Oxidante de Bilirrubina. Nitrito de sodio 20 mmol/L, acuoso. Adicionado de un estabilizador. Estndar de Bilirrubina (10 mg/dL). N-1-naftiletilendiamina diclorhdrico, 0.

346 mmol/L. Adicionado de estabilizadores. Equivalente a 10 mg/dL de bilirrubina en el mtodo descrito. Precauciones: Para uso diagnstico in-vitro. Los reactivos son custicos: No pipetee con la boca. Preparacin del Reactivo de Trabajo: Aada una gota (50 L) de Bilirrubina Oxidante a cada mL de reactivo de Bilirrubina Total y Directa. Invierta suavemente de 3-4 veces. El calibrador esta listo para su uso. Estabilidad y almacenamiento del Reactivo. El reactivo de Bilirrubina Total y Bilirrubina Directa, el reactivo Oxidante y el estndar son estables cuando se almacenan a temperatura ambiente, hasta la fecha de caducidad indicada en su respectiva etiqueta. Descartar el Oxidante si presenta una coloracin amarillo obscuro. El reactivo de trabajo es estable por 7 das de 275-281 K (2-8C) o por 24 horas a temperatura ambiente. Materiales requeridos pero no provistos. Espectrofotmetro capaz de leer absorbancias a 540 nm, pipetas automticas, cubetas, agitador, cronmetro. Recoleccin y Preparacin de la muestra . 1. Suero o Plasma colectado con cualquier anticoagulante comn, libre de hemlisis y tomado en ayunas para evitar muestras lipmicas. 2. Las muestras deben protegerse de la luz del sol as como de la luz blanca artificial, ya que la bilirrubina es altamente fotosensible. Se ha reportado que aproximadamente el 50% de la bilirrubina puede perderse cuando se expone a la luz solar por 1 hora. Estabilidad de la muestra. La bilirrubina es estable en suero o plasma de 4-7 das de 275-281 K (2-8C) y por 3 meses cuando se congela a 253 K (-20C).
3,5

Stanbio Liquicolor Bilirrubina Total y Directa

Para la determinacin cuantitativa colorimtrica de bilirrubina directa y total en suero o plasma humano Resumen y Principio La mayora de los procedimientos clnicos de rutina para la determinacin de bilirrubina srica, estn basados en la clsica reaccin Diazo de Ehrlich1, la cual se aplic primero a la estimacin de estos pigmentos biliares en suero en 1913 por Van den Berg y Snapper.2 Winkelman y colaboradores3 proporcionaron una revisin excelente de muchas metodologas de bilirrubina. Cuando una solucin de cido sulfanlico en cido clorhdrico diluido es combinada con nitrito de sodio, se forma cido nitroso. Este cido inestable, el cual debe ser preparado en el momento del ensayo, reacciona para formar cido sulfanlico diazotizado. Este ltimo (tambin llamado p-bencendiazonio sulfonato) se acopla con la bilirrubina para producir azobilirrubina, la intensidad de color de este es proporcional a la concentracin de bilirrubina. Ya que los estndares de bilirrubina sufren una gran degradacin por su inestabilidad, el mtodo presentado utiliza una solucin acuosa de N-1-naftiletilendiamina dihidroclorhdrico como calibrador, de acuerdo con Bilissis y Speer4. Esta amina aromtica estable pura se acopla con el cido sulfanlico diazotizado bajo las condiciones de prueba para dar un colorante azo con cualidades espectrales similares a la azobilirrubina. El calibrador proporcionado ha sido preparado para obtener, por la tcnica descrita, un color equivalente al nivel de bilirrubina a 540 nm. Reactivos. Reactivo de Bilirrubina Total. Acido sulfanlico, 32 mmol/ L en cido clorhdrico diluido. Adicionado de un acelerador y estabilizador. Reactivo de Bilirrubina Directa. Acido sulfanlico, 32 mmol/ L en cido clorhdrico diluido. Adicionado de un estabilizador.

Sustancias Interferentes. La hemlisis puede causar resultados elevados falsos de bilirrubina, debido a la inhibicin de la reaccin diazo por efecto de la oxihemoglobina3,6 . Yung et al7, ha reportado una extensa lista de drogas y otros agentes que interfieren con la metodologa diazo bilirrubina. Muestras turbias o lipmicas puede causar tambin elevaciones falsas de la bilirrubina, si esto ocurre deber manejarse un blanco de suero con cada prueba de paciente. Parmetros de prueba
Total Longitud de onda Tipo de reaccin Direccin de la reaccin Temperatura de la reaccin Relacin de la muestra/reactivo Tiempo de Equilibrio Tiempo de lectura Tiempo lag Absorbancia lmite blanco Mxima absorbancia Calibradores Valor normal bajo Valor normal alto Linearidad pH Absorbancia inicial pH del Reactivo de Trabajo pH del Reactivo de Trabajo pH Oxidante de Bilirrubina pH Calibrador de Bilirrubina Absorbancia Inicial del Reactivo de Trabajo Absorbancia Inicial del Reactivo de Trabajo 6.3 1.0 7.0 1.0 < 0.030 < 0.030 540 nm Punto Final Incremento 310 K (37C) 1:20 3 seg 4 seg 210 seg 0.100 A 2.000 A 10 mg/dL 0.0 mg/dL 1.2 mg/dL 20 mg/dL 1.9 1.0 < 0.100 1.9 1.0 1.8 1.0 6.3 1.0 7.0 1.0 Directa 540 nm Punto Final Incremento 310 K (37C) 1:10 3 seg 4 seg 180 seg 0.100 A 2.000 A 10 mg/dL 0.0 mg/dL 0.5 mg/dL 10.0 mg/dL 1.8 1.0 < 0.100

TOTAL RB Reactivo de Bilirrubina total Oxidante (Gotas) Agua Calibrador Muestra 1.0 1 0.05 C 1.0 1 0.05 BM 1.0 0.05 M 1.0 1 0.05

2. Permitir que las cubetas se incuben a temperatura ambiente por lo menos 3 minutos. 3. Ajuste a cero el espectrofotmetro a 540 nm con el reactivo. 4. Lea C y M-BM vs. RB a 540 nm en el transcurso de 30 minutos. Procedimiento Manual (Bilirrubina Directa). 1. Pipetear en cubetas o tubos de ensaye marcados como RB (Blanco de Reactivo), C (Calibrador), MB (Blanco de muestra) y M (Muestra) los volmenes (mL), excepto el Oxidante, el cual es 1 gota, mezclando bien despus de cada adicin. DIRECTA RB Reactivo de Bilirrubina Directa Oxidante (Gotas) Agua Calibrador Muestra 1.0 1 0.1 C 1.0 1 0.1 BM 1.0 0.1 M 1.0 1 0.1

2. Permitir que las cubetas se incuben a temperatura ambiente por lo menos 3 minutos. 3. Ajuste a cero el espectrofotmetro a 540 nm con el reactivo.

Los parmetros antes mencionados deben ser empleados en la programacin de los analizadores automatizados para Bilirrubina. Consulte su manual del usuario para programar las instrucciones. Procedimiento manual (Bilirrubina Total). 1. Pipetear en cubetas o tubos de ensaye marcados como RB (Blanco de Reactivo), C (Calibrador), MB (blanco de muestra) y M (muestra) los volmenes (mL), excepto el Oxidante, el cual es de una gota, mezclando bien despus de cada adicin.

4. Lea C y M-BM vs. RB a 540 nm en el transcurso de

30 minutos. Notas: 1. El tiempo de 3 minutos para las muestras de Bilirrubina Directa despus de la adicin del suero es crtico, ya que las lecturas de absorbancias se incrementan lentamente debido a la presencia de la fraccin Indirecta. El tiempo del calibrador no es crtico, ya que la reaccin se completa en 3 minutos.

2. Para los recin nacidos, usualmente solo se requiere la Bilirrubina Total. Sin embargo, la presencia de la forma conjugada (directa) ocurre con suficiente frecuencia en los recin nacidos, por lo que la prueba de la bilirrubina directa puede ser utilizada. Control de Calidad Sueros control analizados por este mtodo se deben incluir en cada corrida de muestras de pacientes. Resultados Los valores se derivan de los siguientes clculos: AM-ABM X 10 Bilirrubina directa o total mg/dL = AC Donde AM, ABM y AC son los valores de absorbancias de la muestra, blanco de muestra y calibrador respectivamente y 10 es la concentracin del calibrador. Valores esperados Lmites (mg/dL)
B. total - Adultos: 1.2 Recin nacidos: 12.0 B. directa - Adultos e infantes (mayores de 1 mes) 0.5
8 3,5

Sensibilidad: Tanto el procedimiento de Bilirrubina Total como Directa mostraron una sensibilidad de 0.018 mg/dL por 0.001 unidades de absorbancia. Linearidad: Los procedimientos de la bilirrubina total y directa han sido establecidos de 20 mg/dL y 10 mg/dL, respectivamente. Referencias: 1. Ehrlich P. Charite Ann 8:140, 1883 2. Van den Bergh AAH, Snaper J. Deut Arch Kiln Med. 110:540, 1913. 3. Winkelman JW et al. In clinical Chemistry Chemistry-Principles and Techniques. RJ Henry et al., Eds. Harper & Row, Hagerstown, MD. 1974, pp.1042-1061. 4. BilissisPK, Speer RJ. Clin Chem 9:552, 1963. 5. Routh JI. In Fundamentals of Clinical Chemistry. Nw Tietz, Ed Saunders, Philadelphia, 1976, pp. 1035-1043. 6. Shull DC. Clin. Chem 26:22,1980. 7. Young DS et al. Clin Chem 21:22, 1980. 8. Stanbio Laboratory data. 9. Jendrassik L., Groff, P. Biochem Z 297-81, 1938. Fabricado en EUA por: Stanbio Laboratory 1261 North Main Street Boerne, TX. Distribuido en Mxico por :

Caractersticas de Funcionamiento

Precisin: En el estudio intra-ensayo, se analizaron muestras en 20 ocasiones y en el estudio inter-ensayo se analizaron las mismas muestras durante 10 das consecutivos. Los coeficientes de variacin intraensayo fueron de 3.3% (con un promedio de 0.49 mg/dL) y de 2.3% (con un promedio de 10.2 mg/dL) y los de inter-ensayo fueron de 3.5 % (con un promedio de 0.51 mg/dL) y de 2.4% (media = 10.2 mg/dL) para bilirrubina total. Para bilirrubina directa los coeficientes de variacin del intra-ensayo fueron los siguientes: 1.82% ( media = 3.70 mg/dL) 2.76 % ( media = 3.62 mg/dL). Correlacin: La determinacin de bilirrubina por el procedimiento descrito (y) y por la tcnica modificada de Jendrasski-Groff (x) en 25 muestras de suero mostraron un coeficiente de correlacin (r) de 0.9995 para la bilirrubina total y 0.9970 para la bilirrubina directa. La ecuacin de regresin para la bilirrubina total es y= 1.06 x - 0.100.

Laboratorios Licon, S.A. Tlalnepantla, Estado de Mxico, 54080 Tel : 5362-02-99 Fax: 5632-17-92 Rev. 20/03/00 Rev. 22/11/01 IN-345