Cuestionario 1.

Secuenciacin del genoma La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la determinacin del orden de los nucletidos (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN. La secuencia de ADN constituye la informacin gentica heredable del ncleo celular, los plsmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. As pues, determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de los procesos biolgicos fundamentales, as como en campos aplicados, como la investigacin forense. El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha acelerado significativamente la investigacin y los descubrimientos en biologa. Las tcnicas actuales permiten realizar esta secuenciacin a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciacin a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboracin de cientficos a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos. 2. Qu son los genomas humanos? El genoma humano es el genoma del Homo sapiens, es decir, la secuencia de ADN contenida en 23 pares de cromosomas en el ncleo de cada clula humana diploide. De los 23 pares, 22 son cromosomas autosmicos y un par determinante del sexo (dos cromosomas X en mujeres y uno X y uno Y en hombres). El genoma haploide (es decir, con una sola representacin de cada par) tiene una longitud total aproximada de 3200 millones de pares de bases de ADN (3200 Mb) que contienen unos 20.000-25.000 genes1 (las estimaciones ms recientes apuntan a unos 20.500). De las 3200 Mb unas 2950 Mb corresponden a eucromatina y unas 250 Mb a heterocromatina. El Proyecto Genoma Humano produjo una secuencia de referencia del genoma humano eucromtico, usado en todo el mundo en las ciencias biomdicas. La secuencia de ADN que conforma el genoma humano contiene codificada la informacin necesaria para la expresin, altamente coordinada y adaptable al ambiente, del proteoma humano, es decir, del conjunto de las protenas del ser humano. Las protenas, y no el ADN, son las principales biomolculas efectoras; poseen funciones estructurales, enzimticas, metablicas, reguladoras, sealizadoras..., organizndose en enormes redes funcionales de interacciones. En definitiva, el proteoma fundamenta la particular morfologa y funcionalidad de cada clula. Asimismo, la organizacin estructural y funcional de las distintas clulas conforma cada tejido y cada rgano, y, finalmente, el organismo vivo en su conjunto. As, el genoma humano contiene la informacin bsica necesaria para el desarrollo fsico de un ser humano completo. El genoma humano presenta una densidad de genes muy inferior a la que inicialmente se haba predicho, con slo en torno al 1,5%2 de su longitud compuesta por exones codificantes de protenas. Un 70% est compuesto por ADN extragnico y un 30 % por secuencias relacionadas con genes. Del total de ADN extragnico, aproximadamente un 70% corresponde a repeticiones dispersas, de manera que, ms o menos, la mitad del genoma humano corresponde a secuencias repetitivas de ADN. Por su parte, del total de ADN relacionado con

genes se estima que el 95% corresponde a ADN no codificante: pseudogenes, fragmentos de genes, intrones o secuencias UTR, entre otros. 3. Para qu se estudian los genomas? Los objetivos del Proyecto son: Identificar los aproximadamente 100.000 genes humanos en el DNA. Determinar la secuencia de 3 billones de bases qumicas que conforman el DNA. Acumular la informacin en bases de datos. Desarrollar de modo rpido y eficiente tecnologas de secuenciacin. Desarrollar herramientas para anlisis de datos. Dirigir las cuestiones ticas, legales y sociales que se derivan del proyecto. 4. Cules son los pasos para estudiar los genomas? Los pasos seran: - Mapeo cromosmico de baja resolucin (ubicacin de genes que producen fenotipos mutantes conocidos y algunos marcadores). Las distancias genticas se basan en frecuencias de entrecruzamientos (crossing overs) y son medidas como porcentaje de recombinacin en centiMorgans (cM). - Mapeo gentico de alta resolucin de cada cromosoma (con marcadores moleculares ubicados muy prximos entre s). - Mapeo fsico, basado en distancias moleculares, resultantes de mapas de fragmentos de restriccin parcialmente superpuestos. La distancia entre dos marcadores puede ser medida determinando el tamao de los fragmentos de restriccin que los contienen, siendo el fragmento ms pequeo que lleva ambos marcadores una estimacin de la distancia entre ellos. Utilizando combinaciones de sondas y enzimas de restriccin puede construirse un mapa fsico determinando qu fragmentos poseen marcadores en comn. Las distancias fsicas se miden en kilobases (Kb) o megabases (Mb). - Anclado del mapa gentico en el mapa fsico. - Secuenciacin de ADN a gran escala, que brinda un mapa completo de cada cromosoma. - Anclado del mapa gentico y del mapa fsico en el de secuencia. Las distancias fsicas generalmente no se correlacionan directamente con las distancias genticas porque las frecuencias de recombinacin no son siempre proporcionales a las distancias moleculares. Sin embargo, a menudo las dos correlacionan razonablemente bien en las regiones eucromticas de los cromosomas (aquellas menos condensadas, que se colorean de manera ms difusa). En humanos, un cM es equivalente, en promedio, a aproximadamente 1 Mb de ADN. 2.1 Asignacin de loci a cromosomas especficos Se utilizan los siguientes mtodos: - Ligamiento a loci conocidos: anlisis tradicional basado en cruzamientos, en especies en las que es factible hacerlo. - Electroforesis de campo pulstil: se usa en el caso de especies que poseen cromosomas pequeos, separables por esta tcnica, como sucede con los de levaduras. Las bandas en el gel corresponderan a cromosomas individuales y pueden utilizarse para localizar nuevos genes por hibridacin. Primero, utilizando sondas de localizacin conocida se establece que banda corresponde a cada cromosoma. Luego, un nuevo gen clonado de ubicacin desconocida se utiliza como sonda para asignarle una posicin en un cromosoma determinado.

- Hbridos celulares interespecficos, por ejemplo humano-ratn. Se utiliza exclusivamente en mapeo del genoma humano o de especies animales. Se establecen bancos de lneas celulares que contengan todos los cromosomas del roedor y un cromosoma humano particular. Siempre incluye un cromosoma humano que lleva un alelo salvaje defectivo para una funcin bioqumica determinada en el genoma del ratn. Si sobreviven en un cultivo deficiente para el factor que no sintetizan es porque llevan el alelo humano equivalente, que complementa la funcin faltante. 2.2 Ubicacin de los genes a lo largo del cromosoma El prximo nivel de resolucin consiste en determinar la posicin de un gen o marcador molecular sobre el cromosoma. Este paso es importante porque los mapas genticos pueden alinearse con los mapas fsicos y utilizarse para validar los mismos. - Mapeo por recombinacin: en los casos en que ha sido factible hacerlo organismos experimentales como levaduras, la mosca de la fruta, ratn, Arabidopsis, etc- ha posibilitado la construccin de mapas que a lo largo de los aos aparecen repletos de genes con efectos fenotpicos determinados. Sin embargo, los intervalos recombinacionales entre genes conocidos contienen cantidades muy grandes de ADN. Estos intervalos o gaps no pueden ser completados utilizando anlisis de ligamiento debido a la ausencia de marcadores en esas regiones. Para llenarlos y construir mapas de alta resolucin surgieron los marcadores moleculares, entre los que se encuentran los RFLP y los SSLP (mini y microsatlites) (ver II.-4 y IV.-2). Estos marcadores permiten la construccin de mapas genticos con una densidad de un marcador /centimorgan (cM). Aunque tal resolucin es un logro muy importante, un centimorgan representa, en humanos, una megabase, lo que equivale a un milln de pares de bases o 1000 kb. Para lograr mayor resolucin actualmente existen los SNP, que son marcadores basados en el polimorfismo de un solo nucletido. - Hibridacin in situ: cuando se dispone de un gen clonado ste puede ser utilizado como sonda para hibridar con los cromosomas in situ, para lo cual se lo marca radiactivamente o por fluorescencia. Puede, de ese modo, identificarse a los cromosomas portadores de la secuencia, determinar si son secuencias especficas de un cromosoma y determinar la posicin del gen en el mismo. En el caso de fluorescencia, la tcnica se denomina FISH (fluorescence in situ hybridization). La localizacin del fragmento en el cromosoma se visualiza como un punto brillante (ver II.-5). - Mapeo fsico de los cromosomas: aporta un nivel de resolucin mayor. Se trata de identificar un conjunto de fragmentos de ADN clonados superpuestos que juntos representen un cromosoma o un genoma completo. Los mapas as obtenidos se llaman mapas fsicos, porque el ADN es el material fsico del genoma. El mapa fsico es til en tres aspectos: 1- Los marcadores genticos ubicados en los clones pueden ordenarse y contribuir al proceso general de mapeo. 2- Cuando se han obtenido los clones contiguos, ellos representan una genoteca ordenada de secuencias de DNA que puede utilizarse para futuros anlisis genticos, como, por ejemplo, correlacionar fenotipos mutantes con disrupciones en regiones moleculares especficas. 3- Estos clones constituyen la materia prima para secuenciar en proyectos genmicos a gran escala. 2.3 Secuenciacin a gran escala del genoma - Generacin de bancos de EST (etiquetas de secuencias expresadas) La complejidad de los genomas eucariotas hace aconsejable, como primera aproximacin, no abordar el estudio del genoma completo. Es preferible estudiar slo una fraccin del mismo, es decir, aquellos genes que se estn expresando en un momento determinado de la vida del organismo. Para ello se obtienen poblaciones de ADNc (que reflejan slo secuencias expresadas) que se secuencian de forma masiva para generar miles de secuencias parciales conocidas como ESTs (ver VII.- 2). Estas secuencias de entre 300-500 pb suelen ser suficientes para la identificacin

de los genes mediante comparacin con las secuencias existentes en las bases de datos pblicas (ej. Genbank, EMBL), utilizando para ello programas de anlisis informtico. Si la informacin contenida en la secuencia parcial no es suficiente, habra que determinar la estructura del ADNc completo para estudiar su funcin por otros mtodos. - Secuenciacin genmica La aproximacin anterior no permite identificar genes que se expresan a bajo nivel o en situaciones fisiolgicas no consideradas o regiones no representadas en el ARNm. Para obtener esta informacin debe secuenciarse el genoma completo. Para ello, el ADN genmico total se digiere con enzimas de restriccin apropiadas o se fragmenta mecnicamente para generar fragmentos de gran tamao (100-300 kb), que se clonan en vectores apropiados, para construir genotecas que contienen, al menos, una representacin completa del genoma, que puede estudiarse en detalle y secuenciarse (ver II.3). A fin de distinguir las regiones codificantes para genes, que en muchos organismos representan un porcentaje bastante pequeo del genoma, de las no codificantes, las secuencias se comparan con las secuencias de ESTs y ADNc previamente estudiadas. a) Secuenciacin de los clones y ensamblado de los fragmentos El clonado comienza obteniendo un nmero elevado de fragmentos al azar que se clonan en un vector apropiado. En la preparacin de mapas fsicos de genomas se utilizan vectores como los csmidos, los YAC, los BAC y los PAC, que aceptan insertos de gran tamao (ver II.-3). El contenido de estos clones se caracteriza y se ordenan, buscando los puntos de solapamiento o superposicin. Un conjunto de clones solapantes se llama contiguo (contig). Para establecer el solapamiento de clones al azar se secuencian regiones cortas del inserto proximales al sitio de clonado utilizando primers posicionados en el vector. Los vacos (gaps) se completan utilizando el final de un fragmento clonado para llegar al siguiente (primer walking). A medida que se van caracterizando los clones, los contiguos se alargan y van convergiendo unos con otros. El proyecto termina cuando se tiene un conjunto de contiguos que equivale al nmero de cromosomas de la especie en estudio. En la Fig. 4 se resume una estrategia de secuenciacin jerrquica (hierarchical shotgun sequencing). Esta se usa para genomas grandes. Para genomas ms pequeos se utiliza otra, llamada secuenciacin de genomas completos (whole genome shotgun sequencing). Todos los estados del anlisis genmico como la preparacin de clones, el aislamiento de ADN, la electroforesis y la secuenciacin han sido bien adaptados a diferentes mquinas o robots, automatizando el trabajo. b) Ordenamiento de los clones Se utilizan varias tcnicas para ordenar los clones en contiguos. Entre ellas: - FISH: para localizar las posiciones aproximadas de insertos grandes. - Fenotipificacin (fingerprinting): se corta el clon con enzimas de restriccin que generan un grupo de bandas que representan un fingerprint o huella digital del clon. Las bandas generadas por varios clones pueden alinearse visualmente o por un programa de computacin para determinar si se superponen o solapan. - STS (sequence tag sites o sitios de secuencia marcada): son secuencias cortas de insertos grandes clonados. Se rene un conjunto de clones al azar y se cortan en fragmentos ms pequeos que se clonan y se secuencian pequeas regiones de cada uno. Para ello se disean primers que amplifican una secuencia corta de ADN (STS). 3 Utilizacin de mapas genmicos para el anlisis gentico Los mapas genticos y los mapas fsicos son un importante punto de partida para varios tipos de anlisis gentico, incluyendo el aislamiento de genes y genmica funcional. Por ejemplo: - Aislamiento de genes por clonado posicional: para ubicar un gen cuya secuencia se desconoce se puede partir de un marcador conocido que est estrechamente ligado al mismo. Este marcador acta como punto de partida para el procedimiento de caminado cromosmico (chromosome walking), por el cual los fragmentos finales del marcador ligado son utilizados como sondas para seleccionar otros clones de la genoteca. Del segundo grupo de clones (los

que solapan con el inicial) se hacen mapas de restriccin y los fragmentos obtenidos son utilizados para hacer una nueva ronda de seleccin de clones superpuestos. As el proceso de caminado se mueve hacia ambos lados a partir del sitio inicial, que culmina cuando se llega al gen de inters. Existe otra tcnica relacionada llamada salto cromosmico, que permite saltar a travs de reas distantes y potencialmente no clonables del ADN y genera marcas, ampliamente espaciadas a lo largo de la secuencia, que pueden utilizarse como puntos de inicio para mltiples caminatas cromosmicas bidireccionales. Esta tcnica consiste en crear fragmentos grandes (entre 80-150 kb) por restriccin del ADN en la regin que se cree contiene al gen de inters. Cada fragmento de ADN es luego circularizado, poniendo en contacto los extremos libres. Este procedimiento acerca puntos relativamente distantes de la regin de genoma en estudio. Se trata de generar en esa unin un sitio que no sea cortado en una posterior restriccin, de manera que esas dos regiones que estaban distantes en el genoma ahora estn unidas en un fragmento. El crculo se corta con una nueva enzima de restriccin y los fragmentos obtenidos, entre los que se encuentran los sitios de unin, se clonan en fagos. Esto es lo que se llama una genoteca de saltos. Una sonda del sector de comienzo de la regin que contiene al gen de inters puede utilizarse como punta de partida para comenzar a saltar por el genoma. Un salto puede, por ejemplo, avanzar unos 50 kb hacia el locus de inters. Una vez all, el otro extremo de la unin del fragmento inicial se corta y se usa para buscar el siguiente punto de salto en la genoteca. O sea que a travs de las uniones se va avanzando hacia el punto donde se encuentra el locus. Cada posicin de salto es un punto de partida para una caminata cromosmica. Estas regiones se van secuenciando. All comienza la bsqueda de genes utilizando programas de prediccin y se seleccionan las secuencias candidatas. Esta estrategia de saltos se utiliz para clonar el gen de la fibrosis qustica, que es una enfermedad humana que resulta fatal y es causada por mutaciones en gen de gran tamao localizado en el cromosoma 7. - Estrategia del gen candidato: la caracterizacin de una regin cromosmica hace que aparezcan varios genes de funcin desconocida. Si un gen de inters es mapeado en esa regin, estas secuencias pasan a ser candidatas. Para cada una de ellas, o para la ms probable de acuerdo al anlisis de secuencia, se disean experimentos tendientes a determinar en cuales tejidos se expresa, en qu condiciones, etc., utilizando Northern blot o RT-PCR. Si el patrn de expresin encontrado coincide con el patrn esperado es altamente probable que hayamos encontrado el gen de inters. El experimento ideal para confirmar esto, sera la transformacin de un individuo mutante para esta funcin con el gen normal. Si se produce la reversin del fenotipo mutante (complementacin), tendremos la prueba irrefutable de que estamos frente al gen buscado. - Genes con patrones complejos de herencia: no todos los genes muestran patrones simples de herencia. Puede suceder que: - La variacin fenotpica sea cuantitativa, como peso o altura. Este tipo de variacin se debe a la interaccin acumulativa entre alelos + y de varios genes y el ambiente. La disponibilidad de miles de marcadores moleculares como los SSLP, dispuestos a lo largo del cromosoma, ha posibilitado el mapeo de algunos de estos genes que contribuyen a la variacin cuantitativa cuyos loci son llamados QTL (quantitative trait loci). Para abordar este problema, se buscan dos tipos de lneas que muestren fenotipos contrastantes para un carcter cuantitativo y se cruzan para generar descendencia homocigota que contenga solo un segmento o un pequeo nmero de segmentos de una de las lneas. Se realizan cruzas y retrocuzas y se obtienen lneas endocriadas recombinantes (RIL). Estos individuos pueden caracterizarse por su fenotipo y puede estimarse la contribucin de los segmentos especficos a la variacin observada. (ver IV.2) En el futuro, el anlisis de SNP (polimorfismos de un nucletido simple) promete acelerar el mapeo de caracteres complejos. Nuevos enfoques de mapeo de QTL y QTN (quantitative trait nucleotide) estn disponibles.

El concepto emergente es la posibilidad de explorar directamente la variacin dentro de genes y no a travs de marcadores annimos. 5. Qu es secuenciacin automtica? SECUENCIACIN AUTOMTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMTICO Es una alternativa al mtodo de Sanger. Consiste en marcar el oligo cebador o los terminadores con un compuesto fluorescente y activar la reaccin de secuencia. Los productos de la reaccin se detectan directamente durante la electroforesis al pasar por delante de un lser que al excitar los fluorforos permite detectar la fluorescencia emitida. Secuenciacin empleando cebadores fluorescentes Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se aade el oligonucletido o cebador marcado con una sonda fluorescente distinta y un ddNTP diferente en cada una de ellas. Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en un nico tubo. Secuenciacin empleando terminadores fluorescentes Se realiza una nica reaccin de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta. SECUENCIADORES AUTOMTICOS Secuenciadores automticos capilares Existen instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan una alternativa clara al sistema basado en geles de acrilamida/bisacrilamida donde este soporte ha sido sustituido por un polmero que se inyecta de forma automtica en un capilar antes de cargar la muestra de secuenciacin; las muestras se van analizando una a una. Este tipo de secuenciadores se utiliza para lecturas no superiores a unos 450pb. Secuenciacin automtica en geles desnaturalizantes de acrilamida/bisacrilamida La secuenciacin automtica mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando un gel de acrilamida/bisacrilamida entre dos cristales montados adecuadamente sobre el cassette que sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acoplar en el secuenciador automtico para proceder a la carga de la muestras. EQUIPAMIENTO Secuenciador automtico ABI 377 Modo operativo: Preparacin de las muestras. OTROS MTODOS DE SECUENCIACIN AUTOMTICA Secuenciacin de ADN empleando microarrays Los microarrays constituyen la ltima lnea de tcnicas basadas en la interaccin de cadenas complementarias de ADN. Este tipo de tcnicas introducen bsicamente dos nuevas innovaciones: el empleo de soportes slidos no porosos tales como cristal que facilitan la miniaturizacin y la deteccin basada en fluorescencia y el desarrollo de mtodos de sntesis in situ de oligonucletidos a altas densidades sobre el soporte slido. Pirosecuenciacin Se trata de un mtodo simple y consistente, til para la secuenciacin de fragmentos de ADN de tamaos pequeos o medianos. 6. Qu es secuenciacin de genomas a gran escala? Estrategias de secuenciacin a gran escala Los procedimientos actuales solo pueden secuenciar directamente fragmentos relativamente cortos (de entre 300-1000 nucletidos de longitud) en una sola reaccin.14 El principal obstculo para secuenciar fragmentos de ADN de una longitud superior a este lmite es la capacidad insuficiente de separacin para resolver grandes fragmentos de ADN cuyo tamao

difiere en un slo nucletido. En cambio, las limitaciones impuestas por la incorporacin de ddNTPs fueron resueltas en gran medida por Tabor, de la Hardvard Medical, Carl Fueller, de USB biochemicals, y colaboradores.15

El ADN genmico se fragmenta en trozos al azar y se clonan en una biblioteca bacteriana. El ADN de los clones bacterianos individuales se secuencia y la secuencia se ensambla observando las regiones solapantes. (Click para ampliar) La secuenciacin a gran escala persigue la secuenciacin de fragmentos muy grandes de ADN. Incluso los genomas bacterianos relativamente pequeos constan de miles de nucletidos y slo el Cromosoma 1 humano consta de 246 millones de bases. As pues, algunos enfoques abordan el problema cortando (con enzimas de restriccin) o cizallando (mediante fuerzas mecnicas) fragmentos grandes para obtener otros ms pequeos. El ADN fragmentado se clona en un Vector de ADN, normalmente un cromosoma artificial bacteriano (BAC) y amplificado en Escherichia coli. El ADN amplificado se puede purificar entonces a partir de las clulas bacterianas (Una desventaja de los clones bacterianos para el secuenciado es que algunas secuencias de ADN pueden ser inherentemente inclonables en todas las lneas bacterianas disponibles debido al efecto deletreo de la secuencia clonada en la bacteria hospedadora u otros efectos). Estos fragmentos cortos de ADN purificados a partir de colonias bacterianas individuales se secuencian completamente y se ensamblan computacionalmente en una secuencia larga y contigua identificando las secuencias que se solapan entre ellas (por secuenciacin por fuerza bruta o "shotgun"). Este mtodo no requiere informacin preexistente sobre la secuencia de ADN y a menudo se la conoce como secuenciacin de novo. Los intervalos entre las secuencias ensambladas se pueden rellenar mediante paseos de cebadores, a menudo mediante pasos de sub-clonado (o secuenciacin a base de transposones dependiendo del tamao del resto de regin que quede por secuenciar). Todas estas estrategias implican efectuar muchas lecturas menores del ADN por alguno de los mtodos anteriores y posteriormente ensamblarlos en secuencias contiguas. Las diferentes estrategias tienen diferentes inconvenientes en cuanto a velocidad y exactitud. El mtodo de secuenciacin por fuerza bruta es el ms prctico para secuenciar genomas grandes, pero su proceso de ensamblaje es complejo y potencialmente proclive al error -en particular en presencia de repeticin de secuencias. Debido a esto, el ensamblaje del genoma humano no est literalmente completo las secuencias repetitivas de los centrmeros, telmeros y otras partes del cromosoma quedan como huecos en el ensamblaje del genoma. A pesar de contar con solo el 93% del genoma ensamblado, el Proyecto Genoma Humano se declar completado porque la definicin de secuencia del genoma humano se limit a la secuencia eucromtica (completa al 99% en aquel momento), para excluir esas regiones repetitivas intratables.16

Pasos para la resecuenciacin. Preparacin de la muestra: Extraccin del cido nucleico. Preparacin del molde: Amplificacin y preparacin de una pequea regin de la

regin objetivo. El genoma humano tiene una longitud de unos 3000 millones de pares de bases;17 si la longitud media de cada fragmento es de 500 bases, llevara un mnimo de seis millones de fragmentos secuenciar el genoma humano (sin tener en cuenta el solapamiento, es decir si fuera posible hacerlo de una sola vez). Mantener el control de un nmero tan elevado de secuencias presenta desafos significativos que solo se pueden abordar mediante el desarrollo y la coordinacin de varios algoritmos de procedimiento y computacin, tales como el desarrollo y mantenimiento eficientes de bases de datos. Se utiliza la Resecuenciacin o secuenciacin marcada para determinar un cambio en la secuencia de ADN a partir de la secuencia "de referencia". A menudo se efecta utilizando la PCR para amplificar la regin de inters (se necesita una secuencia de ADN preexistente para disear los cebadores de ADN). La resecuenciacin realiza tres pasos, la extraccin del ADN o ARN del tejido biolgico, la amplificacin del ARN o ADN (habitualmente por PCR) y despus la secuenciacin. La secuencia resultante se compara con la de referencia o con una muestra normal para detectar mutaciones. 7. Secuenciacin de alto rendimiento Ej. Aplicacin en la clula Secuenciacin de alto rendimiento La elevada demanda de secuenciacin de bajo coste ha dado lugar a las distintas tecnologas de secuenciacin de alto rendimiento. Estos esfuerzos han sido financiados por instituciones pblicas y privadas as como desarrolladas y comercializadas dentro de la empresa privada por las compaas de biotecnologa. Se pretende que las tecnologas de secuenciacin de alto rendimiento disminuyan los costes de secuenciacin de las bibliotecas de ADN ms all de lo que se puede hacer con el mtodo corriente del terminador marcado basado en la separacin del ADN por electroforesis capilar. Muchos de los nuevos mtodos de alto rendimiento usan mtodos que paralelizan el proceso de secuenciacin, produciendo miles o millones de secuencias a la vez. Amplificacin clonal in vitro Ya que los mtodos de deteccin molecular frecuentemente no son lo suficientemente sensibles para la secuenciacin de una sola molcula, la mayora de los mtodos utilizan un paso con clonacin in vitro para generar muchas copias de cada molcula individual. Uno de los mtodos es la PCR de emulsin, en la que se aislan las molculas individuales de ADN junto con microesferas recubiertas con cebadores en burbujas acuosas dentro de una fase oleosa. Posteriormente una PCR recubre cada microesfera con copias clonales de la bliblioteca de molculas aisadas y seguidamente se inmovilizan para ser ms tarde secuenciadas. La PCR de emulsin se usa en los mtodos publicados por Margulis y colaboradores (comercializado por 454 Life Sciences, adquirido por Roche), Shendure y Porreca et al. (conocido como "secuenciacin polony ", trmino formado por polimerasa "pol" y colonia "colony"), y la secuenciacin SOLiD (desarrollada por Agencourt y adquirida por Applied Biosystems).20 21 22 Otro mtodo para la amplificacin clonal in vitro es la "PCR de puente", en la que los fragmentos se amplifican a partir de los cebadores unidos a una superficie slida, desarrollados y usados por Solexa (de la que ahora es propietaria la empresa Illumina). Estos mtodos producen ambos muchas localizaciones fsicamente aisladas que contienen cada una muchas copias de un solo fragmento. El mtodo con una nica molcula desarrolado por el laboratorio de Stephen Quake (y ms tarde comercializado por Helicos) se salta este paso de amplificacin, fijando directamente las molculas de ADN a una superficie.23

Secuenciacin paralelizada Una vez que las secuencias clonales de ADN se localizan fsicamente en posiciones separadas de la superficie, se pueden utilizar varios mtodos de secuenciacin para determinar las secuencias de ADN de todas las localizaciones en paralelo. La "secuenciacin por sntesis", como en la popular secuenciacin electrofortica con terminador marcado con colorante, usa el proceso de sntesis de ADN por ADN polimerasa para identificar las bases presentes en la molcula complementaria de ADN. Los mtodos de terminador reversible (usados por Illumina y Helicos) utilizan versiones reversibles de terminadores marcados con colorante, aadiendo un nucletido cada vez, y detectando la fluorescencia correspondiente a esa posicin y removiendo posteriormente el grupo de bloqueo para permitir la polimerizacin de otro nucletido. La Pirosecuenciacin (utilizada por 454) tambin usa la polimerizacin del ADN para aadir nucletidos, aadiendo cada vez un tipo diferente y despus detectando y cuantificando el nmero de nucletidos aadidos a una determinada localizacin a travs de la luz emitida por la liberacin de los pirofosfatos unidos a ellos.20 24 La "secuenciacin por ligacin" es otro mtodo enzimtico de secuenciacin que emplea una ADN ligasa en lugar de una polimerasa para identificar la secuencia objetivo.25 21 22 Se usa en el mtodo polony y en la tecnologa SOLiD que ofrece Applied Biosystems. Este mtodo utiliza un reservorio de todos los oligonucletidos posibles de una longitud dada, marcados de acuerdo con la posicin secuenciada. Los oligonucletidos se templan y ligan; el ligamiento preferente de las ADN ligasas por su secuencia especfica produce una seal correspondiente a la secuencia complementaria en esa posicin concreta. 8. En qu cultivo o microorganismo se ha logrado estudiar su secuencia genmica? Escherichia coli, conocida de forma abreviada como E. coli, es un habitante comn en aves y mamferos. Habita en el intestino del ser humano junto a varios centenares de otras especies de bacterias. Todas ellas forman la microbiota intestinal, conocida coloquialmente como la flora intestinal. Normalmente, E. coli es beneficiosa para el cuerpo humano pero a veces se encuentra fuera del intestino y puede ocasionar infecciones de mayor o menor importancia. Algunas de sus estirpes han adquirido genes que codifican toxinas que pueden conllevar a graves infecciones. Muchas otras bacterias comparten los mismos hbitats que E. coli, pudiendo tambin ser las causantes de infecciones en las personas. El organismo mejor conocido en el mbito cientfico es, seguramente, una bacteria que habita en el intestino humano. Invisible a simple vista, a Escherichia coli se debe en gran medida el conocimiento de algunos de los fundamentos de la biologa moderna que han merecido el reconocimiento de varios premios Nobel. Se trata de los procesos de recombinacin gentica de las bacterias, de transcripcin del ARN, de replicacin del ADN y de la regulacin gnica. Adems, en las ltimas dcadas esta bacteria se ha convertido en un instrumento ms del laboratorio, sobre todo en el campo de la biologa molecular. Su genoma fue secuenciado en 1997 y el nmero de genes que lo conforman es una sptima parte del nmero de genes en el ser humano. 9. Cul es la importancia de estos estudios para la poblacin humana? - Diagnstico y prevencin de enfermedades Informacin del pronstico as como del curso de la enfermedad. Confirmar la presencia de enfermedad en pacientes asintomticos.

Y con variados grados de certeza, para predecir el riesgo de enfermedades futuras en personas sanas y en sus descendencias. - Estudio de susceptibilidad en las enfermedades - Intervencin sobre la enfermedad: El procedimiento implica reemplazar, manipular o suplementar los genes no funcionales con genes funcionales. En resumen, es la introduccin de genes en el ADN de una persona para tratar las enfermedades. Se estn estudiando posibles tcnicas para tratar enfermedades hereditarias. 10. Cules son los pases que participan en el consorcio biolgico formado para la secuenciacin genmica? Argentina participa del consorcio internacional del proyecto secuenciacin del genoma del trigo FONCYT (proyecto PAE37108), INTA, CONICET junto con INDEAR unieron esfuerzos para participar del consorcio internacional de secuenciacin del genoma de trigo hexaploide (Triticum aestivum L. 2N= 6x =42, AABBDD) el cual, con 17000 millones de pares de bases es uno de los genomas ms grandes de plantas. De esta manera Argentina es el nico pas latinoamericano presente en el consorcio compuesto por 18 pases. Argentina tendr a su cargo la secuenciacin del cromosoma 4D (aprox. 700 Mb) de la variedad hexaploide Chinese spring usada como modelo para las variedades cultivadas de trigo pan. INDEAR proveer pirosecuenciacin 454 de alto rendimiento para cubrir unas 4 veces el tamao del cromosoma con financiacin de INTA y CONICET. El anlisis de las secuencias nucleotdicas producidas por parte del consorcio argentino permitir definir un catlogo de genes presentes en este cromosoma y el orden virtual de los genes conservados entre las especies de gramneas. PROYECTO GENOMA DE LA PAPA DE LA PLATAFORMA SOUTHNOMICS DEL PROCISUR Antecedentes El 2006 se constituy el Consorcio del Secuenciamiento del Genoma la Papa (The Potato Genome Sequencing Consortium, PGSC) liderado por la Universidad de Wageningen de Holanda. Este consorcio multinacional tiene como objetivo determinar la secuencia completa del genoma de la papa para fines del ao 2010. Los pases que participan en el consorcio PGSC son Alemania, Argentina, Austria, Brasil, Canad, Chile, China, Estados Unidos de Norteamrica, Finlandia, Francia, Holanda, India, Irlanda, Japn, Nueva Zelanda, Per, Polonia, Reino Unido, Rusia y Turqua. El esfuerzo de secuenciacin por parte de este grupo se est lanzando en una reunin que se celebrar los das 17-19 de julio en Washington DC, EEUU. La Red Internacional para el Mejoramiento del Banano y el Pltano (INIBAP), un programa del Instituto Internacional de Recursos Fitogenticos (IPGRI), con sede en Roma, est encabezando el esfuerzo que rene a organizaciones de Australia, Blgica, Brasil, Repblica Checa, Francia, Alemania, India, Mxico, Reino Unido y Estados Unidos. El "Consorcio Global de la Genmica de Musa (Banano)" fundado recientemente, incluye la Universidad Catlica de Brasilia y el CENARGEN/EMBRAPA de Brasil, el Centro de Investigacin Cientfica de Yucatn y el CINVESTAV de Mxico as como el Instituto Internacional de Agricultura Tropical (IITA) basado en Nigeria. El IPGRI y el IITA son

Centros "Future Harvest". El Consorcio tambin incluye el Instituto de Investigacin Genmica (TIGR), que previamente colabor en la secuenciacin de los genomas de arroz y Arabidopsis (una planta de la familia de la mostaza), as como en la secuenciacin del parsito que causa la Fiebre de la costa este, la principal causa de muerte del ganado africano. Los cientficos confeccionarn el mapa del genoma del banano utilizando especies silvestres que se reproducen sexualmente, provenientes del Sudeste de Asia. "El banano ser exclusivamente el primer cultivo tropical a secuenciar," dijo Frison. "Ms que un bocadillo popular, los bananos representan el alimento bsico que las familias africanas consumen en cada comida. Esta es nuestra oportunidad para desarrollar un cultivo que no les fallar y les podr ayudar a levantarse del hambre y de la pobreza." 11. Cul es la importancia del conocimiento del genoma en los mejoramientos tecnolgicos? Los objetivos del Proyecto son:

Identificar los aproximadamente 100.000 genes humanos en el DNA. Determinar la secuencia de 3 billones de bases qumicas que conforman el DNA. Acumular la informacin en bases de datos. Desarrollar de modo rpido y eficiente tecnologas de secuenciacin. Desarrollar herramientas para anlisis de datos. Dirigir las cuestiones ticas, legales y sociales que se derivan del proyecto. Diagnstico y prevencin de enfermedades - Informacin del pronstico as como del curso de la enfermedad. - Confirmar la presencia de enfermedad en pacientes asintomticos. - Y con variados grados de certeza, para predecir el riesgo de enfermedades futuras en personas sanas y en sus descendencias. Estudio de susceptibilidad en las enfermedades Intervencin sobre la enfermedad: El procedimiento implica reemplazar, manipular o suplementar los genes no funcionales con genes funcionales. En resumen, es la introduccin de genes en el ADN de una persona para tratar las enfermedades. Se estn estudiando posibles tcnicas para tratar enfermedades hereditarias.

12. Desarrolle e investigue sobre las tcnicas Maxam-Gilbert Secuenciacin de Maxam-Gilbert En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un mtodo para secuenciar ADN basado en la modificacin qumica del ADN y posterior escisin en bases especficas. Aunque Maxam y Gilber publicaron su secuenciacin qumica dos aos antes del trascendental artculo de Sanger y Coulson sobre su mtodo de secuenciacin "ms-menos" la secuenciacin de Maxam y Gilbert rpidamente se hizo ms popular hasta que se pudo utilizar ADN directamente, mientras que el mtodo inicial de Sanger requera que cada comienzo de lectura fuera clonado para producir un ADN de cadena simple. No obstante, con el desarrollo y mejora del mtodo de terminacin de la cadena (ver ms adelante), la secuenciacin de Maxam y Gilbert ha quedado en desuso debido a su complejidad tcnica, el uso extensivo de productos qumicos peligrosos y dificultades para escalarla. Adems, a diferencia del mtodo de terminacin de la cadena, los reactivos que se usan en el mtodo de Maxam y Gilbert no se pueden adaptar para utilizarse en un kit biolgico estndar.

En resumen, el mtodo requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificacin del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento qumico genera rupturas en una pequea proporcin de uno o dos de los cuatro nucletidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Los agentes qumicos utilizados en cada caso son: DMS (G), cido frmico (A+G), hidrazina (C+T) e hidrazina ms sales (C).De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molcula. Los fragmentos posteriormente se separan por tamao mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. El gel utilizado presenta condiciones desnaturalizantes, y un contenido en poliacrilamida que vara entre un 6 y un 20%. Para visualizar los fragmentos generados en cada reaccin, se hace una autoradiografa del mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioistopo, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia. Conocido en ocasiones como "secuenciacin qumica", este mtodo se origin en el estudio de las interacciones entre ADN y protenas (huella gentica), estructura de los cidos nucleicos y modificaciones epigenticas del ADN, y es en estos campos donde an tiene aplicaciones importantes. 13. Investigue el mtodo de Sanger. Mtodo enzimtico de terminacin de cadena o mtodo didesoxi de Sanger Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el mtodo enzimtico de terminacin de cadena, se necesitan los siguientes compuestos: El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Adems, debe estar en estado de hlice sencilla. Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea como molde ADN de hlice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va aadiendo nucletidos a partir de un cebador o "primer". Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucletido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a aadir nucletidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucletidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer" con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de ADN, adems, este cebador procede de una regin del vector muy cercana al punto de insercin del ADN problema cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente. Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucletidos trifosfato en cada reaccin.

Por ltimo, se necesitan nucletidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucletidos didesoxi son nucletidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posicin 3' de la desoxirribosa. Estos nucletidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningn otro nucletido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un nucletido didesoxi se termina la sntesis de la cadena de ADN.

Breve descripcin del mtodo enzimtico de terminacin de cadena En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reaccin. Cada mezcla de reaccin contiene los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucletido didesoxi, por ejemplo ddATP, a una concentracin baja. El nucletido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo) competir con su homlogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se est sintetizando, produciendo la terminacin de la sntesis en el momento y lugar donde se incorpora. Por este sistema, en cada mezcla de reaccin se producen una serie de molculas de ADN de nueva sntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucletido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).

Los fragmentos de ADN de nueva sntesis obtenidos en cada mezcla de reaccin se separan por tamaos mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucletido.Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reaccin se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel.

Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una pelcula fotogrfica de autorradiografa. La aparicin de una banda en una posicin concreta de la autorradiografa en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva sntesis (complementario al ADN molde) est la base correspondiente al nucletido didesoxi utilizado en la mezcla de reaccin correspondiente.

Teniendo en cuenta que el ADN de nueva sntesis crece en la direccin 5' 3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamao (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamao de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva sntesis en la direccin 5' 3'. Bibliografa

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