INTRODUCCIN

En este estudio se intenta mostrar los principios fundamentales de las tcnicas instrumentales espectroscpicas as como dar una apreciacin de los tipos de espectrofotmetros existentes en el momento, su instrumentacin y funciones. Estas tcnicas se basan en una serie de caractersticas de un foco luminoso. Los focos luminosos emiten energa radiante que es recogida por una serie de sensores. En el caso del hombre el sensor es la retina, de manera que la radiacin va a llegar a sta produciendo una estimulacin que conlleva a una sensacin. Para medir las sensaciones en los anlisis de sustancias es imprescindible utilizar instrumentos adecuados ya que la sensibilidad del ojo humano est limitada a la regin visible del espectro. Debido a esto se han diseado y construido los espectroscopios sensibles a cualquier regin del espectro de manera que se pueda medir de forma cuantitativa la intensidad de un foco luminoso. Actualmente los cientficos precisan de aparatos como el espectrofotmetro para conseguir informacin de la materia. Esta tcnica es de utilidad en diversos campos como la biologa, bioqumica, geologa, qumica, medicina, ingeniera, medio ambiente, fsica, entre otros.

Origen. En los comienzos de la qumica, la mayora de los anlisis se realizaban separando los componentes de inters de una muestra (analitos) mediante, precipitacin, extraccin o destilacin. En los anlisis cualitativos los componentes separados se trataban con reactivos originando productos que podan identificarse por sus colores, punto de ebullicin o de fusin, sus solubilidades en una serie de disolventes, sus olores, sus actividades pticas. En los anlisis cuantitativos la cantidad de analito se determinaba por medidas gravimtricas (se determina la masa del analito o de algn compuesto producido a partir de l) y volumtricas (se determina el volumen o el peso de un reactivo estndar que reaccionase completamente con el analito).

Fue a partir de mediados de los aos treinta cuando se empezaron a explotar otros fenmenos distintos de los descritos anteriormente para la resolucin de los problemas analticos. As, empezaron a utilizarse para el anlisis de los analitos sus propiedades fsicas tales como conductividad, potencial de electrodo, absorcin o emisin de la radiacin electromagntica y fluorescencia. Estos fenmenos anteriormente citados se conocen desde hace ms de un siglo. En 1864 Maxwell propuso que la luz era de naturaleza electromagntica, es decir que une los conceptos de electricidad y magnetismo. Sin embargo, su aplicacin se retras por falta de una instrumentacin sencilla y fiable. Fue con el desarrollo de la industria electrnica cuando se produjo su aprovechamiento. Los primeros instrumentos espectroscpicos que aparecieron se desarrollaron para utilizarse en la regin visible de la radiacin electromagntica y por tanto se denominan instrumentos pticos. Hoy en da este trmino se ha ampliado con el fin de incluir tambin a los instrumentos que trabajan con longitudes de onda de la radiacin electromagntica distintas de la regin visible. Los espectrofotmetros son aparatos que trabajan con una longitud de la radiacin electromagntica determinada que vara segn las necesidades del usuario.

ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ULTRAVIOLETA VISIBLE. Las molculas absorben luz. La longitud de onda absorbida y la cantidad de sta, dependen tanto de la estructura de la molcula como del medio en el que se halla. En la espectroscopa de absorcin de ultravioleta visible, la muestra absorbe radiacin electromagntica de una fuente, la cantidad absorbida va relacionada con la concentracin de la sustancia que se desea analizar en disolucin. En este tipo de espectroscopa se suele hablar de longitudes de onda, en el orden de 200 a 800 nm. De 100 a 200 nm es la regin ultravioleta lejano, de 200 a 400 la de ultravioleta prximo y de 400 a 800 luz visible. Esta tcnica es la ms utilizada por su sencillez instrumental y sus diversas aplicaciones en distintos campos de investigacin. Conceptos previos. Ley de Lambert-Beer. Antes de detallar las caractersticas de esta espectroscopa es necesario explicar como interacciona la luz con la materia. Cuando una radiacin incide sobre un medio homogneo (que absorbe luz a una determinada longitud de onda), es parcialmente absorbida y parcialmente transmitida. As el haz de luz que sale tras atravesar el medio tiene una intensidad menor que la del haz incidente. La relacin incidente y la transmitancia fue estudiada por Lambert y extendida por Beer en el caso de disoluciones. Sea una disolucin de concentracin C contenida en un recipiente de espesor b. Si sobre dicha disolucin incide una radiacin monocromtica de intensidad Io, y parte de la radiacin se ha absorbido, la intensidad que se transmite I, ser inferior a Io.
Io I

db b

La ley de Lambert-Beer establece que la disminucin de la intensidad de la radiacin es proporcional a la intensidad, a la concentracin y al espesor atravesado. Para un elemento de espesor db se cumplir: -dI = K I C db Donde K es una constante de proporcionalidad, un coeficiente de absorcin de la sustancia en disolucin. Integrando y haciendo operaciones queda: dI/I = -K C db dI = -K C db ln I/Io = -K C b ; log I/Io =(-K/2,302) C b = a b C log Io/I = a b C Donde a es un nuevo coeficiente de absorcin denominado absortividad. Un concepto muy importante es la absorbancia (A) que es la fraccin de la luz absorbida por la disolucin. A = log Io/I La absorbancia va a depender de la naturaleza del medio, es decir de la composicin y de la longitud de la trayectoria de la luz en el medio. Otro parmetro es la transmitancia (T) que se define como la relacin entre la luz incidente y la luz transmitida, es decir la fraccin de luz transmitida por la disolucin. T = I/Io En la practica se utiliza el porcentaje de transmitancia (%T) %T = 100 T = 100 I/Io Tanto la absorbancia como la transmitancia son parmetros adimensionales y por lo tanto no llevan unidades.

Estos parmetros descritos se relacionan entre si de la siguiente forma: A = log Io/I = -log T = -log %T/100 A = 2 - log%T Por lo tanto la absorbancia es la relacin logartmica entre la intensidad incidente y la intensidad transmitida, la ley de Lambert-Beer queda de la siguiente forma: A= abC Su representacin grfica se ajusta a una lnea recta que pasa por el origen de coordenadas. Si la concentracin C se expresa en mol/litro, el coeficiente a se denomina absortividad molar o coeficiente de extincin molar representado por e. La ley de Lambert-Beer queda entonces: A=ebC Normalmente el espesor de la cubeta b se mide en centmetros. La relacin entre la concentracin de una solucin y su transmitancia es inversa y logartmica, mientras que la relacin entre la absorbancia y la concentracin es directamente proporcional. Si la sustancia transmite toda la radiacin, I = Io y por lo tanto la transmitancia es igual a 1, el %T es igual a 100 y la absorbancia es igual a 0. Si la sustancia absorbe toda la radiacin que le llega I = 0 y por tanto la transmitancia es igual a 0, el %T es igual a 0 y la absorbancia es igual a infinito .
A

La representacin grfica en un eje de coordenadas de la absorbancia (ordenadas) frente a la concentracin (en el eje de x abcisas) se denomina curva de Curva calibracin.

concentracin

de calibracin con los lmites de linealidad

Para obtener la curva de calibracin se ensayan varias soluciones de concentraciones conocidas, y se determinan sus absorbancias. As se construye la curva de calibracin, que debe ser una recta, representando las concentraciones frente a las absorbancias grficamente. De este modo para calcular la concentracin de una muestra problema slo tenemos que hallar la absorbancia de la disolucin problema y extrapolarla en la curva de calibrado. Esta tcnica slo es vlida si la muestra cumple la ley de LambertBeer y si las soluciones estndar y las problema son ledas en las mismas condiciones. En las determinaciones espectrofotomtricas se cumple la ley de Lambert-Beer cuando la curva de calibrado sigue la llamada linealidad, que es el intervalo de concentraciones de la muestra entre las cuales existe una relacin lineal entre concentracin y absorbancia. La ley de Lambert-Beer tiene una serie de limitaciones; slo es aplicable para la luz monocromtica y las soluciones utilizadas para el anlisis, en teora, no deben tener concentraciones inferiores a 0,01M (moles/litro), aunque en la prctica se trabaja sin problemas con concentraciones ms bajas. Otras posibles fuentes de error que originan desviaciones en la curva de calibrado y por ello en la ley de Lambert-Beer son: - las altas concentraciones de la muestra - que los lados de la cubeta estn rayados o con algo de suciedad - si la muestra se disocia, asocia o reacciona con la solucin - longitudes de onda parsitas - incertidumbres o ruido asociado al instrumento

Los electrones absorbentes de la radiacin La absorcin de la radiacin ultravioleta o visible se puede considerar que es un proceso en dos etapas, primero hay una excitacin electrnica y posteriormente se produce una relajacin.

La absorcin de la radiacin ultravioleta o visible proviene de la excitacin de los electrones enlazantes, la espectroscopia de absorcin molecular es por tanto valiosa para la identificacin de los grupos funcionales de una molcula. Pero son ms importantes las aplicaciones de la espectroscopia de absorcin ultravioleta y visible para la determinacin cuantitativa de compuestos. Todos los compuestos orgnicos son capaces de absorber radiacin electromagntica ya que contienen electrones de valencia que pueden ser excitados. La absorcin de radiacin ultravioleta y visible de longitud de onda larga se restringe a un grupo funcional llamado cromforo. Los electrones que intervienen en la absorcin de las molculas orgnicas son los que se encuentran en la formacin de enlaces entre los tomos y los electrones localizados alrededor del tomo y que no participan en la formacin de enlaces. Las regiones entre los tomos en las que se encuentran los electrones enlazantes se denominan orbitales moleculares. Al conbinarse dos orbitales atmicos se forma un orbital molecular enlazante de baja energa o un orbi- tal molecular antienlazante de alta energa. Los orbitales moleculares que se encuentran asociados a los enlaces sencillos se llaman orbitales sigma, s al igual que los electrones que los constituyen. Los dobles enlaces de las molculas orgnicas poseen dos tipos de orbitales moleculares, uno de ellos es p y el otro es un orbital molecular pi, (asociado al anterior. Adems de estos existen los orbitales sigma y pi antienlazantes, con mayor energa s* y p*. Ocurre tambin que muchos compuestos orgnicos tienen electrones no enlazantes n, cuyo nivel de energa est entre los orbitales enlazantes y antienlazantes pi y sigma. De esta forma al absorber la radiacin se producen una serie de transiciones electrnicas: - Transiciones s s*. Es una transicin que requiere gran cantidad de energa y que corresponde con la regin del ultravioleta de vaco. Esta transicin la presentan molculas alifticas, que tienen enlaces sencillos. - Transiciones n s*. Requieren menor energa que las anteriores, se producen en la zona entre 150 y 250 nm.

- Transiciones p p* y n p*. La mayor parte de las aplicaciones de la espectroscopa de absorcin en compuestos orgnicos se basa en estas transiciones que se dan en la regin de 200 a 700 nm. Estas son las transiciones que requieren los grupos cromforos. Cuando hay varios de estos grupos cromforos prximos entre s pueden dar lugar al efecto de conjugacin. Instrumentacin de la espectroscopa de absorcin UV-V

Antienlazante Antienlazante

Energa

No enlazante Enlazante

Enlazante

Niveles de energa moleculares eectrnicos

Instrumentacin de la espectroscopia de absorcin UV-V Los componentes de los espectrofotmetros en general son tratados, pero cabe ampliar brevemente las caractersticas de los instrumentos que trabajan en esta regin. - Fuentes de radiacin. Se utilizan fuentes continuas que deben emitir a alta intensidad sin que se produzcan fluctuaciones. Son de dos tipos, lmparas de arco y fuentes de incandescencia. Lmparas de arco: Constituidas por un gas que est en el interior de un recipiente al que se le somete una descarga elctrica y emite radiacin electromagntica. La excitacin elctrica puede ser a baja presin (lampara de deuterio e hidrgeno), o a alta presin (lmpara de xenn). Lmpara de deuterio e hidrgeno: El mecanismo anteriormente citado supone la formacin de una especie molecular excitada, que posteriormente se disocia dando dos especies atmicas ms un fotn ultravioleta. Como resultado se produce un espectro continuo desde unos 160 nm hasta el inicio de la regin visible. Con estas lmparas suelen usarse ventanas de cuarzo ya que el vidrio absorbe fuertemente longitudes de onda menores de los 350 nm. Lmpara de xenn: Al pasar una corriente a travs de una atmsfera de xenn se produce una intensa radiacin. El espectro producido va desde 250 a 600 nm teniendo un mximo en los 500 nm.

Fuente incandescente: Constan de un slido calentado a alta temperatura. Para la zona visible del espectro ( 400-800 nm) se utiliza un filamento de tungsteno colocado en el interior de una ampolla de vidrio. En la zona del UV se usan lmparas halgenas o de yoduro-tunsteno.

Lmparas de filamento de tungsteno. La distribucin de energa de esta lmpara depende de la temperatura. Se utiliza para la regin espectral que va desde 350 a 2500 nm. Para que la fuente sea estable se requiere un estricto control del voltaje Los aparatos que emiten en la zona del UV-visible tienen dos lmparas distintas, una de arco y otra de incandescencia. El paso de una lmpara a otra puede ser manual o automtico. - Analizador: Se utilizan filtros, prismas y redes de difraccin. Los prismas ms utilizados son los de tipo Littrow, en cuanto a filtros se utilizan los de absorcin sobre todo en la regin visible. - Compartimento para la muestra: Como ya se ha comentado para el visible basta con que sean de vidrio, pero para la regin del ultravioleta deben de ser de cuarzo. Pueden tener forma prismtica o circular. - Detector: Normalmente se utilizan las fotoclulas o los fotomultiplicadores. Suele ser un ctodo revestido de un metal que liberar electrones que son conducidos hacia el nodo.

Tipos de instrumentos El instrumento ms sencillo es el de haz simple, en el que el selector de la longitud de onda es o un filtro o un monocromador. La determinacin de la transmitancia de la muestra supone tres pasos; primero, un ajuste del 0% de transmitancia, segundo, ajuste al 100% de transmitancia con el disolvente solo, y por ltimo la medicin del % de transmitancia de la muestra colocada. Si existe alguna fluctuacin en la fuente realizaremos una lectura no exacta de la muestra. Tambin existen aparatos de doble haz, en los que un espejo rotatorio dirige la radiacin procedente del filtro o monocromador alternativamente a una cubeta de referencia y a la cubeta de la muestra. En estos instrumentos si hay alguna fluctuacin en la fuente se afecta por igual a la muestra y a la referencia, por lo tanto el error es menor. Un tercer tipo de aparato es aquel que se basa en una serie de diodos. Precisan de una ptica sencilla; una fuente de radiacin electromagntica y una red de refraccin que dirija la radiacin a la serie de diodos. Estos instrumentos se diferencian de los anteriores en que la muestra se coloca entre la fuente y el analizador. En el mercado existen gran variedad de modelos disponibles con distintas calidades, costes y diseos. Pueden ser fotmetros o espectrofotmetros, ambos de haz simple o doble que pueden estar o no controlados por ordenador. Pueden ser de doble dispersin con el fin de mejorar la resolucin espectral que llevan dos prismas o redes.

Aplicaciones de la espectroscopa molecular de absorcin UV-V En el trabajo con esta tcnica se encuentran unas extensas aplicaciones tanto en las determinaciones cualitativas como en las aplicaciones cuantitativas de especies moleculares. a. Aplicaciones a nivel cualitativo - La aplicacin principal es la determinacin de los grupos funcionales o estructuras qumicas de las sustancias analizadas. Sobre todo se detecta la presencia de ciertos grupos funcionales que actan como cromforos. Una

sustancia en unas determinadas condiciones tiene un espectro caracterstico que la identifica pero siempre en unas condiciones fijas; tipo de disolvente, pH, concentracin, etc. Es muy utilizado en el control de calidad. b. Aplicaciones a nivel cuantitativo - Son muchos los campos que se sirven de esta tcnica para la resolucin de sus problemas de informacin qumica cuantitativa. Un claro ejemplo de esto es que el 95% de las determinaciones cuantitativas llevadas a cabo en el campo de la sanidad se realizan por espectrofotometra ultravioleta-visible. - Determinacin cuantitativa de una sustancia. Lo primero que tenemos que realizar es un espectro para determinar a que longitud de onda vamos a trabajar. Siempre trabajaremos en un mximo de longitud de onda donde la sensibilidad es mayor y se produce una menor desviacin de la ley de Lambert-Beer. Viendo la absorbancia de distintas concentraciones de la sustancia hacemos una recta de calibrado. Como sabemos que A = abC, a partir de la recta de calibrado y el valor de absorbancia obtenemos la concentracin.

Absorbancia de la sustancia desconocida

Concentracin de la sustancia desconocida C

Una tcnica aproximativa para calcular una concentracin problema a partir de una concentracin y absorbancia conocida es: Ar/Ax = Cr/Cx Siendo Ar la absorbancia de la muestra referencia , Cr la concentracin de dicha muestra referencia, Ax la absorbancia de la muestra problema y Cx la concentracin problema.

Determinacin de varios componentes de una muestra. La absorbancia total de una disolucin es igual a la suma de las absorbancias de los constituyentes individuales de una mezcla. Supongamos una muestra donde tenemos dos componentes A y B, con espectros de absorcin diferentes, un anlisis de ambos es imposible en una nica medida. Pero podemos hallar las absorbancias de la muestra a dos longitudes de onda distintas l y l De manera que podemos expresar: . A = A b CA + A =

b CB
B

(al ) (a l )

b CAA+

b CB

Las absortividades molares pueden obtenerse a partir de disoluciones estndar individuales de A y de B o a partir de las pendientes de sus representaciones de la ley de Beer. Las absorbancias se determinan experimentalmente al igual que la anchura de la cubeta. Sabiendo estos datos nos queda resolver este sistema de dos ecuaciones en el que hay dos incgnitas que son CA y CB que son las concentraciones de cada componente. De esta forma se pueden analizar muestras con ms de dos componentes si se hacen ms medidas de la absorbancia para cada componente aadido. Pero las indeterminaciones en los resultados obtenidos son cada vez mayores. - Medidas de constantes de equilibrio: Es posible la determinacin de las constantes de disociacin o de equilibrio de indicadores cido-base mediante espectrofotometra de absorcin uv-visible, ya que los espectros de esas sustancias varan con el pH del medio. Un indicador AH se puede disociar segn la siguiente ecuacin: AH $ A- + H+ Al trabajar con una disolucin la constante de equilibrio sera: Ka = [H+][A-]/[HA] Siendo [ ] concentracin en moles/litro

Tomando logaritmos queda de la siguiente manera: pH = pKa + log [A-]/[HA] La relacin entre la concentracin de las formas inica y no inica se puede conocer a partir de sus absorbancias, ya que representando estas frente al pH, a una longitud de onda seleccionada (la correspondiente a un mximo), se obtendr una grfica en forma de S, es decir una curva sigmoidea. Cuando trabajemos con la longitud de onda mxima de la forma bsica, la absorbancia mnima representa la medida de la forma no ionizada HA, mientras que el valor de absorbancia mxima corresponder a la forma disociada A-. La absorbancia media obtenida de la semisuma de las absorbancias mnima y mxima, corresponde a la semidisociacin donde las concentraciones de HA y A- son iguales, de manera que el logaritmo de HA/A- es igual a cero. De esta forma el pH ser igual al pKa, de forma que podremos calcular Ka, es decir la constante de equilibrio.

A-

AH pH

- Calculo de la constante de reaccin: La constante de una reaccin se puede calcular fcilmente conociendo la concentracin inicial de un reactivo y la concentracin de dicho reactivo a un tiempo t desde que empez la reaccin: ln Cr/Cro = - Kt Siendo t el tiempo de reaccin, Cr la concentracin del reactivo al tiempo t y Cro la concentracin inicial y K la constante de reaccin. Pero como sabemos podemos expresar la concentracin en funcin de la absorbancia de manera que la expresin quedara:

ln At-A$/Ao-A& = -Kt Siendo t el tiempo de reaccin, At la absorbancia de la muestra a ese tiempo, Ao la absorbancia antes de que se de la reaccin, A( la absorbancia despus de la reaccin y K la constante. De esta manera conociendo los datos de absorbancia podemos calcular fcilmente la constante de la reaccin. -Valoraciones fotomtricas: Las medidas espectrofotomtricas pueden utilizarse con el fin de encontrar el punto de equivalencia de una valoracin, siempre que en sta algn elemento absorba la radiacin. Para ello se emplean curvas de valoracin fotomtricas que son una representacin de la absorbancia con respecto al volumen de la sustancia valorante. La representacin consta de dos zonas de lneas rectas con diferente pendiente, una al principio de la valoracin y otra cuando se ha pasado el punto de equivalencia. El punto final es el de la interseccin de ambas lneas. Para poder utilizar esta tcnica es necesario que el elemento o elementos que absorben la radiacin cumplan la ley de Lambert-Beer y tambin hay que corregir la absorbancia frente a los cambios de volumen. Las valoraciones se realizan en un espectrofotmetro modificado para permitir que el recipiente donde se da la valoracin est en la zona de paso de radiacin. Los resultados obtenidos suelen ser ms precisos puesto que se realizan varias medidas. Una ventaja que tiene es que se pueden valorar soluciones muy diluidas. Espectroscopa fotoacstica. Esta espectroscopa se desarroll en 1970, y proporciona un medio para la obtencin de espectros de absorcin ultravioleta y visible de lquidos turbios, semislidos y slidos. Esta tcnica supuso un gran avance ya que hasta entonces era muy difcil debido a problemas que apareca con la dispersin y reflexin de la radiacin. La tcnica se basa en el efecto de absorcin de la luz, lo podemos ver cuando un gas que se encuentra en una celda es irradiado con un haz de radiacin intermitente de una longitud de onda que absorbe el gas, esto produce una serie de fluctuaciones regulares de la presin del gas en el interior

de la cmara. Si la intermitencia corresponde al intervalo de la frecuencia acstica los pulsos de presin pueden ser detectados por un micrfono. La muestra se pone en una celda cerrada que contiene aire u otro gas que no absorbe la radiacin y un micrfono sensible. El efecto fotoacstico se observa cuando la radiacin es absorbida por la muestra, la potencia del sonido que se obtiene est relacionada con el grado de absorcin. Este mtodo tiene la ventaja de que la radiacin dispersada o reflejada por la muestra no tiene efecto en el micrfono. Existen instrumentos de haz simple y de doble haz, que en general tienen la fuente de radiacin, el monocromador, la celda fotoacstica, amplificadores y el analizador. a. Aplicaciones de la espectroscopa fotoacstica. En la espectroscopa convencional, incluso haciendo diluciones muy diluidas de sangre se produce la dispersin de la luz. Con la espectroscopa fotoacstica permite estudios de la sangre sin necesidad de una separacin preliminar de las molculas que la componen. Otras aplicaciones del mtodo incluyen el estudio de minerales, algas marinas, tejidos de animales, baos de superficies, superficies catalticas, semiconductores, etc.

INSTALACIN Y EMPLEO DEL ESPECTROFOTMETRO. En este tema vamos a tener en cuenta las consideraciones generales en cuanto a la disposicin y el empleo de cualquier tipo de espectrofotmetro UV VIS. El espectrofotmetro es un instrumento ptico de precisin, de forma que debe ser tratado de forma suave y sin brusquedades, no se deben desmontar las piezas pticas ni manipular incorrectamente las partes mecnicas. Para evitar errores en el funcionamiento o que llegue a estropearse, el espectrofotmetro debe ser colocado sobre una mesa plana, en posicin horizontal, mantenindolo alejado del polvo, del calor, de la humedad y las vibraciones. Hay que evitar las corrientes de aire sobre el aparato ya que si se produce este fenmeno la lampara emitir la radiacin de forma inestable. Previamente a su utilizacin es conveniente familiarizarse con sus principios bsicos y saber para que sirven las diferentes funciones de los controles. Adems por seguridad es conveniente revisar el aparato previo a su utilizacin. Una vez encendido el aparato se selecciona la longitud de onda deseada. Es conveniente esperar al menos unos veinte minutos para que el instrumento pueda estabilizarse. Pasado este tiempo se realiza el ajuste de 0% de transmitancia con el control de ajuste a 0, despus colocaremos una cubeta con disolvente (sin muestra) y se realiza el ajuste del 100% de transmitancia mediante el control de ajuste de 100. Debemos tener en cuenta que existen instrumentos que pueden realizar el ajuste a 0, el ajuste a 100, o ambos ajustes de manera automtica si necesidad de que empleemos ningn control. Existen varios niveles de ajuste de sensibilidad, siempre emplearemos el nivel menor posible, que nos permita alcanzar empleando el control de ajuste a 100 cuando estemos realizando un blanco. Despus de ajustar a 0 y a 100 se introduce la cubeta con la muestra y se mide la transmitancia o la absorbancia. Cada vez que se haga un cambio de la longitud de onda es necesario ajustar de nuevo a 0 y a 100. Si la longitud de onda es modificada considerablemente ser necesario esperar durante un tiempo despus del ajuste a 0 y a 100.

Como blanco se puede emplear aire, agua destilada, soluciones coloreadas, filtros neutros. Es conveniente conforme se va utilizando el aparato (tras utilizar el aparato en largos periodos) comprobar la longitud de onda para asegurarnos de su exactitud. Una vez que finalicemos el trabajo el aparato debe ser desconectado y cubierto con una funda de plstico para evitar una contaminacin por polvo u otras partculas. Para un anlisis espectrofotomtrico preciso es necesario el uso de cubetas de buena calidad. Es necesario calibrarlas de forma regular para comprobar y detectar las diferencias que pueden surgir por ralladuras y desgaste. Es muy importante tambin el uso de tcnicas adecuadas de limpieza y de secado. Para el limpiado de las caras externas de las cubetas Erickson y Surles propusieron la siguiente tcnica de limpiado: - Las superficies de la celda se limpian con un papel para lentes empapado con metanol, el papel se debe coger con una pinza. - Despus de la limpieza el etanol se evapora dejando las superficies de las cubetas quedan libres de contaminantes. Esta tcnica evita que no queden hilos ni pelculas de papel, que suelen quedar cuando se limpian las cubetas con el papel para lentes seco. Como hemos podido comprobar la utilizacin de estos instrumentos requiere una cierta comprensin de cmo es su funcionamiento, de cuales son sus partes, cual es el modo de trabajar con ellos , que aplicaciones y limitaciones tienen, etc. Esperamos que haya podido ofrecer cierta informacin para el usuario con el fin de que se interese ms por este tema. A continuacin mostraremos una serie de prcticas sencillas para realizar con el espectrofotmetro con el fin de ilustrar mejor lo citado anteriormente y conseguir una mayor compresin en las aplicaciones que tienen las tcnicas espectroscpicas.

BIBLIOGRAFA.
Mtodos modernos de anlisis qumico / Robert L. Pecsok, L. Donald ShieldsMxico : Limusa, 1990 / pag.102 376 (libro electrnico fuente: http://books.google.com.pe/books/about/M%C3%A9todos_modernos_de_an%C3%A 1lisis_qu%C3%ADmico.html?id=EQw5AgAACAAJ&redir_esc=y)

Anlisis qumico e instrumental moderno/Harold F. Walton, J Reyes Reverte, 1983 / pag.161 - 214