Quim. Nova, Vol. 31, No.

1, 44-46, 2008 DETERMINAO DE FRMACOS DIURTICOS EM ASSOCIAO POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA E ESPECTROFOTOMETRIA

Artigo

Dnia Mendes de Sousa Vallado* Departamento de Engenharia, Campus de Sinop, Universidade do Estado do Mato Grosso, 78850-000 Sinop MT, Brasil Massao Ionashiro e Jos Zuanon Netto Departamento de Qumica Analtica, Instituto de Qumica de Araraquara, CP 355, 14801-970 Araraquara SP, Brasil Recebido em 25/10/06; aceito em 5/7/07; publicado na web em 19/12/07

DETERMINATION OF DIURETIC DRUGS BY THIN LAYER CHROMATOGRAPHY AND SPECTROPHOTOMETRY. A rapid, sensitive and reliable thin-layer chromatography/spectrophotometry screening procedure was developed for quantitative determination of diuretics associated in pharmaceutical dosage forms. The chromatographic method employed microcrystalline cellulose and butanol : acetic acid : water (4:1:1) or amilic alcohol : ammonium hydroxide 25% (9:1) as mobile phases and detection by U.V. light. The drugs were extracted using a simple procedure and were quantified by U.V. spectrophotometry. Results varied from 97.5 to 102.5% and are similar to those obtained by conventional methods. This method of quantification of diuretics is promising for quality control of drugs. Keywords: thin layer chromatography; quality control; diuretics.

INTRODUO Diurticos so frmacos que aumentam a eliminao de eletrlitos (especialmente sdio e ons cloreto) e gua. Esses frmacos so utilizados no tratamento de edemas resultantes de uma variedade de causas, como por exemplo insuficincia cardaca congestiva, sndrome nefrtica, doenas crnicas do fgado, em associao hipertenso, hipercalcemia, diabetes, glaucoma etc1. Os diurticos comercialmente disponveis so as tiazidas, os de ala e poupadores de potssio. Os diurticos poupadores de potssio so considerados com fraco poder diurtico, apresentandose normalmente associados a outros diurticos, com a finalidade de diminuir a depleo de potssio1. A identificao e quantificao desses compostos apresenta grande importncia na indstria farmacutica. A associao de diurticos em formas farmacuticas tem sido analisada por vrios mtodos, incluindo espectroscopia de absoro na regio do ultravioleta e visvel, amperometria, titulometria, todos envolvendo longo tempo de extrao2-6. Existem muitos mtodos cromatogrficos descritos para separao, deteco e medida quantitativa para agentes diurticos individuais, apenas para fluidos biolgicos. Estes mtodos incluem a cromatografia gasosa, cromatografia gs-lquido7, cromatografia gasosa espectrometria de massa8 e cromatografia lquida de alta eficincia, sendo essa a que apresenta maior interesse na determinao de preparaes farmacuticas9,10. Publicaes envolvendo a cromatografia em camada delgada restringem-se a testes qualitativos11. Considerando a dificuldade de anlise de frmacos diurticos em associao em preparaes farmacuticas e o alto custo que envolve as anlises, este trabalho objetivou estabelecer uma metodologia simples, eficiente e de baixo custo para a quantificao de frmacos diurticos combinados, utilizando-se a cromatografia em camada delgada e a espectrofotometria.

PARTE EXPERIMENTAL Solues padro As solues padro de furosemida, hidroclorotiazida, espironolactona e cloridrato de amilorida foram preparadas em metanol em vrias concentraes e ento construdas suas curvas de calibrao usando a espectrofotometria na regio do ultra-violeta, com Espectrofotmetro Carlzeiss Jena, Modelo Specord M 40. Amostras: comprimidos diurticos obtidos no comrcio Furosemida Espironolactona (Amostra A): furosemida - 20 mg; espironolactona - 100 mg; excipiente - 380 mg. Furosemida Cloridrato de Amilorida (Amostra B): furosemida 40 mg; cloridrato de amilorida - 10 mg; excipiente - 210 mg. Hidroclorotiazida Espironolactona (Amostra C): hidroclorotiazida - 50 mg; espironolactona - 50 mg; excipiente - 170 mg. Hidroclorotiazida Cloridrato de Amilorida (Amostra D): hidroclorotiazida - 50 mg; espironolactona - 5 mg; excipiente - 195 mg. Condies cromatogrficas Adsorvente A fase estacionria utilizada foi a de celulose microcristalina (Merck) preparada pela suspenso de 25 g para 90 mL de gua destilada. As placas foram preparadas com auxlio de um espalhador regulvel 0-2 mm (Desaga), sobre placas de vidro 20 x 20 cm. Uma vez preparadas foram secas ao ar por cerca de 2 h e ento ativadas em estufa regulada entre 105 e 110 0C por um perodo de 10 min. Desenvolvimento As cromatoplacas foram desenvolvidas em cubas de vidro 22 x 22 x 10 cm, que continham as fases mveis adequadas ao experi-

In memoriam *e-mail: denia_mv@hotmail.com

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mento, num percurso de 10 cm, em um desenvolvimento unidimensional ascendente simples, em cmara saturada. Fases mveis As fases mveis foram escolhidas baseadas na melhor separao dos frmacos11, onde: Fase Mvel 1: butanol: cido actico glacial: gua (4:1:1) v/v, utilizada para a anlise das amostras B, C e D. Fase Mvel 2: lcool amlico e hidrxido de amnio 25%, (9:1) v/v, utilizada para a anlise da amostra A. Agente revelador A revelao foi feita pelo mtodo fsico da luz ultravioleta (onda curta e longa). Preparo da amostra Foi feita uma amostragem dos comprimidos, de maneira a obter o peso mdio dos mesmos12; em seguida, as amostras foram pulverizadas e homogeneizadas e, ento, tratadas com metanol, sob agitao por 15 min. Seguiu-se ainda, uma filtrao. Aplicao das amostras e padres As solues padro e as amostras foram aplicadas na linha de partida, localizada a 1,5 cm da borda inferior da cromatoplaca e distanciadas 1,5 cm entre si. As aplicaes foram realizadas com auxlio de micropipetas de volume fixo. Padronizao Foram elaboradas duas curvas de calibrao: uma direta, a qual no passou pelo processo cromatogrfico, e outra cromatografada, com solues padro dos frmacos em diversas concentraes, variando de 020 g mL-1. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. Quantificao Para a determinao dos frmacos, as concentraes usadas foram: Amostra A : furosemida 4 g mL-1 espironolactona 10 g mL-1; Amostra B : furosemida 8 g mL-1 cloridrato de amilorida 2 g mL-1; Amostra C : hidroclorotiazida 4 g mL-1 espironolactona 4 g mL-1; Amostra D : hidroclorotiazida 10 g mL-1 cloridrato de amilorida 2 g mL-1; Soluo padro de furosemida : 4 e 8 g mL-1; Soluo padro de hidroclorotiazida: 4 e 10 g mL-1; Soluo padro de espironolactona: 4 e 10 g mL -1; Soluo padro de cloridrato de amilorida: 2 g mL-1. A localizao, realizada atravs da luz UV, e retirada do frmaco isolado pela cromatografia foi a base para a quantificao. Transferiu-se a parte da camada contendo o frmaco diretamente para tubos de centrfuga com tampa, com capacidade para 15 mL, adicionadas de 10 mL de metanol e ento centrifugados a 1000 rpm por 2 min. O lquido sobrenadante foi transferido para cubeta de 1 cm e procedeu-se a leitura espectrofotomtrica em comprimento de onda de 271 nm para furosemida, 273 nm para hidroclorotiazida,

238nm para a espironolactona e 286 nm para o cloridrato de amilorida, que so os comprimentos de onda aonde a absorbncia maxima 12 . A Figura 1 mostra o esquema utilizado para a quantificao dos frmacos. Ainda foi realizada a determinao dos frmacos padro, nas mesmas concentraes das amostras, utilizando-se apenas a espectrofotometria (UV) para efeito de comparao dos resultados com aqueles obtidos pelo mtodo proposto (cromatografiaespectrofotometria).

Figura 1. Esquema de quantificao dos frmacos diurticos em associao

RESULTADOS E DISCUSSO Para definio do sistema cromatogrfico, o principal quesito foi o estabelecimento do adsorvente a ser utilizado, uma vez que a recuperao dos frmacos para posterior quantificao era de primordial importncia. Optou-se pela celulose microcristalina, pois foi o adsorvente que atendeu s exigncias da metodologia proposta. Com relao s solues padro dos frmacos puro, foi construda uma curva de calibrao (usando somente a espectrofotometria), e outra cromatografada (utilizando a cromatografiaespectrofotometria), que apresentou uma correlao linear entre absorbncia e concentrao do frmaco na faixa de 2 a 20 g mL-1, de acordo com a Lei de Lambert-Beer. Os dados destas curvas encontram-se na Tabela 1. As concentraes usadas para as anlises dos frmacos associados foram baseadas na linearidade da curva de calibrao e no tamanho das manchas11. Na Tabela 2, verificamse os valores de Rf x100 para os frmacos estudados nas condies realizadas para o experimento. A Tabela 3 apresenta os valores de absorbncia das solues padro dos frmacos estudados utilizando-se apenas a espectrofotometria (UV) e os valores obtidos pelo mtodo proposto (cromatografiaespectrofotometria), onde se verifica que os dados so concordantes, demonstrando que o mtodo pode ser utilizado. Os ingredientes ativos das amostras foram calculados como uma funo da curva de calibraes e da frmula CA = CP X AA/AP, respectivamente, correspondendo s concentrao da amostra e do padro, absorbncias da amostra e do padro, aps subtrao da absorbncia do branco12. A Tabela 4 apresenta os resultados de concentrao dos frmacos obtidos nas preparaes farmacuticas que se apresentam em associao (amostras), verificando-se que os valores concordam com os das

Tabela 1. Valores de Rf x 100 dos frmacos estudados utilizando a celulose microcristalina e suas fases mveis Frmacos/ Fases Mveis 1 2 Furosemida 89 5 Hidroclorotiazida 58 Ponto de partida Espironolactona 97 93 Cloridrato de amilorida 37 Ponto de partida

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Tabela 2. Dados experimentais obtidos das curvas de calibrao das solues padro, utilizando a espectrofotometria na regio do UV Furosemida Faixa de concentrao (nm) de leitura 0 20 gmL 271
-1

Hidroclorotiazida 0 20 g mL 273 Equaes de regresso: y = a + bx

-1

Espironolactona 0 12 g mL 238
-1

Cloridrato de amilorida 0 10 g mL-1 286

(a) (b) Coeficiente de regresso

-0,01239 (-0,01886)* 0,06068 (0,06001)* 0,9997 (0,9986)*

0,00431 (0,00561)* 0,04826 (0,04436)* 0,9994 (0,9980)*

0,00121 (0,00160)* 0,05087 (0,05063)* 0,9986 (0,9967)*

-0,00179 (-0,00198)* 0,05360 (0,05033)* 0,9998 (0,09986)*

* os valores entre parnteses referem-se s curvas de calibrao cromatografadas Tabela 3. Valores de absorbncia de solues padro de frmacos diurticos utilizando-se o mtodo da espectrofotometria e da cromatografia-espectrofotometria Frmaco Concentrao (g mL )
-1

Valor de Absorbncia Espectrofotometria 0,2392 0,4710 0,1900 0,5245 0,2075 0,5292 0,1194

Valor de Absorbncia CromatografiaEspectrofotometria 0,2362 0,4708 0,1880 0,5183 0,2060 0,5243 0,1146

dade de ingrediente ativo nos medicamentos, verificou-se atravs da Tabela 4 que as formulaes se encontram dentro dos padres oficiais. A principal vantagem da quantificao desses frmacos associados, pela cromatografia espectrofotometria o baixo custo e a possibilidade de analisar preparaes farmacuticas que apresentam mais de um componente ativo, num tempo relativamente curto, comparado com outras tcnicas. CONCLUSO O mtodo proposto aplicvel para a determinao de frmacos diurticos em associao e nenhuma interferncia foi observada com relao aos excipientes utilizados pelas indstrias farmacuticas. O mtodo cromatografia - espectrofotometria apresenta vantagens em relao a outras tcnicas, uma vez que permite a quantificao de mltiplos ingredientes ativos com preciso adequada, num curto perodo de tempo, alm do seu baixo custo. A metodologia apresenta resultados satisfatrios e promissores no que se refere sua aplicao no controle de qualidade de medicamentos. AGRADECIMENTOS Ao CNPq pelo apoio financeiro.

Furosemida Hidroclorotiazida Espironolactona Cloridrato de amilorida

4 8 4 10 4 10 2

Tabela 4. Concentrao encontrada nos frmacos em associao Frmacos AMOSTRA A Furosemida Espironolactona AMOSTRA B Furosemida espironolactona AMOSTRA C Hidrolorotiazida Espironolactona AMOSTRA D Hidroclorotiazida Cloridrato de amilorida Concentrao Terica (g mL-1) - % 4 10 100 100 Concentrao Obtida (g mL-1) - % 3,99 9,99 99,7 99,9

8 2 4 4 10 2

100 100 100 100 100 100

7,98 2,05 4,06 3,91 10,1 2,00

99,8 102,5 101,5 97,8 101,0 100

REFERNCIAS
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solues padro (tanto os obtidos diretamente pela espectrofotometria, como os obtido pela cromatografia-espectrofotometria), o que torna o mtodo promissor quanto a sua aplicao. De maneira geral, as monografias oficiais estabelecem uma faixa compreendida entre 95105% para produtos acabados12 e, considerando que os ensaios foram obtidos em funo da quanti-