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Mtodos de siembra, aislamiento y recuento de bacterias

1.- Objetivos:

Aprender diversos tipos de mtodos de siembra. Obtener de un cultivo puro (realizando un aislamiento)

2.-Fundamento Terico:

Siembra de bacterias Sembrar una bacteria significa promover intencionalmente el desarrollo de sta en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de bacterias desarrollada en un medio se denomina siembra. Cuando sta contiene una sola especie de bacteria, se denomina cultivo puro o axnico, cuando contiene ms de una especie de bacterias se denomina cultivo mixto.

Aislamiento de bacterias A partir de un cultivo mixto, se puede obtener un cultivo puro de bacterias, a travs de la obtencin de colonias aisladas. Cada colonia representa una poblacin de microorganismos procedentes de una sola clula, a partir de la cual se posee la seguridad de obtener dicho cultivo puro de un solo tipo de microorganismo. Para ello se utilizan diferentes tcnicas de aislamiento, basadas en diluir la muestra inicial para obtener colonias aisladas. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las clulas en glicerol (10-30%) a -70 C, en Nitrgeno lquido a -173 C, o mediante liofilizacin. Se requiere un medio en este caso solido con gran superficie para que las bacterias diseminadas pueda generar una cepa es decir su propia progenie por formacin de colonias separadas.

Algunos Mtodos de Aislamiento son: Aislamiento por agotamiento por estras. Aislamiento por siembra de diluciones seriadas.

Recuento de bacterias 1. Principales mtodos de recuento del nmero bacterias en una muestra. El nmero de bacterias puede determinarse directamente por recuento del nmero total de clulas o indirectamente por la estimacin del nmero ms probable, por filtracin o por el recuento de clulas viables en placa (clulas capaces de dividirse en un medio de cultivo slido, tambin se refieren como unidades formadoras de colonias, UFCs). Entre ellos tenemos: recuento directo de bacterias al microscopio, recuento directo con contadores electrnicos, recuento en filtros de membrana 2. Mtodos de recuento de bacterias viables en placa Estos mtodos ofrecen la ventaja de cuantificar solo a las bacterias viables presentes en una muestra. Implican la dilucin seriada de la muestra en agua, caldo o solucin salina, la inoculacin de la dilucin en medio de cultivo slido y la incubacin durante 24-48 horas a la temperatura apropiada y en placa son mtodos de estimacin de bacterias viables en trmino de unidades formadoras de colonias (UFCs). El nmero de unidades formadoras de colonias de una suspensin bacteriana puede determinarse mediante dos tcnicas: recuento en placa por siembra en profundidad, recuento en placa por siembra en superficie.

3.-Procedimiento:

Para la extensin de la superficie, siembra por estras y diluciones sucesivas .

i.

Se nos entrego un tubo con una muestra de bacteria y tres tubos de ensayo con 9ml de agua destilada cada uno. Se enciende el mechero para esterilizar los instrumentos, tenerlo encendido durante el experimento.

ii.

iii.

Con la ayuda de una pipeta pasar del tubo de ensayo que tiene la muestra de bacteria, un 1ml al primer tubo de ensayo. Del primer tubo de ensayo pasar 1ml al segundo tubo de ensayo, de este segundo tubo de ensayo pasar 1ml al tercer tubo de ensayo. Se obtendrn tres muestras de 0.1 ml, 0.01ml y 0.001 ml en los respectivos tubos de ensayo arriba mencionado. De la muestra de 0.001 ml, se extraen dos gotas con la ayudad de la pipeta y se pone sobre la placa petri. Luego de esterilizar la esptula con el mechero, lo usamos para extender la muestra sobre la place petri. Se tapa la placa petri y se invierte.

iv.

v.

vi.

vii.

viii.

Para el recuento del numero de bacterias por mililitro

i. ii.

De una muestra de bacteria (escherichia coli) se extrae un poco. Con una pinza que se calienta con el mechero y se deja enfriar, se forma estras sobre la muestra de la placa petri. Lo anterior se repite sucesivamente

iii.

4.-Observaciones:

Para la extensin de la superficie, siembra por estras y diluciones sucesivas.

Al aadir 1ml de echerrichia coli a los 9 ml de agua esterilizada observamos que la opaco (fig. 1). El agar tiene consistencia un poco ms dura que la gelatina de fcil fragmentacin.

Se observ que de la muestra entregada se formo colonias en la placa Petri. Se observ una especie de envejecimiento de la placa (incubada por un tiempo prudencial) que adquiri un tono marrn. Se observo la formacin un pequeo hongo. Se observ que el contenido del cuarto tubo de ensayo expona un color ms opaco que el primero, luego de aadir la muestra.

Figura 1

Para el Recuento de Nmero de Bacterias por mililitro.

Luego que nos entregaron la muestra ( placa incubada el da anterior )y despus de dividir en cuatro regiones pudimos contar en cada una de ellas 277 bacterias

5.-Resultados y Discusiones:

Para la extensin de la superficie, siembra por estras y diluciones sucesivas

La extensin en superficie tambin es bastante til para poder aislar pero preferentemente en laboratorio se usa para poder contar las bacterias puesto que al final de toda la tcnica quedan puntitos los cuales pueden ser fcilmente contados como se ver en la parte 4.4 del informe. Al realizar la siembra de estras debamos esterilizar el asa antes de generar ms estras. El color de la Pseudomona aeringinosa y de escherichia coli es debido a que el agar ha alterado su composicin qumica La adicin de agar nutritivo es para su alimentacin ya que es un soporte que contiene levadura (cerveza). La presencia de hongos en la placa petri pudo ser debido a la mala esterilizacin o la presencia de bacterias en el aire.

Para el recuento de Nmero de Bacterias por mililitro

Hay 1108 bacterias de Escherichia coli en 0.5 ml con el tubo cuya concentracin era 0.01 Por lo tanto hay 1108x0.5x200=110800 bacterias UFC (Unidades Formadoras de Colonias) La tcnica del conteo manual nos facilito el recuento de bacterias ya que no requera de instrumentos sofisticados (de los cuales no contamos) para su fin a diferencia de otras tcnicas.

6.-Conclusiones:

Aprendimos un mtodo de siembra( estra mltiple). Contabilizamos de forma manual el nmero de bacterias atreves del mtodo de siembra. Aprendimos a realizar un aislamiento.