloma congeladas en nitrgeno liquido, con una densidad celular de 5 x 106 clulas/ml. Rpidamente se introdujo el vial en un bao a 37 oc y, una vez descongelado, se resuspendi en 20 ml del medio de cultivo completo con ayuda de una pipeta estril. Esta nueva suspensin celular se reparti en 2 frascos de cultivo de 75 cm2 (dependiendo de la densidad celular) y los frascos se rellenaron con un volmen similar o ligeramente superior del medio de cultivo completo. Los frascos se incubaron en posicin horizontal a 37 0C en una atmsfera saturada de humedad y con un 5% de CO 2 y las clulas de mieloma se subcultivaron cada 48 horas. 111.2.7.3.4. Preparacin de las clulas para la fusin En el momento de realizar la fusin, es conveniente que las clulas de mieloma se encuentren en la fase de crecimiento logartmico, por lo que se subcultivaron el da anterior a la misma. El mismo da de la fusin, las clulas de mieloma se recogieron de los frascos de cultivo y se distribuyeron en tubos de centrfuga estriles, centrifugndolas a 1500 rpm durante 5 minutos y resuspendiendo el sedimento en medio de cultivo sin suero para lavarlas dos veces por centrifugacin a 1500 rpm durante 5 minutos. Despus de lavar las clulas se elimin el sobrenadante y el sedimento se resuspendi en 10 ml del medio de cultivo sin suero para determinar su concentracin celular. 111.2.7.3.5. Preparacin del agente fusionante La fusin celular es un proceso poco frecuente de manera espontnea, por lo que se requiere la utilizacin de agentes que promuevan la fusin de las clulas. Actualmente, el polietilenglicol (PEO) es el agente fusionante ms utilizado porque proporciona resultados reproducibles y una eficacia de fusin elevada. El PEG fusiona las membranas plasmticas de las clulas de mieloma y de los linfocitos adyacentes, formando una nica clula con 2 o ms ncleos. Estas clulas multinucleadas reciben el nombre de heterocariontes, pudindose fusionar los ncleos en la siguiente divisin celular, presentando entonces las clulas hijas aumentada su dotacin cromosmica. En este trabajo, como agente fusionante utilizamos el PEO de Pm 1.500 (B5ehringer Manheim GmbH), que previamente a su uso se calent 115

Material y Mtodos

durante 1 minuto en un bao a 37 0C. 111.2.7.3.6. Fusin celular El protocolo utilizado para la fusin celular fue el siguiente: Las concentraciones de clulas utilizadas en la fusin, se ajustaron de modo que la proporcin final entre los linfocitos esplnicos y las clulas de mieloma fuese de 5:1.
-

La mezcla celular se centrifug a 1500 rpm durante 5 minutos y el sedimento se resuspendi en 10 ml del medio de cultivo sin suero. El lavado de las clulas se realiza dos
-

veces ms. Despus de eliminar completamente el sobrenadante, el pellet celular se libera de la pared del tubo con pequeos golpecitos, introduciendo el tubo de centrfuga en un bao a 37 0C, tras lo cual se procedi a realizar la fusin celular aadiendo 1 ml de PEO, gota a gota y agitando, durante 1 minuto.
-

Transcurrido este tiempo, el PEG se diluy lentamente y en agitacin con medio de cultivo sin suero: Se aade 1 ml del medio de cultivo sin suero durante 1 minuto Se aaden 3 ml del medio de cultivo sin suero durante 3 minutos Se aaden 16 ml del medio de cultivo sin suero durante 6 minutos
-

Una vez diluido el PEO, las clulas se incubaron durante 15 minutos a 37 0C y un 5% de CO 2 y se sedimentaron por centrifugacin a 1500 rpm durante 5 minutos
-

Una vez eliminado el sobrenadante, las clulas se resuspendieron en 50 ml del medio HT-completo (HT-CRPMI) suplementado con un 10 % de BM-Condimed, distribuyendo la suspensin celular en alcuotas de 100 lfllpocilloen placas de 96 pocillos. Finalmente, las placas se incubaron a 37 oc en una atmsfera saturada de humedad con un
-

5% deCO2 111.2.7.4. Una vez concluida la fusin celular entre los linfocitos y las clulas de meloma, es posible la existencia de fusiones mieloma-mieloma, linfocito-linfocito y mieloma-linfocito, 116

MaterialyMtodos

presentando este ltimo dos subpoblaciones, una secretora y otra no secretora de anticuerpos especficos. Como se pretende la supervivencia de los hbridos linfocito-mieloma, es necesario establecer una primera seleccin a partir del medio de cultivo. 111.2.7.4.1. Medio selectivo Esta seleccin se efecta aadiendo al medio de cultivo componentes como la aminopterina del medio BAT que bloquea la sntesis de novo de los nucletidos. De esta manera las clulas deficientes en el enzima HPGRT, esto es, los hbridos niieloma-mieloma y las clulas de mieloma no fusionadas, mueren cuando este compuesto se encuentra en el medio de cultivo. El segundo tipo de hbridos formados, los hbridos linfocito-linfocito y los linfocitos no fusionados son clulas que mueren naturalmente tras 7-10 das de cultivo. tercer tipo de hbridos, es decir el mieloma-linfocito sobrevive en el medio selectivo BAT, pues la clula de mieloma le aporta la capacidad de reproducirse de forma ilimitada, mientras el linfocito aporta el enzima necesario (HGPRT) para la sntesis de nucletidos, utilizando la ruta de salvamento. Adems, el medio de cultivo HAT incorpora hipoxantina y timidina como nucletidos de refuerzo a la ruta de salvamento.
El

A las 24 horas de realizada la fusin comenz la seleccin de los hibridomas de inters aadiendo 100 II/pocillo del medio HAT (HAT-CRPMI) que bloquea el crecimiento del mieloma parental. Tras mantener los hbridos formados 7-10 das en este medio, se da por finalizada esta primera etapa de seleccin. Para el mantenimiento de los hibridomas, se ha seguido la siguiente pauta:
-

cambio de medio de las placas de fusin se realiz cada 48 horas Los seis primeros cambios se realizaron con el medio HAT-CRPMI para realizar la seleccin de los hbridos mieloma-linfocito Los tressiguientes cambios se realizaron con el medio HT-CRPMI Los cambios posteriores se realizaron con medio completo CRPMI Aproximadamente cada dos cambios de medio, se aadi al medio de cultivo el componente BM-Condimed al 10%
El

111.2.7.4.2. Pre-seleccin de los hibridamos productores de anticuerpos de inters Los procesos de fusin y seleccin son claves para el xito en la produccin de
117

Material y Mtodos

hibridomas. Para seleccionar los hbridos de inters, es necesario analizar el sobrenadante de los pocillos de las placas, y si a esto le unimos que es necesario efectuar este ensayo a distintos tiempos durante la produccin de los Acm podemos decir que la deteccin de los hibridomas productores de anticuemos constituye una de las partes ms laboriosas del proceso. Es imprescindible, por tanto, disponer para ello de una tcnica sencilla, rpida y econmica. Existen una gran variedad de mtodos para realizar la seleccin de los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales de inters, pero como norma general, debe elegirse el mismo mtodo para el que vaya a ser utilizado el Acm y utilizar procedimientos que permitan analizar grandes cantidades de muestras. En nuestro caso, la tcnica utilizada ha sido el ELISA Indirecto descrito en el apartado 111.2.8,1., utilizando como antgenos las casenas de la leche de oveja, vaca y cabra. 111.2.7.5. CLONACIONDE LOS HIBRIDOMAS DE INTERES Una vez seleccionados los hbridos productores de los anticuerpos de inters, se procedi a su donacin por dilucin lmite. El clonaje es importante, porque reduce el riesgo de un sobrecrecimiento de las clulas que por haber perdido cromosomas implicados en la sntesis de inmunoglobulinas, se han trasformado en no secretoras y, por esta razn, poseen una velocidad de crecimiento mayor. La donacin se efectu por el mtodo de dilucin lmite, para lo cual se tom una alcuota del contenido del pocillo positivo y se determin su concentracin celular. A las clulas se les aadi el medio completo-BAT o medio completo-HT, dependiendo del estadio de la fusin, para realizar diluciones seriadas a la mitad que se sembraron en placas de 96 pocillos. Se parti de una concentracin celular de unas 800 clulas/200 gl/pocillo hasta llegar a una densidad celular de 0,5 clulas/200 II/pocillo. El clonaje se repiti 3 veces. 111.2.7.5.1, Expansin de los clones Despus de la donacin de los hibridomas positivos, se procedi a la expansin de los mismos y a la obtencin masiva de Acm para su posterior anlisis y caracterizacin. La expansin de los hibridomas se efectu mediante subcultivo de las placas de 96 pocillos a placas de 48 pocillos, a placas de 24 pocillos, a placas de 6 pocillosy a frascos de cultivo de 25 cm2 y de 75cm2.

lis

MaterialyMtodos

111.2.7.5.2. Conservacin de los clones Los clones se conservaron por duplicado en congelacin a -80 0C y en N2 liquido para que no perdieran su viabilidad. Para ello se determin la concentracin de las clulas de los frascos de cultivo mediante recuento en el hemocitmetro de Neubauer y tincin con tripn azul y, posteriormente, las clulas se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y 6 clulas/ml en una mezcla se distribuyeron en criotubos a una concentracin celular de 5x10 de congelacin compuesta de un 90% de suero fetal bovino y un 10% de DMSO. La congelacin en N 2 se realiz lentamente: el contenedor con los criotubos se someti durante unas horas a la accin de los vapores de N2liquido para, posteriormente, introducirlos totalmente en el contenedor. 111.2.7.6. PRODUCCION DE Ac11, EN GRAN ESCALA La produccin de Acm en grandes cantidades se realiz mediante dos sistemas diferentes, el cultivo de hibridomas y la induccin de ascitis.

111.2.7.6.1. Cultivo de los hibridomas

2~ El Los cultivos de los hibridomas se realizaron en frascos de cultivo Nunc de 75 cm sobrenadante de los frascos se recogi cada 2 3 das, sustituyndolo por medio fresco, el medio de cultivo completo CRPMI + 10% BM-condimed. El crecimiento celular continu hasta la recoleccin de, aproximadamente. 50 ml de sobrenadante que se reparti en alcuotas de 2 ml y se congel a -20 0C hasta su utilizacin. 111.2.7.6.2. Produccin de lquido esctico Para inducir la ascitis, los ratones Balb/c se sensibilizaron mediante la administracin de 0,5 ml de pristane (2, 6, 10, 14 tetrametildecanoico) y, transcurridos 7 das, se les inocul por va intraperitoneal una concentracin de clulas de los hibridomas de inters de 1x106 en 0,5 ml de PBS estril. La recoleccin del lquido ascitico de los ratones, se realiz a los 15 das de la inoculacin por puncin intraperitoneal. El lquido ascitico recogido se incub 1 hora a 37 y toda la noche a 4 0C; posteriormente, se centrifug a 3000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se conserv en alcuotas de 1 ml a -20 o(2~
0(2

Los anticuerpos presentes en los sobrenadantes de los cultivos celulares y de los

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Material y Mtodos

lquidos ascicicos, se purificaron por precipitacin con sulfato amnico como se describe en el apartado 111.2.6.1. 111.2.7.7. CARACTERIZACION ISOTIPICA DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES

La clase y subclase de los Acm especficos frente a las casenas de la leche de cabra, se determinaron por un ELISA Indirecto, utilizando un inmunosuero comercial de conejo frente a las inmunoglobulinas IgOl, IgG2a, IgG2b, 1g03, IgM e IgA de ratn, utilizando un Kit comercial de Sigma. 111.2.7.8. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTENA DE

LQSANTICUEEEQ&MQNDCLONALES
Para ello, se parti de 1 ml de los sobrenadantes y lquidos asciticos, leyendo la absorbancia de las muestras resultantes a 280 nm segn lo descrito por Harlow y Lane (1988). 111.2.7.9. ESPECIFICIDAD La especificidad de los Acm de inters, se evalu para observar la existencia de reacciones cruzadas con casenas de otras especies animales con los que el epitopo diana pudiera ser confundido. En la determinacin de la especificidad de los Acm se utilizaron dos pruebas inmunolgicas: un ELISA Indirecto y la tcnica de Inmunoblotting. En el ELISA Indirecto los anticuerpos monoclonales se enfrentaron a un extenso panel de antgenos que incluan las casenas de la leche cruda de cabra, oveja y vaca; protenas musculares solubles de vaca, caballo, poo y cerdo y las protenas de gelatina, soja y seroalbmina bovina. La metodologa utilizada se describe en el apartado 11.2.8.1. En la tcnica del inmunoblotting el anticuerpo monoclonal B2B 11(2 se enfrent a las casenas totales de las especies de leche de cabra, oveja y vaca, adems de hacerlo frente a las fracciones purificadas por cromatografa de intercambio catinico de la leche de cabra. La metodologa empleada se describe en el apartado 111.2.8.4.

120

Material y Mtodos

111.2.7.10. CONJUGACION DE LOS ANTICUERPOS PURIFICADOS CON LA

BJOTINA
El marcaje de los anticuerpos por conjugacin con la biotina es una tcnica muy simple y exitosa. La biotinizacin no posee ningn efecto adverso en el anticuerpo y las condiciones de unin son suaves. Los anticuerpos biotinizados se detectan utilizando estreptavidina o avidina; ambas molculas son tetravalentes y los sitios adicionales de enlace pueden utilizarse para incrementar el tamao del complejo de deteccin y, por tanto, la fuerza de la seal. La mayora de las biotinizaciones se realizan utilizando un ster succinamida de biotina. El acoplamiento se produce a travs de grupos amino libres en el anticuerpo u otra protena, normalmente, de la lisina. Si un grupo amino libre forma parte de un lugar de la protena que es esencial para su actividad (para un anticuerpo normalmente el sitio de combinacin con el antgeno), la biotinizacin con el ster de succinamida puede disminuir la actividad de la protena, y debern utiizarse otros mtodos de marcaje. Para el marcaje de nuestros anticuerpos con la biotina se procedi como sigue: Se prepar una solucin de N-hidroxysuccinamida biotina en DM50 a u~a concentracin de 1 mg/ml. Los anticuerpos purificados se disolvieron en un tampn borato sdico (0,1 M, pH 8,8) a una concentracin de 1 mg/ml. La solucin de biotinase aadi a la del anticuerpo, en una concentracin de 25-250 ~g de ster/mg de anticuerpo, mezclando bien las soluciones que se incubaron toda la noche a temperatura ambiente. A la mezcla anterior de biotina/anticuerpo, se le aadieron 20 gl/250 gg de ster de
-

una solucin 1 M de NH4Cl. La mezcla se incub durante 10 minutos a temperatura ambiente. La biotina libre se elimin de la mezcla por dilisis de la misma durante 16 horas a 0C frente a PBS. 4 Los anticuerpos conjugados se congelaron en alcuotas de 1 ml a -20 0C hasta el momento de su utilizacin.
-

121

Material y Mtodos

111.2.8. TECNICAS INMUNOENZIMATICAS (ELISA)

111.2.8,1. TECNICA DEL ELISA INDIRECTO En este trabajo se han utilizado dos variantes de la tcnica del ELISA Indirecto. La primera es un ELISA Indirecto clsico que emplea un conjugado comercial de anticuerpos anti-especie unidos al enzima peroxidasa de rbano, mientras la segunda es un ELISA Indirecto utilizando el sistema de amplificacin biotina-avidina. Esta tcnica se diferencia de la primera, en que los anticuerpos especficos se conjugan con la biotina (biotinizacin) y la deteccin de este complejo se realiza con un conjugado comercial de avidina o estreptavidina marcada con un enztma. La tcnica del ELISA Indirecto se basa en que los antgenos fijados a una superficie inerte son reconocidos por los correspondientes anticuerpos especficos y el complejo formado se detecta por un segundo anticuerpo marcado con un enzima, que reconoce como antgenos a los anticuerpos especficos. La reaccin es visible porque al actuar el enzima sobre el sustrato se libera un compuesto coloreado. a) M~ En el desarrollo de este trabajo se han empleado una gran variedad de antgenos:
-

Casenas de la leche cruda de cabra, oveja y vaca, obtenidas como se describe en el apartado 111.2.1.1. Fracciones caseinicas purificadas por FPLC y cromatografa de intercambio catinico. Extractos crnicos que contienen las protenas musculares solubles de cerdo, caballo, po11o y vaca Protenas de gelatina, soja y seroalbmina bovina. Leches crudas y calentadas de cabra, oveja y vaca. Mezclas lcteas, preparadas como se describe en el apartado 111.2.1.2. Quesos frescos, tiernos y madurados de cabra, oveja y vaca. Mezclas experimentales de quesos (apartado 111.2.1.3.)

b) Anticuerpos Se utilizaron tambin varios inmunosueros: 122

Material y Mtodos

Los anticuerpos especficos anticaseinas de la leche de cabra, purificados por cromatografa de afinidad frente a los extractos liofilizados de las casenas de las leches de oveja y vaca y, posteriormente, biotinizados (obtenidos previamente en nuestro Departamento por Rodrguez y col., 1991).
-

Los anticuerpos anti-caseina as2 de la leche de cabra obtenidos por la inmunizacin

de conejos y purificados parcialmente por precipitacin de las inmunoglobulinas con sulfato amnico.
-

Los Anticuerpos monoclonales frente a la casena a5~ de la leche de cabra obtenidos

por inmunizacin de ratones Balb/c y fusin posterior de los linfocitos del bazo con clulas de mieloma. Estos anticuerpos se emplearon parcialmente purificados por precipitacin con sulfato amnico, sin biotinizar y tambin biotinizados. Conjugado En la deteccin y cuantificacin de los anticuerpos marcados con biotina, se emple un conjugado comercial de estreptavidina-peroxidasa de rbano. En la deteccin y cuantificacin de los anticuerpos sin biotinizar, se emplearon un conjugado comercial anti-inmunoglobulinas de conejo obtenidas en cerdo y marcadas con el enzima peroxidasa de rbano (anticuerpos policlonales) o de anti-inmunoglobulinas de ratn obtenidas en cabra marcadas con peroxidasa de rbano (anticuerpos monoclonales). d) Tampones y Reactivos 1.- Tampn PBS de pH 7,2 Se compone de: NaC
Na2HPO4.12 H20 KH2PO4 KCI

8,0 g 2,9 g
0,2 g 0,2 g

Agua destilada 2.- Tampn PBST

1 L

Se prepara como el tampn PBS y se le aade un 15% de Tween 20. 123

Material y Mtodos

3.- Sustrato El sustrato empleado fue el cido 2-Wazino-bis-3-etilenbenzotiazolina sulfnico (ABTS) (BLiehringer Manheim), comercializado como tabletas que condenen el ABTS y que se disuelven en un tampn que contiene perborato sdico, cido ctrico y fosfato disdico. 4.- Solucin de tapizado Gelatina al 1% en tampn PBS de pH 7,2. e) Metodolo2ia del ELISAIndirecto Los 96 pocillos de una placa de ELISA (Costar 3590) se sensibilizaron con 100 g de las muestras antignicas correspondientes disueltas en tampn PBS y la placa se incub durante 1 hora a 37 0C, tras lo cual se lav 5 veces con tampn PBST. A continuacin, para tapizar las zonas del pocillo en las que no se hubiera adsorbido el antgeno, se aadieron a cada pocillo 200 gl de gelatina al 1% en tampn PBS. La placa se mantuvo 30 minutos a 37 y los pocillos se lavaron 5 veces con tampn PBST para eliminar el exceso de gelatina. Posteriormente, se aadieron a cada pocillo 100 g del anticuerpo correspondiente diluidos en tampn PBST y la placa se incub en un agitador de placas de ELISA durante 1 hora a temperatura ambiente.
0(2

Finalizada la incubacin, los pocillos se lavaron de nuevo 5 veces con tampn PBST para eliminar los restos de anticuerpo que no hubieran reaccionado. Seguidamente, se depositaron en cada pocillo 100 t del conjugado diluido en tampn PBST y, de nuevo, la placa se mantuvo en el agitador durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar los pocillos 5 veces con agua destilada para eliminar los restos del conjugado libre, se aadiieron acada pocillo 100 jil del sustrato, manteniendo la placa en el agitador durante 20 minutos a temperatura ambiente. El color verde resultante de la degradacin del sustrato, se cuantific midiendo la absorbancia de cada pocillo a 405 nm en un lector espectrofotomtrico de placas de ELISA. En la prueba se realizaron los siguientes controles:
-

Control de antgeno: gelatina + anticuerpo + conjugado + sustrato Control de anticuerpo: antgeno + gelatina + conjugado + sustrato Control de conjugado: gelatina + conjugado + sustrato

124

Material y Mtodos

Si la absorbancia a 405 nm de alguno de los controles era mayor de 0,150, el experimento se consideraba nulo. 111.2.8.2. TECMCA DEL ELISA SANDWICH En esta tcnica, los anticuerpos especficos se fijan a una fase slida y actan como anticuerpos de captura de los antgenos problema. Los antgenos anclados son reconocidos por los mismos anticuerpos conjugados con la biotina y el complejo formado se detecta con un conjugado comercial de estreptavidina-peroxidasa. La reaccin se pone de manifiesto, porque al actuar el enzima sobre el sustrato, se ilbera un compuesto coloreado.

a) Mti~enos

Como antgenos se emplearon las mezclas de leche crudas con los porcentajes de sustitucin indicados en la seccin 111.2.1.2. b) Anticuerpos de captura y de deteccin Se emplearon dos sistemas diferentes:

Captura

Deteccin

1.2.-

Ac. monoclonales Ac. policlonales

Ac. policlonales Ac. monoclonales

Co~u2ado Se emplearon el conjugado comercial de antiinmunoglobulinas de conejo o el de antiinmunoglobulinas de ratn, segn el anticuerpo de deteccin empleado. e) Tampones y reactivos Adems de los descritos en la seccin 111.2.8 d, se utiliz el tampn carbonato125

Material y Mtodos

bicarbonato de pH 9,6 cuya composicin es la siguiente:

-

Tampn carbonato-bicarbonato de pH 9,6 Na2CO3 NaHCO3 Agua destilada

2,93 g 2,93 g iL

e) Metodoloela del ELISA Sandwich Los pocillos de una placa de ELISA (Costar 3590) se sensibilizaron con 100 ktl de los anticuerpos de captura correspondientes diluidos en tampn carbonato-bicarbonato de pH 9,6 y la placa se incub durante 1 hora a 37 o(2~ Transcurrido este tiempo, los pocillos se lavaron 5 veces con tampn PBST para eliminar los anticuerpos no adsorbidos a la placa. A continuacin, para tapizar las zonas del pocillo en las que no se hubieran adsorbido los anticuerpos, se aadieron a cada uno de ellos 200 tI de gelatina al 1% en tampn FRS. La placa se mantuvo 30 minutos a 37 0(2 y los pocillos se lavaron de nuevo 5 veces con tampn PBST para eliminar el exceso de gelatina. Posteriormente, se aadieron a cada pocillo 100 U del antgeno correspondiente diluidos en tampn PBST y la placa se mantuvo en agitacin durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras un nuevo lavado con PBST, sc depositaron en cada pocillo 100 II del anticuerpo de deteccin correspondiente y la placa se mantuvo en agitacin durante 1 hora a temperatura ambiente. Despus de otro lavado con PBST, se aadieron a cada pocillo 100 pl del conjugado disuelto en PBST y la placa se incub una hora en agitacin a temperatura ambiente. Finalmente, tras lavar los pocillos 5 veces con agua destilada para eliminar los restos del conjugado libre, se aadi a cada pocillo 100 111 del sustrato, manteniendo la placa en el agitador durante 20 minutos a temperatura ambiente. El color verde resultante de la degradacin del sustrato por el enzima, se cuantific midiendo la absorbancia de los pocillos a 405 nm en un lector espectrofotomtrico de placas de ELISA. En la prueba se realizaron los siguientes controles:
-

Control de antgeno: anticuerpo de captura + gelatina + anticuerpo de deteccin + conjugado + sustrato. Control del anticuerpo de captura: gelatina + antgeno + anticuerpo de deteccin + conjugado + sustrato. Control del anticuerpo de deteccin: anticuerpo de captura + gelatina + antgeno + conjugado + sustrato. Control de conjugado: gelatina + conjugado + sustrato.
126

Material y Mtodos

111.2.8.3. TECNICA DEL ELISA COMPETITIVO

En esta tcnica, el antgeno especfico se fija a una superficie inerte, y, a continuacin, se aaden el anticuerpo especifico con la muestra problema (de concentracin antignica desconocida) que competir con el antgeno adsorbido por el anticuerpo especfico. El ensayo se cuantifica por la concentracin de conjugado comercial que se une al complejo anticuerpo-antgeno adsorbido. Como control se utilizan pocillos sin la muestra problema, cuantificando la diferencia de absorbancias entre los pocillos con la muestra problema o sin ella ambos, que es indicativa de la concentracin del antgeno de inters en la muestra problema. a) AnU~enos En esta tcnica se han empleado tres formatos antignicos diferentes: 1.- Lechecrudadecabra 2.- Casenas totales de la leche de cabra (CC) 3.- Casena as2 de la leche de cabra purificada por cromatografa de intercambio catinico

Se emple el anticuerpo monoclonal B2B liC purificado por precipitacin con sulfato amnico.

Las muestras problema utilizadas comprendieron los diferentes porcentajes de sustitucin de leche de oveja y vaca por la de cabra, as como las de sustitucin de quesos de oveja y vaca por el de cabra, Corn~u2ado Como conjugado se utiliz uno comercial de anti-inmunoglobulinas de ratn obtenidas en cabra, marcado con el enzima peroxidasa de rbano, d) Tampones y reactivos
127

Material y Mtodos

Se emplearon los utilizados en la tcnica del ELISA Indirecto descritos en la seccin

111.2.8.1 d.

e) Metodolo~ia del ELISAComnetitivo Los pocillos de una placa de ELISA (Costar 3590) se sensibilizaron con 106 II de la muestra antignica correspondiente y la placa se incub toda la noche a 4 O(2~ A la maana siguiente, tras lavar 5 veces las placas con PBST y para tapizar las zonas de los pocillos en las que no se hubiera adsorbido el antgeno, se aadieron a cada pocillo 200 fi de gelatina al 1% en tampn PES. La placa se mantuvo durante 30 minutos a 37 0(2 y los pocillos se lavaron de nuevo 5 veces con tampn PBST para eliminar el exceso de gelatina. A continuacin, se aadieron a cada pocillo 50 U del anticuerpo monoclonal y 50 tI de la muestra problema, diluidos en tampn PBST y la placa se mantuvo en agitacin durante 1 hora a temperatura ambiente. Despus de otro lavado de los pocillos con PBST para eliminar las protenas que no se hubieran unido, se aadieron a cada pocillo 100 tI del conjugado comercial diluido en tampn PBST y, de nuevo, la placa se incub en agitacin durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, tras lavar los pocillos 5 veces con agua destilada para eliminar los restos del conjugado libre, se aadieron a cada pocillo 100 tI del sustrato, manteniendo la placa en el agitador durante 20 minutos a temperatura ambiente. El color verde resultante de la degradacin del sustrato por el enzima, se cuantific midiendo la absorbancia de cada pocillo a405 nm en un lector espectrofotomtrico de placas de ELISA. En la prueba se realizaron los siguientes controles:
-

Control de antgeno: gelatina + anticuerpo + muestra problema + conjugado + sustrato. Control del anticuerpo : antgeno + gelatina + muestra problema + conjugado + sustrato. Control de la muestra problema : antgeno + gelatina + anticuerpo + conjugado + sustrato. Control de conjugado: gelatina + conjugado + sustrato.

111.2.8.4.

IECIiIC&DELINMLINQBLQJ2INfl

La identificacin del epitopo o epitopos reconocidos por nuestro anticuerpo en los antgenos de inters, se realiz utilizando la tcnica del inmunoblotting. Esta tcnica consiste en la transferencia electrofortica de protenas separadas por electroforesis, de un gel de
128

Material y Mtodos

poliacrilamida a una membrana sinttica, seguida de un mtodo inmunolgico de identificacin de las protenas de la membrana. El inmunoblotting es un mtodo muy sensible de identificacin de protenas especficas en una mezcla antignica compleja y tiene muchas aplicaciones en la deteccin, identificacin y caracterizacin de protenas, as como de visualizacin de las interacciones protena-protena. La transferencia electrofortica de las protenas de los geles de poliacrilamida a las membranas de nitrocelulosa, sc realiz utilizando un equipo automatizado Phast~TransferIM de Pharmacia (semi-dry electrophoretic transfer system), dotado de dos unidades independientes: el separador del gel y la caja de electrodos utilizado conjuntamente con la unidad de separacin y control del Phast~SystemTM. El equipo automatizado Phast-Transfer~ transfiere las protenas de una manera rpida y reproducible; adems la utilizacin de geles de poliacrilamida pequeos, combinados con la transferencia semiseca, minimizan la cantidad de reactivos y tampones utilizados en otros sistemas de transferencia de protenas. 1- Separacin electrofortica de las protenas La separacin electrofortica de las protenas se realiz en geles de poliacrilamida con SDS utilizando un equipo automatizado Phast~SystemTM de Pharmacia y siguiendo la tcnica descrita en el apartado 111.2.4. Como muestras antignicas se depositaron en el gel las casenas totales de la leche de cabra, oveja y vaca, adems de las fracciones caseffiicas de la leche de cabra obtenidas por cromatografa de intercambio catinico. Se utilizaron dos geles idnticos, uno de los cuales se ti de la manera descrita como en el apartado 111.2.4. y, el otro, se utiliz en la transferencia de las protenas a una membrana de nitrocelulosa. 2- Transferencia de las protenas del ael de poliacrilamida la membrana de
nia~biQ5a

Una vez realizada la electroforesis, las protenas presentes en el gel de poliacrilamida se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 ,xm, utilizando el equipo automatizado Phast-Transfer~. Las condiciones programadas para la transferencia fueron 20 V, 25 mA, 5 V a 15 de temperatura y durante 15 minutos. El tampn de transferencia utilizado consisti en una solucin 25 mM tris, 192 mM glicina, 20 % metanol, de pH 8,3.
0(2

3- Inmunoidentificacin de las protenas en la membrana de nitrocelulosa Terminada la transferencia electrofortica de las protenas, se procedi a la realizacin 129

Material y Mtodos

de un ELISA Indirecto sobre la membrana de nitrocelulosa. a) Antgenos Como antgenos se emplearon las protenas separadas electoforticamente y transferidas a la membrana de nitrocelulosa.

Se emple el anticuerpo monoclonal B2B 11(2 parcialmente purificado por precipitacin con sulfato amnico. ConjuEado Se utiliz un conjugado comercial de anti-inmunoglobulinas de ratn obtenidas en cabra y marcadas con peroxidasa de rbano. d) Tampones y Reactivos 1.- Tampn Tris salino (TBS), pH 7.5 Se compone de: NaC Tris Agua desionizada 2.- Tampn TBST Se prepara como el tampn TBS y se le aade un 0,05% de Tween 20. 3.- Sustrato Como sustrato se utiliz la diaminobenzidina (Sigma) disuelta en tampn Tris-HCI 50 mM de pH 7,6 (6 mg de dianiinobenzidina/ 10 ml tampn). Esta solucin debe filtrarse por papel de filtro Whatman n0 1 y, en el momento de la adicin a la membrana, se le aaden 100 t de H 202 /10 ml de tampn. 4.- Solucin bloqueante 29,24 g 2,42 g 1 L

130

Material y Mtodos

Seroalbumina bovina al 1% en tampn lBS de pH 7,5. e) Metodolo2a del ELISA Indirecto sobre membrana de nitrocelulosa Terminada la transferencia electrofortica, la membrana de nitrocelulosa se lav durante 10 minutos en tampn lBS para eliminar los posibles restos de gel que pudieran quedar. A continuacin, se aadi a la membrana la solucin bloqueante en tampn IBST y se mantuvo durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas de ELISA, tras los que se volvi a lavar durante 10 minutos en tampn TBST. Posteriormente, la membrana se incub con el anticuerpo monoclonal B2B lIC diluido (1/1000) en tampn TBST durante 1 hora, en agitacin y a temperatura ambiente. Finalizada la incubacin, la membrana se lav de nuevo con TBST y se le aadi el conjugado comercial de anti-inmunoglobulinas de ratn diluido en TBST mantenindose en el agitador durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar la membrana con agua destilada, la especificidad del anticuerpo monoclonal B2B 1 lC sobre las protenas de la membrana de nitrocelulosa, se visualiz aadiendo el sustrato.

131

CAPITULO IV

RESULTADOS

Resultados

IV.1. FRACCIONAMIENTO

DE

LA

CASENA

DE

LA DE

LECHE DE CABRA POR CROMATOGRAFA INTERCAMBIO IONICO.

El fraccionamiento de la casena total de la leche de cabra, se realiz de la manera descrita en la seccin 111.2.3. de esta memoria. IV.1.1. CROMATOGRAFA LQUIDA RPIDA DE PROTENAS (FPLC) El fraccionamiento de la casena total de la leche de cabra por cromatografa lquida rpida de protenas (FPLC) en una columna Mono Q MR 5/5, utilizando un gradiente discontnuo de CINa de O a 0,4 M, se muestra en la Figura IV.1. Los resultados obtenidos indican la separacin de la casena total en tres fracciones mayoritarias (1, 2 y 3), bien separadas, que por comparacin con el perfil de elucin de las casenas de la leche de vaca (Davies y Law, 1987), se identificaron como casena ic (1), 3(2) y as (3) respectivamente. Las fracciones individuales integrantes de las tres fracciones mayoritarias se mezclaron, dializaron y liofilizaron, determinando su concentracin determin su concentracin de protena segn el mtodo descrito en el apartado 11.2.2. de esta memoria, resultando lo siguiente:
-

Fraccin n0 1:128 tg de protena/mg de extracto liofilizado. Fraccin n0 2:115 tg de protena/mg de extracto liofilizado. Fraccin n0 3: 260 gg de protena/mg de extracto liofilizado.

Conocida la concentracin de protena de las fracciones resultantes, se determin el rendimiento proteico por gramo de casena liofilizada de cabra (CC), que fue de 50 mg para la fraccin n0 1, 55 mg para la fraccin n0 2 y 130 mg para la fraccin n0 3. Una vez determinada la concentracin de protena de cada fraccin, se realiz la identificacin de las protenas presentes en las mismas, por electroforesis de las fracciones en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (SDS-PAGE), utilizando el equipo automatizado Phast~SystemTM.
IV. 1.1.1. CARACTERIZACION ELECTROFORETICA DE LAS FRACCIONES CASEINICAS PURIFICADAS POR FPLC

La separacin e identificacin de las protenas integrantes de las fracciones caseinicas

133

Resultados

In

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134

Resultados

purificadas por FPLC, utilizando la electroforesis de SDS-PAGE, se muestra en la Figura IV.2. Los resultados obtenidos sugieren que las protenas del primer pico eluido (1) contienen la casena ic, la segunda fraccin (2) contena la casena 3 y la tercera (3) la fraccin caseinica as ( asi y as2). Estos resultados confirman los obtenidos del perfil de elucin e indican una separacin aceptable de las casenas x, 3 y ct5, purificadas, aunque la separacin entre las casenas a5~ y a52 resulta incompleta. IV.1.2. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO ANIONICO CON DEAE-CELULOSA En la Figura IV.3. se observa el fraccionamiento de la casena total de la leche de cabra, por cromatografa de intercambio aninico con DEAE-celulqsa y un gradiente lineal de CNa de O a 0,3 M. Las casenas eluyeron en 5 fracciones distintas, no bien separadas, por lo que se concluy que esta tcnicacomnmente utilizada para el fraccionamiento de las casenas bovinas y ovinas (Mercier, 1968), no permite una separacin adecuada de las cuatro casenas caprinas. IV.1.3. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO CATIONICO EN UNA MATRIZ DE S-SEPHAROSE FAST-FLOW La figura IV.4. el fraccionamiento de 1 g de casena caprina, por cromatografa de intercambio catinico en una columna con una matriz de S-Sepharose Fast-Flow, utilizando un gradiente lineal de CNa de O a0,3 M. Los resultados obtenidos indican la separacin de la casena total en cinco fracciones diferentes (1, 2, 3, 4 y 5), que se dializaron exhaustivamente, se liofilizaron y se determin su concentracin de protena mediante una modificacin del mtodo de Lowry (Markwell y col., 1978), descrito en el apartado 111.2.2. El contenido proteico de las fracciones fue el siguiente:
-

fraccin 1: 526 tg de protena/mg de extracto liofilizado fraccin 2: 44 ~.tg protena/mg de extracto liofilizado de fraccin 3: 9 tg de protena/mg de extracto liofilizado fraccin 4: 503 tg de protena/mg de extracto liofilizado fraccin 5: 461 tg de protena/mg de extracto liofilizado

El rendimiento proteico por gramo de casena liofilizada de cabra (CC), fue de 462 mg 0 1, 9,3 mg para la fraccin n0 2, 2,5 mg para la fraccin n0 3, 123 mg para la fraccin n para la fraccin n0 4 y 91 mg para la fraccin n0 5. La identificacin y pureza de las 135

Resultados

CC

CO

Fi

F2

F3

Figura 11.2. Electroforesls SDS.PAGE.PhastSystenlTM de las caninas de la leche de

cabra rracclonadas por FPLC en geles de pollacrilamida al 20%. Lnea CC, casenas totales de la leche de cabra; lnea Co, casenas totales de
la leche de oveja; lnea FI, fraccIn 1 (casena ic); lnea F2, fraccidn 2 (casena 3); lnea F3, fraccIn 3 (casena cz5).

136

Resultados

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137

Resultados

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40

138

Resultados

protenas de las fracciones, se determin por electroforesis de las mismas en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (SDS-PAGE), utilizando el equipo automatizado Phast-System~.
IV. 1.3.1. CARACTERIZACION ELECTROFORETICA DE LAS FRACCIONES CAS EINICAS PURIFICADAS POR CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO CATIONICO

Los resultados de la caracterizacin electrofortica de las fracciones caseinicas obtenidas por cromatografa de intercambio catinico, se muestran en la Figura IV.5. Estos resultados confirman los obtenidos por Law y Tziboula (1992) y sugieren que la fraccin 1 contiene la casena 3 completa de la leche de cabra, por lo que no se consigui la separacin de las dos formas de esta casena (Pi y 32)~ probablemente debido a que la nica diferencia entre ellas es el grado de fosforilacin (6 grupos fosfato en la Pi y 5 en la 32) y, por lo tanto, la diferencia de sus pesos moleculares es muy pequea. La fraccin 2, que migr por encima de la casena 3 de acuerdo con su menor peso molecular, contena la casena ic. La fraccin 3, contena pequeas bandas proteicas no identificadas y que no se utilizaron en anlisis posteriores. La fraccin 4, contena la casena as con residuos de las casenas 3 y ic y, finalmente, la fraccin 5 contena mayoritariamente la casena a5~, migrando por encima de la banda de la casena a5, de acuerdo con su peso molecular ligeramente mayor. En esta ltima fraccin tambin se detectaron bandas de protena con un peso molecular inferior al de la casena as2, que probablemente sean fracciones minoritarias de la casena a5, identificadas previamente por Grosclaude y col. (1987).

IV.2. CARACTERIZACION INMUNOLOGICA PARCIAL

DE LAS FRACCIONES CASEINICAS PURIFICADAS Una vez separadas las fracciones caseinicas de la leche de cabra, empleando diversas tcnicas cromatogrficas y una vez identificadas las protenas de las fracciones electroforticamente, la siguiente etapa de este trabajo consisti en la caracterizacin inmunolgica de las mismas mediante un ELISA Indirecto. El ensayo utiliza anticuerpos policlonales obtenidos en conejo frente a la casena total de la leche de cabra (and-CC), purificados por cromatografa de afinidad en una columna conteniendo casenas de la leche de cabra inmovilizadas (CC) y, posteriormente, biotinizados y neutralizados frente a los extractos liofilizados de las casenas de la leche de vaca (CV) y oveja (CO) (Rodrguez y col., 1991). 139

Resultados

CC

F5

F4

F3

FZ

FI

Figura 11.5. Electroforesls 8DS~PAGE~PhastSystCmTM de las casenas de la leche do

cabra fraccionadas por cromatografa de intercambio catlnlco en geles

de pollacrilamida al 20%. Lnea CC, casenas totales de la leche de cabra; lnea Fi, fraccin 1 (casena ~) ; lnea F2, fraccin 2 (casena 1c); lnea 3, fraccin 3 (bandas difusas de protena); lnea F4, fraccin 4 <casena a5j, con casenas 3 y c>; lnea F5, fraccin (casena a8~~

mayoritarIamente).

140

Resultados

Para determinar las concentraciones adecuadas de los componentes del ensaye, se realizaron numerosos experimentos, como antgenos se emplearon, adems de las fracciones purificadas por FPLC y cromatografa de intercambio catinico, las casenas totales de la leche de vaca (CV), oveja (CO) y cabra (CC) a diferentes concentraciones (O a 20 gg de protena en tampn PBS). Como conjugado, se utiliz uno comercial de Streptavidina-peroxidasa. Las diluciones de trabajo ptimas de los inmunosueros fueron de 1/1000 (y/y) en tampn PBST, mientras que la del conjugado fue la 1/3000 (y/y) en tampn
PBST.

Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras IV.6. y IV.7., donde se muestran los valores de absorbancia a 405 nm de cada una de las fracciones purificadas, as como de las casenas totales utilizadas como antgenos y de los que se desprende que los inmunosueros anti-CC reconocen muy poco a las casenas de la leche de oveja (CO), observando los mismos resultados frente a las casenas de la leche de vaca (CV) (no se muestran los datos). Los valores de absorbancia ms altos se obtuvieron con la fraccin 3 (casena cts) purificada por FPLC (Figura IV.6.), fraccin 5 (casena as2) purificada por cromatografa de intercambio catinico (Figura IV.7.) y con la casena total de cabra (CC) (Figuras IV.6. y IV.7.). La casena ~i purificada por cromatografa de intercambio catinico (Figura IV.7.) mostr valores de absorbancia ms bajos que la fraccin 82 purificada por el mismo mtodo. Las fracciones caseinicas jc y 13 obtenidas por FPLC (Figura IV.6.) y por cromatografa de intercambio catinico (Figura IV.7.), obtuvieron unos valores de absorbancia mucho ms bajos o, lo que es lo mismo, mostraron muy poca inmunoreactividad frente al inmunosuero especifico de las casenas de la leche de cabra. Se puede por tanto, afirmar que la fraccin 5 de la leche de cabra (casena a82), obtenida por cromatografa de intercambio catinico es la ms inmunoreactiva frente al inmunosuero especifico anti-CC, probablemente porque es la fraccin con un mayor nmero de epitopos especficos de las casenas de la leche de cabra. Esta fraccin se utiliz en la inmunizacin de conejos para la obtencin de anticuerpos policlonales y, de ratones Balb/c, como primer paso en la obtencin de anticuerpos monoclonales especficos frente a las casena de la leche de cabra.

IV.3. PRODUCCION DE ANTICUERPOS POLICLONALES

Para la obtencin de los inmunosueros se emplearon conejos que se inmunizaron con la casena cts2 de la leche de cabra, purificada por cromatografa de intercambio catinico. Antes de comenzar el protocolo de inmunizacin, alos conejos se les extrajo una muestra de
141

Resultados

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In

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Figura IV.6.

10

15

20

Concentracin de casena (xg)

ELISA Indirecto de las fracciones caseinicas purificadas por FPLC, utilizando anticuerpos blotinizados especficos frente a las casenas totales de la leche de cabra (anti-CC). Fraccin 1 (A,case(na K), fraccin 2 (A casena 3), fraccin 3 ( o casena cts), casenas totales de oveja (O ) y casenas totales de cabra (
, ,

3
E

PC

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10

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20

Concentracin de casena
Figura Vi.

ELISA Indirecto de las fracciones caseinicas purificadas por cromatografa de intercambio catinico, utilizando anticuerpos biotinizados especficos frente a las casenas totales de la leche de cabra <anti-CC). Fraccin 1 (A, casena 3), fraccin 2 (A, casena c), fraccin 4 6<, casena si con residuos de 3 y O, fraccin 5 (o, casena 52), casenas totales de oveja (O ) y casenas totales de cabra ( ). 142

Resultados

sangre y el suero obtenido se analiz por la tcnica del ELISA Indirecto frente a los extractos antignicos de inters (CC, CV y CO); despus de comprobar que ninguno de los conejos presentaba reactividad inmunolgica frente a dichos extractos antignicos, los animales se consideraron aptos para su inmunizacin, Durante la inmunizacin de los conejos, se realizaron tres sangras parciales para comprobar si producan anticuerpos frente a las casenas de cabra, as como para detectar si existan o no reacciones cruzadas con las casenas de otras especies animales. En la sangra parcial, efectuada a los 48 das de la primera inoculacin, ya se detect una reaccin inmunolgica significativa de los inmunosueros anti-casefna as~ frente a sus respectivos extractos antignicos. En las sangras realizadas a los 68 y 80 das, se apreci un incremento significativo de la respuesta inmunolgica de los conejos frente alos extractos antignicos de inters y, por ello, a los 115 das de iniciar el proceso de inmunizacin se efectu la sangra final. Los inmunosueros procedentes de la sangra final se purificaron parcialmente por precipitacin con sulfato amnico y empleando un ELISA Indirecto, se eva]u su potencial de discriminar las casenas de la leche de cabra, vaca y oveja, utilizando como antgenos 20 gg de las casenas totales de estas leches, los inmunosueros purificados a diferentes diluciones (1/1000 a 1/64000 y/y en tampn PBST) y, como conjugado uno comercial de anti- inmunoglobulinas de conejo obtenidas en cerdo y conjugadas al enzima peroxidasa de rbano a la dilucin 1/1500 (y/y) en tampn PBST. En la tabla IV.l. se muestta la actividad del inmunosuero obtenido de conejos frente a la fraccin que contiene la casena a5~ de la leche de cabra, observndose que los anticuerpos utilizados reconocen a todos los extractos antignicos y por tanto son incapaces de discriminar las casenas de la leche de cabra de las de vaca y oveja.

IV.4. OBTENCION Y PRODUCCION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

Para la obtencin de anticuerpos monoclonales, comenzamos la inmunizacin de ratones Balb/c de ocho semanas de edad, con la casena as~ de la leche de cabra purificada por cromatografa de intercambio catinico. Como en el caso de los conejos, a los ratones se les extrajo una muestra de sangre antes de comenzar la inmunizacin y el suero se analiz por un ELISA Indirecto frente a 20 ~.tge los extractos antignicos CC, CV y CO. Ninguno d de los animales manifest tactividad inmunolgica frente a dichosextractos, por lo que se 143

Resultados

Tabla IV.1. Actividad del inmunosuero obtenido de conejos frente a la casena de la leche de cabra, utilizando un ELISA

Indirecto
DILUCIONES

INMUNOSUERO CABRA
1/1000

CASEINAS TOTALES (20 gg)

VACA 2,775
2,744

QYEJA 2,854 2,824 2,407 1,700

2,854*
2,824 2,598 1,907 1,416 0,951 0,579

1/ 2000 1/4000 1/8000

1/ 16000 1 1 32000 1/64000

1,720
1,141 0,838 0,604 0,375

1,236
0,849 0,479

Densidad ptica a 405 mi

144

Resultados

consideraron aptos para su inmunizacin. Durante la inmunizacin de los ratones tambin se realizaron sangras parciales. En la primera de ellas, efectuada a los 25 das, ya se apreci inmunoreactividad de los animales frente a las CC, incrementndose sta en la segunda y terceras sangras, realizadas a los 40 y 55 das respectivamente del comienzo de la inmunizacin, por lo que procedimos a realizar la fusin celular a los 60 das de la primera inoculacin. IVA.1. FUSION CELULAR El bazo del ratn con el ttulo mayor de anticuerpos frente a las casenas de la leche de cabra (Figura IV.8.), se utiliz para la fusin de los linfocitos con las clulas de mieloma (P3X63-Ag 8.653). A las 24 horas de realizada la fusin se comenz la seleccin de los hibridomas con el medio HAT y, a los 7 das, ya se observaban los primeros hibridomas al microscopio. A los 15 das, se evalu la capacidad de los sobrenadantes de los hibridomas para reconocer a las casenas de la leche de cabra mediante un ELISA Indirecto. Las condiciones de este ensayo preliminar fueron: Antgeno: 20 ~.tg extracto antignico CC/pocillo del Anticuerpo: sobrenadantes de cultivo de los hibridomas (dilucin 1/1) Conjugado: uno comercial de anti-inmunoglobulinas de ratn obtenido deconejo y marcado con el enzima peroxidasa de rbano ala dilucin 1/1500 (vIs) en tampn PBST
-

De este estudio determinamos que la eficiencia de la fusin celular (nmero de pocillos que mostraban crecimiento de hibridomas/nmero total de pocillos utilizados) fue mayor del 50%. Asimismo, de 400 pocillos que mostraban crecimiento de hibridomas, el 25% producan anticuerpos frente a las casenas de la leche de cabra. IV.4.2. SELECCION DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES DE
INTERES

Los sobrenadantes de los hibridomas se analizaron tambin mediante un ELISA Indirecto frente a los extractos antignicos CO y CV (20 .tg), para determinar su especificidad. Este segundo estudio determin la existencia de 8 lIneas celulares que producan anticuerpos especficos frente a las casenas de la leche de cabra y que no reconocan inmunolgicamente a las casenas de las leches de vaca y oveja. Estos 8 hibridomas fueron donados por dilucin limite, hasta obtener los subclones estabilizados denominados: A1H 11H (A1H), B2B liC (B2B), C2H 1lH (C2H), C6C 70 (C6C), CXI 2A (CXI), F4E 2E (F4E) y A6F SD (A6F).

145

Resultados

Por otra parte, la posible inmunidad cruzada de las 8 lineas celulares productoras de anticuerpos monoclonales frente a las casenas de la leche de cabra, se examin mediante un ELISA Indirecto, enfrentando los sobrenadantes celulares a 20 .tg/pocillo de diferentes extractos antignicos (Tabla IV.2.). De los resultados obtenidos, se deduce que los anticuerpos monoclonales analizados son monoespecificos para las casefnas de la leche de cabra y no reconocen otras protenas como las casenas de la leche de vaca y oveja, extractos crnicos (de cerdo, vaca, caballo y pollo), protena de soja, gelatina y seroalbmina bovina. Estas 8 lineas celulares fueron seleccionadas para la produccin en gran escala de anticuerpos monoclonales frente a las casenas de la leche de cabra lo que se llev acabo de dos formas diferentes. Por una parte, se expandieron las lineas celulares mediante subcultivos celulares sucesivos de placas de 96 pocillos a placas de 48, 24 y 6 pocillos y a frascos de cultivo de 25 y 75 cm2, hasta obtener aproximadamente 50 ml de los sobrenadantes. Al mismo tiempo, 2 lineas celulares (B2B y C2H) se utilizaron en induccin de tumores asciticos en ratones Balb/c, recogiendo unos 2 ml de liquido asctico de cada lnea celular. IV.4.3. CARACTERIZACION ISOTIPICA DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES SELECCIONADOS
La caracterizacin inmunolgica de la clase y subclase de los 8 anticuerpos

monoclonales, se reajiz utilizando un Kit comercial de Sigma con un antisuero comercial de conejo y mediante un ELISA Indirecto. Los resultados obtenidos indicaron que 6 hibridomas secretaban anticuerpos IgGl, mientras otros 2 (AlH y F4E) secretaban IgM. IV.4.4. ACTIVIDAD DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES SELECCIONADOS, FRENTE A LAS CASENAS DE LA LECHE DE CABRA UTILIZANDO UN ELISA INDIRECTO Para determinar la especificidad y reactividad de los 8 anticuerpos monoclonales de los sobrenadantes de las lineas celulares y de los lquidos asciticos, se desarroll un ELISA Indirecto, en el que las condiciones del ensayo fueron: Antgeno: 20 .tg de las casenas de la leche de cabra (CC)/pocillo Anticuerpos monoclonales: los sobrenadantes de las 8 lineas celulares y los 2 lquidos asciticos a diferentes diluciones (1/8000 a 1/12800) (y/y) en PBST Conjugado: uno comercial de anti-inmunoglobulinas de ratn obtenidas de conejo y marcadas con la enzima peroxidasa de rbano, a la dilucin 1/1500 (vIs) en PBST.
-

146

Resultados

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Resultados

En la Figura IV.9. se muestran los resultados obtenidos y de su anlisis es posible afirmar que de los 8 anticuerpos monoclonales obtenidos de los sobrenadantes de las lineas celulares, 3 de ellos (B2B, Bl2B y C2H) son los ms reactivos (1/3200 B2B, 1/1600 E 12B y 1/1600 C2H), mientras que de los 2 lquidos asciticos obtenidos, el B2B (1/10000) fue el de mayor actividad. De esta forma, nuestro trabajocontinu con la seleccin de los 3 anticuerpos monoclonales que mostraban la mayor reactividad inmunolgica a partir de los sobrenadantes celulares (B2B, E 12B y C2H) y uno del liquido asctico (B2B). Los tres anticuerpos nonoclonales seleccionados se purificaron parcialmente por precipitacin con sulfato amnico y se determin su concentracin de protena, segn el mtodo descrito por Harlow y Lane (1988), obteniendo los siguientes resultados:

Anticuerpo nonocional Liquido Ascitico B2B Sobrenadante C2H Sobrenadante B12B Sobrenadante B2B

Concentracin de protena (mg/mi) 0,49 0,99 0,98 1,19

Una vez purificados y para determinar si la purificacin parcial por sulfato amnico habla influido en su actividad inmunolgica, realizamos un ELISA Indirecto con las mismas condiciones que el realizado con los anticuerpos sin purificar (Figura IV.9.). De los resultados de la Figura IV.10~, se comprueba que los resultados obtenidos con los anticuerpos monoclonales sin purificar y purificados son los mismos, lo que significa que su purificacin parcial por sulfato amnico no reduce su actividad. El siguiente paso fue la determinacin de la actividad de los 4 anticuerpos monoclonales seleccionados, frente a la leche cruda de cabra. Para ello se realiz un ELISA Indirecto utilizando como antgeno leche cruda de cabra a la dilucin 1/200 (y/y) en tampn PBS, los sobrenadantes de cultivo y el liquido ascitico a diferentes diluciones (1/800 a 1/12800. vIs en tampn PBST) y el conjugado de anti-inmunoglobulinas de ratn a la dilucin 1/1500 (y/y) en PBST. De los datos obtenidos (Figura IV.11.), se desprende que de los 4 anticuerpos monoclonales estudiados, los ms inmunoreactivos frente al extracto antignico de la leche cruda de cabra fueron el sobrenadante del cultivo y el lquido ascitico del hibridoma B2B. Por esta razn, el Acm B2B presente en el sobrenadante del cultivo celular y en el liquido ascitico, fue seleccionado para contmuar con l nuestro trabajo. 148

Resultados

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0 1000

10000

100000

1000000

Logaritmo dilucin del Anticuerpo

Figura IV8 Reactividad de los inmunosueros de los cinco lotes de ratones
inmunizados, frente a la casena cts2 de la leche de cabra y utilizando un ELISA Indirecto, Lote 1 ( O), lote 2 < A ), lote 3 <0 ), lote 4 y lote 5 (u ).

a .2
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1000 10000 100000 1000000 Logaritmo dilucin del Anticuerpo

100

Figura IV 9. Reactividad de los anticuerpos nionoclonales obtenidos de los sobrenadantes de las lneas celulares AlE ( A ), B121 <U ), BID ( A ), C~ (~ ), CdC (4.), F4E ( p ), 07G (u) y MF (14) y de los lquidos asciticos B2B ( e ) y C211 ( oD, frente a las casenas de la leche de cabra, utilizando un ELISA Indirecto.

149

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Resultados

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Figura v.ia

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100000

1000000

Logaritmo dilucin del Anticuerpo

Reactvidad de los anticuerpos monoclonales purificados de los sobrenadantes de las lneas celulares BX2B (0 ), BID ( A ) y C211 ( ) y del lquido asctico BID ( A ), frente a 20 p.g de las casenas de la leche de cabra, utilizando un ELISA Indirecto,

r
a . . .

y
Figura Vil,

0 100

.1

1000

10000

100000

1000000

Logaritmo dilucin del Anticuerpo

Reactividad de los anticuerpos monoclonales purificados de. los sobrenadantes de las lineas celulares BX2B < A ), E22 ( A ) y CIH CC) y del liquido ascitico B28 ( o ), frente a la leche de cabra (dilucin 1/200), utilizando un ELISA Indirecto.

150

Resultados

IV.4.5. DETERMINACION DE LA ESPECIFICIDAD Y ACTIVIDAD DEL ANTICUERPO MONOCLONAL B2B En la Tabla IV.3. se muestran los valores de absorbancia a 405 nm del Acm B2B, procedente tanto del lquido ascitico como del sobrenadante del cultivo celular a diferentes diluciones (1/800 a 1/12800, y/y en tampn PBST), frente a las casenas de la leche de cabra, oveja y vaca (20 gg/ l00~. en tampn PHS) y frente ala leche cruda de cabra, oveja y vaca (dilucin 1/200 v/s en tampn PBST). De los resultadod obtenidos, se deduce que la especificidad del anticuerpo monoclonal del sobrenadante celular, frente a las casenas y la leche cruda de cabra, es mayor que la que presenta en el liquido ascitico, Debido a esta mayor especificidad, elegimos el sobrenadante celular del cultivo del hibridoma B2B, para continuar nuestro trabajo de investigacin. Debido a que el objetivo de nuestro trabajo era detectar la leche de cabra, tanto en mezclas frescas como en quesos madurados, el siguiente paso en nuestra investigacin consisti en evaluar la actividad del Acm B2B frente a la leche de cabra sometida a los tratamientos trmicos de pasterizacin y esterilizacin (dilucin 1/200 y/y en tampn PBS). De los resultados de la Tabla IV.4., se deduce que la actividad del Acm B2IB frente ala leche cruda, pasterizada y esterilizada de cabra fue prcticamente la misma, lo que indica que la actividad de dicho anticuerpo monoclonal es constante frente a las diferentes temperaturas de procesado de la leche de cabra. Finalmente, la especifidad del Acm B2B frente a las casenas de la leche de cabra, oveja y vaca, as como frente a las casenas ([3, ic, asi y as2) de la leche de cabra purificadas por cromatografa de intercambio catinico (20 gg/lOOp.l en PBS), se determin por la tcnica de inmunoblotting. La dilucin del Acm B2B empleada fue la 1/1000 (y/y) en tampn PBST. De los resultados obtenidos (Figura IV.12.), se deduce que el Acm B2B es monoespecifico frente ala casena asz de la leche de cabra. Debido a la especificidad del Acm B2B purificado, frente a la casena de la leche de cabra, se decidi utilizarlo en la deteccin y cuantificacin de la presencia de leche de cabra en mezclas lcteas frescas y quesos madurados, mediante el desarrollo y puesta a punto de tcnicas inmunoenzimticas (ELISA) adecuadas.

151

Resultados

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Resultados

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154

Resultados

IV.5.

DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA EN MEZCLAS LACTEAS, UTILIZANDO METODOS INMUNOENZIMATICOS (ELISA)

El Acm B2B parcialmente purificado por precipitacin con sulfato amnico, se utiliz en las tcnicas de ELISA Indirecto, Sandwich y Competitivo para determinar la presencia de la leche de cabra cruda y de la sometida a tratamientos tnnicos en mezclas lcteas con leches frescas de oveja y vaca. Como se describe en la seccin 111.2.1.2. de esta memoria, se utilizaron tres mezclas experimentales independientes de leche de cabra en leche de oveja, y de leche de cabra en leche de vaca, dependiendo del origen de la leche de cabra. De cada mezcla, se realizaron 6 ensayos independientes para, posteriormente, realizar estudios estadsticos utilizando el programa Statview y representar los valores medios obtenidos en forma de recta patrn. Cada punto de la recta patrn representa, por lo tanto, la media de los valores de absorbancia a405 nm de las seis experiencias independientes realizadas con cada mezcla. IV.5.1. DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE CRUDA DE CABRA EN LA LECHE CRUDA DE OVEJA A. TECNICA DEL ELISA INDIRECTO Las concentraciones ptimas de los reactivos utilizados en los ensayos, se determinaron tras varias experiencias preliminares y siguiendo la metodologa descrita en el apanado 111.2.8.1. de esta memoria. Los resultados obtenidos indicaron que la dilucin ms apropiada del Acm B2B era la 1/1000 (y/y) en tampn PBST, mientras que la del conjugado de antiinmunoglobulinas de ratn obtenidas de conejo y marcadas con el enzima peroxidasa de rbano fue la 1/1500 (y/y) en tampn PBST. Como antgeno se utilizaron las tres mezclas lcteas experimentales realizadas a la dilucin 1/25 (vIs) en tampn PBS, con los porcentajes de sustitucin de 0,0,5,1,2,5, 5,10 y 15% de leche cruda de oveja por leche cruda de cabra. La Figura IV.13., muestra los valores medios de la absorbancia a 405 nm, de las tres mezclas experimentales procedentes de 6 ensayos diferentes. Utilizando esta tcnica y los reactivos descritos, es posible cuantificarla sustitucin de un 0,5 a un 15% de leche cruda de oveja por leche cruda de cabra, mediante la ecuacin: A405= 0,3505 + 0,1138 x, cuyo 155

Resultados

coeficiente de regresin fue de r2= 0,996 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 0,996 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de leche de cabra por leche de oveja. Aunque la recta patrn nos permite cuantificar del 0,5 al 15% de sustitucin, los valores de absorbancia para los porcentajes de sustitucin menores (0,5-2,5%) son pequefios y poco significativos, por lo que decidimos intentar mejorar estos resultados utilizando otra tcnica inmunoenzimtica.

B. TECNICA DEL ELISA SANDWICH En la desarrollo de esta tcnica inmunoenzimtica se utilizaron varios modelos experimentales. El primero de ellos utilizaba el inmunosuero anti-CC obtenido de conejos y el Acm B2B, ambos purificados parcialmente por precipitacin con sulfato amnico, del que se realizaron dos variantes, una que tena como anticuerpo de captura al Acm B2B y como anticuerpo de deteccin al inmunosuero anti-CC y, otra, en la que se invirtieron las posiciones, es decir, como anticuerpo de captura el inmonusuero anti-CC y como anticuerpo de deteccin el monoclonal B2B. Los resultados obtenidos (no mostrados), indicaron que este sistema de ELISA Sandwich, no discriminaba la leche de cabra de la leche de oveja. Para el segundo modelo, utilizamos dos anticuerpos monoclonales (B2B y B 12B) y como en el caso anterior, se realizaron varios experimentos intercambiando las posiciones de los anticuerpos de captura y de deteccin. Los resultados obtenidos (no mostrados), de este segundo modelo tampoco permitieron discriminar entre las leches de cabra y oveja, ya que incluso la leche de oveja sin nada de cabra muestra una absorbancia a 405 nm de 0,5 y 0,6, no existiendo diferencias entre los porcentajes de mezcla ms bajos y los ms altos. Los resultados de las experiencias descritas en este apartado permiten concluir que las tcnicas del ELISA Sandwich desarrollados no mostraron su utilidad en la deteccin de leche de cabra en la de oveja. C. TECNICA DEL ELISA COMPETITIVO Dada la ineficacia del ELISA Sandwich y con el fin de mejorar los resultados obtenidos con la tcnica del ELISA Indirecto, se procedi al desarrollo y puesta a punto un ELISA Competitivo. En primer lugar, se determinaron las concentraciones idneas de los reactivos 156

Resultados

utilizados en los ensayos. Despus de varios ensayos preliminares, se establecieron las condiciones ptimas de trabajo, que fueron: AnUg~nQ: como antgeno se utilizaron 20 gg/podilo de las casenas totales de cabra liofilizadas (extracto antignico CC>.
-

a la dilucin 1/200 en tampn PBST (y/y) en tampn PBST en los diferentes porcentajes de sustitucin de leche de oveja por leche de cabra.
-

Mu~srna.prnbkmx las tres mezclas de leche experimentales realizadas,

-.~.njkjj~r.pa: el monoclonal B2B, parcialmente purificado por precipitacin con sulfato amnico a la dilucin 1/1000 (y/y) en tampn PBST.
-

Cm~jjagdQ: uno comercial de anti-inmunoglobnlinas de ratn obtenidas deconejo y

conjugadas al enzima peroxidasa de rbano, diluido a la 1/1500 (y/y) en tampn PBST. Los resultados obtenidos con el ELISA Competitivo (Figura IV.14.) se muestran en funcin del % de Inhibicin, calculado a partir de los valores de la absorbancia obtenidos a 405 nm, de la siguiente manera:

B (valor de la A405 en cada punto)

96 A405 = x 100

B0 (valor de la A)5 del 0% de mezcla)

96 Inhibicin= 100 96 A405

-

Los estudios estadsticos se realizaron del mismo modo que en el ELISA Indirecto, por lo que cada punto de la grfica representa la media del porcentaje de inhibicin de seis experiencias distintas, con cada una de las tres mezclas experimentales. Con esta tcnica es posible detectar y cuantificar la sustitucin de un 0,25% a un 15 % de leche de oveja por leche de cabra, utilizando la ecuacin de regresin logartmica: log A405= 0,0383 0,3831 2= 0,976 y el coeficiente de regresin ajustado log x, cuyo coeficiente de regresin fue de r Adj. r2 = 0,970 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de leche de oveja por leche de cabra.
-

Comparando estos resultados con los obtenidos con el ELISA Indirecto, se observa 157

Resultados

2,4 E O
o o
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2,0
1,6

<u Sc Ls o Sc

1,2
0,8

0,0

5 10 15 % Sustitucin Leche de Oveja/Cruda de Cabra

Figura IV 13. Deteccin de eche cruda de cabra en leche de oveja, utilizando

la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes con 3 mezclas lcteas distintas.

90 80
0
O

70 60 50 40 30 20 o

10 15 % Sustitucin Leche de Oveja/Cruda de Cabra

5

Figura IV 14. Deteccin de leche cruda de cabra en leche de oveja, utilizando

la tcnica del ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultadas de 6 experiencias
diferentes con 3 mezclas lcteas distintas.

158

Resultados

que la tcnica del ELISA Competitivo permite detectar y cuantificar porcentajes de mezcla mucho mds bajos, ya que para sustitucines del 0,25% se aprecia ya un porcentaje de Inhibicin superior al 25%, de lo que se deduce que la sensibilidad de este ensayo es mucho mayor que el del ELISA Indirecto. D. TECNICA DEL ELISA INDIRECTO UTILIZANDO EL
SISTEMA DE AMPLIFICACION BIOTINA..AVIDINA

En esta tcnica el Acm E2B parcialmente purificado por precipitacin con sulfato amnico, se conjug a la biotina y la deteccin de los anticuerpos biotinizados unidos a sus antgenos especficos, se realiz empleando un conjugado de comercial estreptavidinaperoxidasa. Con el fin de poner a punto esta tcnica se realizaron numerosos experimentos, aunque los resultados obtenidos (no mostrados), indicaron que la biotinizacin del Acm B2B originaba una disminucin de su actividad para reconocer la leche de cabra en mezclas lcteas, por lo que se decidi utilizar las tcnicas del ELISA Indirecto y Competitivo con los anticuerpos sin conjugar con la biotina en el resto de la investigacin. IV.5.2.DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE CRUDA DE

CABRA EN LA LECHE CRUDA DE VACA A. TECNICA DEL ELISA INDIRECTO

La metodologa y los reactivos empleados en la deteccin de leche cruda de cabra en la leche cruda de vaca, fueron los descritos en la seccin IV.5, 1.A. La dilucin del Ac~ fue la 1/1000 y la del conjugado la 1/1500. Como antgeno se utilizaron las tres mezclas lcteas experimentales a la dilucin 1/25 (y/y) en tampn PBS, con los porcentajes de sustitucin de 0,0,5, 1,2,5, 5,10 y 15% de leche cruda de vaca por leche cruda de cabra. En la FiguraIV. 15. se muestran los valores de la absorbancia a 405 mu obtenidos con las tres mezclas experimentales utilizadas. Cada punto de la grfica corresponde a los valores medios de los resultados de seis experiencias independientes. De los resultados obtenidos, se deduce que la tcnica del ELISA Indirecto permite detectar la sustitucin de un 0,5 a un 15% de leche de vaca en leche cruda de cabra, utilizando la ecuacin de regresin lineal: A405= 0,4211 + 0,1122 x, cuyo coeficiente de regresin fue de r2= 0,98 1 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,977 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de leche de vacan por leche de cabra.

159

Resultados

B. TECNICA DEL ELISA COMPETITIVO Con objeto de mejorar los resultados obtenidos con el ELISA Indirecto, para pequeos porcentajes de leche cruda de vaca por leche cruda de cabra, se procedi a la puesta a punto de un mtodo de ELISA Competitivo. Para ello, se emplearon las diluciones de antgeno, anticuerpo y conjugado descritos en la seccin IV.5.l.C. Las muestras problema fueron tres mezclas lcteas experimentales con diversos porcentajes de sustitucin de lechefresca de vaca por leche crudade cabra a la 1/200 en PBST (vis). La figura IV.16. muestra la relacin entre el porcentaje de Inhibicin de la absorbancia a 405 nm y el porcentaje de sustitucin de la leche, calculados a partir de 6 ensayos con las 3 mezclas lcteas independientes. La absorbancia se relaciona con el porcentaje de inhibicin como se describe en el apartado IV.5. 1.C.y con el porcentaje de sustitucin (0,25-15%), mediante la ecuacin de regresin logartmica: log A~5= 0,4290 0,3360 log 2= 0,975 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. x, cuyo coeficiente de regresin fue de r = 0,970 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de leche de vaca por leche de cabra.
-

Con los resultados obtenidos es posible decirque, al igual que ocurra en la deteccin de leche cruda de cabra en leche de oveja, el ELISA Competitivo mejora sensiblemente la deteccin y cuantificacin de leche cruda de cabra en leche de vaca.

IV.5.3. INFLUENCIA

DEL TRATAMIENTO TERMICO EN LA DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA EN LECHE CRUDA DE OVEJA

Para determinar la posible influencia de los tratamientos trmicos en la deteccin y cuantificacin de la leche de cabra en la leche de oveja, las muestras de leche cruda de cabra de la procedencia que se indica en la seccin 111.1.2.2., se sometieron a los tratamientos trmicos de pasterizacin y esterilizacin descritos en la seccin 111.2.1.2. Posteriormente, se prepararon las tres mezclas resultantes de cada tratamiento trmico (leche pasterizada de cabra/leche cruda de oveja y leche esterilizada de cabra/leche cruda de oveja), las cuales se analizaron por las tcnicas del ELISA Indirecto y ELISA Competitivo.

160

Resultados
2,4

2,0
o o
<u <u

1,6 1,2
0,8

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1~

Sc
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0,4 0,0
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15 10 % Sustitucin Leche de Vaca/Cruda de Cabra

Figura V.1S. Deteccin de leche cruda de cabra en leche de vaca, utilizando

la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes con 3 mezclas lcteas distintas.

90 u 80 70
e

60 50 40 30 20
o

10

15

% Sustitucin Leche de Vaca/Cruda de Cabra Figura .16. Deteccin de leche cruda de cabra en leche de vaca, utilizando

corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes con 3 mezclas lcteas distintas.

la tcnica del ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica

161

Resultados

A. TECNICA DEL ELISA INDIRECTO Utilizando el ELISA Indirecto descrito en la seccin IV.5.l.A., se analizaron las tres mezclas que contenan 0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10 y 15% de sustitucin de leche cruda de oveja /lech epasterizada de cabra y de las otras tres mezclas con los mismos porcentajes de sustitucin leche cruda de oveja/ de leche esterilizada de cabra. Las Figuras IV. 17. y IV. 18. muestran los resultados del ELISA Indirecto, para la deteccin y cuantificacin de porcentajes de sustitucin del 0,5 al 15% de leche cruda de oveja por leche pasterizada (IV.17.) o esterilizada (IV.l8.) de cabra. Las ecuaciones de regresin lineal, calculadas a partir de seis ensayos independientes con tres mezclas lcteas experimentales distintas, fueron las que se describen a continuacin. En el caso de la leche pasterizada: A405= 0,131 + 0,4583 x, cuyo coeficiente de 2= 0,983 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,979 (p= regresin fue de r 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de leche de oveja por leche pasterizada de cabra. Para la leche esterilizada: A~ 5= 0,3208 + 0,0955x, cuyo coeficiente de regresin fue 2= 0,966 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,960 (p= 0,0001), siendo xci de r porcentaje de sustitucin de leche de oveja por leche esterilizada de cabra. Con los resultados obtenidos podemos afirmar que el ELISA Indirecto utilizado en la deteccin de leche pasterizada o esterilizada de cabra en leche de oveja, permite cuantificar porcentajes de sustitucin del 0,5 al 15%. En la Figura IV. 19. se muestran los valores de absorbancia con el ELISA Indirecto, para la deteccin y cuantificacin de porcentajes de sustitucin en el rango del 0,5 al 15% de leche de oveja por leche cruda, pasterizada o esterilizada de cabra. De ellos se deduce, que la sensibilidad del ELISA Indirecto para detectar la presencia de leche pasterizada de cabra en la de oveja es incluso mejor que para la leche cruda, disminuyendo ligeramente en las mezclas con leche esterilizada.

B. TECNICA DEL ELISA COMPETITIVO

Las mezclas de leche pasterizada y esterilizada de cabra con leche cruda de oveja, tambin se analizaron mediante la tcnica del ELISA Competitivo descrito en la seccin
IV.5.1.C.

162

Resuhados 2,4

o
cg
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e
2,0

1,6
1,2
e

1
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0,8

10 15 % Sustitucin Leche de Oveja/Pasterizada de Cabra Figura .17 Deteccin de leche pasterizada de cabra en leche de oveja, utilizando la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6
5

0,0

experiencias diferentes con 3 mezclas lcteas distintas.

2,0

a
a

1,6 1,2 0,8

1
.0 .0

10 15 % Sustitucin Leche de Oveja/Esterilizada de Cabra Figura .18. Deteccin de leche esterilizada de cabra en leche de oveja,
5

0,0

utilizando la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes con 3 mezclas lcteas distintas.

163

Resultados

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164

Resultados

Para las mezclas con leche pasterizada de cabra (Figura IV.203, la ecuacin de regresin logartmica obtenida para porcentajes de sustitucin del 0,25 al 15% fue: log A405= -0,0545 0,3807 log x, cuyo coeficiente de regresin fue de r2= 0,976 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,971 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de leche de oveja por leche pasterizada de cabra,
-

405= 0,01~0 2= 0,983 y el coeficiente de regresin 0,4044 log x, cuyo coeficiente de regresin fue de r ajustado Adj. r2 = 0,980 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de leche de oveja por leche esterilizada de cabra.
-

En el caso de las mezclas con leche esterilizada (Figura IV.21.): log A

La representacin de los porcentajes de inhibicin obtenidos en la deteccin y cuantificacin de la sustitucin del 0,25 al 15% de leche de oveja por leche cruda, pasterizada o esterilizada de cabra se muestran en la Figura IV.22. La sensibilidad de] ELISA Competitivo no resulta afectada por los tratamientos trmicos a los que se somete la leche, aunque como en el ELISA Indirecto, en el caso de la leche esterilizada disminuye ligeramente. En cualquier caso, la sensibilidad del ELISA Competitivo es mejor que la del ELISA Indirecto, al igual que ocurra en la deteccin de la leche cruda de cabra en la leche de oveja. IV.6.4. INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO TERMICO EN LA DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA
EN LECHE CRUDA DE VACA

Como en el caso de la leche de oveja, se realizaron mezclas de leche pasterizada/ esterilizada de cabra en leche cruda de vaca, con unos porcentajes de sustitucin del 0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, y 15% de una leche por otra, que se analizaron por las tcnicas del ELISA Indirecto y Competitivo. A. TECNICA DEL ELISA INDIRECTO La metodologa empleada, as como las concentraciones de los reactivos utilizados, fueron las mismas que las descritas en la seccin W.5. l.A. En el caso de la leche pasterizada (Figura IV.23.), la ecuacin obtenida para la cuantificacin de los porcentajes de sustitucin deI 0,5 al 15% de leche de vaca por leche pasterizada de cabra fue: A 2= 405= 0,1246+ 0,4838 x, cuyo coeficiente de regresin fue de r 165

Resultados

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50
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O 5 10 15 % Sustitucin Leche de Oveja/Pasterizada de Cabra Figura .20. Deteccin de leche pasterizada de cabra leche de oveja, utilizando la tcnica del ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes con 3 mezclas lcteas distintas.

20

90

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60 50 40 30

5 10 15 o % Sustitucin Leche de Oveja/Esterilizada de Cabra Figura 11/21. Deteccin de leche esterilizada de cabra enleche de oveja, utilizando la tcnica del ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes coft 3 mezclas lcteas distintas.

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Resultados

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Resultados

0,988 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,986 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de leche de vaca por leche pasterizada de cabra. Para la leche esterilizada (Figura IV.24.), la ecuacin de cuantificacin del 0,5 al 15 % de sustitucin fue la siguiente: A 405= 0,0966 + 0,2577 x, cuyo coeficiente de regresin 2= 0,993 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,992 (p= 0,0001), siendo fue de r x el porcentaje de sustitucin de leche de vaca por leche esterilizada de cabra. Los resultados obtenidos coinciden con los de las mezclas con leche de oveja, por lo que e] ELISA Indirecto utilizado para la deteccin de leche pasterizada o esterilizada de cabra en leche de vaca, permite cuantificar porcentajes de sustitucin del 0,5 al 15%. En la Figura IV.25., se comparan los valores de absorbancia obtenidos con la tcnica del ELISA Indirecto para la deteccin de leche cmda, pasterizada y esterilizada de cabra en leche de vaca. En este caso, se observa una gran disminucin de la absorbancia con leche esterilizada debido, probablemente, a una mayor desnaturalizacin de las casenas a la temperatura de esterilizacin, mientras que con la leche pasterizada los valores son similares alos obtenidos con la leche cruda. B. TECNICA DEL ELISA COMPETITIVO Las mezclas de leche pasterizada y esterilizada de cabra con leche cruda de vaca, se analizaron mediante el ELISA Competitivo descrito en la seccin IV.5.1.C. En la Figura IV.26. se reprsentanlos resultados obtenidos para las mezclas con leche pasterizada, siendo la ecuacin de regresin logartmica obtenida para la deteccin y cuantificacin de porcentajes de sustitucin del 0,5 al 15% la siguiente: log A 405= 0,0480 2= 0,974 y el coeficiente de regresin 0,3465 log x, cuyo coeficiente de regresin fue de r ajustado Adj. r2 = 0,970 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de leche de vaca por leche pasterizada de cabra.
-

Y para las mezclas con leche esterilizada (Figura IV.27.): log A 405= 0,0697 - 0,2991 2= 0,978 y el coeficiente de regresin ajustado log x, cuyo coeficiente de regresin fue de r Adj. r2 = 0,974 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de leche de vaca por leche esterilizada de cabra. La representacin de los valores del % de inhibicin obtenidos para la sustitucin de un 0,25 a un 15% de leche de vaca por Leche cruda, pasterizada y esterilizada de cabra se muestran en la Figura IV.28. De ella se deduceque, la sensibilidad del ELISA Competitivo 168

Resultados

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Figura 1/23. Deteccin de leche pasterizada de cabra en leche de vaca,

utilizando la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes con 3 mezclas lcteas distintas.

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Figura 131.24. Deteccin de leche esterilizada de cabra en leche de vaca,

utilizando la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes con 3 mezclas lcteas distintas.

169

Resultados

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% Sustitucin Leche de Vaca/Pasterizada de Cabra Figura 11/26 Deteccin de leche pasterizada de cabra en leche de vaca, utilizando la tcnica del ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes con 3 mezclas lcteas distintas. 80 70
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15

% Sustitucin Leche de Vaca/Esterilizada de Cabra

Figura 11/27. Deteccin de leche esterilizada de cabra en leche de vaca,

utilizando la tcnica del ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes con 3 mezclas lcteas distintas.

171

Resultados

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172

Resultados

no resulta afectada por los tratamientos trmicos a los que se somete la leche, permitiendo la deteccin y cuantificacin de la sustitucin de leche de vaca por la de cabra tratada trmicamente, con valores similares a los obtenidos para la leche cruda de cabra, incluso en el caso de la leche esterilizada. IV.6. DETECCION Y CUANTIFICACION DE CABRA, EN QUESOS MADURADOS DE TICOS (ELISA) En los trabajos desarrollados para la deteccin y cuantificacin de leche de cabra en quesos madurados de oveja y vaca, se emple el Acm B2B especifico de las casenas de la leche de cabra y parcialmente purificado por precipitacin con sulfato amnico, as como las tcnicas inmunoenzimticas del ELISA Indirecto y Competitivo. El procedimiento seguido fue similar al descrito con las mezclas lcteas, utilizndose tres tipos de queso de cabra, fresco, tierno y madurado, para determinar si el reconocimiento de las casenas de la leche de cabra por el Acm B2B, se vela afectada por las transformaciones que sufren las casenas durante la maduracin del queso. Las mezclas se realizaron con quesos de oveja (Roncal) y vaca (Mahn), madurados y con Denominacin de Origen, para asegurar el origen y la genuidad de las leches utilizadas en su fabricacin. LECHE DE OVEJA Y

VACA, UTILIZANDO METODOS INMUNOENZIMA-

IV.6.1. DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA EN QUESOS MADURADOS DE OVEJA Se realizaron tres mezclas experimentales (MI, MII y MIII) que contenan 0, 0,250, 0,5, 1, 2,5, 5,10, 15 y 25% de sustitucin de queso de oveja (Roncal) por queso de cabra fresco (MI), tierno (MII) y madurado (MIII) de la manera descrita en la seccin 111.2.1.3. de este trabajo. Cada mezcla se analiz en 6 ensayos independientes, con los que se realiz un estudio estadstico utilizando el programa Statview, representando los valores medios obtenidos en forma de recta patrn. Cada punto de la recta patrn representa por lo tanto, la media de los valores de absorbancia a 405 nm de las seis experiencias independientes realizadas con cada mezcla.

173

Resultados

A. TECNICA DEL ELISA INDIRECTO En primer lugar, se determinaron las concentraciones idneas de los reactivos utilizados en los ensayos, siguiendo la metodologa descrita en el apartado 111.2.8.1. de esta memoria, encontrndose que eran las mismas para las tres mezclas y resultando que la dilucin ptima del Ac1~ B2B era la 1/2000 (y/y) en tampn PB ST, mientras que la del conjugado anti-inmunoglobulinas de ratn era la 1/1500
(y/y)

en tampn PBST.

Como antgenos se emplearon las 3 mezclas experimentales de quesos que contenan 0, 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15 y 25% de queso de cabra en mezcla con el de oveja, a la dilucin 1/1600 (y/y) en tampn PBS. La Figura IV.29. muestra los resultados de la sustitucin de queso madurado de oveja (Roncal) por queso fresco de cabra (MI). Cada punto representa la media de la absorbancia de seis experiencias distintas. La ecuacin resultante para la deteccin y cuantificacin de queso fresco de cabra en queso madurado de oveja, fue de: log A405= -0,4533 + 0,5003 2= 0,992 y el coeficiente de regresin ajustado log x, con un coeficiente de regresin de r Adj. r2 = 0,990 (p=O,O00l), siendo x el porcentaje de sustitucin de queso de oveja por queso fresco de cabra.
A continuacin, se analiz la mezcla queso madurado de oveja (Roncal) con queso

tierno de cabra (Garrotxa) en (MII). Los resultados obtenidos con esta mezcla se muestran en la Figura IV.30., cuya ecuacin para el rango de sustitucin del 0,25 al 25% fue de: log A 2= 0,991 y el 405= -0,4639 + 0,5763 log x, con un coeficiente de regresin de r coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,989 (p=0,000l), siendo x el porcentaje de sustitucin de queso de oveja por queso tierno de cabra. Los resultados obtenidos al analizar la tercera mezcla experimental (MIII), utilizando como queso de cabra el madurado (Cceres), se muestran en la Figura IV.31. En este caso, la ecuacin resultante para el rango de sustitucin del 0,25 al 25% de queso madurado de 405= -0,4486 + log x, con un 2= 0,945 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,936 coeficiente de regresin de r (p=0,OOO 1), siendo x el porcentaje de sustitucin de queso de oveja por queso madurado de cabra. Finalmente, en la Figura IV.32. se muestra la absorbancia a 405 nm de las muestras con los porcentajes de sustitucin del 0,25 al 25% del queso madurado de oveja (Roncal) por el queso fresco, tierno (Garrotxa) y madurado (Cceres) de cabra. De ella se deduce, 174 oveja por queso madurado de cabra fue:log A

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Resultados
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% Sustitucin de Queso de Oveja/Queso Fresco de Cabra Figura 11/29. Deteccin de queso fresco de cabra en queso madurado de oveja, utilizando la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes.

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% Sustitucin de Queso de Oveja/Queso Tierno de Cabra

Figura 11/30. Deteccin d queso tierno de cabra en queso madurado de

oveja, utilizando la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punta de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes.

175

Resultados

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25 5 10 15 20 % Sustitucin de Queso de Oveja/Queso Madurado de Cabra Figura 11/31. Deteccin de queso madurado de cabra en queso madurado de oveja, utilizando la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes.

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% Sustitucin de Queso de Oveja/Queso de Cabra

Figura 1432. Deteccin de queso fresco (O), tierno

(@) y madurado (El) de cabra en queso madurado de oveja, utilizando la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punto de la grfica corresponde a [a media de los resultados de 6 experIencias diferentes.
176

Resultados

que utilizando la tcnica del ELISA Indirecto descrito es posible detectar y cuantificar la presencia de leche de cabra en queso madurado de oveja, observndose diferencias en la absorbancia a 405 nm segn el perodo de maduracin del queso de cabra utilizado, Sin embargo, al igual que el caso de las mezclas lcteas, las diferencias son menores en los porcentajes de sustitucin menores (0,25-5%). B. TECNICA DEL ELISA COMPETITIVO Para la deteccin y cuantificacin de queso de cabra en queso de oveja, se ha desarrollado y puesto a punto, adems del ELISA Indirecto previamente descrito, una tcnica de ELISA Competitivo. Despus de varios ensayos preliminares, se establecieron las condiciones ptimas de trabajo; que fueron las mismas para las tres mezclas: Anlig~im: como antgeno se utilizaron 20 ~tg/pocillo las casenas totales de cabra de liofilizadas (extracto antignico CC>.
-

Mu~Za&umbkmn: los diferentes porcentajes de sustitucin de queso de oveja por

queso de cabra, de las tres mezclas experimentales realizadas (MI, 11,111), a la dilucin 1/50 (y/y) en tampn PBST. -..Anikn~wQ: el monoclonal B2B, parcialmente purificado por precipitacin con sulfato amnico, a la dilucin 1/1000 (y/y) en tampn PBST. Qnjugdn: el comercial de anti-inmunoglobulinas de ratn obtenidas de conejo y conjugadas al enzima peroxidasa de rbano, diluido a la 1/1500 (y/y) en tampn PBST.
-

Los resultados obtenidos utilizando la tcnica del ELISA Competitivo se muestran en funcin del porcentaje de Inhibicin, calculado de la manera descrita en la seccin IV.5.l.C. Los resultados obtenidos se analizaron de la manera descrita en el ELISA Indirecto, por lo que cada punto de la grfica representa la media del porcentaje de inhibicin de seis experiencias distintas realizadas con cada una de las tres mezclas experimentales. La Figura IV.33. muestra que, con los resultados obtenidos utilizando esta tcnica, es posible detectar y cuantificar la sustitucin de un 0,25 a un 25% de sustitucin de queso madurado de oveja (Roncal) por queso fresco de cabra (MI), mediante la ecuacin: log
177

Resultados

A405= 0,1203 0,3855 log x, cuyo coeficiente de regresin fue de r2= 0,983 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,980 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de queso madurado de oveja por queso fresco de cabra.
-

Siguiendo la misma metodologa, para porcentajes de sustitucin deI 0,25 al 25% de queso madurado de oveja (Roncal) por queso tierno de cabra (Garrotxa) (MII) (Figura IV.34.), se obtuvo la ecuacin: log A 405= 0,1321 0,3539 log x, cuyo coeficiente de 2= 0,981 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,978 (p= regresin fue de r 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de queso madurado de oveja por queso tierno de cabra,
-

Asimismo, para la deteccin y cuantificacin de porcentajes de sustitucin en el rango del 0,25 al 25% de queso madurado de oveja (Roncal) por queso madurado de cabra (Cceres) (MIII) (Figura IV.35.), la ecuacin obtenida fue: log A 405= 0,1787 0,3344 log 2= 0,962 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. x, cuyo coeficiente de regresin fue de r = 0,956 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de queso madurado de oveja por queso madurado de cabra.
-

En la Figura IV.36. se observan los porcentajes de inhibicin obtenidos con las tres mezclas para los distintos porcentajes de sustitucin. De los resultados obtenidos, utilizando la tcnica del ELISA Competitivo, es posible afirmar que dicha tcnica es vlida en la deteccin y cuantificacin de la sustitucin de queso de oveja por queso de cabra en el rango de 0,25 al 25%, mejorando los resultados obtenidos con el ELISA Indirecto y que las variaciones resultantes del perodo de maduracin del queso de cabra empleado, son mnimas.

IV.6.2. DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA EN QUESOS MADURADOS DE VACA Como en el caso de los quesos de oveja, se utilizaron 3 mezclas experimentales de queso madurado de vaca (Mahn) con los quesos de cabra fresco (MIV), tierno (Oarrotxa) (MV) y madurado (Cceres) (MVII), de la manera descrita en la seccin 111,2.1.3, De cada mezcla se realizaron 6 ensayos independientes realizando el estudio estadstico de los resultados experimentales de la manera descrita en el apartado IV.6.1.

178

Resultados

90 80
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20

O 5 10 15 20 25 % Sustitucin Queso de Oveja/Queso Fresco de Cabra Figura 11/33. Deteccin de queso fresco de cabra en queso madurado de oveja, utilizando la tcnica del ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes.

10

90 80 70 o
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60 50 40 30 20 lo 0 5 10 15 20 25 % Sustitucin de Queso de Oveja/Queso Tierno de Cabra O

Figura 1434. Deteccin de queso tierno de cabra en queso madurado de

oveja, utilizando la tcnica del ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes.

179

Resultados
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5 10 15 o 20 25 % Sustitucin Queso de Oveja/Queso Madurado de Cabra Figura 11/35. Deteccin de queso madurado de cabra en queso madurado de oveja, utilizando la tcnica de ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes.

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Figura 1/36

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25

% Sustitucin de Queso de Oveja/Queso de Cabra Deteccin de queso fresco (O), tierno y madurado (El) de cabra en queso madurado de oveja, utilizando la tcnica del ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes.

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180

Resultados

A. TECNICA DEL ELISA INDIRECTO El inmunosuero y el conjugado fueron los mismos que los descritos en el apartado IV.6.1.A. La dilucin ms idnea de los antgenos utilizados (los diferentes porcentajes de sustitucin de queso de vaca por queso de cabra fresco, tierno y madurado en queso de vaca) fue la 1/800. En las figuras IV.37., IV.38. y IV.39. se muestran los valores de absorbancia obtenidos para los porcentajes de sustitucin del 0,25 al 25% de vaca madurado por los quesos de cabra fresco, tierno y madurado. Con la metodologa empleada, el ELISA Indirecto es vlido para la deteccin y cuantificacin de porcentajes de sustitucin del 0,5 al 25% de queso devaca por queso de cabra. Las ecuaciones resultantes en cada caso fueron: (a).- Mezcla de queso madurado de vaca (Mahn)/queso fresco de cabra (MIV): logA405= -0,43 12 + 0,574 Iog x, con un coeficiente de regresin de r2= 0,993, un Adj. r2= 0,992 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de queso de vaca por queso fresco de cabra. (b).- Mezcla de queso madurado de vaca (Mahn)/queso tierno de cabra (Garrotxa) (MV): log A~ 2= 0,989, un 5= 0,459 1 + 0,5728 log x,con un coeficiente de regresin de r Adj. r2= 0,987 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de queso de vaca por queso tierno de cabra.
-

(c).- Mezcla de queso madurado de vaca (Mahn)/queso madurado de cabra (Cceres)(MVI): log A 405= 0,5007 + 0,5639 log x, con un coeficiente de regresin de 2= 0,964, un Adj. r2= 0,958 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de queso r de vaca por queso madurado de cabra.
-

En la Figura IV.40. se muestran los valores de absorbancia obtenidos con las tres mezclas, observando que los valores procedentes de la MVI (queso madurado de cabra en queso madurado de vaca,) son menores que los de las otras dos mezclas, B. TECNICA DEL ELISA COMPETITIVO En esta tcnica, se utilizaron el antgeno, el inmunosuero y el conjugado a las mismas diluciones que las descritas en la seccin IV.6.2.B. Las muestras problema fueron los diferentes porcentajes de sustitucin (del 0,25 al 25%) de las 3 mezclas experimentales realizadas (queso madurado de vaca (Mahn)/(queso fresco, tierno (Garrotxa) y madurado 181

Resultados 2,4

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% Sustitucin de Queso de Vaca/Queso Fresco de Cabra Figura 1.37. Deteccin de queso fresco de cabra en queso madurado de vaca, utilizando la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes

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Resultados 2,4

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Figura IV.39. Deteccin de queso madurado de cabra en queso madurado de

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vaca, utilizando la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes.

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% Sustitucin de Queso de yuca/Queso de Cabra

Figura 11/40. Deteccin de queso fresco (O), tierno

y madurado (O) de cabra en queso madurado de yace, utilizando la tcnica del ELISA Indirecto. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes.

()

183

Resultados

(Cceres) de cabra), a la dilucin 1/50. En la Figura IV.41. se muestran los resultados obtenidos para porcentajes de sustitucin del 0,25 a 25% para la mezcla queso madurado de vaca/queso fresco de cabra (MIV), con la siguiente ecuacin: log A405= 0,1247 0,4724 log x, cuyo coeficiente de 2= 0,943 y el coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,933 (p= regresin fue de r 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de quesode vaca por queso fresco de cabra.
-

En el caso de la mezcla queso madurado de vaca (Mahn)/queso tierno de cabra (Garrotxa) (MV) los resultados se observan en la Figura IV.42., y la ecuacin obtenida fue: Iog A 2= 0,979 y el 405= 0,1868 0,365 1 log x, cuyo coeficiente de regresin fue de r coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,976 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de quesode vaca por queso tierno de cabra.
-

Asimismo, la relacin obtenida entre el porcentaje de Inhibicin y los porcentajes de sustitucin en el rango 0,25 al 25%, de queso madurado de vaca (Mahn)/queso madurado de cabra (Cceres) (MVI) se muestran en la Figura IV.43. y la ecuacin obtenida fue: ]og A 2= 0,941 y el 405= 0,2 156 0,7330 log x, cuyo coeficiente de regresin fue de r coeficiente de regresin ajustado Adj. r2 = 0,931 (p= 0,0001), siendo x el porcentaje de sustitucin de queso de vaca por queso de cabra.
-

Finalmente, en la Figura IV.44. se muestran los valores de absorbancia obtenidos con las tres mezclas de queso de vaca/queso de cabra. De los resultados obtenidos se deduce que, la tcnica del ELISA Competitivo mejora la deteccin y cuantificacin del queso de cabra en queso de vaca para valores de sustitucin bajos y, adems, mientras los valores obtenidos para las mezclas con queso tierno y madurado son prcticamente iguales, los obtenidos para la mezcla con queso fresco son ms elevados.

184

Resultados 90

80
70 o

e e

60
50

40
30

20

10 o 5 10 15 20 25 % Sustitucin de Queso de Vaca/Queso Fresco de Cabra Figura 1/41. Deteccin de queso fresco de cabra en queso madurado de vaca, utilizando la tcnica del ELISA Competitiva. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes. o

90 80
70

:2

60 50 40 30 20 10 0 5 10 15 20 25 % Sustitucin Queso de Vaca/Queso Tierno de Cabra 0

Figura 1/42. Deteccin de queso tierno de cabra en queso madurado de

vaca, utilizando la tcnica del ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes.

185

Resultados

90 80 70
o

60
50 40 30

20 10 0 5 10 15 20 25 % Sustitucin de Queso de Vaca/Queso Madurado de Cabra

Figura 1443. Deteccin de queso madurado de cabra en queso madurado de

vaca, utilizando la tcnica del ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experiencias diferentes.

90
80

70 60

50

40 30 20 10 O O 5 10 15 20 25

% Sustitucin de Queso de Vaca/Queso de Cabra

Figura 1/44. Deteccin de queso fresco (O), tierno (@) y madurado (El) de
cabra en queso madurado de vaca, utilizando la tcnica del ELISA Competitivo. Cada punto de la grfica corresponde a la media de los resultados de 6 experIencias diferentes.
186

CAPITULO V

DISCUSION

Discusin

VA. OBTENCION, FRACCIONAMIENTO Y PURIFICAClON DE LAS CASENAS DE LA LECHE DE CABRA

Como se ha sealado en la exposicin del problema a investigar, el objetivo de este trabajo consista en la obtencin de anticuerpos policlonales y monoclonales frente a la fraccin caseinica ms inmunoreactiva de la leche de cabra, para su posterior utilizacin en el desarrollo de tcnicas inmunoenzimticas (ELISA), que permitan la deteccin y cuantificacin de leche de cabra en mezclas lcteas frescas y en quesos madurados. La especificidad de un inmunoensayo viene en gran parte determinada por el inmungeno utilizado en la produccin de los anticuerpos. En la seleccin de un antgeno deben considerarse caractersticas tales como peso molecular, estructura tridimensional y solubilidad (Rittenburg y Grothaus, 1992). La mayora de las tcnicas inmunolgicas descritas para la identificacin de leches de diferentes especies animales en mezclas lcteas, emplean anticuerpos policlonales obtenidos de conejos frente a las protenas del suero de la leche, las casenas totales, inmunoglobulinas o pptidos sintticos (Aranda y col., 1988; 1993; Calvo y col., 1989; Rodriguez y col., 1991; 1994; Garca y col., 1993; 1994; Rolland y col., 1993; 1995). Algunos investigadores han evaluado la antigenicidad de las protenas de la leche de vaca con el objeto de eliminar los problemas alrgicos derivados de su utilizacin en preparados alimenticios para nios. May y col. (1982), determinaron que las protenas del suero de la leche de vaca eran ms antignicas que las casenas, aunque cuando la leche se somete a tratamientos trmicos, las protenas del suero se desnaturalizan y disminuye su antigenicidad (Kishlaw y col., 1982; Heppell y col,, 1984; Heppell, 1985). AsImismo, Mahmoud y col. (1992), han estudiado el efecto de la hidrlisis enzimtica sobre la antigenicidad de las casenas, con el fin de utilizarla en preparados alimenticios para nios, determinando que cuando se ha realizado el 10% de la hidrlisis enzimtica se produce una disminucin muy fuerte de la antigenicidad de las casenas, que no se reduce significativamente durante el resto de la hidrlisis. Los mtodos inmunolgicos que utilizan anticuerpos policlonales frente a las protenas del suero lcteo, presentan el inconveniente de que esta fraccin es ms sensible al calor que las casenas (Calvo y col., 1989; Law y col., 1992), pudiendo originar falsos negativos cuando en las mezclas de leche o quesos se utilizan leches tratadas trmicamente (Saniarajeewa y col., 1991). Adems, aunque las protenas del suero de la leche sufren pocas modificaciones durante la proteolisis del queso (Amigo y col., 1991) no son

188

Discusin

componentes esenciales de ste, encontrndose slo en pequeas proporciones dependiendo del tipo proceso empleado en la fabricacin del queso (Ndftez y ccl., 1989; Ramos y Jurez, 1984) Aunque la antigenicidad de las casenas es pobre, produciendo ttulos bajos de anticuerpos en los animales de experimentacin (Levieux, 1977; Radford y col., 981; Aranda y col., 1988; Garca y col., 1989; Gazzaz y col., 1992), los inmunoensayos que utilizan anticuerpos frente a la casena total de la leche ofrecen ventajas, debido a que su inmunoreactividad no resulta afectada por los tratamientos trmicos de la leche y slo disminuye ligeramente, durante la maduracin del queso (Ramos y Jurez, 1984; Rolland y col., 1993; Prez y col., 1992). De esta manera, dichos anticuerpos se han utilizado con xito para la deteccin de adulteraciones en mezclas de leche fresca, pasterizada y esterilizada, as como en quesos (Aranda y col., 1988; Rodrguez y col., 1990). Aunque los inmunosueros obtenidos frente a la casena total de la leche, son eficaces en la deteccin y cuantificacin de adulteraciones en mezclas lcteas frescas y quesos madurados, en este trabajo se propuso utilizar fracciones purificadas de la casena de la leche de cabra en La obtencin de anticuerpos policlonales y monoclonales. Aunque la tecnologa de produccin de anticuerpos monoclonales no requiere la utilizacin de antgenos altamente purificados, la utilizacin de protenas purificadas debera producir un mayor rendimieto en la obtencin de los anticuerpos monoclonales de inters; adems, debido a que la comparacin de las estructuras primarias de las casenas de las especies bovina, caprina y ovina revela una gran similitud, especialmente entre las casenas ovinas y caprinas (Jaubert y Martin, 1992), consideramos muy importante la obtencin de extractos antignicos purificados para la obtencin de anticuerpos monoclonales especficos frente a las casenas de la leche de cabra. Por tanto, como paso previo de los dems, se procedi al fraccionamiento, aislamiento y purificacin de las casenas a5 S2, 3 y ic de la leche de cabra, ya que stas no se encuentran disponibles comercialmente.
~,

En la seccin 11.3.3. de esta memoria, se resumen las tcnicas analticas utilizadas tradicionalmente para el aislamiento, identificacin y cuantificacin de las casenas. Tambin se indica que, de todas ellas, la cromatografa de intercambio inico es la ms adecuada al permitir la separacin de molculas que presentando tamaflos similares, difieren ligeramente en cuanto a su punto isoelctrico proporcionando, adems, la obtencin de fracciones caseinicas homogneas. En el fraccionamiento y purificacin de las casenas de la leche, se han utilizado tanto

189

Discusin

la cromatografa de intercambio jnico clsica en columna (Thompson, 1966; Mercier y col., 1968; Richardson y Creamer, 1974; 1976; Rose y col., 1969; El-Negoumy, 976; Davies y Law, 1977; Wey y Withney, 1985; Cayot y col., 1992), como las tcnicas cromato grficas de alta resolucin: cromatografa lquida de alt.a eficacia (HPLC) y cromatografa lquida rpida de protenas (FPLC) (Humphrey y Newsome, 1984; Barrefords y col., 1985, Andrews y col., 1985; Haasnot y col., 1986; Davies y Law, 1987; Guillou y col., 1987; St- Martin y Paquin, 1990; Collin y col., 1991; Hollard y col., 1991, Leaver y Law, 1992; Syv~ioja, 1992; Kaminarides y Anifantalds, 1993). La mayora de los trabajos se han realizado con leche de la especie bovina, siendo ms escasas las referencias acerca del fraccionamiento de las casenas de la leche de oveja (Mercier y col., 1968; Addeo y col., 1992; Law y col., 1992) y cabra (Richardson y col., 1973; Addeo y col., 1978; Mikkelsen y col., 1987; Dal Olio y col., 1988; Jaubert y Martn, 1992; Law y Tziboula, 1992). Richardson y col, (1973) y DallOlio y col. (1988), determinaron que el fraccionamiento de las casenas de la leche de cabra es ms problemtico que el de las otras especies. Utilizando la tcnica de HPLC en fase reversa con una columna Lichrosob RP-8 y un sistema de tampones voltil, Mikkelsen y col. (1987) consiguieron la separacin completa de las casenas de la leche de cabra en cuatro fracciones diferentes ( a5j, a5~, 13 y
ic). La utilizacin de tampones voltiles, tiene la ventaja de que es fcil aislar los

componentes puros, libres de sales, simplemente por liofilizacin de las fracciones individuales. Dado el carcter anftero de las casenas de la leche, estas pueden separarse por FPLC en columnas Mono 5 (intercambiador catinico) a pH 3,8 o en columnas Mono Q (intercambiador aninico) a pH 5-11. Sin embargo, parece ser que el intervalo de pH cercano a la neutralidad (7-8) es el ms eficaz en la separacin de las casenas (Andrews y col., 1985). En este trabajo, el fraccionamiento de las casenas de la leche de cabra, se realiz esencialmente segn la tcnica descrita por Davies y Law (1987) para el fraccionamiento de las casenas de la leche de vaca mediante FPLC en una columna Mono Q HR 5/5. Para ello la casena total de cabra se disolvi en un tampn 5 mM bis-tris-propano conteniendo 3,3 M urea como agente disociante y 14 mM 2-mercaptoetanol como agente reductor de los grupos -8-5-. La separacin se realiz a un flujo de lmI/min y con un gradiente discontinuo de CINa de O a0,4 M. Como se observa en la Figura IV.1., la casena caprina eluy en tres fracciones mayoritarias que, seguidamente, se caracterizaron por electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (SDS-PAGE) en un equipo automatizado Phast-System. Los resultados de la electroforesis (Figura IV.2.),

190

Discusin

indicaron que la fraccin 1 corresponda a la casena

ic,

la fraccin 2 a la casena 13 y la

fraccin 3 a la casena cz5 (as y as2), corroborando el perfil de elucin obtenido por Davies y Law (1987) en el fraccionamiento de las casenas bovinas. Este mtodo permite una buena resolucin de las casenas K y 13 caprinas, pero los resultados obtenidos con la fraccin caseinica ag sugieren que el fraccionamiento fue incompleto, ya que las casenas asl Y ~s2 eluyen de la columna Mono Q a la misma concentracin salina, coexistiendo ambas en la misma fraccin cromatogrfica. Con el objeto de obtener una mejor resolucin de las casenas caprinas asi y
~

procedimos al fraccionamiento de las casenas de la leche de cabra por cromatografa de intercambio aninico en columna con DEAE-celulosa, basndonos en los resultados positivos previamente obtenidos con esta tcnica, para el fraccionamiento de las casenas bovinas y ovinas (Mercier y col., 1968, Lpez-Pandino, 1992). Brevemente, 1 g de casena liofilizada de cabra se disolvi en un tampn 0,02 M imidazol-HCL, con 3,3 M urea y un 0,1 % de 2-mercaptoetanol, eluyendo las fracciones de casena en un gradiente continuo de NaC de O a 0,3 M y un flujo de 2 ml/mm. Las casenas de la leche de cabra eluyeron en 5 fracciones diferentes (Figura IV.3.), no bien separadas, por lo que se concluy que este mtodo no ofreca resultados aceptables. Los resultados citados previamente coinciden con los de Jaubert y Martin (1992), los cuales sugieren que la cromatografa de intercambio aninico empleando las condiciones utilizadas para el fraccionamiento de las casenas bovinas, no permite la separacin de las cuatro casenas caprinas, mientras que la cromatografa de intercambio catinico, produce unos resultados satisfactorios. Es por ello, que la casena de la leche de cabra se fraccion por cromatografa de intercambio catinico en una columna con una matriz de S-Sepharose Fast-Flow, que es un intercambiador catinico fuerte. Para ello 1 gramo de casena liofilizada de cabra se disolvi en un tampn 25 mM formato sdico conteniendo 0,8 mM ditiotreitol como agente reductor y 7,5 M urea como agente disociativo a un pH 4,0, que tras su elucin en un gradiente continuo de 0 a 0,3 M de NaC, origin la separacin de la casena en 4 fracciones distintas (Figura IV.4.) que una vez dializadas y liofilizadas se caracterizaron por electroforesis SDS-PAGE en un equipo automatizado PhastSystem (Figura IVi.). El orden de elucin de las cuatro casenas mayoritarias fue: fraccin 1, caseina 3; fraccin 2, casena c; fraccin 3, material protenico difuso en cantidades vestigiales; fraccin 4, casena asl con residuos de las casenas 13 y K y fraccin 5, mayoritariamente casena a5~. De la caracterizacin electrofortica de las fracciones caseinicas, se deduce que las fracciones ic y 13 se encuentran bien purificadas, mientras que en la fraccin 4 se encuentra mayoritariamente a la casena cx5 y en la fraccin 5, la casena 191

Discusin

tL

52.

Como mtodo de purificacin de casenas, la cromatografa de intercambio catinico presenta un gran nmero de ventajas respecto a otros mtodos alternativos. La capacidad de la resma es alta, as como el flujo, permitiendo fraccionar grandes cantidades de casenas rpidamente. Adems, las casenas individuales eluyeron en picos razonablemente separados minimizando as las contaminaciones de los componentes individuales en las fracciones resultantes. Este mtodo podra utilizarse analticamente, utilizando una columna Mono 5 HR 5/5 equivalente a la S-Sepharose Fast-Flow, pero segn Jaubert y Martin (1992) presentara limitaciones: trabajar a pH 4,0 cercano al punto isoelctrico de las casenas caprinas requiere el uso de tampones con una nolaridad elevada del agente disociante (al menos 7,5 molA urna), lo cual generara una alta presin en la columna debido al incremento de viscosidad del tampn; por otra parte, los resultados obtenidos con la cromatografa de intercambio aninico en una columna Mono Q HR 5/5, no son muy reproducibles (Collin y col., 1991). Law y Tziboula (1992) determinaron la dificultad de separarlas casenas caprinas as y as2 a pH alcalino, debido a las diferencias en la carga neta negativa de sus variantes, no obstante, utilizando una columna Mono 5 HR 5/5 de intercambio catinico, con un tampn 6 M urea y un pH de 5, consiguieron el fraccionamiento de las casenas caprinas en 5 fracciones distintas, Segn estos autores, la tcnica de FPLC con matrices de intercambio catinico es un mtodo rpido, automatizado, que es aplicable a las casenas bovinas, caprinas y ovinas y puede utilizarse cuantitativamente para determinar las cantidades relativas de casenas en relacin con las propiedades de la leche. Recientemente, Kaminarides y Anifantalds (1993) realizaron un estudio comparativo de la separacin de las casenas bovinas, ovinas y caprinas mediante la tcnica de HPLC en un intercambiador aninico fuerte (P.L-SAX 811 1000A). Las casenas de las leches de cabra y oveja presentaron perfiles cromatogrficos similares, pero considerablemente diferentes a los de las casenas bovinas. Con esta tcnica, se consigue la separacin de la casena 13 caprina en sus dos componentes Pi y Pi, pero las casenas a5 eluyen juntas de la columna. Estos autores sugieren que un gradiente de NaC ms dbil en la zona de elucin de la casena a5 permitira, probablemente, la separacin de esta fraccin en sus dos componentes (asl y a52). Por otra parte, el estudio comparativo permiti determinar que la casena aM bovina elula de la columna ms tarde que sus homlogas ovina y caprina bajo las mismas condiciones cromatogrficas, por lo que este mtodo podra utilizarse para

192

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determinar la adicin de leche de vaca a las de oveja y cabra. De los resultados obtenidos en nuestro trabajo, podemos concluir que la cromatografa de intercambio catinico permite la separacin satisfactoria de las casenas caprinas, bien utilizando la cromatografa clsica en columna o las modernas tcnicas de FPLC. Las tcnicas FPLC tienen la ventaja de ser rpidas, seguras y fciles de realizar, pero presentan el inconveniente de la obtencin de pequeas cantidades de protena.

V.2. CARACTERIZACION INMUNOLOGICA

PARCIAL

DE LAS FRACCIONES CASEINICAS PURIFICADAS

Una vez obtenidas las diferentes fracciones caseinicas de la leche de cabra, el siguiente paso consisti en caracterizarlas inmunolgicamente, con el objeto de determinar cual de ellas era la ms inmunoreactiva y utilizarla como inmungeno para la obtencin de anticuerpos policlonales y monoclonales en los animales de experimentacin. El grupo investigador de Otani y col, (1986) ha realizado numerosos estudios para determinar la estructura antignica y localizacin de los determinantes antignicos de las casenas de la leche de vaca. La tcnica se basa en la hidrlisis de las casenas en fragmentos peptdicos de tamao variable que, posteriormente se enfrentan mediante tcnicas de inmunodifusin y ELISA a anticuerpos policlonales obtenidos de conejos frente a las casenas a~, 13 y ic. La casena ~ tendra 6 determinantes antignicos, asociados al menos uno de ellos con cada una de las regiones peptidicas 1-54, 124- 135 y 136-196 y, dos de ellos, en la regin 61-123. La casena 3 tendra tambin 6 determinantes antignicos en su molcula, asociados al menos uno de ellos con cada una de las regiones peptidicas 1-25, 26-60, 61-93, 94-102, 103-109, 110-140 y 157-185 (Otani y col., 1988), mientras que la casena ic tendra 5 determinantes antignicos, tres de ellos asociados a las regiones peptdicas 1-95 y 107-169 y, al menos uno a la regin 96-106 (Otani y col., 1991). Estos autores determinaron tambin queel tamallo molecular mfrimo de las casenas de la leche de vaca para oroginar problemas derivados de su inmunogenicidad, estada comprendido entre 3.000 y 5.000 daltona y que un pequeo nmero de aminocidos son crticos para su unin con los anticuerpos (Otani y col., 1990; Kobayashi y col., 1991). Sin embargo, no se ha realizado ningn estudio similar en el caso de las casenas de la leche de cabra. En nuestro trabajo, las casenas de la leche de cabra purificadas por cromatografa

193

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lquida rpida de protenas (FPLC) en una columna Mono Q HR 5/5 Fast-Flow (asl, a5~, 13 y

(as, 11 y iO y por

cromatografa de intercambio catinico en una columna con una matriz de S-Sepharose

ic),

se enfrentaron mediante la tcnica del ELISA Indirecto a

anticuerpos policlonales obtenidos de conejo (anti-CC) y especficos de la leche de cabra (Rodriguez y col., 1991). De los resultados obtenidos (Figuras IV. 6. y IV. 7.), se deduce que la fraccin que contiene la casena as~ purificada por cromatografa dc intercambio catinico en una columna con una matriz de S-Sepharose Fast-Flow, es la ms inmunoreactiva, probablemente porque es la fraccin con el mayor nmero de epitopos especficos de las casenas de la leche de cabra.

V.3. ORTENCION DE INMUNOSUEROS FRENTE A LA CASENA a52 DE LA LECHE DE CABR

Como ya se ha comentado previamente, para el desarrollo de un inmunoensayo pueden utilizarse dos tipos de anticuerpos: policlonales y monoclonales. Ambos se han empleado con xito en el desarrollo de tcnicas inmunolc5gicas, aunque los anticuerpos monoclonales proveen de un grado extra de especificidad que puede ser necesario en algunos casos. La sensibilidad y especificidad requeridas, el tipo de inmunoensayo a utilizar y el volUmen de suero necesario, son algunos de los factores que influyen en la obtencin de uno u otro tipo de anticuerpos (Rittenburg y Grothaus, 1992). V.3.1. OBTENCION DE ANTICUERPOS POLICLONALES En la obtencin de anticuerpos policlonales se pueden utilizar diversos animales, siendo las especies ms comunes el conejo, el cobaya, la rata, el ratn (Harlow y Lane, 1988). La utilizacin de animales grandes como cerdos, carneros, machos cabros y caballos, permiten la obtencin de elevadas cantidades de suero y son los animales de eleccin en la produccin comercial de anticuerpos (Rittenburg, 1990; Rittenburg y Grothaus, 1992). Es importante conocer que la inmunogenicidad de un antgeno aumenta al hacerlo la distancia filogentica entre la especie que lo posee y la receptora. Por razones prcticas, los conejos son los animales ms empleados en la obtencin de anticuerpos policlonales debido a su fcil manejo y mantenimiento, generan un volUmen aceptable de suero (500 m) y responden a una gran cantidad de antgenos (Harlow y Lane, 1988).

194

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El mtodo y el protocolo de inmunizacin influencian el tipo de anticuerpo producido y la intensidad de la respuesta. El nmero y la frecuencia de las inmunizaciones, la cantidad de antgeno inyectado, la ruta de inmunizacin y el tipo de adyuvante empleado, son factores a considerar en la inmunizacin de los animales (Rittenburg, 1990). Los adyuvantes son preparaciones que aumentan la inmunogenicidad de un antgeno y se utilizan tanto en la produccin de anticuerpos policlonales como monoclonales. El adyuvante de Freunds es el de eleccin cuando se dispone de poco inmungeno, si se tienen grandes cantidades o el compuesto es muy inmunognico, se deben utilizar otros, debido a que ste puede originar reacciones de hipersensibilidad (Harlow y Lane, 1988; Hefle, 1995). En nuestro trabajo, los conejos se inmunizaron con la fraccin que contena la casena asz de la leche de cabra, purificada por cromatografa de intercambio catinico y el adyuvante de Freunds. Una vez obtenidos los inmunosueros, los anticuerpos se purificaron por precipitacin selectiva con sulfato amnico, que es un mtodo sencillo, econmico, aplicable a grandes volmenes de suero y til para la concentracin y purificacin de anticuerpos de cualquier especie. Adems, la purificacin parcial de los inmunosueros por precipitacin con sulfato amnico, protege a las inmununoglobulinas frente a su desnaturalizacin, inhibe el crecimiento microbiano y reduce las interacciones inespecificas entre los anticuerpos y otras sustancias cuya superficie posee una configuracin molecular similar a la de los epitopos del antgeno. Los resultados obtenidos al enfrentar el inmunosuero anti-caseina as~ de la lehe de cabra obtenido de conejos, con los extractos liofilizados de las casenas de la leche de vaca, oveja y cabra mediante la tcnica del ELISA Indirecto (Tabla IV. 1.), demostraron que este inmunosuero reconoce no slo las casenas de la especie frente a la que se obtuvo sino tambin las de las otras dos especies. Dicha reactividad cruzada se debe a que los anticuerpos policlonales pueden reconocer epitopos en las mismas protenas de especies cercanas y puede eliminarse por purificacin de los inmunosueros (Gazzaz y col., 1992). En nuestro departamento, se han obtenido anticuerpos policlonales especficos frente a las casenas de la leche de cabra y vaca (Rodrguez, 1992) y frente a las protenas del suero de la leche de vaca y cabra <Garca, 1990), mediante purificacin por cromatografa de afinidad. Para ello, los inmunosueros se purificaron en una columna que contena Sepharosa 4B-CN?Br, cuyo ligando de afmidad era el extracto antignico liofilizado frente al que se hablan obtenido y, posteriormente, se neutralizaron con las protenas antignicas liofilizadas de la leche de las especies heterlogas, o bien, se purificaron por cromatografa

195

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de afinidad en tres columnas de Sepharosa 4B-CNBr, conteniendo las dos primeras las protenas lcteas de las especies heterlogas y, la ltima, las de la leche de la especie frente a la que se obtuvo el inmunosuero. Sin embargo, el proceso de purificacin de los inmunosueros para obtener los correspondientes anticuerpos especficos es muy largo y costoso. Adems los anticuerpos especficos purificados, constituyen una mezcla de inmunoglobulinas, que varan en su afinidad por los distintos determinantes antignicos y poseen una respuesta inmunolgica distinta dependiendo del lote animal del que procedan. V.3.2. ORTENCION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES El suero de un animal inmunizado contiene muchas clases diferentes de anticuerpos y la composicin del inmunosuero vara dependiendo del tiempo de inmunizacin y de la intensidad de la respuesta inmune. Un problema frecuente es la obtencin de inmunosueros con propiedades diferentes obtenidos de animales de la misma especie. Por otra parte, para obtener inmunosueros activos, las inmunoglobulinas deben purificarse utilizando tcnicas qumicas y bioqumicas de purificacin largas y costosas (Gazzaz y col., 1992). La obtencin de anticuerpos homogneos de especificidad definida, fue durante mucho tiempo el objetivo de muchos investigadores, que se alcanz con el desarrollo de la tecnologa de produccin de hibridomas. Desde que en 1975 Khler y Milstein desarrollaron la metodologa para la obtencin de anticuerpos monoclonales, stos se han utilizado con xito en los inmunoensayos. Las caractersticas ms relevantes de estos anticuerpos son su homogeneidad, su especificidad por un eptopo determinado y la capacidad de obtenerlos en cantidades ilimitadas <Harlow y Lane, 1988). Los anticuerpos monoclonales derivan de una nica clula que secreta inmunoglobulinas, procedente de un hibridoma formado por la fusin de un linfocito del bazo de un animal inmunizado con un tipo especial de clula tumoral, generalmente clulas de mieloma. Los hibridomas adquieren la capacidad de producir anticuerpos especficos del linfocito hiperinmune y debido a que proceden de una nica clula de bazo que secreta un slo tipo de inmunoglobulinas, los anticuerpos monoclonales son qumicamente idnticos y manifiestan la misma especificidad. Cuando los hibridomas crecen, secretan al medio de cultivo anticuerpos o se inyectan en la cavidad peritoneal de los ratones para producir liquido ascitico. Las clulas de bibridoma pueden conservarse durante largos perodos de tiempo en nitrgeno liquido y recuperarlos, ms tarde, para producir ms cantidad de anticuerpos (Rittenburg y Grothaus, 1992). Las fusiones pueden realizarse entre clulas de la misma especie o de especies distintas, pero el nmero de hibridomas viables incrementa considerablemente si ambas clulas proceden de la misma especie animal. El ratn es el animal de eleccin para la 196

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produccin de anticuerpos monoclonales debido a su fcil manejo, son baratos de obtener y responder a menores cantidades de antfgeno que otros animales de laboratorio. Adems, se prefiere la utilizacin de ratones Balb/c, debido a que la mayora de las lneas de mieloma de ratn existentes proceden de esta estirpe, y de esta manera los hibridomas Balb/c x Balb/c, se desarrollan en la cavidad peritoneal de ratones de la misma estirpe. Los mielomas son clulas tumorales inducibles en ratones mediante la inyeccin intraperitoneal de aceite mineral. Los primeros mielomas se obtuvieron de ratones Balbc por Potter (1972). Estas clulas pueden secretar anticuerpos y, por ello, las lineas utilizadas para las fusiones celulares se han seleccionado para que carezcan de esta funcin. Tambin ha sido decisiva en la preparacin de hbridos, la obtencin de lneas de mieloma carentes de alguno de los enzimas necesarios para la sntesis de nucletidos por la ruta de salvacin (Littefield, 1964), como la hipoxantina-guanosina- fosforibosi]transferasa (HGPRT) o la timidin-quinasa (TK). Con mielomas HGPRT o TK- se pueden realizar fusiones y eliminar las clulas no fusionadas con compuestos que bloquean la sntesis de novot del DNA como la aniinopterina, el metotrexato, o la azaserina, afladidas al medio de cultivo. La aminopterina y el metotrexato bloquean tanto la sntesis de purinas como de pirimidinas, por lo que deben suplementarse con hipoxantina y timidina. La azaserina solamente bloquea la sntesis de purinas y se suplementa con hipoxantina (Harlow y Lane, 1988). Utilizando la tecnologa de obtencin de hibridomas, se han obtenido anticuerpos monoclonales frente a cada una de las fracciones caseinicas de la leche de vaca (Nagaune y col., 1988; Feng y Cunningham-Rundles, 1989; Kuzmanoff y col., 1990; Kuzmanoff y col., 1991a; 1991b; Leung y coL, 1991; Oudshoorn y col., 1994), con el fin de estudiar su regulacin hormonal durante la lactognesis, su estructura y conformacin, para evaluar sus interacciones con otras protenas y para caracterizar diferentes partes de su molcula en relacin a su antigenicidad. Recientemente, Levieux y Venien (1994) han obtenido dos anticuerpos monoclonales especficos de la 13-lactoglobulina y han desarrollado un ELISA Competitivo para detectar y cuantificar la presencia de leche de vaca en leche de oveja. Hasta ahora, slo se han obtenido anticuerpos monoclonales frente a componentes de la leche de vaca, para evaluarlos posteriormente en la deteccin de leche de vaca en leche de oveja. Sin embargo, no se han descrito anticuerpos monoclonales frente a ningn componente de la leche de cabra, constituyendo ste otro de los objetivos de nuestro trabajo. Por tanto, para la produccin de anticuerpos monoclonales frente a la leche de cabra procedimos a la inmunizacin de ratones hembras Balb/c con 100 .ig de la fraccin que

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contiene la casena

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de la leche de cabra obtenida por cromatografa de intercambio

catinico, utilizando el adyuvante de Freund al igual que en de la inmunizacin de los conejos. Una vez que se desarroll una buena respuesta inmune (Figura IY.8.), procedimos a la fusin de las clulas del bazo (linfocitos) del animal mejor inmunizado con clulas de mieloma en fase de crecimiento exponencial, utilizando como agente fusionante el polietilenglicol (PEO). Se han descrito varias lineas celulares de clulas de mieloma eficaces en la obtencin de hibridomas: NSl-A4/1, FO, P3-X63Ag8, X63Ag8.653, Sp 2/O Ag 14, pero en nuestra experiencia la lnea X63 AgS.653 (Keamey y col,, 1979) es la ms eficiente con el protocolo de fusin y seleccin utilizado en nuestro laboratorio. Esta lnea se caracteriza porque no secreta ninguna inmunoglobulina al medio de cultivo y es HGPRTt En teora, la fusin celular puede ocurrir espontneamente, pero esto es poco frecuente por lo que se requiere la utilizacin de agentes que promuevan la fusin clular, tales como el virus Sendai, lisolecitina o PEO. Actualmente, tambin se utiliza como inductor de la fusin celular la electrofusin, basada en el la aplicacin a las clulas de una corriente elctrica por las clulas, durante un breve perodo de tiempo. Otros procedimientos utilizados en la obtencin de anticuerpos monoclonales, son la transformacin de las clulas productoras de inmunoglobulinas con el virus de Epstein-Barr, donde el DNA del virus transforma las clulas normales aportndoles el crecimiento continuo y la transfeccin con DNA procedente de oncogenes (Sch6nherr y Houwink, 1984). Fue, sin embargo, en 1975 cuando Pontecorvo demostr que el PEO, un poderoso agente fusionante de los protoplastos de las plantas superiores, poda utilizarse con xito en las clulas de mamferos, La fusin con PEO es el mtodo de eleccin en la obtencin de hibridomas, permitiendo una alta reproducibilidad y frecuencia de fusin. En condiciones apropiadas, es entre 100 y 300 veces ms eficazque el virus Sendai, incrementando la frecuencia de hbridos viables (Ooding, 1986). En nuestro trabajo, tras mezclar las clulas en la proporcin adecuada (5:1, linfocito:mieloma), afladimos el PEO al sedimento celular dejndolo actuar durante un cierto tiempo y frenando, a continuacin, la reaccin. Posterionnente, sembramos las clulas en un medio de cultivo durante un da para ailadir a, continuacin, el medio de cultivo selectivo HAT que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina-glicina. La axninopterina, un anlogo del cido flico, bloquea la sntesis de novo del DNA impidiendo el crecimiento de las clulas de mieloma no fusionadas a los linfocitos,mientras que los linfocitos del ratn inmunizado slo sobrevivirn unos das en el cultivo in vitro. Cuando el tamao de los hibridomas observados en los pocillos es de 1-2 mm de dimetro, lo que en nuestro caso sucedi a los 15 das, se valora en el sobrenadante la presencia de los anticuerpos de

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inters, seguir el mtodo elegido para la seleccin de los hibridomas especficos. Existen una gran variedad de mtodos que permiten la seleccin de los hibridomas productores de anticuerpos especficos, pero como norma general, debe elegirse el mismo mtodo para el que vaya a ser utilizado el anticuerpo monoclonal y, si es posible usar procedimientos que permitan analizar grandes cantidades de muestra. Los mtodos ms utilizados son el enzima inmunoensayo (ELISA) o el radio inmunoensayo (RIA) si se requiere una alta sensibilidad, la inmunofluorescencia, si se conviene localizar una determinada estructura celular y la inmunoadsorcin en papel de nitrocelulosa en la identificacin de anticuerpos monoclonales especficos para una protena con una masa molecular definida dentro de una mezcla compleja. En nuestro caso, utilizamos como mtodo de seleccin un ELISA Indirecto, enfrentando los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas a las casenas totales de la leche de cabra, determinando una eficiencia de fusin muy alta, mayor del 50%, mientras (el 25% de los hibridomas observados producan anticuerpos monoclonales frente a las casenas de la leche de cabra). Para determinar cuntos de los hibridomas productores de anticuerpos, producan anticuerpos especficos frente a la leche de cabra, enfrentamos los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas a 20 gg de los extractos antignicos de casenas de la leche de vaca, oveja y cabra, extractos crnicos conteniendo protenas musculares solubles (de cerdo, vaca, caballo y pollo), protena de soja, gelatina y seroalbmina bovina, mediante la tcnica del ELISA Indirecto. Ocho de las lineas celulares, denominadas A1H, B2B, B12B, C2H, C6C, C70, F4E y A6F fueron monoespecificas para la leche de cabra (Tabla IV.23. La caracterizacin isotpica de la clase y subclase de los anticuerpos, determin que 6 lineas celulares B2B, Bl2B, C2H, C6C, C7G y A6F eran productoras de IgOl, mientras que dos de ellas A1H y F4E eran productoras de IgM. Una vez identificados los hibridomas positivos, el siguiente paso consisti en la donacin de estas ocho lineas celulares, ya que el pocillo positivo original suele contener ms de un clon o hibridoma. Existen dos mtodos de clonaje, en medio semislido o por dilucin limite (Goding, 1986). En nuestro trabajo, Realizamos el segundo de ellos que consiste en sembrar un nmero pequeo de clulas por pocillo (10, 5, 2 o 1), evaluando la presencia de anticuerpos mediante el ELISA Indirecto, y seleccionando los pocillos positivos con la menor densidad celular para clonarlos de nuevo a una menor densidad celular. Normalmente, la donacin se repite tres veces hasta obtener el hibridoma a una concentracin terica de 1 o 0,5 clulas/pocillo. Se considera que un hibridoma est donado y estabilizado cuando al menos el 95% de los pocillos, son positivos en el ensayo de 199

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seleccin. Una vez que los hibridomas se donaron y estabilizaron, se expandieron gradualmente y, tan pronto como fue posible, se congelaron y conservaron en nitrgeno liquido. La produccin de grandes cantidades de anticuerpos monoclonales puede realizarse recogiendo el sobrenadante de cultivo de los hibridomas o mediante la induccin de tumores asciticos en ratones BaIb/c. La concentracin de anticuemos especficos en el sobrenadante del medio de cultivo oscila entre 10 y 100 gg/ml. Si se requieren mayores cantidades de anticuerpos, los hibridomas se inoculan en la cavidad peritoneal de ratones Halb/c, previamente inducidos con 0,5 ml de pristane para facilitar su concentracin en el liquido ascitico. La concentracin de anticuemos mnoclonales especficos en el lquido ascitico puede ser de 1-10 mg/m, es decir 1000 veces ms concentrados que ene! cultivo celular (Goding, 1986). Por otra parte, en la mayora de los inmunoensayos se prefiere la utilizacin del sobrenadante del cultivo celular, debido a que ste no se encuentra contaminado con niveles elevados de otros anticuerpos y su concentracin es suficiente para la realizacin de la mayora de los ensayos (Harlow y Lane, 1988>. Por ello, cada lnea celular se expandi hasta obtener aproximadamente unos 50 ml de sobrenadante del medio de cultivo y dos lineas celulares (B2B y C2H) se eligieron para la produccin de lquido ascitico en ratones Balb/c. Los anticuerpos monoclonales de los sobrenadantes delmedio de cultivo de las ocho lineas celulares descritas y de los dos lquidos asciticos, se analizaron frente a 20 gg de las casenas de la leche de cabra mediante un ELISA Indirecto. En la Figura IV.9 .se muestran los resultados obtenidos, de los que se deduce que no todos tienen la misma afinidad por las casenas de la leche de cabra, Los anticuerpos monoclonales que mostraron mayor actividad (sobrenadantes de cultivo de las lineas celulares B2B, Bl2B y C2H y del lquido aseitico B2B) se purificaron parcialmente por precipitacin con sulfato amnico y, de nuevo, se determin su actividad mediante un ELISA Indirecto frente a las casenas de la leche de cabra (Figura IV.10.). De los resultados obtenidos, se observa que la purificacin por sulfato amnico no afect la actividad de los tres anticuemos monoclonales, ya que los resultados fueron similares a los obtenidos con los mismos anticuerpos sin purificar. Como el objetivo principal de este trabajo consista en la utilizacin de anticuerpos monoclonales en la deteccin de leche de cabra en mezclas lcteas, evaluamos los anticuemos monoclonales seleccionados frente a la leche cruda de cabra (1/200), para determinar su reconocimiento mediante un ELISA Indirecto. Los resultados obtenidos (Figura IV.11.), indicaron que el Acm B2B presente tanto en el sobrenadante del medio de

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cultivo como en el liquido ascitico, era el que mostraba una mayor reactividad. Asimismo, el Acm B2fl (sobrenadante del cultivo celular y liquido ascitico) tambin se enfrent a la leche cruda y casenas de las especies vaca, cabra y oveja, mediante un ELISA Indirecto. En la tabla IV.3. se muestran los resultados obtenidos, en los que se observa que la especificidad del sobrenadante del cultivo celular esmayor que la del liquido ascitico, probablemente debido a que entre un 2 y un 10 % de los anticuerpos del liquido asctico proceden de] ratn y no de las clulas de hibridoma (Harlow y Lane, 1988). Por ltimo, se realiz otro ELISA Indirecto para determinar la respuesta del Acm B2B (sobrenadante del cultivo celular), frente a leche de cabra sometida a diferentes tratamientos trmicos. Los resultados obtenidos (Tabla IV.4.), confirmaron que la antigenicidad de las casenas de la leche de cabra no resulta afectada por los tratamientos trmicos, como ya se coment en la seccin V.1. de este trabajo. Finalmente, la especificidad y la posible reactividad cruzada del Acm B2B, se analizaron por la tcnica del Inmunoblotting. Esta tcnica combina la resolucin de las protenas en un gel de electroforesis con la especificidad de su deteccin por un mtodo inmunoenzimtico (ELISA) y se puede utilizar para determinar muchas caractersticas de un antgeno proteico como son, su presencia y concentracin, el peso molecular de la cadena polipeptidica y la eficiencia de su purificacin. El factor que determina el xito en la utilizacin de esta tcnica es la naturaleza de los epitopos reconocidos por los anticuerpos. La mayora de las tcnicas electroforticas incluyen la desnaturalizacin por el calor de la muestra antignica, por lo que slo los anticuemos que reconozcan epitopos resistentes a la desnaturalizacin podrn unirse a ellos. La mayora de los anticuerpos policlonales contienen, al menos, algunos anticuerpos de este tipo, pero muchos anticuerpos monoclonales no podrn reaccionar con antgenos desnaturalizados. La sensibilidad de un inmunoblottingdepende del mtodo de deteccin utilizado y la ventaja de la utilizacin de anticuerpos monoclonales reside en la especificidad de sus interacciones. Otro problema cuando se utilizan anticuerpos monoclonales, es la posibilidad de detectar reacciones cruzadas con otros polipptidos, debido a que un epitopo puede estar formado por cuatro o cinco aminocidos y cabe la posibilidad de la existencia de la misma secuencia en otro poliptido (Harlow y Lane, 1988). Aunque existen una gran variedad de tcnicas de inmunoblotting, las ms utilizadas se basan en la transferencia electrofortica de las protenas a membranas de nitrocelulosa (Towbin y col., 1979; Burnette, 1981). En la Figura IV. 12. se observa que el Acm B2B reconoce slo las casenas de la leche de cabra y no las de oveja y vaca. Asimismo, tambin reconoce las casenas purificadas por cromatografa de intercambio catinico correspondientes a la fraccin que contiene la 201

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casena

52 y

la que contiene la caesina ctsl. La razn de que dicho anticuerpo reconozca

tambin casenas presentes en la fraccin que contiene la casena sj, es que dicha fraccin, como se aprecia en la electroforesis, se encuentra contaminada con las casenas ~ 13 y K. Las bandas minoritarias reconocidas, se atribuyen a variantes genticas o productos de degradacin de la casena
52.

En definitiva, los resultados obtenidos confirman que el Acm

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B2B es monoespecfico de la casena

de la leche de cabra.

V.4. DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA EN MEZCLAS LACTEAS, UTILIZANDO METODOS INMUNOENZIMATICOS (ELISA)
La deteccin y cuantificacin de un anticuerpo o de un antgeno por tcnicas inmunoenzimticas (ELISA), requiere la utilizacin de conjugados enzima-protelflt De esta se dividen en mtodos directos e indirectos si el anticuerpo se conjuga a un enzima (directo) o bien el complejo antgeno-anticuerpo es reconocido por un segundo anticuerpo marcado con un enzima (indirecto). Este segundo anticuerpo suelen ser anti-inmunoglobulinas frente al primero o la utilizacin de la protena A. Una variacin importante de estos dos mtodos consiste en la conjugacin del anticuerpo con molculas pequeas, como la biotina, detectndose entonces la unin antgeno-anticuerpo por compuestos como la estreptavidina. El mtodo directo es sencillo de realizar y requiere menos tiempo que el indirecto, aunque su sensibilidad es menor, disponiendo de la ventaja de la existencia de conjugados comerciales de enzima-anticuerpo y de que el primer anticuerpo no sufre ninguna modificacin. Para la mayora de las aplicaciones, los mtodos indirectos son los ms utilizados. En este trabajo, hemos utilizado el mtodo indirecto detectando los complejos antgeno-anticuerpo formados, con un conjugado comercial de anti-inmunoglobulinas de ratn obtenidas de cabra y marcado con el enzima peroxidasa de rbano (Dako). En el caso de los anticuerpos conjugados a la biotina, utilizamos un conjugado comercial de estreptavidina marcada con peroxidasa de rbano (Dako). V.4.1. DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE CRUDA DE CABRA EN LECHE CRUDA DE OVEJA Existen muchas variantes de las tcnicas inmunoenzirnticas, aunque las ms utilizadas son el ELISA Indirecto, Sandwich y Competitivo. En nuestro trabajo, la primera 202

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tcnica que utilizamos fue la del ELISA Indirecto clsico ya que es la ms sencilla de todas en lo que se refiere a la obtencin y preparacin de los reactivos utilizados y a su desarrollo en cuatro etapas, con lo que el tiempo requerido para su realizacin es muy pequeo (4 horas) (Figura 11.18.) En la realizacin del ELISA Indirecto se utiliz el Acm B2B parcialmente purificado con sulfato amnico y un conjugado comercial de antiinmunoglobulinas de ratn marcadas con el enzima peroxidasa de rbano. Como se observa en la Figura IV. 13., la respuesta del Acm B2B frente a porcentajes crecientes de leche de cabra en las mezclas lcteas, fue lineal, originando una recta de regresin que nos permite detectar y cuantificar de un 0,5 a un 15% de adicin de leche de cabra en leche de oveja mediante la expresin: y= 0,3505 + 0,1138 x, con un coeficiente de regresin (r2) de 0,996, un coeficiente de regresin ajustado (Adj. r2) de 0,996 y un valor de p=O,000l. El coeficiente de regresin ajustado es el parmetro estadstico ms adecuado cuando el nmero de muestras del que se parte no es muy grande. De la expresin Adj. r2= 0,996 (p=O,000l), se deduce que existe una relacin estadstica adecuada entre el porcentaje de leche de cabra existente en las muestras y la absorbancia de dichas muestras. Sin embargo, si los valores de sustitucin de leche de oveja por leche de cabra superan el 15%, la fiabilidad del ensayo sera escasa, ya que a partir de este valor los valores de las absorbancias no se incrementan con el porcentaje de sustitucin. Por tanto, en los ensayos procuramos ajustar las concentraciones de los reactivos para que fueran eficaces en la deteccin de un 0,5 a un 15% de sustitucin de la leche de oveja por la de cabra. No obstante, porcentajes de sustitucin superiores al 15% son poco frecuentes en la industria lctea ya que corresponden a volmenes que originan productos de caractersticas muy distintas a las del producto original, con modificaciones en parmetros que se aprecian organolpticamente. La respuesta inmunolgica lineal obtenida en los inmunoensayos es frecuente, dependiendo de la afinidad del anticuerpo por el antgeno y de las concentraciones de los reactivos que intervienen en el ensayo. La respuesta lineal es preferible cuando el antgeno de inters se encuentra en grandes cantidades en las muestras problema, aunque para detectar la presencia de cantidades pequeas del antgeno buscado se prefiere la respuesta logartmica. La tcnica del ELISA Indirecto clsico desarrollada es sencilla y rpida, pero presenta el inconveniente de su variabilidad interna, posiblemente, como consecuencia de que no siempre se adsorbe en las placas la misma cantidad de antgeno. Adems, resulta poco eficaz en la deteccin y cuantificacin de cantidades pequeas de sustitucin de leche de una

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especie animal por otra. Otra caracterstica a considerar en la utilizacin de este formato ELISA es que las sustancias adsorbidas a los pocillospueden experimentar alteraciones estructurales derivadas de su unin y los epitopos ms inmungenos serian inaccesibles para su reconocimiento por el anticuerpo. El ELISA Sandwich es el mtodo ms utilizado en la deteccin y cuantificacin de antgenos, debido a su gran especificidad y sensibilidad (Harlow y Lane, 1988). Su especificidad se debe a la utilizacin de anticuerpos especificos (anticuerpos de captura) que se adsorben a los pocillos de la placa de ELISA capturando los antgenos de la muestra frente a la que se obtuvieron. Al aadir los anticuerpos de deteccin, estos no se encuentran con una mezcla heterognea de antgenos sino con los especficos de la muestra a analizar, por lo que se unirn a ellos ms fcilmente (Figura 11.19.). La mayor ventaja de esta tcnica es que el antgeno utilizado no necesita de una purificacin previa y, adems, al no encontrarse directamente adsorbido a los pocillos de la placa se encontrar en su forma nativa, eliminando las posibles alteraciones conformacionales que pueden ocurrir en el ELISA Indirecto (Hefle, 1995). El mayor inconveniente de esta tcnica radica en que no todos los anticuerpos son vlidos para proporcionar los resultados deseables y que requiere la utilizacin de dos anticuerpos que pueden ser dos anticuemos monoclonales, o bien, un anticuerpo monoclonal y un otro policlonal. En primer lugar, realizamos el ELISA Sandwich utilizando el Acm B2B y el anticuerpo policlonal anti-caseinas de la leche de cabra obtenido de conejos, ambos purificados por precipitacin selectiva con sulfato amnico y ambos utilizados como anticuerpos de captura y de deteccin. Los resultados obtenidos (no mostrados), indicaron que este ensayo no era vlido en la deteccin de leche de cabra en leche de oveja ya que las absorbancias de las muestras problema, con leche de cabra o sin ella, eran iguales. Esto parece deberse, probablemente, a que los anticuerpos policlonales utilizados no estaban purificados por cromatografa de afinidad y por lo tanto reconocan tanto a las casenas de la leche de cabra como a las de la leche de oveja ya que, al ser especies muy prximas, contienen epitopos comunes. En segundo lugar, para el desarrollo de esta tcnica utilizamos dos anticuerpos monoclonales obtenidos frente a la casena 52 de la leche de cabra (IB2B y Bl2B), aunque los resultados obtenidos fueron similares a los descritos previamente. En este caso, el problema reside en que el ELISA Sandwich debe utilizar dos anticuerpos monoclonales que reconozcan epitopos diferentes y, posiblemente, alejados del mismo antgeno, ya que si esto no ocurre, se producir un solapamiento entre ambos y no ser posible la unin de

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ambos anticuerpos al mismo antgeno. En definitiva, el ELISA Sandwich tal y como se ha realizado en este trabajo, no permite la deteccin y cuantificacin de la leche de cabra en la de oveja. Como ya se ha comentado, el ELISA Sandwich es el mtodo de eleccin en la deteccin y cuantificacin de antgenos de inters, pero si no se encuentran disponibles dos anticuerpos monoclonales que reconozcan epitopos diferentes de un mismo antgeno o de anticuerpos policlonales purificados por cromatografa de afinidad, el siguiente ensayo de eleccin es el ELISA Competitivo (Harlow y Lane, 1988; Hefle, 1995). El ELISA Competitivo se ha utilizado con xito en el anlisis de molculas pequeas tales como pesticidas, toxinas, hormonas y tambin en la deteccin y cuantificacin de algunas protenas como la soja (Rittenburg, 1990). Esta tcnica tiene dos variantes, basadas en la deteccin del anticuerpo o del antgeno, siendo esta ltima la ms utilizada en la deteccin y cuantificacin de componentes y contaminantes delos alimentos. En este sistema, una muestra antignica pura o parcialmente purificada, se adsorbe a los pocillos de las placas de ELISA, mientras la muestra problema conteniendo una concentracin desconocida del antgeno se aade mezclada con el anticuerpo. El antgeno existente en la muestra problema competir con el antgeno inmovilizado en el pocillo por la unin con el anticuerpo y, cuanto mayor sea la concentracin antignica en la muestra problema, menor ser la cantidad de anticuerpo que se unir a la fase slida. El complejo antgeno-anticuerpo de la fase slida se detecta por la adicin de un conjugado de anti-inmunoglobulinas de ratn obtenido de otra especie animal marcado con un enzima y la cantidad de color observado, es inversamente proporcional a la cantidad de antgeno existente en la muestra problema o standar (Figura 11.20.). La realizacin de esta tcnica requiere la utilizacin de anticuerpos monoclonales, especficos para que el antgeno adsorbido y el de la muestra problema compitan por el mismo lugar de unin con el anticuerpo. Para realizar la cuantificacin la absorbancia de cada muestra se dividepor la absorbancia obtenida con un control negativo (sin muestra problema) y se multiplica por 100 dando el porcentaje de absorbancia, que cuando se resta de 100 obtenemos el valor denominado % de Inhibicin (seccin IV.5.l.C.). Otra caracterstica de este tipo de ELISAes la conveniencia de utilizar antgenos puros o parcialmente purificados. Para dotar al ensayo de mayor sensibilidad, utilizamos como antgeno adsorbido al pocillo, las casenas totales de la leche de cabra y como anticuerpo el Acm B2B parcialmente purificado por precipitacin con sulfato amnico. El complejo antgeno-anticuerpo se detect con un conjugado comercial de anti-inmunoglobulinas de

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ratn obtenidas de cabra y marcadas con el enzima peroxidasa de rbano. Los resultados obtenidos se han descrito en la seccin IV.5.l.C. de este trabajo, en los que conviene destacar que la respuesta inmunolgica obtenida es de tipo logartmico, a diferencia de la lineal obtenida con el ELISA Indirecto. Este tipo de respuesta es preferible en la deteccin y cuantificacin de concentraciones pequeas del antgeno de inters. As, (Figura IV.14.) se apr ecia que para una sustitucin del 0,25% de leche de oveja por leche de cabra, el porcentaje de inhibicin obtenido es superior al 25%, por lo que esta tcnica es ms sensible y especfica que la del ELISA Indirecto clsico, Sin embargo, al igual que con la tcnica anterior, a partir de valores de sustitucin superiores al 15% el ensayo no es adecuado. La ecuacin resultante de la deteccin y cuantificacin de un 0,25 a un 15 % de leche de oveja por leche de cabra, fue la siguiente: log A405= 0,0383 0,383 1 log x, con un 2) de 0,976, y un coeficiente de regresin ajustado (Adj r2) de coeficiente de regresin (r 0,970 y un valor de p=O,OOOI.
-

Por tanto, al igual que suceda con el ELISA Indirecto, la correlacin existente entreel incremento de absorbancia y el porcentaje de sustitucin de leche de oveja por leche de cabra, es tambin muy elevada. Por otra parte, al contrario que en el ELISA Indirecto, lo que se adsorbe en los pocillos es una concentracin conocida de anticuerpos especficos, en lugar de una muestra antignica diluida, por lo que la variabilidad intra e interensayos disminuye considerablemente. De lo expuesto, podemos concluir que para la deteccin y cuantificacin del 0,25 al 15% de leche de cabra en leche de oveja, el ELISA Competitivo es el mtodo de eleccin, debido a su gran sensibilidad. La conjugacin de los anticuerpos purificados con la biotina y su deteccin con ]a estreptavidina, puede amplificar la respuesta inmunolgica e incrementar la sensibilidad de las tcnicas inmunoenzimticas (ELISA). Esto se debe, a que al encontrarse las inmunoglobulinas unidas a muchas molculas de biotina, el conjugado de estreptavidina-peroxidasa encuentra ms lugares de anclaje a los anticuerpos, que cuando se utiliza como conjugado los anticuerpos anti-inmunoglobulinas de especie marcadas con el mismo enzima. Por este motivo intentamos desarrollar y poner a punto un ELISA Indirecto en el que el Acm B2B se conjug con la biotina. Sin embargo, en nuestro caso la biotinizacin del Acm B2B en lugar de amplificar la respuesta, provoc una disminucin en su capacidad de reconocimiento de las casenas de la leche de cabra. Este resultado puede deberse a que para la conjugacin utilizamos un ster de la biotina, denominado biotinil-N-hidroxisuccinimida (BHNS), que reacciona con el anticuerpo a travs de los grupos amino libres de las protenas, normalmente los del aminocido usina. Si la unin

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con el anticuerpo se realiza a travs de aminocidos esenciales para la actividad del anticuerpo (los lugares de combinacin con el antgeno), la biotinizacin puede disminuir o destruir la actividad de ste (Harlow y Lane, 1988). De los resultados obtenidos, se deduce que con la utilizacin del Acm B2B y las tcnicas del ELISA Indirecto y Competitivo empleadas en este trabajo, es posible la deteccin y cuantificacin de la sustitucin de la leche de oveja por leche de cabra, teniendo como limite mximo un 15% de sustitucin y como limite inferior un 0,5% (Indirecto), mientras en la deteccin y cuantificacin de porcentajes pequeos de sustitucin, el ELISA Competitivo es el mtodo ms sensible y fiable. V.4.2. DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE CRUDA DE CABRA EN LECHE CRUDA DE VACA La deteccin y cuantificacin de leche cruda de cabra en mezclas con leche cruda de vaca, se realiz utilizando el Acm 132B purificado parcialmente por precipitacin selectiva con sulfato amnico y las tcnicas inmunoenzimticas del ELISA Indirecto y Competitivo. Del anlisis de las mezclas experimentales de leche y utilizando la tcnica del ELISA Indirecto (Figura IV. 15.), obtuvimos una respuesta lineal en la deteccin y cuantificacin del 0,5 al 15% de leche de cabra en leche de vaca y cuya ecuacin fue la siguiente: A405= 2) de 0,981, y un coeficiente de 0,4211 + 0,1122 x, con un coeficiente de regresin (r regresin ajustado (Adj. r2) de 0,977 y un valor de p=O,OOOl. Utilizando la tcnica del ELISACompetitivo, la representacin grfica de la relacin entre el porcentaje de inhibicin y los de sustitucin del 0,25 al 15% de leche de vaca por leche de cabra, origin una respuesta logartmica (Figura IV.16), cuantificable mediante la ecuacin:log A 405= 0,4290 2) de 0,975, y un coeficiente de regresin 0,3360 log x, con un coeficiente de regresin (r ajustado (Adj r2) de 0,970 y un valor de p=0,000l.
-

Debido a la analoga existente entre las leches de oveja y cabra, se pens que su diferenciacin sera ms difcil que en el caso de la leche de vaca, aunque los resultados que se describen en esta seccin determinaron que la cuantificacin de leche de cabra en leche de oveja (Figuras IV.13. y IV. 14.), es igual de precisa que cuando el mtodo se utiliza en la deteccin y cuantificacin de la leche de cabra en leche de vaca (Figuras IV.15. y IV.16.). Por tanto, podemos afirmar que tanto el ELISA Indirecto (deteccin del 0,5 al 15%) como el Competitivo (deteccin del 0,25 al 15%), desarrollados en este trabajo, permiten la 207

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deteccin y cuantificacin de la sustitucin de leche de vaca por la de cabra. V.4.3. INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO TERMICO EN LA DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA EN LECHE CRUDA DE OVEJA Como ya se ha comentado en la seccin V. 1., las casenas de la leche presentan una elevada termoestabiidad. Puesto que utilizamos la casena as2 de la leche de cabra para la produccin del Acm B2B, consideramos de inters analizar la influencia de los tratamientos
trmicos en la capacidad de reconocimiento de este Acm por las casenas frente a las que se

obtuvo. En una primera aproximacin, enfrentamos el Acm B2B a la leche cruda, pasterizada y esterilizada de cabra, determinando que ste era termoestable (Tabla IV.4.). No obstante, permaneca por determinar la capacidad de reconocimiento de este Acm para la leche de cabra sometida a los diferentes tratamientos trmicos de pasterizacin y esterilizacin, en mezclas con leche de oveja y vaca. El tratamiento trmico de la leche origina cambios en la estructura de la micela de casena y en, un principio, las casenas ic y as2 se asocian a la p-lactoglobulina. Si el tratamiento trmico es ms intenso, se producen cambios en los aminocidos de las casenas, como la prdida de fosfato de los radicales fosfoserina, la formacin de lisoalanina y la aparicin de productos de la reaccin de Maillard. Cuando el tratamiento trmico se prolonga a temperaturas elevadas, se puede producir una ligera proteolisis de las casenas como lo indica el incremento en los niveles de proteasa-peptona y de nitrgeno no proteico de la leche (Law y col., 1994). En la deteccin y cuantificacin de la leche de cabra tratada trmicamente en mezclas con leche de oveja, utilizamos las tcnicas inmunoenzimticas del ELISA Indirecto y Competitivo. Los resultados obtenidos se han descrito en la seccin IV.5.3., obteniendo con el ELISA Indirecto, tanto para la leche pasterizada (Figura IV.17.) como para la esterilizada (Figura IV.18.) de cabra, una respuesta lineal con una ecuacin que nos permite detectar la presencia del 0,5 al 15% de leche pasterizada (Adj. r2= 0,979, p=O,O00l) o esterilizada (Adj. r2= 0,960, p=O,000l) de cabra, en la leche de oveja. En la Figura IV.19. se muestran los resultados obtenidos con el ELISA Indirecto, para la deteccin y cuantificacin de leche cruda, pasterizada y esterilizada de cabra en leche de oveja. En ella se aprecia, que los valores de absorbancia obtenidos cuando la leche de cabra se somete a pasterizacin son superiores a los obtenidos con la leche cruda, mientras 208

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que con la leche esterilizada, los valores de absorbancia disminuyen respecto de los de la leche cruda. Recientemente, Law y col. (1994) estudiando los cambios estructurales de las casenas sometidas a tratamientos trmicos, han determinado que stos solamente se producen cuando la leche se calienta durante 5 minutos a temperaturas superiores a 110 0C. Por tanto, la pasterizacin de la leche (62 0C, 30 minutos) no afectada a la estructura de las casenas. El que los valores de absorbancia sean ms altos que con los de la leche cruda se debe, probablemente, a que con el calor la cadena protenica se vuelve ms laica (se abre ms) y los epitopos quedaran ms expuestos para su reconocimiento por el anticuerpo. Por el contrario, la esterilizacin de la leche (121 0C, 20 minutos), provoca cambios estructurales en las molculas de casena, lo que dificulta el reconocimiento de sus correspondientes epitopos por el anticuerpo. La utilizacin del ELISA Competitivo, permiti la obtencin de dos ecuaciones para la tilies en la deteccin y cuantificacin del 0,25 al 15% de sustitucin de leche de oveja por leche pasterizada de cabra (Figura IV.20., Adj. r2= 0,971, p=O,OOOl) o por leche esterilizada de cabra (Figura IV.21., Adj. r2= 0,980, p=O,OOOl). Las diferencias que se observan con respecto al ELISA Indirecto (Figuras lvii. y IV.l8.), son las que se observaron en el caso de la leche cruda (seccin V.4.l.). El ELISA Competitivo proporciona una respuesta logartmica que nos permite detectar y cuantificar la presencia del del 0,25% de leche pasterizada o esterilizada de cabra en la leche de oveja. La representacin de los porcentajes de inhibicin obtenidos para la leche cruda, pasterizada y esterilizada de cabra, se muestran en la Figura IV.22. Como en el caso del ELISA Indirecto, se aprecian diferencias en los valores de los tres tipos de leche aunque stas son mnimas comparadas con las obtenidas con el ELISA Indirecto. Estos resultados confirman la mayor sensibilidad del ELISA Competitivo en la deteccin y cuantificacin de la presencia de leche cruda, pasterizada o esterilizada de cabra en la leche de oveja. V.4.4. INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO TERMICO EN LA DETECCION Y CIJANTIFICACION DE LECHE DE CABR EN LECHE CRUDA DE VACA La deteccin y cuantificacin de leche pasterizada o esterilizada de cabra en mezclas con leche cruda de vaca, se realiz utilizando el Ac~ B2B purificado parcialmente por precipitacin con sulfato amnico y las tcnicas inmunoenzimticas del ELISA Indirecto y

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Competitivo. Los resultados obtenidos utilizando la tcnica del ELISA Indirecto se muestran en las figuras IV.23. y IV.24. En ambos casos se obtuvo una respuesta lineal, lo que permite detectar y cuantificar de un 0,5 % a un 15 % de sustitucin de leche de oveja por leche pasterizada de cabra ( Adj. r2= 0,986 p=O,OOOl) o por leche esterilizada de cabra (Adj. r2= 0,992 p=O,OOOl) (Figura IV.20.). En la figura IV.25. se comparan los valores de absorbancia obtenidos con los tres tipos de leche de cabra utilizada en las mezclas lcteas. Como suceda en el caso de las mezclas con leche de oveja, los valores de absorbancia cuando se utiliza la leche pasterizada de cabra son mayores que con la leche cruda, mientras que con la leche de cabra esterilizada los valores de absorbancia disminuyen. La respuesta que se obtiene al utilizar el ELISA Competitivo en la deteccin y cuantificacin de leche pasterizada (Figura IV.26.) o esterilizada (Figura IV.27.) de cabra en leche de vaca fue del tipo logartmico. Las ecuaciones obtenidas permiten detectar y cuantificar la presencia del 0,25 hasta el 15% de leche pasterizada (Adj. r2= 0,970, p=O,OOOl) y esterilizada (Adj. r2= 0,974, p=0,000l) en la leche de vaca. La comparacin de la relacin entre los porcentajes de inhibicin y los porcentajes de sustitucin obtenidos para la leche cruda de cabra o la sometida a pasterizacin o esterilizacin (Figura IV.28.), permite comprobar que existen diferencias en los valores de inhibicin (leche pasterizada de cabra> leche cruda de cabra > leche esterilizada de cabra), pero estas son menores que las obtenidascon utilizarel ELISA Indirecto.

V.5. DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA EN QUESOS MADURADOS DE OVEJA Y VACA, UTILIZANDO METODOS INMUNOENZIMATICOS (ELISA)
El empleo de las tcnicas inmunolgicas del ELISA Indirecto y Competitivo en la deteccin y cuantificacin de leche de cabra en leche de oveja y vaca, dieron resultados muy satisfactorios, por lo que se procedi a utilizrlas en la deteccin y cuantificacin de la leche de cabra en los quesos madurados de oveja y vaca.

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V.5.1. DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA EN QUESOS MADURADOS DE OVEJA Como antgenos se utilizaron las tres mezclas de quesos realizadas con queso fresco, queso tierno y queso madurado de cabra en queso de oveja. El objetivo era determinar si el reconocimiento de la leche de cabra por el Ac~ B2B se modificaba por los cambios de las casenas durante la maduracin de los quesos. La primera tcnica utilizada fue la del ELISA Indirecto clsico y los resultados se muestran en las Figuras IV.29., IV.30. y IV.31. En los tres casos, la respuesta del Acm B2B a la presencia creciente de leche de cabra produce un incremento logartmico de la absorbancia entre los porcentajes del 1 y 25% de sustitucin del queso de oveja por los de cabra. Las ecuaciones de regresin obtenidas mostraron un coeficiente de regresin lineal suficientemente elevado y significativo (queso fresco : Adj. r2= 0,990, p=O,OOOl; queso tierno: Adj. r2= 0,989, p=O,OOOl; queso madurado: Adj. r2= 0,936, p=O,00Ol), como para afirmar que tambin en este caso existe una gran correlacin entre el aumento de absorbancia y el del porcentaje de sustitucin del queso de oveja por queso de cabra. Cuando se comparan los resultados correspondientes a las tres mezclas (Figura IV.32.), se aprecia que los valores de absorbancia obtenidos son ligeramente superiores en la mezcla con queso fresco que con queso tierno. Asimismo, los valores de absorbancia obtenidos con el queso madurado que con el queso tierno. Por tanto, parece ser que el reconocimiento de las casenas de cabra por el Acm B2B en el caso de las mezclas de quesos resulta afectada (dependiendo del perodo de maduracin del queso), aunque las diferencias encontradas son muy pequeas. La respuesta logartmica obtenida, contrasta con la respuesta lineal observada en la deteccin de leche de cabra en leche de oveja (Figuras

IV. 19.) y puede deberse a la mayor dificultad del Acm B2B para reconocer las casenas de la
leche de cabra, en una muestra antignica ms compleja como es el queso. Los resultados obtenidos al utilizar la tcnica del ELISA Competitivo (Figuras IV.33., IV.34. y IV.35.), permitieron la obtencin de ecuaciones de regresin con buenos indices de correlacin (queso fresco : Adj. r2= 0,980, p=O,O0Ol; queso tierno: Adj. 9= 0,978, p=O,OOOl; queso madurado: Adj. r2= 0,956, pmO,0001), para la deteccin y cuantificacin del 0,5 al 25% de de queso de cabra en queso de oveja. En la Figura IV.36., se observa que las diferencias entre los porcentajes de inhibicin obtenidos para cada una de las mezclas, son menores que los obtenidos al utilizar el ELISAIndirecto. Por lo tanto, para la deteccin y cuantificacin del 0,5% al 25% de queso de cabra en

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Discusin

queso de oveja, el ELISA Competitivo es el mtodo de eleccin por su mayor sensibilidad. V. 5.1. DETECCION Y CUANTIFICACION DE LECHE DE CABRA EN QUESOS MADURADOS DE VACA Para determinar la capacidad de reconocimiento del Ac~ B2B del queso fresco, tierno y madurado de cabra en mezclas con queso de vaca, se utiliz primero la tcnica del ELISA Indirecto. Al relacionar los porcentajes de absorbancia obtenidos con los porcentajes crecientes de sustitucin de queso de vaca por queso fresco (Figura IV.37., Adj. r2= 0,993, p=O,OOOl), queso tierno (Figura IV.38. Adj. r2= 0,989, p=O,O00l) y queso madurado (Figura IV.39. Adj. r2= 0,958, p=O,OOOl) de cabra y como sucedi en las mezclas con queso de oveja, se obtuvo una respuesta logartmica. De los resultados obtenidos se deduce que esta tcnica permite la deteccin e identificacin del 1 al 25% de queso de cabra en queso de vaca. Las diferencias observadas cuando se comparan las tres mezclas ( Figura IV.40.), son escasas. Con la tcnica del ELISA Competitivo (Figuras IV.4 1., IV,42. y IV.433, se consigui detectar y cuantificar del 0,5 al 25% de queso de vaca por el de cabra y la correlacin de los resultados obtenidos se consider adecuada (queso fresco : Adj. r2= 0,933, pmO,OOOl; queso tierno: Adj. r2= 0,976, p=O,OOOl; queso madurado: Adj. r2= 0,931, p=O,OOOl). Adems, las diferencias observadas en los porcentajes de inhibicin de las tres mezclas son mnimas (Figura IV.44), al igual que suceda con el queso de oveja, por lo que la tcnica del ELISA Competitivo es la ms adecuada para la deteccin y cuantificacin de la sustitucin del 0,5-25% de queso de vaca por el de cabra,

V.6. COMPARACION DE LOS RESULTADOS DE ESTE TRABAJO CON LOS DE OTROS INVESTIGADORES
En la introduccin de este trabajo, se revisan los principales mtodos disponibles para la identificacin y cuantificacin de la leche de diversas especies animales en mezclas lcteas frescas y quesos madurados. La mayor parte de los estudios desarrollados se refieren a la deteccin de leche de vaca en la de oveja y cabra. Sin embargo, en los pases mediterrneos, la deteccin de leche de cabra y su determinacin cuantitativaen leche y en quesos de oveja, posee una enorme importancia econmica. Debido a la gran analoga entre las leches de oveja y cabra, su diferenciacin es ms difcil que en el caso de la de vaca, aunque no por ello han dejado de desarrollarse diversas tcnicas analticas.

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Discusin

As, Assenat (1967) fraccionando las casenas por electroforesis en geles de poliacrilamida, detecta un 2% de leche de vaca en la de oveja, sealando que dada la similitud de las casenas a5 de las leches de cabra y oveja, esta tcnica slo permite la deteccin y cuantificacin de leche de cabra en la de oveja para porcentajes de sustitucin superiores al 30%. La identificacin y cauntificacin de las protenas del suero de la leche por electroforesis en geles de poliacrilamida (Amigo y col., 1989), permite la deteccin del 1-2% de leche de vaca o de cabra en quesos maduradosde oveja. Esta tcnica es oficial en Espaa (B.O.E., 300(191) para la deteccin de leche de cabra en la de oveja (limite de deteccin del 2 %) y de leche de cabra en el queso de oveja (lffite de deteccin del 3%). Ruiz y Santillana (1986) separando las protenas del suero de la leche por isoelectroenfoque en geles de poliacrilamida, detectan y cuantifican desde un 3% de leche de cabra en la de oveja. Ortin y col. (1992a y b) desarrollando la misma tcnica en un equipo automatizado Phast-System, determinan porcentajes del 5 al 40% de leche de vaca, cabra y oveja en quesos de mezcla y de maduracin corta, con una gran precisin. Asimismo, evaluando el punto isoelctrico de la casena te de la leche de las tres especies, concluyen que las para-te-casenas constituyen un marcador potencial y podran utilizarse en la identificacin y cuantificacin de la leche de vaca, oveja y cabra en mezclas de quesos. No obstante, a pesar de su sensibilidad, los mtodos electroforticos presentan el inconveniente de un coste elevado y de requerir mucho tiempo para completar los anlisis. En cuanto a los mtodos inmunolgicos, uno de los primeros empleados en la deteccin de la leche de cabra en mezclas lcteas, fue el de la inmunoprecipitacin en medio liquido (Pinto, 1966), en el que mpleando inmunosueros anti-proteinas sanguneas de la leche de cabra, neutralizadas con las protenas sanguneas de las especies con las que presentaba reacciones cruzadas, se consigue la deteccin de un 5% de leche de cabra en la de oveja. Sin embargo, el mtodo no es vlido cuando la leche se somete a temperaturas superiores a las de pasterizacin. De los mtodos inmunolgicos, el de la inmunodifusin radial (Levieux, 1977) es el que ms se ha empleado en la deteccin y cuantificacin de la leche de cabra en mezclas lcteas, con un limite de deteccin dcl 1%, pero este mtodo presenta la limitacin de que en las leches sometidas a tratamientos trmicos superiores a 0C durante 30 segundos debe aplicarse un factor de correccin, lo mismo que en los 75 quesos. Amigo y col. (1989), al comparar la inmunodifusin radial de las protenas del suero de la leche, con la electroforesis en geles de poliacrilamida de las mismas protenas indican que ambos mtodos permiten la deteccin y cuantificacin de leche de cabra en mezclas lcteas y en quesos elaborados con leche de oveja, si bien, el mtodo electrofortico cuantifica mejor la composicin real de la mezcla que el inniunolgico. A pesar de sus

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Discusin

limitaciones, la inmunodifusin radial es un mtodo oficial para la deteccin de leche de cabra en la de oveja con un limite de deteccin del 1% (B.O.E., 30/X/91). La tcnica del inmunodotting empleando inmunosueros anti.inmunoglobulinas sanguneas de cabra obtenidas de carneros ha sido utilizada por Prez y col. (1992), como un mtodo cualitativo en la deteccin de leche de cabra en la de oveja. Garca y col. (1993; 1994 ) empleando un inmunosuero anti-proteinas sricas de la leche de cabra, han desarrollado y puesto a punto dos mtodos inniunoenzimticos (ELISA), Indirecto y Sandwich, que permiten la deteccin y cuantificacin de un 1% de leche de cabra en leche de oveja. El inconveniente de ambos es que el inmunosuero descrito no permite la deteccin y cuantificacin de la leche de cabra en los quesos madurados de oveja, ya que las protenas sricas son muy sensibles a los tratamientos trmicos y se encuentran en concentracines pequeas en los quesos madurados. Por este motivo, Rodrguez y col. (1991; 1992) utilizaron inmunosueros frente a las casenas de la leche de cabra purificados por cromatografa de afinidad, biotinizados y neutralizados, para su utilizacin en diversas tcnicas inmunoenzimticas. As, utilizando un ELISA Indirecto detectan y cuantifican de un 1 a un 25% de leche de cabra en leche y quesos madurados de oveja. Si el sistema utilizado es un ELISA Sandwich, es posible la deteccin y cuantificacin de un 1 a un 100% de leche de cabra en la leche y quesos de oveja. Sin embargo, la purificacin de los anticuemos policlonales por afinidad es larga y costosa y su disponibilidad es limitada. De lo expuesto sobre las tcnicas empleadas en la deteccin y cuantificacin de la leche de cabra en leche y quesos de oveja, puede concluirse que las tcnicas inmunoenzimticas (ELISA) desarrolladas en este trabajo, poseen una sensibilidad adecuada. Empleando el Acm B2B especifico de las casena 52 de la leche de cabra, la tcnica del ELISA Indirecto permite la deteccin y cuantificacin de la sustitucin del 0,5 al 15% de leche de oveja por leche de cabra y del 1 al 25% de sustitucn de queso de oveja por queso de cabra. no obstante, con el ELISA Competitivo desarrollado, el rango de deteccin y cuantificacin de la leche de cabra se amplia del 0,25 al 15% en las mezclas lcteas y del 0,5 al 25% en los quesos. Adems, estos mtodos ofrecen frente a los descritos previamente, las ventajas de disponer de una fuente ilimitada de anticuerpos, requieren solamente cuatro (Indirecto) o 5 (Competitivo) horas para su realizacin, su coste econmico es pequeo y permiten analizar un gran nmero de muestras en una sla placa de ELISA. Debido a la escasa informacin existente sobre el desarrollo de tcnicas analticas para

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Discusin

detectar y cuantificar la presencia de leche de cabra en leche y quesos de vaca y como se han obtenido resultados similares a los descritos con la leche de oveja, es posible concluir que los mtodos inmunoenzimticos (ELISA) desarrollados en este trabajo, son tambin adecuados para la deteccin y cuantificacin de la leche de cabra en leche y quesos de vaca.

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CAPITULO Vi

CONCLUSIONES

Conclusiones

1. De los mtodos cromatogrficos empleados para el fraccionamiento de las casenas de la leche de cabra, que han sido los de cromatografa lquida rpida (FPLC) de intercambio aninico, cromatografa de intercambio aninico con DEAE-celulosa y cromatografa de intercambio catinico en una matriz de S-Sepharose Fast-Flow, la cromatografa de intercambio catinico es la que ha permitido una mejor separacin de las casenas en sus cuatro componentes mayoritarios (si, 5~, ~ y te). 2. La caracterizacin inmunolgica parcial de las fracciones caseinicas purificadas por cromatografa lquida rpida (FPLC) de intercambio aninico y cromatografa de intercambio catinico en una matriz de S-Sepharose Fast-Flow, utilizando anticuerpos policlonales especficos de la leche de cabra y un ELISA Indirecto, indic que la fraccin que contena la casena as~ obtenida por cromatografa de intercambio catinico era la fraccin ms inmungena, probablemente porque es la que posee el mayor nmero de epitopos especficos de las casenas de la leche de cabra, 3. El bazo del ratn inmunizado con la fraccin que contena la casena 52 de la leche de cabra y que mostraba el mayor titulo de anticuerpos frente a las casenas de la leche de cabra, se utiliz para la fusin de los linfocitos con clulas de mieloma. La eficacia de la fusin celular fue mayor del 50%: de 400 pocillos que mostraban hibridomas, el 25% producan anticuerpos monoclonales frente a las casenas de la leche de cabra,
4. La metodologa de produccin de hibridomas permiti la identificacin y

seleccin de 8 lineas celulares productoras de anticuerpos monoclonales especficos de la leche de cabra, denominados: AlH, B2B, B12B, C2H, C6C, F4E y A6F.
5.

Los estudios realizados para evaluar la actividad y especificidad de los 8 anticuerpos monoclonales citados indicaron que, el ACm B2B procedente del sobrenadante del cultivo celular era monoespecifico frente a la casena s2 de la leche de cabra, adems de mostrar la mayor reactividad frente a dicha leche.

6. La especificidad del Acm B2B procedente del sobrenadante del cultivo celular frente a las casenas y a la leche cruda de cabra fue mayor que la presentada por el mismo Acm existente en el liquido ascitico, por lo que se seleccion para su

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Conclusiones

utilizacin posterior en la deteccin y cuantificacin ele leche de cabra en mezclas lcteas y quesos de diversos tipos, empleando tcnicas inmunoenzimticas (ELISA). 7. De las tcnicas inmunoenzimticas desarrolladas en este trabajo, que fueron un ELISA Indirecto, Sandwich y Competitivo, as como un ELISA Indirecto utilizando el sistema de amplificacin biotina-avidina, el ELISA Competitivo result ser el ms eficaz y sensible en la deteccin y cuantificacin de leche de cabra en mezclas lcteas y quesos.
8.

Utilizando el Acm B2B y la tcnica del ELISA Indirecto, es posible detectar y cuantificar porcentajes de sustitucin del 0,5 al 15% de leche de oveja o vaca por leche de cabra y del 1 al 25% de queso de oveja o vaca por queso de cabra. Sin embargo, la sensibilidad del mtodo es insuficiente para detectar concentraciones menores.

9. Utilizando el Acm B2B y la tcnica del ELISA Competitivo, es posible detectar y cuantificar porcentajes de un 0,25% a un 15% de sustitucin de leche de oveja o vaca por leche de cabra y del 0,5 al 25% de queso de oveja o vaca por queso de cabra. La sensibilidad del mtodo recomienda su empleo cuando los porcentajes de sustitucin de las leches de oveja o vaca por la de cabra son pequeos.

1 0. La deteccin y cuantificacin de leche de cabra utilizando el Acm B2B y el

ELISA Competitivo, no resulta afectada significativamente por los tratamientos

trmicos de pasterizacin y esterilizacin a los que se somete la leche de cabra, ni por los diferentes perodos de maduracin de los quesos de cabra utilizados en la preparacin de las mezclas de quesos.

218

CAPITULO VH

TRABAJO FUTURO

Trabajo Futuro

Los resultados de este trabajo indican que el empleo de anticuerpos monoclonales obtenidos frente a la fraccin que contiene la casena as2 de la leche de cabra, permiten el reconocimiento de epitopos especficos de las casenas de la leche de cabra. Asimismo, mediante el desarrollo de tcnicas inmunoenzimticas (ELISA) adecuadas, estos anticuerpos monoclonales son tiles en la deteccin y cuantificacin de leche de cabra en mezclas lcteas y quesos madurados con leches de otras especies. Debido a que el empleo de anticuerpos monoclonales presenta el inconveniente de la inestabilidad gentica de los hibridomas productores de los mismos, as como de su pobre viabilidad celular y de la posibilidad de su prdida cuando se almacenan y conservan a temperaturas bajas, una de las alternativas frente a este problema, consiste en la obtencin y produccin de anticuerpos recombinantes utilizando tcnicas de Biologa Molecular, basadas en la donacin de las inmunoglobulinas o anticuerpos de inters en vectores genticos adecuados y en su expresin en bacterias genticamente modificadas. Estos avances combinan la capacidad de expresar protenas de clulas cucariontes en bacterias con el aislamiento y amplificacin de los genes que codifican las regiones variables de los anticuerpos, mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y con sistemas de seleccin que permiten la identificacin y aislamiento de los anticuerpos de una forma ms sencilla y rpida que la seguida en la seleccin de los anticuerpos monoclonales. Las ventajas de la utilizacin de bacterias genticamente manipuladas en la sntesis de anticuerpos, son obvias en lo que se refiere a la estabilidad gentica de esta funcin, al almacenamiento y conservacin de las bacterias a temperaturas menores y a su facilidad de transporte, sin los problemas de viabilidad y modalidad celular propios de las clulas cucariontes. Los anticuerpos recombinantes, obtenidos por manipulacin gentica, presentan varias ventajas con respecto a los anticuerpos monoclonales como son: 1) el tiempo necesario para su obtencin es menor; 2) mayor capacidad para localizar epitopos que son inaccesibles para las grandes molculas de inmunoglobulinas; 3) la posibilidad de produccin de fragmentos fusionados a un enzima o a cualquier otra protena, con una funcin complementaria a la del reconocimiento delantgeno; 4) la posibilidad de prescindir de la inmunizacin de animales de experimentacin y 5) permiten la obtencin de reactivos de afinidad y especificidad precisas, mediante la utilizacin de tcnicas que modifican la estructura y caractersticas del lugar de unin del anticuerpo con el antgeno. Como trabajo futuro sera conveniente la utilizacin de esta metodologa para asegurar la estabilidad gentica de los hibridomas ya existentes. Por ello, se propone la utilizacin de 220

Trabajo Futuro

los hibridomas generados en este trabajo en la obtencin de anticuerpos recombinantes frente a las casenas de la leche de cabra, para su utilizacin posterior en la deteccin y cuantificacin de leche de cabra en mezclas lcteas y quesos. Para conseguir este objetivo, es conveniente seguir el siguienteesquema de trabajo: 1. Extraccin del mRNA de los hibridomas de inters y obtencin del DNA complementario. 2. Amplificacin de los genes de las inmunoglobulinas de inters, empleando cebadores adecuados y la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). 3. Clonacin de las secuencias VH (cadena pesada de la regin variable) y VL (cadena ligera de la regin variable) responsables del reconocimiento antignico de los Acm producidos, en en los vectores genticos adecuados. 4. Introduccin del vector en hospedadores bacterianos adecuados, como clulas de

E. ~di genticamente modificadas, que permiten la expresin y secrecin al

exterior de las cadenas peptdicas que reconocen alos antgenos de inters.

221

CAPITULO VH

BIBLIOGRAFA

Bibliografa

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