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MICRORGANISMOS DE

IMPORT NCIAAGRCOLA
Editores:
RICARDO S. ARAUJO
MARIANGELA HUNGRIA
.PlCIHS 1 2 3
1",1",1",1",1",1,,,111,1,,,1,,,1,,,1 ,,,1,,,1
EMBRAPA
Ministrio da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrria
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria - EMBRAPA
Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijo - CNPAF
Centro Nacional de Pesquisa de Soja - CNPSo
MICRORGANISMOS DE
IMPORTNCIA AGRCOLA
EMBRAPA-SPI
Braslia, DF
1994
Editores: Ricardo S. Araujo
Mariangela Hungria
EMBRAPA-CNPAF. Documentos, 44.
FIGURAS DA CAPA
esquerda: esporocarpo de Amanita sp. (Basidiomycotina).
No centro: soja no-inoculada ( frente) e inoculada (fundo), em rea de primeiro ano de cultivo nos
Cerrados.
direita: corte de ndulos ativos de soja mostrando cor vermelha devida leghemoglobina.
Comit de Publicaes
Pedro A. Arraes Pereira (CNPAF/Presidente)
Carlos Caio Machado (CNPSo/Presidente)
Editorao e Programao Visual
Danilo Estevo (CNPSo/Desenhos)
Hlvio B. Zemuner (CNPSoIFotografias)
Lauro Pereira da Mota (CNPAF/Fotografias)
Lgia M. de O. Chueire (CNPSo/Reviso)
Reinaldo Paulino da Silva (CNPAF/Desenhos)
Sebastio Pereira de Arajo (CNPAF/Desenhos)
Sinbio de Sena Ferreira (CNPAF/Digitao)
Normatizao Bibliogrfica
Ademir Benedito A. de Lima (CNPSo/Coordenao)
Ana Lcia D. de Faria (CNPAF/Catalogao na fonte)
Tiragem: 1000 exemplares.
CIP-Brasil. Catalogao-na-publicao.
Microrganismos de importncia agrcola / editores Ricardo S. Arajo.
Mariangela Hungria; Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria,
Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijo: Centro Nacional de
Pesquisa de Soja. - Braslia: EMBRAPA-SPI, 1994.
236p. - (EMBRAPA-CNPAf. Documentos. 44)
ISSN 0101-9716
Contedo: Introduo / Ricardo S. Arajo. Mariangela Hungria -
fixao biolgca do nitrognio em soja / Mariangela Hungria ... [et aI.]
- Fixao biolgica do nitrognio em feijo / Ricardo S. Arajo -
Fixao biolgica do nitrognio em espcies arbreas / Fatima M.S.
Moreira - Micorrizas arbusculares / Jos Oswaldo Siqueira - A
biomassa microbiana do solo e sua importncia nos ecossistemas
terrestres / David A. Wardle. Mariangela Hungria - Biodegradao de
xenobiontes : potencialidades e limites / Tomaz Langenbach.
I. Microbiologia. 2. Solo - Microrganismo. I. Arajo, Ricardo S.
11. Hungria. Mariangela. 1/1. EMBRAPA. Centro Nacional de Pesquisa
de Arroz e feijo (Goinia. GO). IV. EMBRAPA. Centro Nacional de
Pesquisa de Soja (Londrina. PR). V. Srie.
CDD 631.46
EMBRAPA 1994
APRESENTAO
Apesar do grande avano cientfico na rea de microbiologia do solo, poucos desses conheci-
mentos tm sido aplicados na tomada de decises em relao s prticas agronmicas que visam o
aumento da produtividade das culturas. Entretanto, a atividade biolgica oriunda da grande massa de
seres microscpicos que habitam o solo participa de vrios eventos que o transformam em um ambi-
ente propcio ao crescimento das plantas.
Este livro traz os conhecimentos mais recentes sobre a atividade dos microrganismos do solo
de importncia agrcola. Os resultados nele apresentados e discutidos so frutos de muitos anos de
pesquisa por dedicados cientistas e representam o estado-da-arte dos conhecimentos na rea, qualifi-
cando este livro como bibliografia complementar de suma importncia para estudantes de Agronomia,
Biologia e Cincias afins. Sua publicao representa um esforo da Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuria (EMBRAPA) no sentido de divulgar o trabalho de seus especialistas e difundir tecnologias
desenvolvidas para melhorar a agricultura brasileira.
Homero Aidar
Chefe do CNPAF
sUMRIO
1. INTRODUO .................................................................................................................. 7
Ricardo S. Araujo & Mariangela Hungria
2. FIXAO BIOLGICA DO NITROGNIO EM SOJA ..................................................... 9
Mariangela Hungria, Milton A. T. Vargas, AlJert R. SuHet & Jos R.,berto R. Peres
3. FIXAO BIOLGICA DO NITROGNIO EM FEIJO ................................................. 91
Ricardo S. Araujo
4. FIXAO BIOLGICA DO NITROGNIO EM ESPCIES ARBREAS ....................... 121
Ftima M. S. Moreira
5. MICORRIZAS ARBUSCULARES ..................................................................................... 151
Jos Oswaldo Siqueira
6. A BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO E SUA IMPORTNCIA NOS ECOSSISTE-
MAS TERRESTRES. ............................ ....................................... ........... .................. ..... ..... 195
David A. Wardle & Mariangela Hungria
7. BIODEGRADAO DE XENOBIONTES: POTENCIALIDADES E LIMITES ................ 217
Tomaz Langenbach
CAPTULO 1
INTRODUO
Ricardo S. Arauj ol
Mariangela Hungria
2
A frao biolgica um dos principais componentes do solo. Essa frao composta por
comunidades de pequenos animais (mesofauna) e microrganismos (microfauna e microflora). Muitas
das propriedades dos solos so decorrentes da atividade biolgica, sendo comum dizer-se que um solo
sem atividade biolgica um solo sem vida. As relaes e interaes entre as diferentes comunidades
de organismos do solo contribuem para a manuteno da vida do solo, e para diversos outros proces-
sos que, por sua vez, esto intimamente ligados cadeia trfica.
Os componentes mais numerosos da frao biolgica do solo so, sem dvida, os microrganis-
mos, representados por integrantes da microfauna (protozorios) e da microflora (fungos, bactrias,
algas e vrus). Esses organismos participam ativamente da decomposio de resduos orgnicos, dos
ciclos de reciclagem do nitrognio, do fsforo e do enxofre e da decomposio de poluentes. Muitos
desses componentes, portanto, desempenham um papel vital na construo do solo como suporte
fsico para as culturas agrcolas.
A pesquisa nas ltimas dcadas rendeu muitos resultados que contriburam para um melhor
conhecimento das propriedades dos organismos do solo e aproveitamento dos processos biolgicos
que influenciam na produtividade agrcola. Como exemplos, temos os conhecimentos adquiridos
sobre a capacidade de certos microrganismos de modificar ou destruir poluentes e defensivos agrco-
las, a habilidade da microflora de produzir substncias txicas s culturas agrcolas e aos animais, a
utilizao da inoculao de leguminosas em larga escala, a micorrizao de mudas de caf e rvores
frutferas para o transplante, a utilizao de associaes entre plantas e microrganismos do solo na
recuperao de reas degradadas pela minerao, remoo da cobertura vegetal e construo civil.
O advento das tcnicas de biologia molecular permitiu o emprego de rigorosas anlises genti-
cas nos estudos da composio e das propriedades das comunidades de microrganismos do solo. Com
isso, foi possvel, por exemplo, estudarem-se aspectos muito ntimos da relao entre as leguminosas
e seus simbiontes fixadores de nitrognio, da interao entre patgenos do solo e seus hospedeiros e
at da manipulao gentica de microrganismos para que atuem de acordo com o interesse do homem,
quer seja como simbiontes de plantas, agentes de controle biolgico de pragas e doenas, ou como
condicionadores dos solos para o cultivo agrcola.
Este livro relata os avanos obtidos com a pesquisa sobre microrganismos do solo de importn-
cia agrcola. Ele est dividido em captulos, de acordo com os assun.t;().s ,contemplando
aspectos relevantes da microbiologia dos solos agrcolas. Apesar de-_uo ser uma -reyiso exaustiva
sobre cada assunto, so apresentados os conhecimentos mais relevantes e recentes';elll cada rea, e
discutidas suas implicaes para a produtividade agrcola e para a manuteno da vida do solo.
I Pesquisador, Ph.D., EMBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijo (CNPAF), Caixa Postal 179, CEP 74001-970, Goinia, GO.
2 Pesquisadora, Ph.D., EMBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa de Soja (CNPSo), Caixa Postal 1061, CEP 86001-970, Londrina, PRo
8
Agradece-se a colaborao de cada um dos autores, partilhando informaes e, sobretudo, se
prontificando a ajudar a editar estas informaes to valiosas. Para finalizar, segue uma pequena
estria para reflexo. Um dia, um professor disse a um de seus alunos, nascido e criado em uma
fazenda, que enchesse alguns vasos com terra para que pudesse plantar um experimento. O aluno,
ento, respondeu que aquilo no era terra, mas sim solo. O professor respondeu dizendo que tudo
depende do referencial: aquilo que cai de nossos sapatos no cho limpo das cozinhas de nossas mes
terra, enquanto que o suporte para as plantas , realmente, solo.
Terra ou solo, o importante que se lembre que ali vivem imensas comunidades de seres vivos
que sofrem os mais diversos impactos em decorrncia da atividade humana. Somente atravs de um
manejo de solo que considere a vida presente ser possvel alcanar a to almejada sustentabilidade da
agricultura. Os captulos so exemplos claros da importncia dos microrganismos do solo para esse
fim.
2.1. Introduo
CAPTULO 2
FIXAO BIOLGICA DO NITROGNIO EM SOJA
Mariangela Hungria
1
Milton A. T. Vargas
Z
Allert R. Subet
3
Jos Roberto R. Peres
3
A soja uma cultura que apresenta grande demanda pelo nitrognio (N) devido, particular-
mente, ao teor protico elevado em seus gros, de cerca de 40%. Mas justamente pelo seu teor protico
elevado, essa uma cultura de grande importncia econmica e o Brasil o segundo maior produtor
de soja, sendo responsvel por 16,9 % da produo mundial (FAO, 1993).
As principais fontes fornecedoras do N necessrio ao crescimento das plantas so: 1- nitrog-
nio do solo, proveniente da decomposio da matria orgnica e das rochas; 2- nitrognio fornecido
por fertilizantes; e 3- nitrognio fornecido pelo processo da fixao biolgica do nitrognio atmosf-
rico (N2)' Existe, tambm, uma pequena contribuio pela reao das descargas eltricas com o N
2
,
resultando em nitrato, que adicionado ao solo e representa cerca de 4% das entradas positivas no
balano de N na Terra. O fornecimento, utilizao e perdas do N formam um cicIo complexo, denomi-
nado "ciclo do N". Para maiores detalhes, diversas revises, particularmente da dcada de 70, quando
houve um grande impulso nos estudos de fixao biolgica do N
2
, abordam esse assunto (Delwiche,
1970; Burns & Hardy, 1975; Brill, 1979; Postgate & HilI, 1979).
Os teores de N nos solos do Brasil, de um modo geral, no so elevados e geralmente se situam
na faixa de 0,05% a 0)0 %. Com a intensificao da agricultura, as exigncias nutricionais de N, bem
como a sua remoo, so ampliadas; conseqentemente, se o N do solo retirado pelas plantas no for
reposto, o teor desse nutriente decrescer rapidamente.
A sntese qumica de fertilizantes nitrogenados iniciou na primeira dcada deste sculo, quan-
do Fritz Haber e Carl Bosch descobriram o processo que transforma o N
2
atmosfrico em amnia. As
necessidades para essa sntese qumica so: 1- hidrognio (derivado de gs de petrleo); 2- catalisador
contendo ferro; 3- altas temperaturas (300C a 600C); e 4- altas presses (200 atm a 800 atm). Con-
seqentemente, existe um custo elevado para a sntese de fertilizantes, resultante principalmente da
necessidade de gastos com fontes de petrleo, que tambm no so renovveis. Calcula-se que, para a
sntese de uma tonelada de amnia, sejam necessrios seis barris de petrleo. Prticas aglcolas alter-
nativas para diminuir esses custos precisam ser procuradas, principalmente para o Brasil, que importa
fertilizantes nitrogenados para satisfazer a demanda interna.
O N
z
abundante na natureza, constituindo quase 80% do gs atmosfrico. Mas nenhum ani-
mal ou planta capaz de utilizar o N
2
como uma fonte de protena, devido tripla ligao que existe
entre os dois tomos do N
2
, que uma das mais fortes de que se tem conhecimento na natureza.
1 Pesquisadora, Ph.D., ElvIBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa de Soja (CNPSo), Caixa Postal 1061, CEP 86001-970, Londrina, PRo
2 Pesquisador, Ph.D, EMBRAPA-Centro de Pesquisa Agropecuria do CelTado (CPAC), Caixa Postal 700023, CEP 73301-970, Planaltina, DF.
3 Pesquisador, M.Sc., EMBRAPA-CI'AC.
10
Bactrias da famlia Rhizobiaceae fonnam estruturas altamente especficas, os ndulos, onde ocorre a
converso do N
2
atmosfrico a amnia, que ento incorporada em diversas formas:de N orgnico'
para a utilizao por algumas plantas da famlia Leguminosae, como a soja. Essas bactrias conse-
guem quebrar a tripla ligao pela ao de um complexo enzimtico, denominado dinitrogenase e o
processo denominado de fixao biolgica do N
2
.
Para que o N proveniente da fixao biolgica possa suprir todas as necessidades da planta,
porm, o processo precisa ser eficiente, o que resulta, principalmente, da escolha adequada dos parcei-
ros simbiticos, ou seja, estirpes de bactrias mais eficientes e competitivas e gentipos de plantas que
respondam ao microssimbionte. Embora exista controvrsia, conforme ser discutido ainda neste ca-
ptulo, os gastos energticos relacionados fixao biolgica do N
2
parecem ser mais elevados do que
os gastos para a assimilao do N dos fertilizantes, alm do gasto inicial com a formao e manuten-
o dos ndulos. Por isso, caso essa simbiose no seja eficiente, a associao pode se tornar parastica.
A fixao biolgica do N
2
um passo crucial no ciclo do N. Em reas no perturbadas, com
vegetao clmax, esse processo biolgico no limitante. Tambm em reas ridas, frias ou fraca-
mente ensolaradas, a gua, temperatura ou luz limitam a produtividade biolgica. Mas, em reas per-
turbadas e ainda frteis, a introduo do N atravs da fixao biolgica, geralmente, limita a produti-
vidade. Esses locais incluem as reas agrcolas, reas onde as florestas clmax foram perturbadas e
replantadas e aquelas perturbadas por desastres naturais, como o fogo (Postgate & RiU, 1979).
No caso da soja, muitos estudos foram conduzidos no Brasil desde a introduo dessa cultura,
tornando a simbiose muito eficiente e resultando em uma grande economia para o pas, pela no
utilizao de fertilizantes nitrogenados. Para alcanar produtividades de 2500 kg.ha-t, a soja absorve
cerca de 200 kg de N.ha-
1
, dos quais 67% a 75% so alocados para as sementes. Devido baixa
eficincia de utilizao dos fertilizantes nitrogenados, normalmente inferior a 50%, pois h perdas por
lixiviao, nitrificao e desnitrificao, seriam necessrios 300 a 400 kg de N.ha-
1
para se obter essa
produtividade, portanto um custo certamente proibitivo para os agricultores. Utilizando dados do se-
tor de economia do Centro Nacional de Pesquisa de Soja (CNPSo), da EMBRAPA, com uma estima-
tiva de rea colhida de 1l.350.000 ha, na safra de 1993/94, uma produtividade mdia de 2156 kg.ha-
1 e considerando que a recomendao atual para essa cultura de utilizao de inoculao sem a
suplementao de qualquer fonte de fertilizante nitrogenado, calcula-se que o pas economize, hoje,
cerca de 1 bilho de dlares, por safra, pela inoculao da soja (Tabela 2.1). Alm disso, as vantagens
ecolgicas da fixao de N
2
incluem a economia de petrleo e gs natural, que so fontes energticas
no renovveis, e a menor poluio dos rios e lagos, causada pela lixiviao dos fertilizantes. As
principais vantagens e desvantagens da utilizao de fertilizantes nitrogenados e do processo de fixa-
o biolgica do N
2
esto listadas na Tabela 2.2.
Finalmente, no poderia deixar de ser mencionada a importncia da cultura da soja no que se
refere ao valor protico para a populao, particularmente nos pases com carncias nutricionais, como
o Brasil. Um hectare de soja produzindo 2156 kg de gros com um teor protico de 40% tem-se um
acmulo de 862 kg de protena. Considerando que o consumo dirio de protenas recomendado pela
FAO de 53 g.pessoa-\ constata-se que a protena produzida seria capaz de suprir as necessidades
proticas de um adulto por 16.264 dias e que a produo nacional pode fornecer, para cada um dos 150
milhes de brasileiros, 179 g de protena.dia-
1
.
I I
Tabela 2.1. Comparao econmica entre a fixao biolgica do N
2
em soja e a aduba-
o mineral.
Forma de Fornecimento Custo (U$) Economia pelo processo
doN de fixao biolgica do N 2 (U$)
por ha no pas* porha no pas
(10
6
) (10
6
)
Inoculante (2 doses.ha-
1
) 1 11
Uria (290 kg.ha-
1
) ** 60 681 59 670
Uria (435 kg.ha-
1
) 90 1.021 89 1.010
Considerando a rea colhida de 11.350.000 ha na safra de 1993/94 .
.. Considerando uma produtividade mdia de 2156 kg.ha<- (safra 1993/94), com teor mdio de N dos gros de 6,0 %; correspondendo,
ento, e"ll0rtao de 129 kg de N.ha-l-. A adubao com 290 kg de uria.ha-l- (45% de N) seria capaz de repor essa exportao
se a eficincia de utilizao do fertilizante fosse de 100% mas, como a eficincia de utilizao normalmente encontrada de 50%,
seriam necessrios 435 kg.ha-l-.
2.2. Taxonomia da Planta Hospedeira
A planta hospedeira destacada neste captulo est classificada da seguinte maneira:
Subreino: Cormobionta
Diviso: Spermatophyta
Subdiviso: Angiospermae
Classe: Dicotiledoneae
Subclasse: Archichlamydae
Ordem: Rosales
Subordem: Leguminosinae
Famlia: Leguminosae
Subfamlia: Papilionaceae, Fabaceae
Tribo: Phaseoleae
Subtribo: Phaseolinae (Glyciniae)
Gnero: Glycine L.
Subgnero: Glycine subg. Soja (Moench)
Espcie: Glycine max (L.) Merrill
Vrios autores tm classificado a soja na famlia Fabaceae. Isso resultou de uma proposta feita
por Delorit & Gunn (1986) para subdividir a famlia Leguminosae, criando a famlia Fabaceae, na
qual a soja ficaria includa. Existe ainda muita controvrsia taxonmica e, de um modo geral, ainda
prevalece a classificao na famlia Leguminosae.
12
Tabela 2.2. Principais vantagens e desvantagens da utilizao de fertilizantes nitrogenados e do pro-
cesso de fixao biolgica do N
2
.
Vantagens Desvantagens
FERTILIZANTES
1- disponibilidade imediata para as plantas
2- geralmente o custo energtico para a sua ab-
soro pelas plantas inferior ao custo do N
obtido pelo processo biolgico
1- gasto energtico elevado para a sua sntese
2- gasto com tecnologia e mo-de-obra envolvi-
das na produo
3- gasto com transporte at o campo
4- raramente mais do que 1/3 do fertilizante
nitrogenado aplicado aproveitado pelas
plantas, sendo perdido por desnitrificao,
nitrificao e lixiviao
5- poluio de lagos e rios
FIXAO BIOLGICA DO N
2
1- menor custo para o agricultor
2- diminuio dos problemas ambientais
3- manuteno da fertilidade do solo
1- plantas dependentes da fixao do N
2
podem
crescer mais lentamente, pois fotossintatos
so desviados para o metabolismo dos ndu-
los
2- estirpes de bactrias diferem em sua
efetividade. Trabalhos cientficos devem ser
feitos continuamente para assegurar o uso de
bactrias que permitam a maximizao da
produtividade das plantas.
3- gentipos de plantas diferem no potencial de
resposta inoculao. O melhoramento deve
incluir sempre a avaliao da capacidade
fixadora de N
2
com as estirpes recomenda-
das comercialmente.
A soja utilizada agronomicamente j foi denominada como Glycine soja e Soja max, mas
desde 1948 conhecida botanicamente por Glycine max (L.) Merrill. O tipo selvagem de soja, consi-
derado o parental da soja cultivada hoje, j foi denominado de G. ussuriensis RegeI and Maack., mas
a designao como G. soja Sieb and Zucc. aceita desde 1970 (Verdcourt, 1970). O local de origem
de G. soja inclui o Vale do Rio Yangtze, as provncias do norte e nordeste da China, reas adjacentes
da Federao Russa, Coria e Japo. Informaes botnicas sobre a soja foram recentemente compila-
das por Gazzoni (1994), e devem ser procuradas para maiores detalhes.
2.3. Taxonomia do Microssimbionte
2.3.1. Estirpes de crescimento lento
13
Espcies: Bradyrhizobumjaponicum (Buchanan 1980) Jordan, 1982
Bradyrhizobium elkanii (Jordan 1982) Kuykendall et aI., 1992
H descries do gnero Rhizobium por Kirchner, em 1886, e Frank, em 1889. Em 1932, as
bactrias responsveis pela nodulao da soja foram classificadas como Rhizobium japonicum (Fred
et aI., 1932), num critrio baseado, principalmente, nos grupos de inoculao cruzada entre o
microssimbionte e a planta hospedeira. Outras caractersticas fisiolgicas, bioqumicas e genticas,
alm da inoculao cruzada e do crescimento lento com produo de lcali in vitro passaram a ser
consideradas nas dcadas subseqentes e permitiram a diviso de Rhizobium em dois grupos, de cres-
cimento rpido e lento. Entretanto, as bactrias que nodulam a soja continuaram a ser classificadas
como R.japonicum (Jordan & AIlen, 1974) sendo confirmado por Buchanan, em 1980. interessante
observar, porm, que a diviso de rizbio em duas classes, de acordo com a taxa de crescimento, j
havia sido sugerida por L:ihnis & Hansen (1921).
A partir de 1982, as bactrias da espcie Rhizobiumjaponicum foram reclassificadas em um
novo gnero, Bradyrhizobium, dentro do qual est a espcie Bradyrhizobium japonicum , que inclui as
principais estirpes que nodulam a soja (Jordan, 1982, 1984). O nome Bradyrhizobium alusivo s
taxas de crescimento dessa bactria, pois "bradus" vem do grego, significando lento e Rhizobium o
nome genrico da bactria.
Na dcada de 80, vrios trabalhos comearam a demonstrar que existe grande variabilidade
gentica e fisiolgica entre as estirpes de B. japonicum, possibilitando a diviso em dois grupos com
caractersticas diferentes, conforme ser visto adiante com maiores detalhes. Esses estudos levaram
Kuykendall et aI. (1992) a sugerirem a subdiviso de Bradyrhizobium em duas espcies: B.japonicum,
com as estirpes do grupo I, e B. elkanii, com as estirpes do grupo n.
Apesar das grandes diferenas que separam os dois grupos, essa nomenclatura ainda no
aceita por todos. A nova nomenclatura foi validada no Intemational Joumal ofSystematic Bacteriology
(Annimo, 1993), mas no ganha suporte em algumas anlises genticas, como a comparao de
seqncias 16S rRNA (Young et aI., 1991; Young, 1992), e no foi recomendada no ltimo relato do
subcomit de Rhizobium (Young et aL, 1993). As estirpes-padro esto listadas na Tabela 2.3.
O manual de taxonomia de Bergey (Jordan, 1984) classifica a espcie Bradyrhizobum japonicum
no reino Procmyotae e famlia Rhizobiaceae . Os trs gneros dessa famlia, Rhizobium, Bradyrhizobium
e Azorhizobium (este ltimo descrito por Dreyfus et a!., 1988), foram agrupados devido sua habilida-
de em fixar N
2
, pois na verdade so muito distintos entre si, estando mais prximos de outros gneros
no-fixadores de N
2
. Bradyrh;zobiumjaponicum, por exemplo, apresenta semelhanas genticas com
Rhodopseudomonas palustris, bactria fototrfica prpura no -sulfurosa. Com base nos estudos
empregando tcnicas moleculares, tem-se utilizado cada vez mais a classificao filogentica, na qual
B. japonicu111 fica posicionada como Proteobacteria na subdiviso alpha (Young, 1992; Young et a1.,
1993), confonne Figura 2.1.
Tabela 2.3. Lista das estirpes de crescimento lento (Bradyrhizobium) e rpido (Rhizobium ou Sinorhizobium) que nodulam a soja
segundo nomenclatura utilizada por Jordan (1982), Scholla & Elkan (1984), Chen et aI. (1988) e Kuykendall et aI.
(1992).
Estirpe Outras Espcie Espcie Chemovar Espcie
(Jordan, 1982) (Kuykendall et (Scholla & Elkan, 1984) (Chen et aI., 1988)
aI., 1992)
ATCC 10324 USDA6 B. japonicum*
ATCC 49852 USDA 76 B. elkanii *
ATCC 35423 USDA205 R. fredii chemovar fredii* S.jredii*
USDA201 R. fredU chemovar siensis* S.fredU
CCBAU 110 RX42 S. xinjiangensis*
* Estirpe padro da espcie ou chemovar.
.j>.
15
grobocterlum tumefociens
Rhizobium loti
.R.: 90legoe
R. meliloti, R. fredii
& tropici
!!guminosorum
joponicum (Tipo I a)
izobium sp. (L)
(Tipo I )
j-p-onicum (Tipo Ir)
Rhodop-seudomonos p-olustris
Figura 2.1. rvore taxonmica mostrando as relaes provveis entre as es-
pcies de rizbio. Segundo Young et a!. (1991, 1993) e Young
(1992).
2.3.2. Estirpes de crescimento rpido
Espcie: Rhizobiumfredii (Buchanan 1980) SchoIla & Elkan, 1984
Em 1982 foram isoladas algumas estirpes de crescimento rpido de solos e ndulos de soja
coletados na China (Keyser et a!., 1982). Essas estirpes foram classificadas coino Rhizobi1ll11 fi'edii
(Scholla & Elkan, 1984) e, posteriormente, foi proposto um novo gnero para as mesmas, Sillorhizobiul11
gen. nov., com duas espcies, S. fredii e S. xir?jiangensis (Chen et a!., 1988). Atravs de estudos de
seqenciamento por PCR (polymerase chain reaction) de um segmento de 260 pares de bases, corres-
pondente s posies 44 a 337 da seqncia 16S rRNA de Escherichia coli Jarvis et aI. (1992) conclu-
ram, porm, que as estirpes de crescimento rpido deveriam continuar a ser classificadas como R.
fredii. Na Figura 2.1 pode-se observar um fenograma simplificado das estirpes que nodulam a soja e
na Tabela 2.3 esto listadas as estirpes-padro.
Aqui, convm definir alguns termos, muito usados neste captulo e no captulo seguinte:
infectiva, efetiva e eficiente. Bactrias infectivas (infective) so aquelas capazes de infectar as razes
e formar ndulos; o termo efetiva, eficaz (effective) foi proposto para avaliar a simbiose como um
todo, enquanto que eficiente (efficient) seria utilizado para indicar a quantidade de N
z
fixado por
unidade de tecido nodular (Dobereiner et aI., 1970). Os primeiros relatos indicavam que as estirpes de
crescimento rpido s conseguiam nodular Glycine soja e Glycine max cultivar Peking, cultivares
primitivas de soja, sendo ineficazes em linhagens comerciais (Keyser et aI., 1982). Mas, desde o
isolamento dessas bactrias, alguns estudos vm sendo conduzidos procurando estudar a compatibi-
16
lidade com os gentipos de soja norte-americanos (Devine, 1984, 1985a, 1991; Balatti & Pueppke,
1992) e brasileiros (Chueire & Hungria, 1994), tendo-se comprovado que diversas cultivares comerci-
ais de soja so capazes de nodular com R. fredU, conforme ser discutido adiante.
Do mesmo modo que para as estirpes de crescimento lento, Jordan (1984) classifica essa esp-
cie no reino Procaryotae e na famlia Rhizobiaceae. Nos estudos de evoluo molecular, porm, R.
fredii tambm classificado como Proteobacteria na subdiviso alpha (Young, 1992).
2.4. O Processo da Nodulao
2.4.1. Histrico
Curiosamente, Antoine Laurent Lavoisier denominou o elemento N como "azoto", que signi-
fica "sem vida". O qumico, nessa poca, pensava que o N no participava do metabolismo dos orga-
nismos vivos, como ocorria com o oxignio (0
2
), O nome se tornou irnico, pois o N componente
essencial para os cidos nuclicos e protenas, sendo necessrio para todas as formas de vida (Brill,
1979).
Existem relatos sobre o uso de leguminosas desde a idade do bronze, de recomendao de
rotao de culturas por gregos e romanos, alm de relatos de recomendao de leguminosas em pasta-
gens, na Inglaterra, j em 1613. A elucidao do processo de fixao biolgica do N
2
, porm, teve
impulso com os estudos de Jean-Baptiste Boussingault, em 1837, com trevo e ervilha e com aveia e
trigo, que observou que as leguminosas, de alguma forma, conseguiam obter o N necessrio para o seu
metabolismo do ar. O botnico russo Woronin descobriu que os ndulos de leguminosas continham
bactrias e os alemes Hellriegel e Wilfarth constataram que a fixao biolgica do N
2
dependia de
"fermentos no solo", responsveis pela formao dos ndulos nas razes. Finalmente, Beijerinck iso-
lou as bactrias dos ndulos de ervilha (Wilson, 1940; Burris, 1974; Evans & Burris, 1992). Desde
ento, o processo de nodulao e fixao do N
2
tem sido estudado com afinco, mas muitos passos
ainda esperam por elucidao.
2.4.2. Etapas do processo
A formao dos ndulos um processo complexo, que ocorre em vrias etapas, envolvendo
mudanas fisiolgicas e morfolgicas tanto na clula hospedeira como na bactria. As mudanas na
bactria visam, principalmente, o recebimento de fontes de carbono da planta hospedeira, para prover
o ATP e o poder redutor necessrios para o processo de fixao biolgica. As mudanas na planta
hospedeira visam, principalmente, assimilar a amnia produzida pelas bactrias.
i
Existem diversos genes envolvidos no processo de nodulao, que esto localizados em
plasmdeos e nos cromossomos, nas estirpes de crescimento rpido, como Rhizobillmfredii e no DNA
cromossomal, no caso de estirpes de crescimento lento, como Bradyrhizobium japonicum. Os genes
rizobianos essenciais infeco e formao do ndulo podem ser divididos em duas classes. A primei-
ra inclui os genes que, quando mutados, resultam em alteraes no processo de infeco; nessa cate-
goria esto os genes da nodulao, nod (nodulation) e os genes no/ (aps a utilizao de todas as letras
do alfabeto para os genes nod, os demais genes esto sendo designados por no/). A segunda classe
17
inclui diversos outros genes que esto envolvidos com a caracterizao da superficie das bactrias e
alterao da nodulao, tais como os genes exo (exopolysaccharides), lps e ndv
(I;2-B-glucans, nodule .deyelopment).
Diversos eventos pr-infeco precedem -a formao do ndulo. Podem ser includos a, o
estmulo ao rizbio, ativao dos genes da nodulao, adeso da bactria a. determinados stios na
superficie das razes e troca de sinais moleculares entre o hospedeiro e o microssimbionte, levando a
-alteraes fenotpicas nas razes.
Inicialmente, diversos compostos so exsudados pela planta hospedeira, como aminocidos,
acares, cidos carboxlicos, homoserina e fIavonides, que agem como substncias quimiotticas,
atraindo o rizbio (Gaworzewska & Carlile, 1982; Agtiilaret aI., 1988; Kape et aI., 1991; Dharmatilake
& Bauer, 1992). A quimiotaxia pode auxiliar o processo da nodulao, embora no parea ser um
passo essencial, uma vez que mutantes imveis de R. meliloti ainda foram capazes de formar ndulos
(Ames & Bergman, -1981; Mellor & Glenn, 1987).
Outras substncias, exsudadas, principalmente pelas razes laterais, estimulam a multiplicao
das bactrias na rizosfera. Um exemplo de estmulo especfico o da homoserina produzida por ervi-
lha, que estimula R. leguminosarum bv. viceae (van Egeraat, 1975 a,b; Kijne, 1992). Como resultado
desse estmulo, tem-se que, na rizosfera, normalmente ocorre um aumento na populao de rizbio da
ordem de cem vezes (Dowling & Broughton, ] 986). Mas o rizbio tambm precisa competir pelos
exsudatos das razes com outros microrganismos do solo, incluindo estirpes ineficientes mas adapta-
das, outras bactrias, fungos, actinomicetos e protozorios, que tambm podem apresentar ao anta-
gnica pela produo de substncias antibiticas (Holland, ] 970). Essa competio pode prejudicar a
co!onizao das razes e a nodulao.
Se _ a' quimiotaxia e o estabelecimento do rizbio forem bem sucedidos, as bactrias ento
aderem supemcie dos plos radiculares_ Considera-se que a adeso do rizbio ocorre em dois pas-
sos: primeiro, clulas isoladas aderem superficie radicular, normlmente a stios especficos
(Bhuvaneswari et aI., ] 980; Gulash et aI., 1984) e, posteriormente, outras clulas aderem s bactrias
que j esto presas aos plos radiculares (Smit et aI., 1989). H indicaes de que algumas molculas
parecem estar envolvidas no processo de adeso e, recentemente, foi relatado que uma protena da
supemcie da bactria, a ricadesina, comum s diversas espcies de rizbio, estaria envolvida com a
ligao aos plos radiculares (Smit et aI., 1989). Fibrilas de celulose, de origem bacteriana, tambm
participam do processo de adeso do rizbio aos plos radiculares (Smit et aI., 1986, 1987), embora
no sejam essenciais nodulao. Nesse processo de adeso, que envolve tambm alguma
especificidade, h algumas evidncias de que o reconhecimento do rizbio envolve lecitinas da planta
hospedeira e a hiptese de que elas interagem com os radicais de acar dos polissacardeos da
supemcie celular do rizbio (Bohlool & Schmidt, 1974; Dazzo & Gardiol, 1984; Halverson & Stacey,
1985; Kijne et aI., 1988). Existem relatos, tambm, de que outros fatores, como a idade da cultura, pr-
tratamento das clulas e composio do meio afetam a adeso das bactrias (Smit et aI., 1986; Smith
& Wollum 11, 199]). H indicaes, ainda, de que interaes fisico-qumicas entre as supemcies do
plo radicular e do rizbio tambm podem intermediar o processo de adeso (Morris et aI., 1989).
Proporcionalmente, porm, poucas bactrias aderem aos plos radiculares da leguminosa hospedeira,
variando de 0,4% a 15% da populao bacteriana total (Pueppke, 1984; Vesper & Bauer, 1985).
18
Provavelmente, em um processo simultneo com a adeso das bactrias, tem incio uma troca
de sinais moleculares entre o microssimbionte e a planta hospedeira, ativando genes dos dois parcei-
ros. Em uma primeira etapa, a planta hospedeira libera sinais que so responsveis pela induo da
transcrio de genes do rizbio essenciais nodulao, nod e n % ~ ~ O primeiro indutor de plantas
estudado foi isolado de extratos de sementes de alfafa e identificado como a flavona luteolina (5,7,3',4'-
tetra-hidroxi-flavona) (peters et aI., 1986). Aps a identificao .da luteolina, os fatores de ativao
presentes nas sementes e razes de diversas outras leguminosas hospedeiras comearam a ser investi-
gados e foram tambm identificados como flavonides. A Figura 2.2 mostra que, no caso da soja, os
principais indutores dos genes nod de B. japonicum e R. fredU, presentes em extratos de sementes e de
plntulas, foram inicialmente identificados como os isoflavonides daidzena (7,4'-di-hidroxi-
isoflavona) e genistena (4,5,7-tri-hidroxi-isoflavona) (Kosslak et aI., 1987). Posteriormente, foi rela-
tado que a isoliquiritigeninina (4,2',4'-tri-hidroxi-chalcona) tambm um indutor presente em exsudatos
de razes de soja (Kape et aI., 1992) e que os isoflavonides liberados pela soja so liberados na forma
glicosilada (Barbour et aI., 1992). Os isoflavonides, at ento, eram conhecidos apenas por seu papel
como ftoalexinas, ou seja, substncias utilizadas pelas plantas na defesa contra patgenos e, geral-
mente, sintetizadas em resposta infeco (Dixon et aI., 1983; Lawton & Lamb, 1987; Dixon &
Lamb, 1990). O papel desses isoflavonides como indutores dos genes nod de B. japonicum refora a
hiptese de Vance (1983), de que o processo de infeco das leguminosas por rizbio apresenta mui-
tas semelhanas com a infeco por microrganismos patognicos.
Na segunda etapa de troca de sinais moleculares, as bactrias, atravs dos genes da nodulao,
produzem sinais especficos para o hospedeiro, induzindo as modificaes radiculares que ocorrem no
estdio de pr-infeco, como: a deformao dos. plos radiculares (Had, hair deformation); o
encurvamento dos plos (Hac, hair furling), podendo ser um encurvamento moderado, de 90 a 360,
ou acentuado, com 360 ou mais); a formao de razes curtas e grossas (Tsr,Jhick and hort [oot); e
o aumento no nmero de plos radiculares (Hai, hair increase) (Canter Cremers et aI., 1986; van
Brussel et aI., 1986; Zaat et aI., 1987a,b; Faucher et aI., 1988). Alguns desses fentipos, em razes de
soja, podem ser vistos na Figura 2.3. Esses sinais moleculares tambm so capazes de induzir
diviso das clulas no crtex das razes (Coi, cortical cell division induction), induo do meristema
do ndulo (Noi, nodule induction), formando ndulos contendo meristemas apicais, feixes vasculares
perifricos e endoderme, mesmo na ausncia do rizbio (Truchet et aI., 1991). O primeiro sinal estu-
dado foi o produzido por R. meliloti e identificado como um lipo-oligossacardeo sulfatado, com a
estrutura de um /3-1,4-tetra-sacardeo de D-glucosamina, contendo trs grupos amino acetilados e um
acilado com um cido graxo bis-no-saturado (Lerouge et aI., 1990). Posteriormente, vrios sinais,
I
produzidos por outras espcies de rizbio, foram identificados e, no caso de B. japonicum, algumas
estruturas produzidas por trs estirpes esto representadas na Figura 2.2. Na soja, j foi relatado que
esses fatores Nod so capazes de induzir diviso celular do crtex (Sanjuan et aI., 1993) e produo
de novos flavonides (Ini, increased nod-inducing activity) (Cho & Harper, 1991). Mais detalhes
sobre essa sinalizao molecular podem ser obtidos em uma reviso recente realizada por Hungria
(1994).
OH
OH
TROCA DE SINAIS MOLECULARES NA SIMBIOSE DA SOJA
Indutores
da
Soja
Flavonides
Daidzeina
'OH
Genisteina
OH
RI
C18:1
C18:1
C16:0
C16:0
C16:1
CI8:I,Me
Induo dos genes nod de B.joponicum
R2
H
Ac
H
Ac
H
Ac
Indu60 de mudanas no fentipo das rafzes
Induto,res
da Bactria
Fatores Nod
R5 R4 n
-
2-0-Me-Fuc H 5
2-0-Me-Fuc H 5
2-0-Me-Fuc H 3
2-0-Me -Fuc H 5
2-0-Me -fuc H 5
2- O-Me -fuc H 5
R5
I
CH20
O ~
HO OR
4
n
NHAc
Malla E.tirpe
14115 110 (I)
15!5 (I)
14!58 15!5
151
1580 15!5
1452 15!5
1588 155
1472 61
Figura 2.2. Sinalizao molecular que ocorre entre a soja e Bradyrhizobium japonicum. Os metablitos foram
sintetizados pelas estirpes USDA 110, USDA 135 e USDA 61. Segundo Barbour et aI. (1992) e
SanJuan et aI. (1993).
\O
20
Figura 2.3. Fentipos de razes de soja, cultivar BR-16, provocados peta inoculao com a estirpe
SEMIA 586 de lJ. japonicllm. esquerda, plantas no inoculadas e, direita. tratamento
inoculado. Avaliaes realizadas 15 dias aps a inoculao das plntulas. Aumento de
20 vezes. Segundo Nishi & Hungria (1993).
No estdio seguinte ocorre a dissoluo das paredes celulares, permitindo a entrada das bac-
trias nas razes. Um cordo de .infeco desenvolvido e cresce da extremidade do plo radicular
encurvado em direo ao crtex, conduzindo o rizbio para as clulas interiores. Com a diviso das
clulas do crtex e a induo de um meristema nodular, forma-se o primrdio do ndulo. Os cordes
de infeco penetram nas clulas individuais desses primrdios, em cujo citoplasma as bactrias so
liberadas (Sprent, 1984; Sobral et aI., 1991) e, ento, envolvidas em uma membrana de origem vege-
tal, chamada "membrana peribacteroidal", cuja formao envolve vrios sinais produzidos pelo rizbio
(Verma et aI. , 1993). Os primrdios diferenciam-se em um ndulo e a bactria sorre um processo de
diferenciao, transformando-se em bacteride. O processo de diferenciao do bacteride no to-
talmente conhecido, mas h indicaes de que alguns fatores relacionados com ele seriam a
fosforilao protica, a concentrao do on potssio e a baixa concentrao de 02 (Gober & Kashket,
1987, 1989; Karr & Emerich, 1989). Em seguida, inicia-se a expresso dos genes lIifefix (nitrogen
fixation e fixation) . Genes l1if so os responsveis pela sntese e funcionamento do complexo da
dinitrogenase e apresentam homologia com os genes de bactrias associativas, como K. pnelll11olliae,
e genesfix so os necessrios fixao mas que no so. estruturalmente, equivalentes aos genes de K.
pneumolliae. Desenvolvem-se. ento, as enzimas relacionadas com a quebra da tripla li gao do N
2
e
com a assimilao do nitrognio fixado. J foram identificadas cerca de 40 protenas que so sintetiza-
das durante o desenvolvimento dou funcionamento dos ndulos. as chamadas nodulinas (nodulinas
precoces e tardias) e a expresso gentica dessas protenas vem sendo caracterizada.
21
Alm desses estudos citados, existem linhas de evidncia de que outros fatores, como
lipopolissacardeos, que esto presentes na superfcie das bactrias, podem estar envolvidos nos pri-
meiros estdios de reconhecimento da simbiose (Carlson et aI., 1987; Priefer, 1989). Para maiores
detalhes sobre o processo de infeco, consultar revises recentes de Brewin (1991); Sobral et aI.
(1991); Franssen et aI. (1992); Kijne (1992); Venna (1992). As principais etapas da nodulao esto
resumidas na Tabela 2.4.
Tabela 2.4. Estdios para a formao dos ndulos e fentipos causados nas razes.
1- Quimiotaxia
2- Multiplicao do rizbio na rizosfera, colonizao (Roc, root folonization)
3- Adeso do rizbio s razes da planta hospedeira (Roa, root ttachment)
4- Troca de sinais moleculares entre a planta hospedeira e as bactrias
5- Alteraes nos fentipos radiculares, com a fonnao de razes curtas e grossas (Tsr, lhick and
hort [oot), encurvamento dos plos radiculares (Hac, hair furling), plos radiculares deformados
(Had, hair 4eformation), aumento no nmero de plos radiculares (Hai, hair increase)
6- Penetrao da bactria
7- Crescimento do cordo de infeco (Inf, infection)
8- Incio de formao e desenVolvimento dos ndulos (Noi, nodule initiation)
9- Liberao das bactrias (Bar, bacterial [elease)
10- Diferenciao dos bacterides (Bad, bacteroid 4ifferentiation)
11- Desenvolvimento da nitrogenase, leghemoglobina e enzimas relacionada" com a fixao do N
2
(Nif, nitrogen ftxation e Fix, fixation)
12- Manuteno do tecido bacteroidal, funo e persistncia do ndulo (Nop, nodule 12ersistence)
2.5. Dinitrogenase e Hidrogenase
O complexo enzimtico presente nas bactrias e responsvel pela reduo do N
2
a amnia
chamado de nitrogenase ou dinitrogenase. Concomitantemente com o processo de fixao de N
2
, o
complexo enzimtico da dinitrogenase tambm evolui hidrognio (H), com o desperdcio de eltrons
e ATP que, de outro modo, seriam usados para a reduo do N
2
(Evans et aI., 1987). Um mnimo de
25% dos eltrons destinados dinitrogenase perdido pela evoluo do H
2
. A evoluo de H
2
por
ndulos de soja j havia sido observada por Hoch e colaboradores na dcada de 50 e ocorre mesmo em
presses extremamente elevadas de N
2
(Neves & Hungria, 1987). Conseqentemente, a equao que
representa o processo de fixao do N
2
pode ser representada por:
. N
2
+ 8H+ + 8e- -+ 2 NH
3
+ H
2
Sabe-se, hoje, que existem trstipos de dinitrogenase, denominadas dinitrogenase-molibdnio,
dinitrogenase-vandio e dinitrogenase-feITo. Para maiores detalhes, procurar reviso de Newton (1993).
Em Rhizohilll11 e Bradyrhizo/Jiul11, porm, at o momento s foi detectada a dinitrogenase-molibdnio.
O processo de reduo do N
2
comea pela doao de eltrons pela ferredoxina e tlavodoxina
para a redutase da dinitrogenase, ou componente I, que est associada com duas molculas de MgATP.
22
Em seguida, a protena reduzida. se liga dinitrogenase propriamente dita ou componente lI, com a
transferncia dos eltrons e a hidrlise concomitante do ATP a ADP. Finalmente, os dois componen-
tes da dinitrogenase se dissociam. Os eltrons so transferidos um a um e, como todo o processo
requer oito eltrons, acredita-se que se formem vrios componentes intermedirios durante a reao.
complexo enzimtico da dinitrogenase muito sensvel ao 02' podendo ser irreversivelmente
inativado pela exposio aos nveis atmosfricos desse gs. As causas para essa sensibilidade ainda
so discutidas, mas podem ter originado durante a evoluo da enzima, quando o teor de 02 na atmos-
fera era baixo. No caso de microrganismos aerbicos, como Bradyrhizobium e Rhizobium, cria-se o
paradoxo da necessidade de 02 para gerar ATP e redutores para a dinitrogenase, mas ao mesmo tempo
manter uma p02 suficientemente baixa para no inativar a enzima. Devem existir, portanto, mecanis-
mos de proteo dinitrogenase. Nos ndulos, um dos mecanismos uma barreira difuso do 02
formada pelas clulas do crtex perto da superficie externa dos ndulos (Witty & Minchin, 1990),
conforme pode ser visto na Figura 2.4. Em ndulos de soja, por exemplo, um minieletrodo de 02
inserido no ndulo a uma profundidade de 0,5 mm conseguiu deteQtar uma queda drstica na presso
parcial de 02 (Tjepkema & Yocum, 1974). H, ainda, evidncias de que diversas condies de estresse,
como suprimento de seiva do floema, exposio a nitrato e acetileno, temperatura e gua, resultam no
aumento da resistncia dos ndulos difuso de 02' podendo limitar a atividade da dinitrogenase.
segundo componente de proteo contra o 02 nos ndulos a leghemoglobina, uma molcula que se
prende ao 02 e serve para fornecer a quantidade adequada de 02 para a respirao mas, ao mesmo
tempo, manter a p02 baixa para a atividade da dinitrogenase (Layzell et a1., 1993).
Algumas estirpes possuem uma segunda enzima, a hidrogenase, capaz de oxidar o H
2
evolu-
do, recuperando parte da energia perdida (Evans et al., 1987). A representao para a atividade dessa
enzima seria, ento:
H
2
+X -+ H
2
X,
sendo X um receptor de eltrons, normalmente o 02.
A produo de H
2
,pela dinitrogenase, indica um uso ineficiente de energia que, de outro modo,
ficaria alocada no processo de fixao do N
2
. Como palie dessa energia pode ser recuperada pela ao
da hidrogenase, gerando ATP, considera-se que os sistemas que possuem essa enzima so mais efici-
entes. Comprovando essa hiptese, vrios experimentos foram conduzidos, demonstrando que a adi-
o de H
2
a suspenses de bacterides ou ndulos formados por estirpes Hup+ (que possuem a
hidrogenase) promovia incrementos na atividade da dinitrogenase, efeito este ausente em estirpes
Hup-. Em certos casos, porm, a oxidao do H
2
no est acoplada com a formao de ATP e, conse-
qentemente, no se observa economia de carbono (revisado em Neves & Hungria, 1987). ciclo
simplificado da ao da dinitrogenase e da hidrogenase pode ser visto na Figura 2.5 .
A avaliao da energia perdida pela evoluo do H
2
e a capacidade da hidrogenase reciclar
parte da energia perdida tomou maior impulso aps o estudo clssico de Schubert & Evans (1976),
que assim definiram o termo eficincia relativa (ER):
ER=
eltrons utilizados para a reduo do N
z
fluxo total de eltrons para a dinitrogenase
23
Experimentalmente, essa eficincia pode ser calculada conforme a frmula abaixo, que se
baseia no princpio de que, na presena do acetileno (C
2
H
2
), todos os eltrons so alocados para a
reduo desse gs.
ER= 1-
H
2
evoludo (ar}
C
2
H
2
reduzido
ou, ainda, segundo a frmula:
H
2
evoludo (ar)
ER= 1-
H
2
evoludo em uma atmosfera sem N
2
Superfcie
do
Ndulo
~
300
::a..
-
C\I
o
200
Q)
'tJ
o
'0
(,).
o
100
L..
-
C
Q)
o
c
o
O
u
O
Endoderme
Crtex 1
~
Clulas
infectadas
Eletrodo
50 100 150 200 250 300
Penetrao do Eletrodo (jJm)
Figura 2.4 Barreira difuso de 02 no crtex do ndulo, formada pe-
las prprias clulas do crtex perto da superficie externa
dos ndulos, e mudana na concentrao de 02 em um n-
dulo. Segundo Witty et aI. (1986).
Doador de
e-
Redutase
da
Dinitrogenase
( Ferredoxina,
Flavodoxina)
2 Mg ATP
24
Dinitrogenase
+
2 NH
3
ambiente
H 2 ~
~
ou
Hidrogenase
ATP ADP + Pi
Figura 2.5. Ciclo simplificado da ao da dinitrogenase, reduzindo o nitrognio atmosfrico (N2)' e
da hidrogenase, reciclando o hidrognio (H2) que produzido obrigatoriamente durante
o processo de reduo do N
2
.
Os autores constataram que diversos sistemas simbiticos estudados diferiam em sua eficin-
cia relativa mas que, no caso de Bradyrhizobiu/11, ao contrrio de outras espcies de Rhizobiu/11, a
atividade da hidrogenase de algumas estirpes era capaz de reciclar todo o H
2
produzido pela
dinitrogenase.
Estudos conduzidos com cultura contnua de Azotobacter chroococcUl11 mostraram que, sob
condies de limitao de carbono e fsforo, as culturas so fortemente dominadas pelo fentipo
Hup-l-. J nos casos de limitao por ferro ou O
2
, h uma pequena vantagem do fentipo Hup- (Yates
& Campbell, 1989). Alm disso, vrios outros fatores podem afetar a atividade da hidrogenase ou a
alocao de eltrons para a dinitrogenase, resultando em maior ou menor eficincia na converso de
eltrons para a reduo do N
2
(Neves & Hungria, 1987).
C?s resultados obtidos em diversos experimentos que investigavam as vantagens do fentipo
Hup-l- em leguminosas, porm, so conflitantes. Em soja, h indicaes de que as estirpes Hup-l- so
mais eficientes energeticamente do que as Hup-, podendo contribuir com maior acmulo de N nos
gros (Schubert et a!., 1978; Albrecht et a!., 1979; Zablotowicz et a!., 1980; Hanus et a!., 1981).
Nesses experimentos, porm, no foram utilizadas estirpes isognicas para o fentipo Hup. Compa-
rando estirpes isognicas Hup -I- e Hup-, Devron et a!. (1987) no detectaram, na fase inicial, diferenas
25
entre as estirpes e, aos 75 dias, as plantas inoculadas com as estirpes Hup+ apresentaram menor mat-
ria da parte area seca, o que foi atribudo limitao de O
2
nos ndulos, pela oxidao pela hidrogenase.
Em outros experimentos com estirpes isognicas de B. japonicum, porm, observaram-se aumentos de
9% e 11 %, respectivamente na matria seca e teor de N total na parte area (Evans et aI., 1985) e de
13% no N total acumulado pelas plantas (Hungria et aL, 1989).
Alm desse papel na economia energtica, h sugestes para pelo menos mais duas funes
para a hidrogenase: 1- mecanismo auxiliar de proteo respiratria, removendo o O
2
do ambiente da
dinitrogenase e 2- prevenir a inibio da atividade da dinitrogenase pelo H
2
evoludo que, devido
compartimentalizao da estmtura do ndulo, pode atingir concentraes inibitrias (revisado em
Neves & Hungria, 1987).
Os estudos sobre a evoluo do H
2
e hidrogenase continuam em diversos laboratrios do mun-
do. Muito j se conhece, tambm, sobre as propriedades fsico-qumicas, propriedades catalticas,
aspectos genticos e regulao da expresso da hidrogenase (Maier, 1986; Evans et aI., 1987; O'Brian
& Maier, 1988; Arp, 1992). Embora a evoluo do H
2
tenha sido freqentemente indicada como um
dos fatores que limitam a efcincia da fixao do N
2
, restam muitas dvidas, tanto a nvel bsico
como a nvel mais aplicado, que precisam ser melhor estudadas e entendidas. Uma das dvidas surge
na constatao de que as estirpes Hup- parecem constituir a maioria dos isolados do solo representan-
do, em alguns levantamentos realizados, de 75% a 81 % da populao rizobiana, o que poderia indicar
alguma vantagem em termos de competitividade (Carter et aI., 1978; Brewin, 1984; Arp, 1992).
2.6. Assimilao da Amnia Resultante da Fixao do N
2
O primeiro produto da fixao do N
2
a amnia, que transferida do bacteride pela membra-
na peribacteroidal para o citossol da planta hospedeira (Bergersen, 1965; Bergersen & Turner, 1967).
As reaes de assimilao so ento mediadas pela glutamina sintetase (GS) e glutamato sintase
(GOGAT) (Figura 2.6). O desenvolvimento dessas enzimas ocorre, principalmente, durante o estabe-
lecimento da nodulao (Atkins et aI., 1980, 1984; Miflin & CuIlimore, 1984; Hungria et aI., 1991),
com mais de 95% da atividade localizada no citossol dos ndulos (Atkins et aI., 1980; Mit1in &
Cullimore, 1984).
Existem duas fonnas de GOGAT nos ndulos, a dependente de ferredoxina e a NADH-GOGAT,
cuja atividade geralmente maior (Suzuki et aI., 1986; Hungria et aI., 1991) e que est localizada em
plastdios (Shelp & Atkins, 1984). Inicialmente, a GS adiciona amnia ao cido glutmico, com a
hidrlise concomitante de ATP. O N-amida da glutamina, que o produto orgnico inicial do proces-
so de fixao , ento, usado pela GOGAT, sendo adicionado a uma molcula de a-cetoglutarato
(cido 2-oxoglutrico), gerando duas molculas de glutamato. Essas duas molculas podem ser nova-
mente usadas como receptoras da amnia ou podem ser usadas, posteriormente, como doadoras de
amida. Devido ao baixo Km da GS para a amnia (200 nM), essa considerada a principal via de
assimilao da amnia nos ndulos (Boland et aL, 1982; Shelp & Atkins, 1984; Atkins, 1991) .
Atividades elevadas da glutamato desidrogenase (GDH) tambm j foram detectadas nos n-
dulos (Shelp & Atkins, 1984; Hungria et aI., 1991) e a assimilao, via GDH, seria pela adio da
amnia ao cido 2-oxoglutarato, gerando glutamato. Entretanto, devido s baixas concentraes de
amnia encontradas nos ndulos e ao Km elevado dessa enzima, de 14 )..lM, pouco provvel que essa
26
via seja utilizada (Streeter, 1989; Atkins, 1991). A constatao de nveis elevados de atividade nos
ndulos, porm, deixa dvidas sobre a ao da GDH, que talvez possa ser importante sob condies
de estresse (Atkins et aI., 1984) ou durante a senescncia dos ndulos (Sutton, 1983).
CLULA INFECTADA CLULA NAo INFECTADA
Na IIACTERIDE
+ 1 2
NH,_ GLN
CITOSSOL
2
_-+-GLN NH, o(; KG
A _
cl!LULA NAO
IN'ECTADA
ri+-- XANTINA
'--+---t-.. GLN GLU L4 SER I 1
12
ASN COa 11 "CitO RICO
+ + + CIDO RICO
r( SNTESE DE PURINA
PRPP _Riboaa ap XMP ALAN
115 PLAlTIDEO
ASN
14
ALAN_ ACAL
12
....-- XANTlNA
URICO
ALAN ...!!.. ACAL
14
ALAN
t 14
ACAL
ACAL ACAL_ ALAN ACAL
PEROXIISOMO
RET(CULO
ENOPi:sMTlCO
ENDODERME
Figura 2.6. Vias de assimilao da amnia fixada nos ndulos de leguminosas. (1) Nitrogenase
(E.C.1.18.6.1); (2) glutamina sintetase (E.C.6.3 .1.2); (3) glutamato sintase (E.C.2.6.1.53);
(4) aspartato aminotransferase (E.C.2.6. 1. 1); (5) serina hidroximetilase; (6) metileno
tetrahidrofolato oxidoredutase (E.C.1.5.1.5); (7) asparagina sintetase (E.C.6.3.54); (8)
fosfoglicerato oxidoredutase (E.C.1.1.1.95); (9) fosforibosil amido-transferase
(E.C.2.4.2.14); (10) inosina monofosfato oxidoredutase (E.C.12.I.14); (11) vrios
passos; (12) xantina oxidoredutase (E.C.I.2.3.2); (13) urato oxidas e (E. C. I. 7.3.3); (14)
alantoinase (E.C.3.5.2.5); (15) fosforibosilpirofosfato sintase (E.C.2. 7.6.1). Abreviaces
usadas: ALAN, alantona; ACAL, cido alantico; ASN, asparagina; ASP, cido asprtico;
GLI, glicina; OH-piruvato, hidroxipiruvato; IMP-inosina monofosfato; PRPP, fosforibosil
pirofosfato; SER, serina; THF, cido tetrahidroflico; XMP, xantina monofosfato. Se-
gundo Neves & Hungria (1987).
27
Os principais produtos que so exportados dos ndulos para as plantas hospedeiras so as
amidas (principalmente asparagina e, em menor porcentagem, a glutamina) e os uredos (alantona e
cido alantico) (Figura 2.6). O maior transporte de N como amida ou uredos varia com a espcie de
leguminosa (Sprent, 1980; Atkins, 1991). No caso da soja, cerca de 90% do N total da seiva do xilema
transportado como uredos, observando-se uma variao com a planta hospedeira e com a estirpe da
bactria (Neves et aI., 1985; Hungria & Neves, 1987a,b; Neves & Hungria, 1987; Hungria et aI.,
1989); em menor porcentagem, tem-se a asparagina (Atkins, 1991). A alantona e o cido alantico
so formados nas plantas pela oxidao dos nucleotdeos de purina, derivados da sntese de novo ou da
hidrlise de cido nuclico. Os estudos sobre o metabolismo dos uredos em soja foram realizados
com 15N2 e 13N2 (Matsumoto et aI., 1977; Minamisawa et aI., 1986; Schubert & Coker, 1982). Maiores
detalhes podem ser encontrados nas revises de Neves & Hungria (1987) e Atkins (1991).
Em feijo e em soja nodulados, foi encontrada uma correlao positiva entre a porcentagem de
N transportado na seiva do xilema como uredo e a produtividade, N total das vagens e ndice de
colheita para o N, tornando-se uma ferramenta importante nos programas de seleo de simbiontes
mais eficientes (Neves et aI., 1985; Hungria & Neves, 1987a,b; Neves & Hungria, 1987) (Figura 2.7).
z
- o o
0-
... c
8..!:!
a.
o
:!: o
cu c
=z
8 ......
cu
cu-
"t:J C
cu
cu E
u cu
"t:J CI)
,.: o
c
-oZ
--
**
(o) y = 0,24 + 0,007 x r = 0,887 ( .)
**
(b) y=-323,70 + 7,71 x r= 0,925 (x)
x
0,85
0,75
0,65
~ ~
~ # ~ I - - - - - - - - - - ~ I ~ - - - - - - - - - - ~ I - - - - - - ~ I
60 70 80
% N - u redo
-
300 a.
......
Z
Ot
E
-
CI)
cu
-
c
200 cu
E
100
cu
CI)
CI)
o
c
Z
-..Q
Figura 2.7. Correlao entre o teor de N-uredo na seiva do xiI ema, aos 35
dias aps a emergncia (DAE) e (a) ndice de colheita para o N,
(b) N total dos gros aos 77 DAE. Experimento conduzido com
cinco cultivares e seis estirpes de feijo. Segundo Hungria &
Neves (1987 b).
28
Novos experimentos devem ser conduzidos para identificar e quantificar os beneficios do maior
transporte de uredos, pois tanto em soja como em feijo h resultados comprovando que o N-uredo
mais facilmente translocado para os gros do que o N mineral (Neves et aI., 1985; Hungria & Neves,
1987b; Yoneyhama, 1984a,b). Alm disso, permanece a dvida sobre as bases bioqumicas que expli-
cariam a correlao positiva encontrada entre a maior eficincia relativa da nitrogenase (ER) e a maior
porcentagem de N-uredo transportada na seiva do xilema (Neves et a!., 1985; Hungria & Neves,
1987a,b).
2.7. Custos Energticos do Processo de Fixao do N 2
Nas plantas dependentes exclusivamente do processo de fixao do N
2
, a energia das reaes
fotossintticas armazenada nos ndulos, para ser oxidada e produzir redutores fortes (eltrons) e
ATP, necessrios atividade da dinitrogenase. No caso das leguminosas dependentes de nitrato
(N03 -), os gastos energticos so similares aos da fixao biolgica quando a assimilao ocorre nas
razes. Em algumas leguminosas, como a soja e o feijo, porm, o nitrato reduzido principalmente
nas folhas e o ATP necessrio para o metabolismo posterior da amnia pode ser fornecido diretamente
pela fotofosforilao nos cloroplastos, reduzindo os custos energticos. Na Figura 2.8 pode-se obser-
var uma representao do fluxo de energia para os processos de reduo do N
2
ou do nitrato nas
leguminosas.
As diferenas no custo energtico do nitrato, assimilado pelas razes e pelas folhas e nas con-
dies experimentais dos estudos conduzidos em vrios laboratrios, levaram aos mais diversos resul-
tados quando compararam a eficincia energtica de leguminosas noduladas ou recebendo N mineral.
Mais detalhes podem ser obtidos nas revises de Phillips (1980); Schubert & Ryle (1980); Minchin et
a!. (1981); Mahon (198.3); Saari & Ludden (1986); Neves & Hungria (1987).
custo terico de reduo de 1 moi de N
2
para 2 mo1s de amnia de 28 ATP. Dependendo
da presena da hidrogenase, tipo de composto exportado e outros fatores, esse custo pode variar de
25,5 a 49 ATP.mol-
1
N
2
fixado (Minchin et a!., 1981; Saari & Ludden, 1986). Existem diversos
mtodos experimentais, conduzidos sob condies controladas de casa de vegetao ou a campo, para
calcular os custos energticos reais do processo de fixao do N
2
e compar-los com os valores teri-
cos (Mahon, 1983; Saari & Ludden, 1986; Neves & Hungria, 1987). Um dos mtodos mais utilizados
o da avaliao dos custos energticos pelo fluxo respiratrio, cujos resultados podem ser expressos
em nmero de mols de glicose.mol-
l
de NH/, mols de CO
2
.mol-
1
de NH/, mg C respirado.mg-
l
N
fixado, etc. Segundo Mahon (1983), a estimativa termodinmica terica para a reao da dinitrogenase
seria de, no mnimo, 0,11 mols de glicose.mol-
l
de NH
4
+, mas, pela compilao dos valores encontra-
dos em diversos experimentos, o autor considera como valor mdio 0,50 mols de glicose.mol-
1
de
NH/, portanto bem mais elevado do que o valor terico.
No caso da soja, os gastos de carbono para a fixao do N
2
encontrados por alguns autores
variaram de 2,4 g a 7,0 g C respirado.g-
l
N fixado (Saari & Ludden, 1986). Alm de diferenas nas
condies experimentais e nos gentipos de soja e estirpes de bactrias, a discrepncia dos resultados
tambm pode estar relacionada com a presena da hidrogenase, que reduz os custos no consumo de
carboidratos na ordem de 11 % a 25%, com a fixao de CO
2
pela enzima NADP-mlica e, principal-
mente, pela fosfoenol piruvato (PEP), que pode resultar em uma economia de 9% a 32% dos esquele-
29
tos de carbono, alm de diferenas no tipo de composto nitrogenado sintetizado e transportado pela
seiva do xilema (Minchin et aI., 1981; Saari & Ludden, 1986; Neves & Hungria, 1987). De qualquer
modo, procurar sistemas simbiticos mais eficientes uma meta importante, pois cerca de 30% dos
fotossintatos dirios da planta hospedeira so desviados para os ndulos (Minchin & Pate, 1973;
Mahon, 1983).
,
E nergia luminoso Agua
+
CD
~ O 2
+ ATP
1/
C02
ReduOo do
Nitrato
+ -
Carboidratos
NH4--- N03
I ~
C02

1--------
Fixao I
Biolgico /
NH;--N2i
I
:---------E]
Fotossntese
Fotoreao
Fotossintese
Reao no escuro
OxidaOo
Fosforilao
oxidativa
Figura 2.8. Representao do fluxo de energia envolvido na reduo do nitrato do
solo ou dos fertilizantes e na reduo do N
2
. Para a reduo do nitrato
podem ser utilizadas duas fontes de redutor: l-excedentes de energia
luminosa e 2-carboidratos produzidos pela fotossntese. Segundo
Mahon (1983).
No caso dos experimentos que encontraram maior eficincia nas plantas que assimilavam N
mineral, os valores so, em mdia, 30% superiores aos das plantas fixando N
2
(revisado em Mahon,
1983; Neves & Hungria, 1987). Essa menor eficincia energtica das plantas noduladas muitas vezes
tem sido mencionada como um desestmulo prtica da inoculao. Combatendo esse pensamento,
porm, tem-se que considerar, entre outros fatores, que o consumo energtico para a fixao do N
2

trs vezes menor do que o do processo Haber e Bosch .. Conforme salientado por Mahon (1983), em
30
termos agronmicos, as vantagens da adaptao e melhoria dos sistemas simbiticos so muitas, par-
ticularmente em comunidades com grandes perdas de N por lixiviao ou desnitrificao, como ocor-
re em vrios solos do Brasil.
2.8. Diferenas Morfolgicas, Fisiolgicas, Bioqumicas e Genticas entre as Espcies
BradyrTtizobium japonicum e BradyrTtizobium elkanii
2.8.1. Diferenas entre as espcies
Em diversos trabalhos, foram encontradas diferenas marcantes entre estirpes de B. japonicum.
Em relao s diferenas genmicas, inicialmente foi realizado um estudo de hibridizao de DNA
com espcies de Rhizobium, Bradyrhizobium e Agrobacteriu111 e de comparao da estabilidade trmi-
ca da fita dupla de DNA das bactriasheterlogas e homlogas (Hollis et aI., 1981). Esse estudo
demonstrou que as estirpes de B:japonicum poderiam ser divididas em dois grupos principais de
homologia do DNA e que o grupo I suportava ainda uma subdiviso em Ia e Ib.
Stanley et aI. (1985) tambm observaram, utilizando hibridizao com n(fDH e seqncias
homlogas dos genes nod, que as estirpes de B. japonicu111 caam em dois gentipos marcantemente
diferentes, sTI e sTlI, que apresentavam linhas evolucionrias distintas. Diferenas entre os gentipos
confirmadas em estudos de seqenciamento dos genes n(fDK e 11([E, que codificam a
/
protena Mo-Fe e o cofator Mo-Fe da dinitrogenase (Minamisawa, 1990; Minamisawa et aI., 1992),
por hibridizaes com o gene hup (Minamisawa, 1990; van Berkum, 1990; Minamisawa et aI., 1992),
pelo padro de restrio com os genes nod comuns (nodYABC) da estirpe USDA 110 (Rumjanek et aI.,
1993a) com as seqncias gnicas 16S rRNA (Young et aI., 1991; Rumjanek et aI., 1993b) e com as
seqncias RS s (Minamisawa et aI., 1992), que esto agrupadas ao redor das regies nifde B. japonicum
(Kaluza et aI., 1985). Informaes sobre algumas estirpes citadas nesta reviso constam da Tabela
2.5. Hibridizaes com 14 clones selecionados, ao acaso, de bibliotecas de cosmdeos de B.japonicum
utilizadas por Kuykendall et a\. (1992), tambm constataram a existncia de dois grupos distintos
dentro da espcie B. japoniCl/117.
Diversas caractersticas fenotpicas (morfolgicas, fisiolgicas e bioqumicas) foram analisa-
das em bactrias dos diferentes gentipos, procurando relacion-las com as diferenas genticas.
Fuhrmann (1990) encontrou diferenas na morfologia das colnias, constatando que bordas irregula-
res e planas ocorreriam exclusivamente no gentipo II (GTlI) o que, contudo, no foi confirmado por
Boddey & Hungria (1994a). J Kuykendall et a!. (1988) demonstraram que os gentipos diferiam
quanto composio dos cidos graxos e que o grupo II apresentava resistncia a nveis elevados dos
antibiticos rifampicina, tetraciclina, estreptomicina, cloranfenicol, eritromicina, carbenicilina e ci-
do nalidxico. As estirpes do GTII tambm diferiam quanto composio dos polissacardeos extra-
celulares (Huber et a!., 1984), contendo ramnose e cido 4-0-metil-glucurnico, com pequena quan-
tidade de glicose e manose, ao passo que nas estirpes do GTI a composio inclua glicose, manose,
galactose, 4-0-metil-galactose e cido galacturnico (Minamisawa, 1989).
Outra diferena observada foi a de que as estirpes do grupo II produziam rizobiotoxina [cido-
2-amino-4-(2-amino-3 -hidropropoxi)-trans-but-3-enico, PM= 190] e desidrorizobiotoxina (PM= 192)
(Minamisawa, 1989) que, quando sintetizadas nos ndulos de soja, induzem clorose em folhas novas
das cultivares sensveis, prejudicando o crescimento das plantas (Johnson et a!., 1959; Owens & Wright,
1964a,b; La Favre & Eaglesham 1986a; Devine et a\., 1988; Fuhrmann, 1990).
Tabela 2.5. Caractersticas de algumas estirpes de Bradyrhizobium citadas neste captulo.
Estirpes
SEMIA 5032
USDA 122
PJ 17-1
PJI7
SEMIA 5071
SEMIA 5051
USDA 31
USDA 94
USDA 76
Outras
Nomenclaturas
USDA 110
TAL-1 02
BR 103
BR 102
USDA 123
USDA 73
SEMIA 5072 NC1005
SEMIA 5039 532c,G3
SEMIA 5019 29w, BR29
R54-a BR 54
SEMIA 587 BR96
SEMIA 5061 lNFA 037
DF395 BR 76
SM,b BR 1
965 BR95
DF383 BR 77
SEMIA 586 CB 1809, BR 33
USDA I36b
SEMIA 527
SEMIA 5070 CPAC 74K
SEMIA 5080 CPAC 7
SEMIA 566 BR40
SEMIA 5079 CPAC 15
Isolados "s"
Origem Principais caracteristicas
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Japo
Brasil
Austrlia
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Isolada pelo Niftal, Hawai. Grupo Ia (Hollis et a!., 1981; Kuykendall el a!., 1988, 1992); sTI (St1n1ey et a!., 1985),
gentipo I - AI (Iv!inamisawa, 1990).
Gentipo I - A2 (lvlinamisawa, 1990).
Mutante revertante isognica Hup+ da estirpe PI 17 (Lepo et a!., 1981). Gentipo 1- A2 (lvlinamisawa, 1990).
Estirpe isognica Hup- da PJ 17. Gentipo 1 - A2 (Il.!inamisawa, 1990).
Grupo I (Hollis et a!., 1981; Kuykendall el aI., 1988). Sensvel alta temperatura e bai.,a umidade (Morote et a!., 1990).
Gentipo misto, entre I e Il (lvlinamisawa, 1989).
Grupo Il (Hollis et aI., 1981; Kuykendall el aI., 1988); sTIl (Stanley et a!., 1985); gentipo Il- Bl (lvlinamisawa, 1990); B. elkalJii Il (Kuykendall et aI., 1992).
Grupo Il (Hollis el aI., 1981; Kuykendall et aI., 1988); gentipo II - Bl (lvlinamisawa, 1990); sTIl (Stanle)" et aI., 1985); B. elkanii Ila (Kuykendall et a!., 1992).
Grupo Il (Hollis et aI., 1981; Kuykendall et a!., 1988); .TIl (Stanley et a!., 1985); gentipo Il - B2 (Minamisawa, 1990); B. elkalJii Il (Kuykendall et a!., 1992).
Isolada na Universidade da Carolina do Norte.
Isolada pelo IP AGRO, RS, em 1966. Eficiente, mas pouco competitiva (peres, 1979).
Isolada da linhagem IAC-70-559, pela EMBRAPA-CNPBS, RI. Eficincia alta (peres, 1979) a mdia (Neves et aI.,
1985). Competitiva (peres, 1979), recomendada comercialmente desde 1979 at o presente momento.
Isolada pela EMBRAPA-CNPBS, RI, em 1963, de solos com alto teor de mangans e que h8\iam sido inoculados com
inoculante misto da SARGS, RS. Eficiente (Dbereiner et a!., 1970).
Isolada pelo IPAGRO,RS, em 1967. Eficiente e competitiva (peres, 1979). Recomendada comercialmente de 1968 a
1975 e de 1979 at o presente momento.
Isolada pelo INPA, AII/!. Eficiente e competitiva.
Isolada de solos do DF. Forma muitos ndulos, mas de baixa eficincia (Neves et aI., 1985).
Isolada pela H.JBRAPA-CNPBS, RI, em 1963, de solos que no haviam sido inoculados. Eficincia mdia (Dbereiner
et a!., 1970) a baixa (Neves et a!., 1985).
Eficincia baixa (peres, 1979) a alta (Neves et a!., 1985).
Isolada de solos do DF. Forma poucos ndulos, mas muito eficientes (Neves et a!., 1985).
Isolada pelo CSIRO, e enviada ao Brasil em 1966. lduito eficiente (Dbereiner el a!., 1970), apesar da baixa massa
nodular (Neves et a!., 1985). Baixa capacidade competitiva e forma poucos ndulos com a cultivar LAC-2 (peres, 1979).
Isolado pelo IP AGRO, RS.
Isolada pela EMBRAPA-CPAC, DF.
Isolada pela EMBRAPA-CPAC, DF. Subcultura da CB1809, mas competitiva (Vargas et a!., 1992a). Nodula a cultivar
L<\C-2. Recomendada comercialmente desde 1992.
Isolada pelo IPAGRO, RS, de inoculante americano, em 1966 e recomendada comercialmente at 1978.
Isolada pela ElvIBRAPA-CPAC, DF. Pertence ao serogrupo 566, mas mais eficiente (Vargas et a!., 1 992a).
Recomendada comercialmente desde 1992.
Isoladas pela ElvIBRAPA-CPAC, DF.
v.>
32
As estirpes do grupo II tambm sintetizam cido indol actico (AIA) in vitro, acumulando
mais de 20 flM no meio, enquanto que nas estirpes do grupo I no se verificou sntese de AIA
(Minamisawa & Fukai, 1991; Minamisawa et aI., 1992). O triptofano geralmente um intermedirio
chave na biossntese de AIA em microrganismos (Morris, 1986). Minamisawa & Fukai (1991) obser-
varam que a adio desse aminocido aumentava a concentrao de AIA nos sobrenadantes do GTII,
ao passo que as estirpes do GTI no acumulavam AIA, mesmo na presena de triptofano.
Quanto atividade enzimtica, Huber et aI. (1984) observaram que somente as estirpes do
grupo II exprimiam a atividade da dinitrogenase in vitro, avaliada pelo mtodo de reduo do acetileno.
Por outro lado, Minamisawa (1989) observou que o fentipo Hup+ est confinado ao gentipo I e que
a expresso do fentipo consistente com a presena dos genes estruturais hup (Minamisawa, 1990;
Minamisawa et aI., 1992). Nem todas as estirpes do grupo I, porm, so Hup+ (Minamisawa et aI.,
1992), o que sugere que a caracterstica Hup implicaria em transferncia gentica horizontal entre
estirpes do gentipo I (Minamisawa, 1990). Recentemente, porm, foi relatado que diversas estirpes
apresentam atividade da hidrogenase denominada Hup-hr, isto , Hup host regulated, caracterizada
por no expressar atividade da hidrogenase em soja, mas sim em caupi (Vigna unguiculata L.) (van
Berkum, 1990; van Berkum & Sloger, 1991). Algumas estirpes do gentipo II se enquadraram na
categoria de Hup-hr (Keyser et aI., 1982; van Berkum & Sloger, 1991), mas esse parmetro ainda no
foi considerado nos estudos de subdiviso em gentipos.
A sntese de rizobiotoxina e a presena de hidrogenase parecem ser incompatveis, desde que
a derrepresso da hidrogenase in vitro inibida pela presena de rizobiotoxina (Minamisawa, 1988).
Foi observado, ento, que as estirpes do gentipo II no parecem carrregar os genes estruturais hup e
que, portanto, a represso pela rizobiotoxina provavelmente no ocorre em condies naturais
(Minamisawa, 1990).
Em relao assimilao do N
2
fixado pelas bactrias in vitro, foi relatado que as estirpes do
grupo I assimilam amnia principalmente pela isoenzima GSn, enquanto que nas estirpes do grupo II
a assimilao ocorre, preferencialmente, pela GSI (Rumjanek et aI., 1993a).
Em simbiose, uma diferena observada foi a de que a principal oxidase terminal do cito cromo
aa", estava presente somente entre as etirpes do grupo II e que essas bactrias no possuam a
hemoprotena P-422 reativa com CO (Keister & Marsh, 1990).
Diferenas impoliantes foram encontradas na interao das bactrias com alguns gentipos de
soja. Foi relatado que a restrio da nodulao (proliferao do crtex sem formao de ndulos) pelo
gene dominante Rj 4' presente na cultivar HiU, ocorre pela inoculao com a grande maioria das estir-
pes do grupo lI, mas no com as estirpes do grupo I (Devineet aI., 1990; Kuykendall et aI., 1992).
Recentemente, porm, Sadowsky & Cregan (1992) observaram que essa restrio poderia ser estendi-
da a algumas estirpes do grupo I. Tambm foi constatado por Devine et aI. (1983) que as estirpes do
grupo II nodulavam soja "no-nodulante", que possui o alelo ':il,.jl e tambm iniciavam a nodulao
em amendoim (Arachis hypogaea L.), alm de induzirem clorose pela produo de rizobiotoxina. A
nodulao da soja com o alelo '.']/1
1
tambm ocorreu com algumas estirpes do gentipo II utilizadas
nos estudos de Rumjanek et a!. (1993a), mas no foi confirmada plenamente por La Favre & Eaglesham
(1986a).
33
Todas essas diferenas encontradas entre os dois gentipos, resumidas na Tabela 2.6, levaram
Kuykendall et aI. (1992) a sugerirem, recentemente, a subdiviso em duas espcies: B. japonicum,
com as estirpes do gentipo I, e B. elkanii, que incluiria as estirpes do gentipo TI (Tabela 2.3).
Para os estudos brasileiros, resta a deciso de quais parmetros poderiam ser mais facilmente
empregados para o enquadramento das estirpes nas duas espcies. Atravs de uma anlise dos parmetros
obtidos em diversos trabalhos, da repetibilidade e consistncia dos resultados entre autores e das
condies de muitos laboratrios brasileiros, podem ser recomendadas, hoje, as anlises de composi-
o dos polissacardeos extra-celulares, resistncia intrnseca a nveis elevados de antibiticos, sntese
de rizobiotoxina e cido indol actico in vivo ou in vitro, presena da hidrogenase pela hibridizao
com os genes hup ou pelo fentipo Hup, alm da hibridizao especfica com algumas seqncias
genticas, como o nijDK, nijE, RS
s
e 16S rRNA (Stanley et aI., 1985; Kuykendall et a!., 1988;
Minamisawa, 1989, 1990; Minamisawa & Fukai, 1991; Minamisawa et aI., 1992; Rumjanek et aI.,
1993b; Boddey & Hungria, 1994a). Para a identificao inicial de diversos isolados, porm, deve-se
considerar a sugesto de Minamisawa et aI. (1992), da anlise de cido indol actico in vitro, por ser
uma anlise fcil, envolvendo custos baixos e que apresenta alta correlao com a diviso em gentipos
ou espcies.
2.8.2. Diviso das estirpes "brasileiras" em B. japonicum e B. elkanii
Embora os estudos mostrando diferenas entre estirpes de B. japonicum tenham iniciado nos
Estados Unidos na dcada de 80, anlises semelhantes no foram realizadas com as estirpes "brasilei-
ras", isto , estirpes que foram ou so utilizadas em estudos e inoculantes no Brasil.
Recentemente, o uso de apenas dez oligonucleotdeos curtos pela anlise de RAPD (random
amplified polymorphic DNA) foi capaz de diferenciar algumas estirpes brasileiras (Lunge, 1993),
embora nenhuma correlao com a diviso em gentipos ou espcies tenha sido feita.
A anlise de alguns parmetros, como assimilao da amnia pela GSin vitro e hibridizao
com a seqncia 16S rRNA nas estirpes SEMIA 5019 e SEMIA 587, recomendadas comercialmente,
mostrou que ambas apresentam caractersticas de B. elkanii (Rumjanek et aI., 1993a,b)
Em outro estudo, 32 estirpes "brasileiras" de Bradyrhizobium e oito estirpes-padro america-
nas dos gentipos I, TI e misto foram analisadas para diversos parmetros in vitro, como morfologia
das colnias, reaes sorolgicas, resistncia intrnseca a antibiticos, sntese de cido indol actico,
expresso da hidrogenase e parmetros in vivo, como produo de rizobiotoxina e restrio nodulao
pelos genes Rj4 e '1/1
1
da soja. Um fenograma obtido com esses parmetros mostrou que a SEMIA
586 e a SEMIA 5080 so as nicas estirpes "brasileiras" que pertencem ao gentipo I (B. japonicuin)
e que a maioria das estirpes utilizadas em inoculantes, ou em estudos conduzidos no Brasil, pertence
ao gentipo TI (B. elkanii) (Boddey & Hungria, 1994a) (Figura 2.9).
Diversos isolados das regies do Cerrado pertencentes ao sorogrupo SEMIA 566, porm, fica-
ram em uma posio intennediria entre as duas espcies. As principais diferenas detectadas nesse
grupo misto foram a sntese de nveis intermedirios de cido indol actico e a ausncia de sintomas
graves de clorose provocados pela rizobiotoxina (Boddey & Hungria, 1994a). Essas estirpes esto
sendo analisadas, agora, com diversos oligonucleotdeos pela tcnica de PCR e os resultados prelimi-
nares confirmam o fenograma obtido.
Tabela 2.6. Algumas diferenas encontradas entre as espcies Bradyrhizobium japonicum e Bradyrhizobium elkanii.
Caracterstica B. japonicum
Morfologia das colnias sem colnias com bordas
irregulares e planas
Composio dos cidos graxos 1,3% 16:1 cis 9, 3,6% 16:1 C,
8,8%, 16:0, 1,2% 19: 1
ciclopropano e 81,2% 18:1
Resistncia a nveis elevados de antibiticos no
(l1g!rnl)
Composio dos polissacardeos eira-celulares glucose, manose, galactose,
4-0-metil-galactose,
Sntese de rizobiotoxina
Sntese de cido indol actico in vitro em meio,
com ou sem triptofano
Atividade da dinitrogenase in vitro
Assimilao do N in vitro
Gentipo hup
Fentipo Hup
Presena, em simbiose, do citotromo aa3
Nodula soja com o alelo Ri4
Nodula soja com o par de alelos ri{i
1
Nodula amendoim
Eficincia de fixao do N
2
Competitividade com G. max
Competitividade com G. soia e
Macroptilium atropurpureum
cido galacturnico'
no
no
no
isoenzima GSII
sim
sim
no
sim
no
no
maior
maior
menor
B. elkanii Referncia
aparecem colnias com bordas Fuhrmann (1990)
irregulares e planas
0,5% 16:1C, 11,1% 16:0, 0,8% 17:0 Kuykendall et alo (1988)
ciclopropano, 24,7% 19:0
ciclopropano e 62,3% 18:1
rifampicina (500), tetraciclina (100), Kuykendall et alo (1988)
estreptomicina (250), cloranfenicol (500),
eritrornicina (250), carbenicilina (500),
cido nalidxico (50)
predomnio de ramnose, cido 4-0- Huber et alo (1984)
metil-glucurnico
sim
sim
sim
isoenzima GSI
no
no
sim
no
sim
sim
menor
menor
maior
Minamisawa (1989)
Minamisawa & Fukai (1991),
Minamisawa et alo (1992)
Huber et alo (1984)
Rurnjanek et aI. (1993a)
Minamisawa (1990)
Minamisawa(1989)
Keister & Marsh (1990)
Devine et alo (1990)
Devine et al; (1983)
Devine et alo (1983)
Fuhrmann (1990), Teaney &
Fuhrmann (1992), Vasilas &
Fuhrmann (1993), Boddey &
Hungria (1994b)
Minamisawa et alo (1993), Boddey
& Hungria (1994b)
Minamisawa et alo (1993)
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Figura 2.9. Fenograma de 40 estirpes de BradyrhizobiulIl que nodulam a soja, obtido pelas matrizes de similaridade pelo
mtodo UPGMA (unweight pair-group with arithmetic mean), considerando diversos parmetros morfolgicos,
fisiolgicos e bioqumicos. Segundo Boddey & Hungria (l994a).
36
2.9. Eficincia e Capacidade Competitiva das Estirpes
2.9.1. Parmetros que afetam a eficincia e competitividade
Conforme j mencionado, devido ao custo energtico elevado do processo de fixao do N
2
,
estirpes mais eficientes energeticamente devem ser procuradas. Foi mencionado, ainda, que os princi-
pais parmetros que vm sendo procurados so as estirpes com maior atividade da hidrogenase, da
PEP carboxilase e com maior sntese de uredos. Na Tabela 2.7, alguns resultados encontrados em
estirpes isognicas Hup+ e Hup- confirmam que a presena da hidrogenase e o maior transporte de
uredos permitiram taxas mais elevadas de fixao do N
2
e aproveitamento desse N, com teores mais
elevados de N total, maior ndice de colheita para o N e menor perda de N nas folhas senescidas.
Sistemas simbiticos com maior atividade da glutamina sintetase (Hungria et aI., 1991; Pacovsky &
Hungria, 1990) e da PEP carboxilase (Hungria, 1993) nos ndulos tambm apresentaram maior efici-
ncia de fixao do N
2
.
Tabela 2.7. Efeito de mutantes isognicas Hup (PJ 17-1 e PJ 17) de B. japonicum em diversos par-
metros relacionados com a eficincia da fixao do N
2
em plantas de soja cv. Santa Rosa*.
Dias Aps a
Emergncia
48
(florescimento)
70
(enchimento
dos gros)
Parmetros Analisados
ndulos secos (mg.pl-I)
atividade de reduo do
acetileno (flmol C
2
H
4
.pl-Ih-
l
)
eficincia relativa da
dinitro genase
eficincia dos ndulos
(mg N fixado.g-1de nduio)
N total transportado no xilema
(flg N.pl-Imin-
I
)
%N-uredo na seiva do xilema
N total das plantas (folha+caule
+raiz) (mg N.pl-l)
N total (folha+caule+raiz)
(mg N.pl-I)
N total das vagens (mg N.pl-I)
N total nas folhas senescidas
(mg N.pl-I)
ndice de colheita para o N
[N nas vagens.(N total nas plantas)-I]
Hup-
795 a
103,7 a
0,78 b
205 b
1,91 b
79,36 b
181,2 b
161,1 a
113,5 b
11,6 a
0,40 b
Hup+
841 a
117,5 a
1,00 a
238 a
2,34 a
88,80 a
218,5 a
168,3 a
144,4 a
9,5b
0,45 a
* Experimento conduzido em vasos de Leonard, esterilizados, contendo areia e vemliculita. Os dados representam mdias de cinco repeties. Para
cada parmetro, valores seguidos pela mesma letra no diferiram estatisticamente pelo teste de Tukey (5%). Segundo Hungria et a!. (1989).
37
Em relao aos estudos de ecologia microbiana interessante salientar que, embora vrios
mtodos tenham sido usados para caracterizar estirpes do solo, como sorologia (Fuhrmann, 1990;
Sawada et aI., 1990), mobilidade eletrofortica de protenas celulares (Noel & Brill, 1980; Kamicker
& Brill, 1986), resistncia intrnseca a antibiticos (Scotti et al., 1982; Sawada et aI., 1990), resposta
a bacteriofagos (Kowalski et aI., 1974), entre outros, raramente h menes sobre a relao entre esses
parmetros e a eficincia das estirpes que foram caracterizadas.
Recentemente, alguns trabalhos procuraram relacionar a eficincia das estirpes com as espci-
es B. japonicum e B. elkanii. Minamisawa (1989) classificou as estirpes do gentipo I como eficientes
e as do gentipo II como ineficientes, baseado principalmente na produo de rizobiotoxina e ausn-
cia da hidrogenase. H, ainda, indicaes de que as estirpes do gentipo II apresentariam inferioridade
simbitica (Fuhrmann, 1990),' com menor matria de ndulos e da parte area secas, menor fixao de
N
2
e menores concentraes de clorofila e protena nas folhas (Teaney & Fuhrmann, 1992; Vasilas &
Fuhrmann, 1993). Recentemente, Boddey & Hungria (1994b) tambm observaram que, sob condi-
es axnicas (isto , na ausncia de microrganismos estranhos), as estirpes classificadas na espcie B.
japonicul11 (gentipo I) apresentaram maior precocidade de fixao do N
2
e taxas mais elevadas de
fixao de N
2
no pr-florescimento do que as estirpes da espcie B. elkanii (Tabela 2.8).
Em relao competitividade, embora muitas vezes seja possvel obter estirpes mais eficien-
tes, atravs de seleo ou de modificaes (Maier & Brill, 1978; Albrecht et aI., 1979;
Zablotowitz et aI., 1980; Hanus et aI., 1981; Williams& Phillips, 1983; Peres et aI., 1984; Kaneshiro
& Kwolek, 1985; Maier & Graham, 1990), o estabelecimento dessas bactrias no campo extrema-
mente dificil, devido elevada capacidade competitiva das estirpes nativas ou naturalizadas do solo
(Ham et aI., 1971; Boonkerd et aI., 1978; Ham, 1980; Triplett, 1990a).
H trabalhos, j da dcada de 20, mostrando que as estirpes nativas do solo nem sempre eram
efetivas, tornando necessrio um processo de seleo para aumentar a produtividade pela inoculao
(Baldwin & Fred, 1929). Tambm so antigos os relatos de que o sucesso da inoculao dependia da
capacidade das estirpes inoculadas de competir com as estirpes infectivas mas ineficazes do solo
(Nicol & Thornton, 1941). A competitividade pode ser definida como a relao entre a proporo do
nmero de bactrias de uma determinada estirpe no inculo e a proporo de ndulos que essa estirpe
consegue ocupar nas razes da planta hospedeira. Para competir com as estirpes naturalizadas ou nati-
vas do solo, a bactria introduzida deve apresentar caractersticas genticas ou fisiolgicas que permi-
tam o seu favorecimento ou, ento, uma vantagem numrica.
Diversos laboratrios tm concentrado seus esforos na identificao dos fatores que influen-
ciam a capacidade competitiva das bactrias. Alguns desses fatores incluem a mobilidade e quimiotaxia
(Mellor et aI., 1987; Caetano-Anolls et aI., 1988a,b; Liu et aI., 1989; Wadisirisuk et aI., 1989; Catlow
et aI., 1990a,b; Thies et al., 1991; Zdor & Pueppke, 1991), polissacardeos da superficie celular (Bhagwat
et aI., 1991; Zdor & Pueppke, 1991), produo de bacteriocina (Triplett, 1990b), taxa de infeco
(Hahn & Hennecke, 1988; McDermott & Graham, 1990), capacidade de responder a diversos substratos
(Bottomley et aI., 1990), taxa de crescimento em substratos de solos (Viteri & Sclunidt, 1987), efici-
ncia da estirpe em formar ndulos (McDermott & Graham, 1990) e possibilidade de realizar manipu-
laes genticas (Triplett, 1990a). As respostas, porm, so variadas e pouco se sabe sobre as caracte-
rsticas genticas que determinam a capacidade competitiva das estirpes (Bhagwat & Keister, 1992).
38
Enquanto diversos laboratrios do mundo procuram descobrir as bases genticas responsveis pela
maior competitividade, uma estratgia simples pode ser a da seleo para maior atividade de fixao
do N
2
e para nodulao precoce. Isso porque foram obtidos diversos resultados mostrando que a sele-
o para maior atividade de fixao (Oliveira & Graham, 1990) e para nodulao precoce (Handelsman
et aI., 1984; Stephens & Cooper, 1988; Oliveira and Graham, 1990) podem conduzir, simultaneamen-
te, seleo para maior habilidade competitiva.
Para entender melhor os mecanismos de sobrevivncia e competitividade, tambm necess-
rio um bom entendimento da ecologia dessas bactrias no solo e, no Brasil, poucos estudos tm sido
conduzidos nesse sentido. Alguns aspectos importantes da ecologia microbiana foram recentemente
revisados (Barnet, 1991; Giller & Wilson, 1991; BottomIey, 1992) e devem ser considerados em
estudos futuros.
Em relao s duas espcies de Bradyrhizobium, em estudos conduzidos em substrato estril
por Minamisawa et aI. (1993) as estirpes pertencentes ao gentipo I foram mais competitivas do que
as estirpes do gentipo 11 em diversas cultivares de G. max, exceto a cultivar Peking, enquanto que as
estirpes do gentipo 11 apresentaram maior competitividade em Glycine soja e Macroptiliiml
atropwpureum. Tambm em substrato estril, Boddey & Hungria (1994b) observaram que as estirpes
de B. japonicum foram mais competitivas do que as de B. elkanii, mas que as estirpes classificadas em
um gentipo misto foram mais competitivas do que as duas espcies (Tabela 2.8).
J em condies no estreis, foi sugerido que, embora a sntese de rizobiotoxina
para a menor eficincia das estirpes, talvez essa toxina auxilie na sobrevivncia das estirpes no solo,
ajudando-as na competio com outros microrganismos (Minamisawa, 1990). Do mesmo modo, as
estirpes Hup-, embora menos eficientes, parecem constituir a maioria dos isolados e, nos levantamen-
tos realizados, representaram de 75% a 81 % dos isolados do solo (Carter et aI., 1978; Brewin, 1984),
o que tambm poderia indicar alguma vantagem em termos de competitividade.
Todos esses estudos sugerem que ainda no h nenhum parmetro conclusivo que permita a
agilizao do processo de seleo de estirpes mais eficientes e competitivas para a soja e que os
mtodos tradicionais, de avaliao da quantidade de N
2
fixado e ocupao dos ndulos, ainda so os
mais confiveis.
2.9.2. Seleo de estirpes mais eficientes e competitivas no Brasil
Embora a seleo de estirpes mais eficientes e competitivas para a soja venha sendo feita
desde a introduo dessa cultura no Brasil (Freire, 1982), trabalhos atuais mostram que ainda existe
um grande potencial para incrementar os nveis de produtividade via fixao biolgica do N
2
(Scotti et
aI., 1981; Peres et aI., 1984; Neves et aI., 1985; Vargas et aI., 1992a).
Com a introduo da soja no Brasil, inicialmente foram utilizados inoculantes americanos, que
muitas vezes no se mostraram eficientes. Foi ento realizado o isolamento da estirpe "adaptada"
SEMIA 566, em 1966, de uma rea que havia recebido inoculante americano fabricado pela firma
Dixie Inoc. Essa estirpe passou, ento, a ser recomendada comercialmente no Brasil at 1978 com
grande sucesso (1. R. 1. Freire, comunicao pessoal).
Tabela 2.8. Valores mdios de trs repeties do nmero (NN, nmero. planta-I) e matria (MNS, dos ndulos secos e N
total (NTPA, mg N.planta-
l
) acumulado na parte area, aos 28 dias aps o plantio (DAP), MNS, NTPA e eficincia dos
ndulos (EN, mg N.mg de ndulo-I), no pr-florescimento (38 DAP), e capacidade competitiva (Compet., porcentagemde
ocupao dos ndulos quando inoculadas na proporo de 1: 1 contra a SEMIA 5019) para as estirpes-padro deBradyrhizobium
pertencentes ao gentipo I (SEMIA 5032, USDA 122, PJ 17-1, SEMIA 5071), gentipo misto (SEMIA 5051) e gentipo II
(USDA 31, USDA 94 e USDA 76), quando inoculadas em soja, cultivar BR-16 (Boddey & Hungria, 1994b).
Gentipo Incio da Nodulao* Pr-Florescimento *
NN MNS NTPA MNS NTPA EN Compet.
GTI 100,75 b 218,50 a 63,73 a 299,34 a 89,38 a 0,290 a 80,56 b
GT misto 99,00 b 141,00 c 36,00 b 294,00 a 74,15 a 0,252 a 88,89 a
GTII 128,00 a 181,00 b 44,10 b 331,78a 52,26 b 0,174 b 71,43 c
* Valores seguidos pela mesma letra na mesma coluna no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (5%).
w
\O
40
Na dcada de 70 foram conduzidos alguns estudos procurando selecionar estirpes mais efici-
entes para a soja e relacionar parmetros que permitissem a seleo in vitro. Um dos trabalhos pionei-
ros foi conduzido por Dobereiner et aI. (1970), que observaram que as estirpes "excepcionais" tinham
seu crescimento inibido em meio enriquecido com asparagina. Isso, porm, no foi confirmado poste-
riormente (Boddey & Hungria, 1994a; M.C.P. Neves, comunicao pessoal). Dentre as estirpes testa-
das por Dobereiner et aI. (1970), estava. a SEMIA 586 (=CB 1809), que em 1968 era recomendada
para a Austrlia pelo Commonwelth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO) e clas-
sificada como excepcional, tendo sido enviada para o Brasil pelo Dr. D. O. Norris em 1966 (Dobereiner
et aI., 1970). Nessa mesma poca, o teor de leghemoglobina nos ndulos tambm foi sugerido como
um parmetro diferencial entre as estirpes de eficincia "normal" e "excepcional" em soja (pedrosa et
aI., 1970). Outros estudos dessa poca procuraram rizbios adaptados s condies e solos brasileiros
(Lopes et aI., 1976a,b).
Ainda na dcada de 70, os rizobilogos tambm tiveram de solucionar o desafio de estabelecer
estirpes em solos de Cerrado recm.abertos para a cultl,lra da soja. O insucesso da inoculao nesses
solos levou a estudos que determinaram que a adubao e a calagem resultavam em um ambiente
favorvel multiplicao de actinomicetos produtores de antibiticos (Coelho & Drozdowicz, 1978).
Foi ento selecionada a "super estirpe" SEMI A 5019 (=29w) (Peres & Vidor, 1980), que conseguia se
estabelecer nesses solos, constatando-se que a sobrevivncia dos rizbios inoculados dependia da
resistncia a antibiticos, particularmente a estreptomicina (Scotti et aI., 1981, 1982). Hoje, porm,
acredita-se que as principais causas para aquele insucesso seriam a especificidade hospedeira da vari-
edade IAC-2, que foi recomendada na poca de desbravamento dessas reas (Peres & Vidor, 1980;
Vargas & Suhet, 1980a), e o uso de baixas doses de inoculante, que no era de boa qualidade (Vargas
& Suhet, 1980a; Peres et aI., 1989; Vargas et aI., 1992b).
Trabalhos conduzidos em casa de vegetao e no campo, no final da dcada de 70 (Peres &
Vidor, 1980; Vargas & Suhet, 1980a), levaram recomendao nacional das estirpes SEMIA 5019 e
SEMIA 587 para a produo de inoculantes. Uma das principais vantagens dessas estirpes era a capa-
cidade de formar uma simbiose efetiva com a cultivar IAC-2, que apresentava elevada especificidade
hospedeira.
Os trabalhos de seleo de estirpes continuaram e, no Centro de Pesquisa AgrOpecuria do
Cerrado (CPAC), da EMBRAP A, os estudos tomaram maior impulso pela utilizao do mtodo de
avaliao da atividade de ndulos individuais, pela tcnica de cromatografia gasosa (Peres et a1.,
1984), para a seleo de estirpes mais eficientes a partir de populaes estabelecidas em solos sob
cultivo de soja. Os estudos se concentraram em populaes de dois sorogmpos, o da SEMIA 566, que
uma estirpe muito competitiva e foi recomendada comercialmente de 1966 a 1978, se estabelecendo
em grande parte dos solos cultivados e o da SEMIA 586, que muito eficiente (Dobereiner et aI.,
1970; Neves et aI., 1985), mas apresenta baixa capacidade competitiva, alm de formar poucos ndu-
los com a cultivar IAC-2 (Peres, 1979).
Aps vrios anos de pesquisa, foram obtidas duas variantes das estirpes SEMIA 566 e SEMIA
586 que, alm de permitirem ganhos de produo, representam uma fonte de material gentico pro-
missora para entender os mecanismos ligados eficincia e competitividade de B. japoniClfl11. A estir-
pe SEMIA 5080 (=CP AC 7) foi obtida atravs de uma sub cultura da SEMIA 586, mas caracterizada
41
por apresentar boa capacidade competitiva, alm de maior nodulao da cultivar IAC-2 (Vargas et aI.,
1992a; Nishi & Hungria, 1993). A estirpe SEMIA 5079 (=CPAC 15) foi selecionada pelo mtodo de
Peres et aI. (1984) de um solo na regio do Distrito Federal e pertence ao mesmo sorogrupo da SEMIA
566, embora se caracterize por uma maior eficincia de fixao do N
2
(Vargas et aI. 1992a,b).
Em relao ao par de estirpes SEMIA 566 e SEMIA 5079, foi observado que esta ltima
diferia da parental no fentipo Hai, ou seja, maior nmero de plos radiculares (Nishi & Hungria,
1993, 1994), o que poderia estar ligado maior capacidade competitiva da estirpe (Tabela 2.9). Atra-
vs de estudos com diversos isolados do sorogrupo SEMIA 566 adaptados ao Cerrado, foi sugerido,
tambm, que a competitividade das estirpes dependeria da sua habilidade de alterar as protenas da
membrana em resposta ao estmulo das razes (Scotti et aI., 1993).
Tabela 2.9. Efeito da inoculao da cultivar de soja BR-16 com a estirpe SEMIA 566 e a mutante
natural SEMIA 5079 na deformao dos plos radiculares (Had, hair deformation) e
aumento no nmero dos plos radiculares (Hai, hair induction), aos 15 dias aps a
inoculao. Em condies estreis foram tambm avaliados, aos 30 dias aps a emer-
gncia, o nmero e eficincia (por grama de ndulos frescos, gNF) dos ndulos e a
porcentagem de ndulos ocupados por essas estirpes, quando inoculadas na proporo
1:1 com a SEMIA 5019*.
Had Hai N ndulos Eficincia Ocupao
I
dos ndulos dos ndulos
Estirpe Comprimento Espessura
()l) ()l)
(na. campo-I) (no.planta-
I
) (mgN.g-INF)
(%)
566 62,50 b 23,75 a 50,25 b 49,38 a 28,76 b 52,10 b
5079 50,00 b 18,75 a > 100,00 a 34,75 a 52,17 a 87,50 a
Controle 205,00 a 10,00 b 23,75 c 0,00 0,00 0,00
CV(%) 17,18 26,08 12,77 45,08 20,55 19,55
* Mdias de quatro repeties. Valores seguidos pela mesma letra no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (5%). Na anlise estatstica dos
trs ltimos panimetros no Juram considerados os valores das plantas no inoculadas. Segundo Nishi & Hungria (1993, 1994).
As estirpes SEMIA 5079 e SEMIA 5080 tm sido testadas h mais de sete anos nos solos do
cerrado, onde promoveram ganhos de rendimento de at 12,5 sacas de soja.ha-
I
(750 kg.ha-
I
), em
solos de primeiro cultivo, em relao ao tratamento sem inoculao, enquanto que as estirpes reco-
mendadas comercialmente, SEMIA 587 e SEMIA 5019, promoveram aumentos mdios de 7 sacas.ha-
r (420 kg.ha-
I
) (Vargas et aI., 1992a). A partir de 1992, essas duas estirpes passaram a ser recomen-
dadas para utilizao nos inoculantes comerciais brasileiros, mas investigaes mais detalhadas sobre
essas bactrias precisam ser conduzidas.
42
Outras "sub-estirpes" mais competitivas do que aparentaI SEMIA 586 tm sido obtidas aps
a adaptao em solos de Cerrado corrigido com calagem e inoculao, repetida por vrios ciclos de
soja, e promoveram um pequeno incremento na nodulao no primeiro ano de cultivo (Neves et aI.,
1992), o mesmo ocorrendo com sub-estirpes do sorogrupo SEMIA 566 (Scotti et aI., 1993). Algumas
sub-estirpes do sorogrupo SEMIA 566, isoladas pela EMBRAP A-CP AC, apresentaram alta eficincia
e capacidade competitiva (Figura 2.10), indicando que a seleo de estirpes "adaptadas" pode resultar
em material gentico promissor para a soja .
NTPA
100
O % Ocupao
80-
60-
40
20-
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Figura 2.10. N total acumulado na parte area (mg N.planta-
1
) de soja,
cultivar BR-16, inoculada com a estirpe SEMIA 566 e vrios
isolados da regio do Cerrado (obtidos na EMBRAP A-
CP AC) pertencentes ao mesmo sorogrupo. Os dados repre-
sentam mdias de trs repeties. Segundo Boddey & Hungria
(1 994b).
Hoje, a recomendao das melhores estirpes para a cultura da soja feita a cada dois anos,
durante a "Reunio de Laboratrios para Recomendao de Estirpes de Rhizobium e Bradyrhizobium"
(RELARE), que ocorre por iniciativa de pesquisadores da rea de microbiologia do solo e integrantes
das indstrias produtoras de inoculantes. So apresentados, nessa reunio, os resultados de pesquisa
relativos s estirpes de Rhizobium e Bradyrhizobium, em diversas leguminosas e diversas localidades
43
do Brasil, geralmente com os mesmos tratamentos e delineamento experimental para cada espcie.
Com base nesses resultados, procede-se recomendao nacional das estirpes e a ata da reunio segue
para o Ministrio da Agricultura. As indstrias de inoculantes passam a receber essas estirpes e se
comprometem a trabalhar somente com elas. A VI RELARE foi realizada em 1994, tendo sido decidi-
do que as estirpes de Bradyrhizobium, recomendadas comercialmente para a cultura da soja, so a
SEMIA 587, SEMIA 5019, SEMIA 5079 e SEMIA 5080. Na Tabela 2.10 esto listadas as principais
caractersticas desejveis em estirpes de Bradyrhizobium que devem ser consideradas nos programas
de seleo.
Tabela 2.10. Caractersticas das estirpes de rizbio que devem ser consideradas durante os proces-
sos de seleo para a recomendao em inoculantes comerciais.
1- Capacidade de formar ndulos eficientes, com resultados comprovando o desempenho a campo.
2- Habilidade competitiva contra as estirpes naturalizadas do solo.
3- Tolerncia aos defensivos agrcolas recomendados, temperaturas elevadas, deficincias hdricas,
etc
4- Amplo espectro de nodulao frente s cultivares recomendadas.
5- Capacidade de sobreviver no solo durante o ciclo da cultura, para permitir a formao de novos
ndulos.
6- Baixa capacidade de sobrevivncia no solo aps o trmino da cultura, pois se a pesquisa poste-
riormente encontrar estirpes mais eficientes, essas podero ser introduzidas nesses solos.
7- Boas condies de crescimento a nvel industrial, apresentando baixas exigncias nutricionais e
ausncia de caractersticas que possam dificultar a produo de inoculantes.
8- Boa sobrevivncia durante a distribuio e uso pelos agricultores.
2.10. Gentipos de Soja
2.10.1. Gentipos mais eficientes
Durante muitos anos, grande ateno foi dada ao estudo do microssimbionte, pela maior faci-
lidade e rapidez de manipulao e porque as bactrias carregam os genes responsveis pela dinitrogenase.
No caso de simbioses mais problemticas, como a do feijo, h programas de melhoramento para
obteno dos gentipos para a fixao do N
2
e teste dos mesmos em rede nacional. No caso da soja,
porm, embora os programas brasileiros de melhoramento tenham sido tradicionalmente conduzidos
na ausncia de adubos nitrogenados, poucas avaliaes do potencial de fixao do N
2
esto sendo
realizadas.
As caractersticas do genoma da soja, com 1 bilho de pares de base por genoma haplide, 10
cromossomos, regies genmicas duplicadas, 35% de DNA altamente repetitivo, centenas de
marcadores genticos, morfolgicos e enzimticos (Gresshoff, 1993) do uma indicao do potencial
de melhoramento dessa espcie para diversos fatores, incluindo a simbiose. Com a manipulao desse
44
genoma, j foram conseguidos diversos mutantes, como os no-nodulantes (Nod-), mutantes com
menor nodulao, supernodulantes, hipernodulantes e os que nodulam mas no fixam nitrognio
(Nod+Pix-).
Entretanto, j em 1946, Nutman salientava a importncia da planta hospedeira no sucesso da
fixao biolgica do N
2
(Dobereiner & Arruda, 1967) e algumas revises recentes salientam essa
importncia (phillips, 1991; Phillips & Teuber, 1992; Gresshoff, 1993). No Brasil, diferenas entre
variedades de soja, na eficincia da simbiose, foram relatadas desde os primeiros estudos conduzidos
(Dobereiner & Arruda, 1967).
Mais recentemente, variaes entre gentipos brasileiros de soja em resposta simbiose foram
relatadas por Galli (1987) (Figura 2.11). Uma anlise de 153 gentipos recomendados comercialmen-
te e inoculados com a SEMIA 5019 constatou que a mdia do grupo mais eficiente superou em mais
de 100% a mdia do grupo menos eficiente (Bohrer et aI., 1994) (Tabela 2.11). Entre os gentipos
mais eficientes, esto algumas das parentais das novas cultivares, como a Davis e a Santa Rosa e, no
grupo das menos eficientes, esto algumas cultivares recentemente lanadas, como a BR-28, cujos
pais so a Santa Rosa e a BR-7811202. Isso mostra que, embora o melhoramento esteja sendo condu-
zindo na ausncia de adubao nitrogenada, muitas vezes est ocorrendo um declnio na eficincia da
simbiose, provavelmente porque vrios desses ensaios esto sendo conduzidos em solos ricos em N, o
que seria uma presso contra a fixao biolgica.
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ANALISE DISCRIMINANTE
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..
Gentipos
Figura 2.11. Discriminao grfica dos 22 tratamentos correspondentes aos gentipos tardios de soja
submetidos anlise multidimensional (variveis dependentes: nmero e massa de n-
dulos, atividade da nitrogenase e produtividade). Segundo Galli (1987).
45
Tabela 2.11. Matria dos ndulos secos (MNS) e N total da parte area (NTPA) das 20 cultivares de
soja com melhor e pior desempenho quando inoculadas com a estirpe SEMIA 5019
(=29w). Coleta realizada cinco semanas aps o plantio, os dados representam mdias
de trs repeties. Segundo Bohrer & Hungria (1994).
Cultivar NTPA MNS Cultivar NTPA MNS
(mg N.pl-l) (mg.pl-l) (mgN.pl-l) (mg/pl)
- - - - - Melhores Desempenhos* - - - - - - -- Piores Desempenhos* - - - - -
IAC-9 76,13 a-d 281,6 abc BR-7 17,65 d-g 93,4 abc
IAC-8 66,58 a-f 283,4 abc Doko 31,88 a-g 148,4 abc
IAC-Foscarin 69,07 a-f 288,4 abc EMBRAPA 9 13,94 fg 70,0 c
FT-14 77,06 a-c 278,4 abc CAC-l 24,80 a-g 138,4 abc
Davis 68,45 a-g 243,4 abc OCEPAR 10 25,04 a-g 95,0 abc
Tiaraju 65,77 a-g 230,0 abc OCEPAR5 26,79 a-g 166,6 abc
Stuart 71,83 a-f 295,0 abc EMGOPA-309 17,00 e-g 100,0 abc
Santa Rosa 68,04a-g 310,0 a BR-15 29,07 a-g 156,6 abc
GO-BR-25 66,34 a-g 195,0 abc UFV-9 23,44 a.,.g 206,6 abc
FT-Bahia 66,21 a-g 276.6 abc Planalta 20,31 d-g 118,4 abc
FT-20 72,07 a-f 221,6 abc BR-28 14,48 fg 155,0 abc
BABR-31 67,71 a-g 283,4 abc CEP-20 23 .. 66 a-g 146,6 abc
Andrews 71,14 a-f 280,0 abc BR-35 18,34 c-g 95,0 abc
Bossier 68,87 a-f 273,4 abc FT -Canarana 23,25 a-g 166,6 abc
FT-Guara 66,06 a-g 243,4 abc UFV-I0 22,05 b-g 101,6 abc
Iva 79,55 ab 315,0 a Paranaba 31,64 a-g 195,0 abc
J-200 81,32a 298,4 ab EMGOPA313 23,63 a-g 151,6 abc
FT-6 74,24 a-d 280,0 abc Paranagoiana 9,76 g 80,0 bc
MS BR-18 67,23 a-g 275,0 abc BR-32 17,99 d-g 158,4 abc
EMBRAPA 1 68,04 a-g 255,0 abc Tropical 28,77 a-g 133,4 abc
--------------------------------------
Mdia do Grupo 70,58 270,35 22,17 133,83
--------------------------------------
CV (%) 32,89 28,52 32,89 28,52
* Valores seguidos pela mesma letra no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ( 5%). Anlise estatstica considerando um total de 153
cultivares que foram estudadas.
46
2.10.2. Solucionando o problema da competitividade atravs dos genes da planta hospedeira
A maior parte dos estudos de manipulao gentica da planta visando a fixao biolgica foi
conduzida nos Estados Unidos, onde o problema de competitividade com as estirpes nativas do solo
grande nas principais regies produtoras de soja. Os pesquisadores americanos observaram, ento,
que algumas plantas hospedeiras podem excluir ou conduzir nodulao ineficaz pelos sorogrupos
dominantes no solo.
J foram relatados quatro genes responsveis pela restrio nodulao na soja americana. O
gene recessivo 1]1' que resulta no fentipo de "no-nodulao" com todas as estirpes de B. japonicum,
foi inicialmente descrito como "no-aleIo" (Williams & Lynch, 1954) e, posteriormente, denominado
aleIo '.7
1
(Caldwell, 1966). No campo, os gentipos que carregam ':i/7
1
formam um ndulo a cada
1000 ou 1500 plantas e, em casa de vegetao sob condies estreis, formam ndulos ocasionais com
algumas estirpes (Clark, 1957; Devine & Weber, 1977; Devine, 1985b). Foi sugerido, ento, que
manipulaes de gentipos contendo 1]1 poderiam permitir a excluso das estirpes indgenas de B.
japoniclll17 menos eficientes, mas aceitando estirpes seIecionadas ou desenvolvidas especialmente
para nodular com esses gentipos (Devine & Weber,1977; Devine, 1985a, b).
O gene Rj2' encontrado nas cultivares Hardee e CNSS, provoca uma resposta ineficaz com B.
japonicum USDA 7, USDA 14 e USDA 122. Caldwell (1966) tambm relatou que Hardee produzia
uma nodulao ineficaz com 22 estirpes testadas do sorogmpo 3-23-44, que mais tarde foi designado
de sorogmpo c1 (Vest et al., 1973) e, posteriormente, como sorogmpo 6. Nas plantas com esses ndu-
los, h o desenvolvimento de proliferaes corticais ou ndulos mdimentares, em vez de ndulos
normais (Caldwell, 1966). Essas plantas, entretanto, nodulam normalmente com outras estirpes, tais
como a USDA 110 e USDA 142.
Quanto ao aleIo dominante Rj3' presente na cultivar Hardee, foi relatado que causa nodulao
ineficaz com a estirpe USDA 33, pertencente ao sorogmpo 31, embora isso no tenha sido confirmado
posteriormente. Ocorrem, tambm, proliferaes do crtex nas razes sem a formao de ndulos
(Vest, 1970; Vest et a1., 1973)
Em 1972, Vest & Caldwell (1972) identificaram um gene dominante na cultivar HiU, Rj 4'
cujas condies restrigem a nodulao pela estirpe USDA 61 (serogmpo 61). O geneRj4 est presente
nas cultivares Hill, Dunfield, Dare, Amsoy 71 e Tracy, que tambm apresentam nodulao ineficaz
com as estirpes USDA 61, USDA 62, USDA 83, USDA 94, USDA 238, USDA 259, USDA 260 e
USDA 340 (Vest & Caldwell, 1972; Vest et a1., 1973; Devine, 1976; Devine et a1., 1990). As plantas
carregando esse aleIo Rj4 nodulam normalmente com outras estirpes, como a USDA 110.
O uso de respostas de incompatibilidade pode permitir aos melhoristas de soja controlar a
especificidade hospedeira da simbiose com estirpes de B. japonicum geneticamente melhoradas (Devine
& Weber, 1977; Devine & Breithaupt, 1980). Isso muito importante, visto que dificil introduzir
estirpes melhoradas geneticamente em solos com populao j estabelecida. Geneticamente, o melho-
ramento parece ser facilitado pelo fato de que os genes '.1
1
, Rj2 e Rj4 so distintos em sua segregao
devendo, portanto, estar localizados em trs locus genticos diferentes. Conseqentemente, os
melhoristas podem construir gentipos de soja contendo uma ou todas as combinaes desse alelos
(Devine & O'Neill, 1989).
47
Outro trabalho foi conduzido por Weiser et aI. (1990), que avaliaram 382 gentipos de soja,
selecionando 12 que excluam, em diferentes graus, os sorogrupos relativamente ineficientes encon-
trados nos solos do regio sul dos Estados Unidos. Segundo esses autores, dois tipos de gentipos
poderiam ser conseguidos: cultivares com alta produtividade em simbiose com as estirpes nativas, ou
cultivares com altas produtividades que conseguiam excluir as estirpes ineficientes do solo.
No caso do Brasil, no foram descritos genes de restrio nodulao, embora tenha sido
relatado que um dos problemas de nodulao no Cerrado fosse a alta especificidade hospedeira da
IAC-2, restringindo parcialmente a nodulao a estirpes como a SEMIA 586 e a SEMIA 5039 (Tabe-
la 2.12, segundo Peres & Vidor, 1980). Restrio total nodulao pelos sorogrupos dominantes nos
solos brasileiros, SEMIA 566, SEMIA 587 e SEMIA 5019, no foi encontrada em nenhuma das 153
cultivares testadas por Bohrer & Hungria (dados no publicados).
Tabela 2.12. Matria de ndulos secos (mg.planta-
1
) de trs cultivares de soja em Latossolo Verme-
lho Escuro do Cerrado inoculadas com quatro estirpes de B. japoniclIl17. Segundo Peres
& Vidor (1980).
Estirpe Cultivar de Soja
Bragg Santa Rosa IAC-2
Testemunha s/inoc. 43 5 18
SEMIA 5039 168 154 28
SEMIA 586 151 167 24
965 152 117 112
SEMIA 5019 * 285 314 172
* A estirpe SEMIA 5019 (=29w) foi denominada de "super estirpe", por conseguir se estabelecer nesses solos j no primeiro ano de cultivo.
Pouca ateno tem sido dada atualmente, no Brasil, especificidade hospedeira, embora estu-
dos conduzidos, j em 1975, tenham mostrado que gentipos de soja poderiam ter preferncia por
determinados sorogrupos de estirpes (Tabela 2.13).
2.10.3. Mutantes tolerantes a teores elevados de N do solo
A fixao biolgica do N
2
pode ser retardada se o N residual do solo estiver disponivel em
nveis elevados (Harper, 1974), situao que se agrava se adubaes pesadas forem realizadas na
cultura que precede a soja. Alguns estudos foram realizados em culturas hidropnicas tentando seleci-
onar gentipos de soja e estirpes de B. japonicum que permitissem um aumento da fixao do N
2
na
presena de N0
3
- (Harper & Gibson, 1984; Gibson & Harper, 1985). Esses estudos concluram que a
manipulao do gentipo da planta seria mais fcil do que a manipulao do microssimbionte.
48
Tabela 2.13. Porcentagem de recuperao de quatro estirpes deB.japonicum de ndulos de 12 cul-
tivares de soja aps a aplicao de inoculante misto. * Segundo Freire (1977).
CultivaI' Ocupao dos Ndulos (%)
de
Soja 527 532c 566 587
Planalto 25 30 45
Bragg 37 33 30
Bossier 15 12 73
IAS-1 12 15 73
IAS-5 38 12 50
Santa Rosa 27 25 47
Prata 13 38 49
Davis 55 10 35
IAS-4 34 45 21
Hardee 37 9 54
Prola 39 26 3 66
Pampeira 29 5 66
--------------------------------------
Mdia 30 21 0,25 48
* Ensaio conduzido em Guaba, RS, 1975.
Alguns grupos de pesquisa iniciaram, ento, duas linhas de investigaes, visando tentar: 1-
obter gentipos que pudessem nodular e fixar N
2
na presena de N0
3
- (Betts & Herridge, 1987;
Herridge & Betts, 1988); e 2- obter mutantes que tolerassem a presena de N0
3
- (Carroll et aI.,
1985a,b; Gremaud & Harper, 1989; Akao & Kouchi, 1992). Carroll et aI. (l985a,b) selecionaram
mutantes da cultivar Bragg e passaram a denominar essas mutantes de nts (nitrate lolerant -ymbiont),
determinando tambm que o controle ocorria pela parte area. Gremaud & Happer (1989) obtiveram
mutantes da cultivar Williams e Akao & Kouchi (1992) e conseguiram mutantes da cultivar Enrei.
Embora essas mutantes sejam parcialmente tolerantes ao nitrato e apresentem, alm de maior
nodulao, maior atividade da reduo do C
2
H
2
na presena de nitrato (Carroll et aI., 1985a; Gremaud
& Harper, 1989), tem sido questionado se as mutantes realmente toleram o nitrato (Eskew et aI. 1989).
Muitas vezes, essas mutantes apresentam nmero de ndulos duas a quatro vezes superior ao da parental,
tanto na ausncia como na presena de N0
3
-, mas a biomassa produzida em condies de casa de
vegetao ou a campo pode ser menor (Carroll et aI., 1985a,b; Gremaud & Harper, 1989; Wu &
Harper, 1991). Mais detalhes de estudos recentes sobre o locus nts podem ser obtidos na reviso de
Gresshoff (1993).
49
2.10.4. Nodulao com estirpes de crescimento rpido
Desde 1982, quando foram isoladas algumas estirpes de crescimento rpido de solos e ndulos
de soja coletados na China (Keyser et a!., 1982), diversos estudos vm sendo conduzidos procurando
estudar a compatibilidade dessas estirpes com os gentipos de soja americanos (Devine 1984, 1985a).
De um modo geral, as linhagens norte americanas no nodulam com essas estirpes, enquanto que nas
linhagens de origem asitica (como as da Rssia, Coria, China, Japo, Tailndia, Vietn, Malsia,
Indonsia) a freqncia de nodulao efetiva varia de 38% a 85% (Devine, 1985a) .
. A nodulao da soja com estirpes de crescimento rpido pode auxiliar, no futuro, a solucionar
o problema de competitividade, visto que essas estirpes podem se estabelecer rapidamente nos solos.
Alm disso, as manipulaes genticas dessas estirps so mais fceis, pois a informao gentica
est localizada em plasmideos, mais acessveis do que os genes do cromossomo.
Trs estratgias tm sido sugeridas para habilitar a nodulao dessas cultivares com estirpes de
crescimento rpido. A primeira linha sugere manipulaes genticas do Rhizobiul17 que permitam a
nodulao a todas as cultivares melhoradas de soja (Chatterjee et a!., 1990). Uma segunda linha sugere
manipular as cultivares modernas, desde que a nodulaocom estirpes de crescimento rpido con-
trolada por um nico alelo dominante (Devine, 1984). Finalmente, possvel selecionar estirpes, como
a USDA 191, capazes de nodular e fixar N
2
com cultivares melhoradas e no melhoradas (Scholla &
Elkan, 1984; Lin et a!., 1987).
Em trabalhos conduzidos recentemente, porm, foi observado que um grande nmero de
gentipos de soja norte-americanos capaz de nodular com R.fredii (Balatti & Pueppke, 1992) e, em
uma avaliao de 80 cultivares brasileiras com trs estirpes de crescimento rpido, Chueire & Hungria
(1994) constataram ndulos eficientes em 66% dos gentipos. O potencial de fixao da soja com
essas estirpes merece ateno.
2.10.5. Cultival"es "promscuas"
Quando a soja cultivada pela primeira vez nas Amricas, Europa ou partes da frica, no
ocorre nodulao, pois as cultivares modernas, que vieram da China e foram melhoradas, principal-
mente, na Amrica do Norte, derivaram de uma base gentica estreita e so restritas em sua nodulao.
O mesmo aconteceu com as estirpes de Bradyrhizobiu711, que foram introduzidas nos Estados Unidos
vindas do Japo e tambm tiveram uma base gentica estreita.
Entretanto, em alguns pases em desenvolvimento, como na Nigria e outros pases da frica,
a disponibilidade e conservao dos inoculantes um fator limitante simbiose. Foram ento desen-
volvidos programas que identificaram linhagens de soja capazes de nodular com rizbio nativo. No
Brasil, porm, pensamento dos rizobiologistas que inoculantes de boa qualidade devam estar dispo-
nveis em qualquer local do pas. Para maiores detalhes sobre essas linhagens promscuas, consultar
reviso de Cattelan & Hungria (1994).
2.11. Ontogenia e Taxas de Fixao Biolgica do N
2
em Soja
Na soja nodulada, observa-se normalmente um perodo inicial de deficincia de N, que ocorre
devido falta de sincronizao entre o esgotamento das reservas de N dos cotildones e o inicio da
fixao e exportao do N
2
fixado pelos ndulos (Hildebrand et aL, 1981; Jones et a!., 1981; Sprent &
50
Thomas, 1984). Por isso, muitas vezes se observa um amarelecimento das plantas no incio do ciclo
vegetativo, por volta de sete a nove dias aps a emergncia, mas que logo superado se a simbiose for
eficiente. No caso do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), estudos conduzidos com diversas estirpes
mostraram que algumas delas conseguem estabelecer ndulos funcionais mais precocemente do que
outras, contribuindo para o aumento do perodo ativo de fixao do N
2
(Hungria & Thomas, 1987;
Barradas & Hungria, 1989; Barradas et aI., 1989); possvel que essa seleo tambm seja vivel para
a sOJa.
Em condies de campo, a fixao biolgica do N
2
pode iniciar j na segunda semana aps o
plantio. Vargas et aI. (1982a,b) observaram que os primeiros ndulos podem ser detectados aos cinco
dias aps a emergncia das plantas, aumentando em nmero ao redor dos 12 dias aps a emergncia.
Aps esse perodo inicial, a nodulao e a fixao do N
2
intensificam at o florescimento, havendo
ento a manuteno da atividade ou mesmo um incremento at a formao das vagens, quando inicia
a senescncia dos ndulos (Franco et aI., 1978; Carmen C. et aI., 1984). Na poca do florescimento,
uma planta de soja bem nodulada deve mostrar, no campo, entre 15 e 30 ndulos ou 100 mg a 200 mg
de matria de ndulos secos por planta (Vargas & Suhet, 1980a,b; Vargas et aI., 1982a; Cattelan &
Hungria, 1994). Muitas vezes, pode ocorrer uma populao secundria de ndulos aps o florescimento,
que contribuir para o fornecimento de N para as vagens (Franco et aI., 1978). A ontogenia da nodulao
e acmulo de N total em soja, cultivar IAC-2, pode ser observada na Figura 2.12.
Durante vrios anos, essa queda na atividade da dinitrogenase, aps o florescimento, era atri-
buda competio entre ndulos e vagens pelos fotossintatos da planta (revisado em Neves & Hungria,
1987). Hoje, outras hipteses, como o controle hormonal (Hungria & Neves, 1986; Neves & Hungria,
1987) ou fatores que controlam o suprimento de 02 na zona bacteroidal, afetando a disponibilidade de
ATP (Hartwig et a\., 1987; Vessey et a\., 1988; Layzell & Hunt, 1990; Layzell et aI., 1990) so consi-
derados mais importantes. Ainda h discusses sobre os fatores fisiolgicos e genticos que seriam
responsveis pelo incio da senescncia dos ndulos, que tambm inicia logo aps o florescimento,
justamente no perodo de maior demanda-de--Npelas plantas (Sutton, 1983; Neves & Hungria, 1987).
No caso do feijo, algumas estirpes de rizbio e algumas cultivares permitiram um prolongamento na
atividade dos ndulos (Hungria & Franco, 1988; Barradas et aI., 1989; Boddey & Hungria, 1990),
sendo provvel que tambm exista variabilidade entre estirpes de B. japonicum e cultivares de soja em
relao senescncia dos ndulos, o que ainda no foi investigado.
2.12. Avaliao da Fixao do Nitrognio
Segundo estimativas da FAO (1985),_ as taxas de fixao do N
2
na cultura da soja se situam
entre 60 kg a 168 kg de N.ha-
1
. H levantamentos com valores de 57 kg a 94 kg de N.ha-
1
(Burns &
Hardy, 1975), 40 kg a 206 kg de N.ha-
1
(Franco, 1978) e 26 kg a 188 kg de N.ha-
1
(Giller & Wilson,
1991). H relatos, tambm, de que o N proveniente da fixao biolgica contribuiria com 57% a 67%
do N total acumulado pela soja (Carmen C. et aI., 1984; Bergersen et a\., 1985). No Brasil, em estudos
realizados por Boddey et a\. (1984, 1990), as taxas de fixao encontradas para a soja foram de 109 kg
a 250 kg de N.ha-\ representando de 70% a 85% do N total acumulado pelas plantas.
Final de enchimento

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Idade das plantas (dias)
Figura 2.12. Nodulao e fixao de N
2
em diferentes estdios de desenvolvimento da soja IAC-2 em solo de primeiro
cultivo; onde cada ponto representa a mdia de quatro tratamentos com trs repeties, e as barras verticais
representam o erro da mdia calculado em cada ponto. Segundo Vargas et al.(1982a).
52
Diversos mtodos podem ser utilizados na avaliao da eficincia do processo de fixao bio-
lgica do N
2
e a escolha depender do tipo de estudo ou interesse considerado. Para o agricultor ou
extensionista, uma avali ao da nadulao a campo aos 10 a 15 dias aps a emergncia geralmente
recomendada. Nesse estdio, em solos com baixos teores de N, a soja bem nadulada deve apresentar
de quatro a oito ndulos Caso contrrio, um acompanhamento deve ser feito e, se aps uma semana
novos ndulos no tiverem sido observados e se as plantas apresentarem sintomas visuais de deficin-
cia de N, pode-se recomendar a apli cao de fertilizantes nitrogenados.
Estudos com 153 cultivares de soja mostraram que 90% da nadulao ocorre na regio da
coroa ou colo da raiz principal (Bohrer et ai., 1994). A ausncia de ndulos na coroa e o aparecimento
de ndulos nas razes secundrias, particularmente na parte inferior do sistema radicular. indica que a
nodulao ocorreu tardiamente As causas da inibio da nodulao primria incluem solos com teo-
res de N elevados. temperaturas elevadas, estresse hdrico, m qualidade do inoculante e falhas duran-
te a inoculao, como a exposio do inoculante a temperaturas elevadas
A nodulao com estirpes eficientes pode ser facilmente visualizada pela distribuio na co-
roa, tamanho de 2-3 mm e colorao interna rsea dos ndulos, relacionada presena de
leghemoglobina ativa (Figura 2.13) A colorao verde das plantas, no florescimento. tambm pode
ser um indicativo de boa eficincia da simbiose. Um parmetro importante, em termos econmicos,
o da produo de gros O incio da senescncia dos ndulos pode ser detectado pela mudana da
colorao interna dos ndulos, que muda de rsea para verde, pela degenerao da leghemoglobina
Normalmente a senescncia inicia entre o florescimento e o perodo de enchimento das vagens; se
ocorrer antes di sso. provavelmente. algum fator ambiental ou nutricional acelerou o processo
Figurn 2.13. Ndulos de soja mostrando colorao interna
rsea, devido leghemoglobina.
Nos trabalhoss de pesquisa, outros mtodos so utilizados. Para maiores detalhes, procurar
Sprent (1984). Boddey (1987). Giller & Wilson (1991) .
Em trabalhos pioneiros, conduzidos no Brasil, foi sugerida a avaliao da simbiose pela re-
gresso entre o peso dos ndulos e o N total das plantas, em uma equao representada por NF=hx,
53
onde o coeficiente de regresso b representava a eficincia do tecido nodular e x o peso dos ndulos
(Dobereiner, 1966; Dobereiner et aI., 1966, 1970). Na avaliao de estirpes, por exemplo, as combina-
es das bactrias classificadas como "normais" apresentaram "b" variando de 0,165 a 0,240, enquan-
to que os valores de "b" para as "excepcionais" ficavam entre 0,279 a 0,439 (Dobereiner et aI., 1970).
Durante muitos anos, o mtodo de reduo do acetileno foi usado intensivamelte, por ser
simples, sensvel e rpido (Hardy et aI., 1968, 1973). Esse mtodo baseado no princpio de que
muitos compostos contm a tripla ligao que pode ser reduzida pela dinitrogenase, e que o acetileno,
um gs de fcil manipulao e baixo custo, reduzido pela dinitrogenase, em uma reao terica de
3: 1. Posteriormente, conforme j foi discutido, essa tcnica foi corrigida para a porcentagem de el-
trons perdida pela evoluo do H
2
, sendo necessrio corrigir a proporo para 4: I (Schubert & Evans,
1976).
Hoje, porm, o uso da tcnica de reduo do acetileno no mais recomendado em estudos
envolvendo a simbiose com a soja ou outros sistemas simbiticos. Isso ocorreu aps a constatao por
Minchin et aI. (1983) de que a atividade da dinitrogenase em razes noduladas e ndulos destacados,
caa rapidamente na presena do acetileno, com a reduo simultnea na respirao. O declnio
causado pelo aumento da resistncia da barreira de difiJso de O
2
(Figura 2.4) devido ao acetileno. As
manipulaes da planta, necessrias tcnica de reduo do acetileno, como remoo da parte area e
retirada das razes e ndulos, tambm causam uma queda drstica na reduo do acetileno, que varia
com a estirpe de rizbio e com o gentipo da planta (Minchin et aI., 1986). O mtodo de reduo do.
acetileno, porm, pode ser utilizado para demonstrar que os ndulos esto ativos e para anlises rpi-
das e numerosas. Na EMBRAPA-CPAC, por exemplo, tem sido conduzido um programa de seleo
de sub-estirpes mais eficientes pela avaliao da atividade de reduo do acetileno em ndulos indivi-
duais (Figura 2.14). Quando os isolados dos ndulos com atividade mais elevada foram inoculados
em plantas, eles permitiram maior acmulo de N total (Peres et aI., 1984). Em estudos fisiolgicos,
tm-se utilizado cmaras de incubao com fluxo contnuo em sistemas no perturbados (LayzeIl,
1993).
Em casa de vegetao, em substrato livre de N-mineral, a anlise do N total nos d a quantida-
de de N
2
que foi fixada, tendo-se que excluir o N adicionado pelo inculo (e pelas sementes. Mas,
quando outras fontes de N esto disponveis, como fertilizantes ou N da m a t ~ r i a orgnica, o balano
de N total e as tcnicas com 15N, incluindo abundncia natural, valor "A" e diluio isotpica e o uso
de 15N2 so muito utilizadas. Algumas restries, porm, precisam ser consideradas, como o custo
elevado das anlises, a escolha correta da planta controle, estabilidade no enriquecimento com 15N do
solo, etc. (Ruschel et aI., 1979; Hardarson et aI., 1984; Boddey, 1987; Boddey et aI., 1984, 1990;
Giller & Wilson, 1991).
O uso da porcentagem de N como uredos, como um mtodo indireto de quantificao, tam-
bm tem sido empregado (Herridge, 1982; van Berkum et aI., 1985) e o teor de clorofila nas folhas
pareceu ser um mtodo promissor (Mirza et aI., 1990), embora testes com cultivares e estirpes brasi-
leiras no tenham mostrado correlao significativa (Nishi & Hungria, 1993; Boddey & Hungria,
1994b; Bohrer et aI., 1994).
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54
4 6 8 10 12
Atividade da Nitrogenase
(nmols/mg nod/h)
14
Figura 2.14. Variabilidade nas taxas de fixao do N
2
entre isolados de
uma mesma estirpe de B. japonicum. Segundo Peres et
aI.(1984).
2.13. Inoculantes
2.13.1. Mtodos de inoculao
Pode-se dizer que a inoculao j ocorria no incio do sculo passado, quando o transporte de
terra de alfafais j estabelecidos, na Inglaterra, era realizado para as novas reas onde se desejava
introduzir essa leguminosa. Na primeira metade deste sculo, teve incio a produo de inoculantes
em agar, mas devido fragilidade da embalagem, necessidade de manuteno em baixa temperatura
e pouca durabilidade do produto, sua difuso ficou limitada. Somente no final da dcada de 20, com
o uso da turfa como veculo para o inoculante, houve um incremento na utilizao desse insumo.
Hoje, os inoculantes para a soja so nonnalmente preparados em turfa, que previamente
corrigida para pH 6,5 a 7,0. O prazo de validade dos inoculantes no Brasil de seis meses, pois como
a turfa utilizada no desinfestada, o nmero de clulas de rizbio viveis decresce drasticamente. Na
VI RELARE foi decidido que, a partir de julho de 1996, os inoculantes brasileiros tero que ser
comercializados em turfa desinfestada. Com isso, o nmero de clulas viveis poder ser maior, bem
como o tempo de comercializao.
Outros veculos de inoculao tm sido testados, como leo diesel, leo mineral e querosene,
mas no se mostraram eficientes (Faria et a!., 1985; Peres et aI., 1986; Kolling et aI., 1990). Diversos
55
inoculantes lquidos, baseados em um meio mnimo de crescimento, ou com clulas liofilizadas, esto
entrando no mercado brasileiro, mas ainda no h resultados conclusivos de pesquisa sobre o seu
desempenho (Tabela 2.14).
Tabela 2.14. Nodulao durante o estdio vegetativo e rendimento de gros em resposta a adesivos
e tipos de inoculantes para a cultura da soja, em um solo sem populao estabelecida de
Bradyrhizobium, em Viamo, RS. Segundo KoIling et aI. (1990).
Tratamento Nodulao*
(mg.planta-
I
)
Rendimento*
(kg.ha-
l
)
Sem inoculao 9 e 505 e
- - - - - - - - - - - - Adesivos para Inoculante Turfoso - - - - - - - - - - - -
Inoc. com gua 147 de 2164 bc
Inoc. com gua no dia anterior semeadura
Inoc. com soluo aucarada a 20%
Inoc. com soluo aucarada a 20% no dia anterior
438 bc
555 ab
691 a
3164 a
3267 a
3533 a
Inoc. com leo mineral 105 e 2064 c
Inoc. com leo queimado 358 bcd 2902 ab
- - - - - - - - - - - - - Outros Tipos de Inoculante - - - - - - - - - - - --
Oleoso inoculado no dia anterior 18 e 924 e
Lquido 246 cde 2976 ab
Lquido no dia anterior 238 cde 2879 ab
* Valores seguidos pela mesma letra no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (5%).
A inoculao a seco no apresenta bons resultados, devido aderncia fraca do inoculante s
sementes, sendo recomendado o uso de alguns produtos misturados gua para aumentar a adeso da
turfa s sementes. Boa adesividade tem sido conseguida com soluo aucarada, que hoje recomen-
dada na concentrao de 25% (Vargas & Suhet, 1990b), mas a goma arbica, produtos industriais
como metil-etilcelulose e metil-hidroxipropil-ceIulose e gomas preparadas base de polvilho de man-
dioca, polvilho de araruta ou farinha de trigo podem ser empregadas com sucesso (Faria et aI., 1985).
Com os adesivos, outros produtos, como calcreo, fosfato de rocha e micronutrientes podem ser apli-
cados e formam um pelete, colocando esses materiais perto das sementes e aumentando a nodulao
nos casos em que esses nutrientes se fazem necessrios (De-Polli & Dbereiner, 1974; De-PoIli et a!.,
1979; Vargas & Suhet, 1980b).
2.13.2. Efeito dos defensivos agr"colas
O tratamento das sementes com fungicidas e pesticidas pode matar as clulas do rizbio. De-
Polli et aI. (1986) fizeram uma reviso extensiva sobre os efeitos de diversos defensivos agrcolas na
fixao biolgica do N
2
. De um modo geral, fungicidas base de metais pesados, como o zinco, cobre
56
e chumbo no deveriam ser usados devido sua toxicidade. Como o tratamento de sementes essen-
,
cial em muitos locais tradicionalmente plantados com a soja, os produtos so anualrnente testados e
aqueles listados, na recomendao anual para a cultura na Regio Central e na Regio Sul, causam
pouca ou nenhuma toxicidade ao rizbio.
De um modo geral, os herbicidas so menos txicos do que os fungicidas, mas a maioria dos
inseticidas organoclorados e alguns organofosfatados prejudicam a nodulao, embora os defensivos
contra nematides, geralmente, no prejudiquem a nodulao (De-Poli et aI., 1986; Cattelan & Hungria,
1994).
2.13.3. Mtodos de inoculao recomendados no Brasil
O mtodo de inoculao recomendado hoje compreende as seguintes etapas: 1- dissolver 250
g de acar cristal (13 colheres de sopa) em um litro de gua (em lugar do acar pode-se utilizar
goma arbica a 20% ou uma celulose substituda a 5%, de qualquer-marca comercial); 2- misturar 500
ml dessa soluo com 500' g de turfa; 3- misturar com 50 kg de sementes ou 400 g por saco de 40 kg
(alternativamente, pode-se misturar a soluo aucarada s sementes e imediatamente, para que as
sementes no absorvam gua, o inoculante; neste caso, deve-se decrescer a proporo a 250 ml de
soluo aucarada para 500 g de inoculante); 4- utilizar tambor rotatrio; 5- espalhar as sementes com
o inoculante em camadas de 10 cm a 30 cm sobre uma superfcie seca, sombra; 6- deixar secar por
algumas horas; 7- regular a plantadeira para as sementes inoculadas; e 8- semear no mesmo dia ou no
mximo aps quatro dias, desde que as sementes fiquem em ambiente fi'esco e protegidas do sol.
A proporo de 500 g de inoculante: 50 kg de semente (ou 400 g: 40 kg de semente) reco-
mendada para a Regio Sul, pois os resultados encontrados com essa dose so adequados. Acima de
uma dosagem de 750 g, ocorre um decrscimo acentuado na porcentagem de inoculante aderido s
sementes, e a nodulao e rendimento de gros no so beneficiados. A campo, embora os resultados
no tenham sido estatisticamente diferentes, a aplicao de 500 g de inoculante, mesmo em um solo
com populao estabelecida elevada, permitiu um aumento no rendimento de 519 kg.ha-
1
(Tabela
2.15).
No caso da regio do Cerrado, paJiicularmente em rea de primeiro cultivo da soja, a produo
de gros responde a uma maior dose de inoculante, 1000 g de inoculante/40 kg de semente (Vargas &
Suhet, 1980a; Vargas et aI., 1992b). Teoricamente, se houver um aumento de 200 g para 1000 g de um
inoculante com concentrao de 10
8
clulas.g-
1
, o nmero de clulas disponveis quintuplicar mas,
se a concentrao de clulas desse inoculante for aumentada para 10l), o nmero de clulas aumentar
dez vezes. Dessa forma, possvel que a dose de inoculante possa ser reduzida pelo uso de maior
concentrao de clulas .. Entretanto, mais experimentos precisam ser conduzidos pois, conforme pode
ser observado na Tabela 2.16, embora o inoculante com maior concentrao de clulas tenha permi-
tido um incremento na ocupao dos ndulos pelas estirpes, o aumento no rendimento dos gros s foi
observado na dose de 1000 g. necessrio investigar se essa dose mais elevada de turfa confere outras
vantagens inoculao, como manuteno da. efetividade do rizbio em condies de temperaturas
elevadas ou baixo teor de umidade no solo.
57
Tabela 2.15. Efeito da dose de inoculante (em g de inoculante:50 kg de semente) na aderncia s
sementes (% do inoculante que ficou aderido) e na matria dos ndulos e da parte area
secas acumulada aos 40 dias aps a inoculao de soja, cultivar BR-16*. Segundo
Brando Jr. & Hungria (1994).
Dose Aderncia Vasos Estreis Vasos c/Solo Rendimento
do s MNS MPAS MNS MPAS de gros
Inoculante Sementes (mg.pI-
1
) (g.pl-l) (mg.pl-l) (g.pl-l) (kg.ha-
1
)
O 3089
250 92,18 a 47,60 a 0,51 a 57,70 a 0,87 a 3410
500 88,56 a 34,52 a 0,48 a 75,55 a 1,05 a 3608
750 80,00 b 47,12 a 0,54 a 75,62 a 1,07 a 3024
1000 66,21 c 42,16 a 0,48 a 61,08 a 0,85 a 2911
* Mdias de cinco repeties. Valores seguidos pela mesma letra em cada coluna no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (5%).
Tabela 2.16. Efeito de doses do inoculante [g de inoculante.(40 kgr
1
de sementes] contendo as estir-
pes SEMIA 5079 e SEMIA 5080 na ocorrncia dos sorogrupos das estirpes introduzidas
e na produtividade da soja em solos do Cerrado com populao estabelecida. * Segundo
Vargas et aI. (1992b).
Dose
o
200
1000
200
* Mdias de quatro repeties.
Ocorrncia dos Sorogrupos
nos ndulos (%)
5079 5080
inoculante com 10
8
clulas/g de inoculante
15 1
15 4
25 11
inoclllante com 10
9
cllllas/g de inoculante
24 12
Produtividade de
gros (kg. ha-
1
)
3575
3532
3943
3528
58
Em relao aos adesivos, sem dvida eles so importantes para garantir a aderncia do inoculante
s sementes (Tabela 2.14). A recomendao da soluo aucarada se deve principalmente a essa
adeso, permitindo o aumento da nodulao (Tabelas 2.14 e 2.17). Alguns resultados de pesquisa
mostraram que, at oito dias aps a inoculao das sementes, a viabilidade do inoculante foi mantida
(Figura 2.15, Peres et aI., 1986) mas, por segurana, recomenda-se que esse prazo no ultrapasse
quatro dias.
Tabela 2.17. Efeito da adio de gua e soluo aucarada a 25% na aderncia do inoculante s
sementes (% do inoculante que ficou aderido) e na matria dos ndulos e da parte area
seca acumulada aos 40 dias aps a inoculao de soja, cultivar BR-16*.
Dose Aderncia Vasos Estreis Vasos c/Solo Rendimento de gros
do s MNS MPAS MNS MPAS Virgem Cultivado
Acar Sementes
(mg.pl-l) (g.pl-l) (mg.pl-l) (g.pl-l) (kg.ha-
1
) (kg.ha-
1
)
Testemunha
s/inoculao 2621 4262
Inoc.+gua 41,00 b 28,11 b 0,28 a 37,60 b 0,97 a 3648 4424
Inoc. +sol. a
25% 80,87 a 41,36 a 0,42 a 52,15 a 1,07 a 3477 3922
* Experimentos conduzidos em vasos com soluo nutritiva estril sem N ou vasos com Latossolo Roxo com 10
5
clulas de Bradyrhizobill/JI.g'r de
solo. Mdias de cinco repeties. Valores seguidos pela mesma letra no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (5%). Segundo Brando Jr. &
Hungria (1994). O eteito da soluo aucarada tambm foi analisado em experimento a campo em solo do CelTado virgem e aps o cultivo e
inoculao. Segundo Vargas et aI. (dados no publicados).
Nos casos em que se fizer necessrio o tratamento de sementes, deve-se: 1- misturar as mes-
mas com a soluo aucarada, utilizando-se 250 m} de soluo (25%) a 50 kg de sementes; 2- adicio-
nar, a seguir, o fungicida; 3- aplicar 500 g de inoculante (ou 1000 g, no caso da Regio Central); 4-
deixar secar sombra por algumas horas; e 5- semear no mesmo dia e, caso isso no seja possvel,
repetir a inoculao no dia do plantio.
Hoje j existem mquinas no mercado que permitem a inoculao com turfa simultaneamente
com o tratamento de sementes, com um rendimento de 60 sacas.hora-
1
e dispensando a secagem. Com
essa facilidade, certamente mais agricultores passaro a adotar essa prtica.
2.13.4. Cuidados com o inoculante e com a inoculao
Para que a inoculao seja bem sucedida necessrio, primeiramente, que o inoculante apre-
sente um nmero elevado de clulas viveis. De acordo com a legislao atual, esse nmero de 10
7
clulas.g-
1
de inoculante na hora do uso. Alm disso, alguns cuidados bsicos devem ser tomados,
como: 1- no utilizar inoculante com prazo de validade vencido; 2- ao adquirir o inoculante, certificar-
59
se de que o produto estava conservado em condies satisfatrias e, aps a aquisio, conserv-lo em
lugar fresco e arejado at o momento da utilizao. Em relao inoculao, deve-se, ainda: 1- fazer
a inoculao sombra e, preferencialmente, pela manh; 2- interromper a semeadura quando o dep-
sito de sementes aquecer em demasia, pois altas temperaturas matam as bactrias.
800
600
400
N2 Ndulos
--o-- Massa de Ndulos
200
o -I----r---r--..----.,.--.-----,r------r--"T
O 2 4 6 8
Dias de Armazenal11ento
Figura 2.15. Efeito do perodo de armazenamento de sementes na
nodulao de soja IAC-2, inoculadas com as estirpes
SEMIA 5019 e SEMIA 587 e utilizando-se uma solu-
o de sacarose a 25%. Segundo Peres et aI.(1986).
2.13.5. Fatores ambientais que podem afetar o sucesso da inoculao
As temperaturas elevadas e o estresse ldrico, muitas vezes atuando juntos, so provavelmente
os principais fatores ambientais limitantes fixao biolgica do N
2
nos trpicos, afetando a simbiose
em todos os estdios.
As temperaturas elevadas podem afetar a sobrevivncia das bactrias no solo, a formao de
plos radiculares e a infeco.Os stios de nodulao, nas partes mais novas do sistema radicular, so
as reas mais sensveis no estdio da pr-infeco. Posteriormente, as temperaturas elevadas podem
afetar a sntese de leghemoglobina, desnaturar a dinitrogenase, acelerar a senescncia dos ndulos,
reduzir a atividade das enzimas que assimilam a amnia resultante da fixao do N
2
, entre outros.
Tambm h os efeitos adversos causados por alteraes na planta hospedeira afetando, particularmen-
te, a fotossntese (Sprent, 1984; La Favre & Eaglesham, 1986b, 1987; GilIer & Wilson, 1991; Hungria
et al., 1993; Hungria & Franco, 1993; Neumaier & Nepomuceno, 1994).
Quanto disponibilidade hdrica, ela importante para a importao de fotossintatos e expor-
tao dos compostos nitrogenados. Com a deficincia hdrica, ocorre o acmulo de compostos
nitrogenados nos ndulos podendo desnaturar a dinitrogenase. Com o excesso hdrico, diminui o
oxignio para os ndulos, afetando a disponibilidade de energia para o metabolismo (Vincent, 1980;
Sprent, 1984).
60
Os estresses trmicos e hdricos podem ser mais drsticos sob determinadas condies, como
solos arenosos ou descobertos. Nessas condies, a irrigao e cobertura morta (Sekhon et aI., 1984;
Morote et aI., 1990) e o sistema de semeadura por plantio direto, que tambm permite maior cobertura
morta (Voss & Sidiras, 1985), podem reduzir o estresse e favorecer a nodulao.
Embora a seleo de estirpes in vitro para tolerncia a temperaturas elevadas no correlacione,
necessariamente, com a tolerncia em simbiose (La Favre & Eaglesham, 1986b), h indicaes, de
que algumas estirpes de B. japonicum e gentipos de soja podem tolerar melhor os estresses trmicos
e hdricos (Morote et aI., 1990; Sall & Sinclair, 1991; Neumaier & Nepomuceno, 1994). Existem,
portanto, diferenas genticas que deveriam ser melhor exploradas.
2.13.6. Fatores nutricionais
As plantas que fixam N
2
so, nutricionalmente, mais exigentes, pois requerem os nutrientes
necessrios ao hospedeiro, ao rizbio e ao sistema simbitico. Neste item, os nutrientes que afetam a
simbiose com soja sero apenas mencionados. Para maiores detalhes, diversas revises podem ser
consultadas (Freire, 1977; Munns & Franco, 1982; Borkert & Sfredo, 1994; Cattelan & Hungria;
1994).
Os estudos indicam que a acidez afeta principalmente o estdio de infeco, devido reduo
da atividade das enzimas relacionadas com a quebra da parede celular. A acidez tambm prejudica a
sobrevivncia do Bradyrhizobium e apresenta efeitos indiretos, reduzindo a disponibilidade de clcio,
magnsio, molibdnio e fsforo e aumentando a de alumnio e mangans. Em relao ao
microssimbionte, o alumnio e o mangans afetam a diviso das clulas da bactria, podem causar
mutao do rizbio, diminuem a sua efetividade e, em relao ao hospedeiro, afetam o desenvolvi-
mento das razes. O incio da nodulao e funcionamento dos ndulos tambm afetado, drasticamen-
te, por nveis txicos desses elementos (Franco & Dobereiner, 1971; Keyser & Munns, 1979a,b; Munns
& Keyser, 1981), mas algumas estirpes de Bradyrhizobiu111 e gentipos de soja tm se mostrado tole-
rantes a essas condies (Dobereiner & Arruda, 1967; Franco & Dobereiner, 1971; Keyser & Munns,
1979b; Asanuma & Ayanaba, 1990; Taylor et aI., 1991.).
O clcio afeta o crescimento dos tecidos meristemticos das razes, a distribuio de -nutrien-
tes, a sobrevivncia, a formao de flagelos e o potencial de infeco do rizbio, alm de ser um
componente da parede e da membrana celulares. Em solos cidos, incrementos no rendimento e
nodulao tm sido freqentemente relatados pela prtica da calagem (Freire, 1977). J o magnsio
muito importante para o crescimento da bactria, estabelecimento e rigidez de seus flagels, para a
atividade da nitrogenase, alm de desempenhar um papel importante no metabolismo da planta hospe-
deira (Freire, 1977; Robinson et aI., 1992). O potssio feta indiretamente a simbiose, pelo metabolis-
mo da planta hospedeira e importante no transporte dos compostos nitrogenados fixados pela soja,
que vo para a parte area na forma de alantoato de potssio.
O fsforo, indiscutivelmente, desempenha um papel de extrema importncia, tanto no incio
da formao dos ndulos como pelo fornecimento de energia em todos os estdios da simbiose. Em
muitos solos brasileiros, caracterizados pelo baixo teor desse nutriente, adubaes fosfatadas aumen-
tam a nodulao e o rendimento da soja (Freire, 1977). J o enxofre faz parte do complexo da
dinitrogenase, alm de estar associado com a fotossntese da planta hospedeira.
61
Em relao aos micronutrienes, o ferro componente da dinitrogenase e da leghemoglobina.
O molibdnio componente da dinitrogenase, razo pela qual os sintomas de deficincia desse nutri-
ente se assemelham aos sintomas de deficincia de N. Em alguns solos, onde ocorre deficincia de
molibdnio, a liberao do micronutriente pela calagem ou a fertilizao pode aumentar significativa-
mente a fixao de N
2
e a produtividade de soja (Ruschel & Eira, 1969; Lantman et aI., ] 989). O
cobalto tambm essencial para as plantas que fixam N 2 e os principais efeitos do boro, cobre e zico
so indiretos, pelo metabolismo da planta hospedeira.
O nitrognio mineral inibe o processo de fixao do N
2
. Pode-se citar que alguns estudos
identificaram como fator inibitrio a preferncia da planta pelo N mineral devido ao menor gasto
energtico para a sua assimilao, inibio via auxinas, inibio da sntese e atividade da dinitrogenase,
aumento na resistncia difuso de oxignio nos ndulos, formao do composto nitrosil-
leghemoglobina, que inibe a sntese e atividade da leghemoglobina, entre outros (Minchin et aI., ] 981;
Sprent, 1984; Kanayama & Yamamoto, 1991; Layzell et aI., 1993).
A aplicao de adubos nitrogenados na cultura da soja no justificvel, pois mesmo em reas
recm-desbravadas dos Cerrados, onde so incorporadas grandes quantidades de resduos vegetais
(26 t.ha-
I
) com alta relao CIN, no se observaram respostas aplicao de at 30 kg de N. ha-
1
(Vargas et aI., 1982b). Levantamentos de literatura mostram que 57% a 83% do N total acumulado
pela soja proveniente da fixao biolgica do N ~ , havendo um decrscimo para 18% a 32%, aps a
fertilizao com 200 kg de N.ha-
I
, sem qllalqlle;' aumento na produtividade (Cattelan & Hungria,
1994). Alguns resultados sobre o efeito da adubao nitrogenada no rendimento da soja esto resumi-
dos na Tabela 2.18. No comprovado, tambm, que uma dose "de arranque" ("stalier") de N, reco-
mendada por alguns pesquisadores, traga qualquer benefIcio s plantas (Barni et aI., 1977; Vargas et
aI., 1992a). A recomendao nacional para a cultura da soja, hoje, de que no se aplique qualquer
fonte de fertilizante nitrogenado e somente quando for mais fcil obter frmula de adubo que contenha
N, essa poder ser utilizada, desde que no sejam aplicados mais do que 20 kg de N.ha-
t
e que isso no
reflita em aumento nos custos para o agricultor.
2.13.7. Inoculao sob condies advel"sas
Se algum produto txico tiver de ser adicionado s sementes, pode-se aplicar maior dose de
inoculante ou ento adicionar sementes inviveis, no tratadas, ou PaIiculas inertes de tamanho e
peso similar ao da soja (De-Polli et aI., 1986). Em alguns casos, realiza-se a inoculao do solo em
forma granulada, turfa ou lquido, mas o inoculante no pode ser misturado com o adubo, pois a
salinidade prejudicial ao rizbio. As vantagens desses mtodos incluem a separao de produtos
txicos que possam estar cobrindo as sementes, mas a maior desvantagem o custo, desde que mais
inoculante precisa ser adicionado.
No caso do insucesso ela inoculao da soja, em solos sob vegetao de cerrados no primeiro
ano de cultivo, Peres et aI. (1989) conseguiram estabelecer as estirpes desejveis pela inoculao do
arroz, que a cultura que precede soja. Resultados semelhantes foram obtidos por DiatIoff (1969),
que estabeleceu estirpes de B. japonicul11 pela inoculao de sementes de cevada, e por Gaur et aI.
(1980), que estabeleceu Bmdy,.hizobiu/77 sp. pela inoculao do milho. Nos cerrados, a inoculao
atravs do arroz permitiu o estabelecimento das estirpes e um incremento no rendimento da soja de
983 kg.ha-
1
(Figura 2.16).
Tabela 2.18. Efeito de doses de adubao nitrogenada no rendimento dos gros de soja em solos da regio do Cerrado e do Paran.
Regio Cultivo Cultiyal' EstillJe Dose Pl"Oduo Instituio Ano Refel"ncia
(kg de N.ha-
1
) (kg.ha-
1
)
Cerrado 10 ano IAC-2 5019+587 O 1921 CPAC 1979/80 Vargas et
10 1963 aI. (l982c)
20 2039
30 2023
Cerrado 2 ano Paran 5019+587 O 2190 CPAC 1977/78 Vargas et
150 2034 aI. (l982c)
Cerrado 2
0
ano Sta. Rosa 5019+587 O 2817 CPAC 1977/78 Vargas et
150 2871 aI. (1982c)
Cerrado 2
0
ano UFV-l 5019+587 O 3443 CPAC 1977/78 Vargas et
150 3527 a!. (l982c)
Cerrado 2
0
ano IAC-2 5019+587 O 3356 CPAC 1977/78 Vargas et 0\
N
150 3673 a!. (l982c)
Paran 1 ano Paran s/inoc. O 1974 CNPSo 1979/80 Campo et
566+587+ O 2252 aI. (1982)
532c 10 2180
20 2175
40 2172
Paran [O ano BR-16 s/inoc. O 2680 CNPSo 1979/80 Cattelan &
5079+5080 O 2888 CNPSo 1991/92 Hmlgria*
587+5019 O 27J,.7
s/inoc. 400 2982
Paran > 2
0
ano BR-37 587+5019 O -+268 CNPSo 1992/93 Cattelan&
s/inoc. 400 4039 Hungria *
Paran > 2" ano BR-16 s/inoc. O 4009 CNPSo 1992/93 Nishi &
s/inoc. 400 3981 Hungria (1994)
5019 O 4400
Dados no publicados.
o
0
CJ)
o
1:1
c.o
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( . ! ) ~
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1 : 1 ~
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-
C
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a::
3000
2000
1000
o
o
63
Arroz sem Inoculao
O Arroz Inoculado
250 500
Dose de Inoculonte
(0/40 kO de semente)
1000
Figura 2.16. Rendimento de soja, cultivar IAC-2, receben-
do quatro nveis de inoculante, em rea em que
o arroz havia sido ou no previamente inocu-
lado com as mesmas doses. O experimento foi
conduzido em um latossolo vermelho-amare-
lo do cerrado sem populao estabelecida de
Bradyrhizobium e o inoculante foi preparado
com as estirpes SEMIA 5019 e SEMIA 587.
2.13.8. Inoculao em solos com populao estabelecida
Conforme discutido anteriormente, pouco se sabe sobre as bases genticas que podem auxiliar
na obteno de estirpes mais competitivas. Deve-se pensar, portanto, em outras alternativas que per-
mitam o estabelecimento das bactrias desejadas. Em relao vantagem numrica, Weaver & Frederick
(1974) verificaram que o nmero de clulas bacterianas do inoculante tem que ser pelo m:1nos 1000
vezes superior ao nmero de bactrias do solo para formar 50% dos ndulos. Usando essa mesma
relao de inculo, porm, Meade et a!. (1985) no conseguiram recuperar mais do que 33% de ndu-
los formados por uma estirpe introduzida de R. leguminosarum bv. viceae. Em soja, inculos 1000
vezes superiores populao estabelecida do solo apresentaram resultados que variaram de acordo
com a estirpe, com um aumento de 20% para 37% pela inoculao com a SEMIA 5019, enquanto que
a inoculao com a SEMIA 566 aumentou a ocupao de 32% para 78% (Nishi & Hungria, 1993).
H controvrsias, ainda, sobre a possibilidade de aumentar a ocupao dos ndulos em solos
com populao estabelecida elevada. Resultados encontrados em uma srie de experimentos nos Esta-
dos Unidos detectaram que populaes to baixas quanto 20 a 50 clulas de rizbio/g de solo podem
64
eliminar a resposta inoculao, desde que algumas dessas bactrias sejam eficientes (Singleton &
Tavares, 1986; Thies et aI., 1991). No Estado do Paran, porm, mesmo em solos com populao de
105 a 10
6
clulas.g-
1
de solo, tem-se conseguido aumentar a porcentagem de ocupao dos ndulos
pelas estirpes do inoculante (Nishi & Hungria, 1993; Cattelan & Hungria, dados no publicados).
Tambm h muita controvrsia sobre a porcentagem de ndulos que uma estirpe eficiente
precisa formar para beneficiar o hospedeiro. Thies et aI. (1991) observaram que pelo menos 66% dos
ndulos da planta precisam ser formados pela estirpe introduzida. Entretanto, em solos do Paran,
uma ocupao de 36% dos ndulos pela estirpe SEMIA 5019 j foi suficiente para permitir um incre-
mento de 419 kg.ha-
1
em relao ao tratamento recebendo 400 kg de N.ha-
1
(Nishi & Hungria, 1993).
Esses resultados, e outros obtidos tambm em solos do Paran, indicam que talvez o nmero e massa
de ndulos formados por uma determinada estirpe sejam mais importantes do que a porcentagem de
ndulos ocupados por essa estirpe.
Alguns mtodos de inoculao, como a aplicao de um nmero elevado de clulas por alguns
anos, tambm podem ser recomendados para auxiliar no estabelecimento de estirpes desejveis (Triplett
& Sadowsky, 1992). Desse modo, a inoculao da estirpe USDA 110 por trs anos consecutivos, nos
Estados Unidos, permitiu o seu estabelecimento no solo (Duningan et aI., 1984), o mesmo acontecen-
do com uma estirpe para o trevo forrageiro (Martensson, 1990). Doses mais elevadas de inoculante
tambm tm permitido o melhor estabelecimento das estirpes em solos do Cerrado (Vargas & Suhet,
1980a).
Diversos fatores afetam a predominncia de uma determinada estirpe no solo, mas em grande
palie o estabelecimento est relacionado com as estirpes competitivas inoculadas nos anos anteriores.
Na Tabela 2.19, esto listadas as estirpes quej foram recomendadas em inoculantes no Brasil, algu-
mas delas altamente competitivas, como a SEMIA 587, que em solos com populao estabelecida em
Guaba, RS, permitiu a ocupao de 68% a 77% dos ndulos (Freire, 1977). Na Tabela 2.20, esto
listados alguns levantamentos mostrando os sorogrupos dominantes em certas regies do Brasil.
Tabela 2.19. Estirpes utilizadas em inoculantes de soja de 1956 a 1994. *
Ano Estirpes (SEMIA)
1956 500 504 505 512 513 516 517 519 521
1957 504 505 509 512 513 516 519 521 525
1958 504 505 509 512 515 517 519 534 535
1961 519 521 526 531 534 535
1962 504 510 513 519 527 531
1964 504 513 527 531
1965 504 513 519 532
1966 532 543 566
1968-1975 543 566 587
1976 527 532 566
1977 527 566 586
1978 527 532 566
1979-1991 587 5019
1992-........ 587 5019 5079 5080
*De 1956 a 1991 as infonnaes fomm compiladas de Freire & Kolling (1991).
Tabela 2. 20. Soro grupos presentes nos ndulos de soja detectados em levantamentos realizados em diversos locais do Brasil.
Local Ano Soro grupos (%) Referncia N!!local
527 532c 566 587 5019 5061 586
Guaba, RS 1973 5 37 5 32 n.a. n.a. 5 Freire (1977)
Guaba, RS 1975 30 21 0,25 48 n.a. n.a. n.a. Freire (1977)
Guaba, RS 1976 8 3 2 77 n.a. n.a. n.a. Freire (1977)
Guaba, RS 1984 n.a.* 1 59 33 6 O n.a. Campo**
Maquin,RS 1984 n.a. O 54 ]7 19 O n.a. Campo**
Capinpolis, MG 1990 n.a. n.a. 21 57 21 n.a O VargasetaI. (1992b)
Tupaciguara, MG 1990 n.a. n.a. 4 48 49 n.a. O Vargas et aI. (1992 b) 3
Nova Ponte, MG 1990 n.a. n.a. 43 39 17 n.a. O Vargas et aI. (1992 b) I
Perdizes, MG 1990 n.a. n.a. O 46 64 n.a. O Vargas etal. (1992 b) 2 0\
1J1
Sacramento, MG 1990 n.a. n.a. 14 57 14 n.a. 14 Vargas et aI. (1992 b)
Uberaba, MG 1990 n.a. n.a. O 50 50 n.a. O Vargas etal. (1992 b)
Tabatinga,DF 1990 n.a. 10 52 10 17 n.a. O VargasetaI. (1992 b) 2
Rio Preto, DF 1990 n.a. 5 37 12 31 n.a. O Vargas et alo (1992 b) 3
J ardilll, DF 1990 n.a. 11 34 18 26 n.a. O Vargas etaI. (1992 b)' 2
PAD.DF 1990 n.a. 7 32 16 26 n.a. O Vargas et aI. (1992 b) 6
Pipiripau, DF 1990 n.a. 11 14 8 36 n.a. O Vargas etal. (1992 b)
Cristalina, GO 1990 n.a. 11 17
? ~
_.J 33 n.a. O Vargas et aI. (1992 b)
Vilhena, RO . 1990 n.a. n.a. 68 18 14 n.a. n.a. Vargas etal. (1992 b) 2
So Gabriel do Oeste, MS 1990 n.a. n.a. 63 13 23 Il.a. Il.a. Vargas et alo (1992 b) 1
Maracaju, MS 1990 Il.a. 3 51 25 21 n.a. n.a. Vargas et alo (1992 b) 1
* No avaliada .
Dados no publicados.
2.14. Resultados de Inoculao no Brasil
2.14.1. Solos de primeiro ano de cultivo
66
Considera-se que os do Brasil no possuem Bradyrhizobiu111 nativo e, por isso, as respos-
tas inoculao em reas no cultivadas so sempre positivas. Graas tecnologia que permite o
cultivo da soja em diversas latitudes, pode-se observar, na Regio Norte, que a inoculao em um solo
isento de Bradyrhizobiu111 resultou em um aumento de rendimento de 239 kg.ha-
1
para 2533 kg.ha-
l
(Oliveira et aI., 1992).
Nos solos sob vegetao de Cerrado, as respostas inoculao tambm so muito significati-
vas no primeiro ano de cultivo (Vargas & Suhet, 1980a,b; Vargas et aI., 1982a,b,c,d). Resultados
positivos de um experimento conduzido em rea do Cerrado podem ser vistos na Tabela 2.21. Aps
sete anos de experimentao com as estirpes SEMIA 5079 e SEMIA 5080, Peres et aI. (1993) obser-
varam ganhos mdios de 260 kg.ha-
1
. Tambm em solos de primeiro ano de cultivo, no Rio Grande do
Sul, a inoculao incrementou o rendimento em quase seis vezes (Tabela 2.14).
Tabela 2.21. Resposta inoculao da soja em solo de cerrado no primeiro ano de cultivo. *
Tratamento Matria de Ndulos Prod utividade N total das Plantas
Secos
(mg.planta-
l
) (kg.ha-
1
) (kg de N.ha-
l
)
SEMIA 586 46,0 b 1600 a 98,04 a
SEMIA 587 176,2 a 1112 ab 61,83 ab
SEMIA 5019 121,2a 1228 ab 71,75 ab
5019+587 166,2 a 1422 ab 83,46 ab
SEMIA 566 (isolado do cerrado) 204,5 a 1359 ab 75,70 ab
N mineral 0,0 1256 ab 71,23 ab
Sem inoculao 0,0 812 b 45,13 b
* dos obtidos pelas cultivares ElvIGOPA-301 e Santa Rosa. Adaptado de Oliveira ot a!. (1991).
2.14.2. Resultados de reinoculao em solos do brasil
Hoje em dia, porm, restam poucas reas que ainda no foram inoculadas e a populao natu-
ralizada dos solos s vezes muito elevada. A maioria dos produtores de soja no pratica a reinoculao,
principalmente pela falta de informaes sobre os resultados que podem ser obtidos. Com essa preo-
cupao, desde a safra de 1992/93 os resultados de experimentao, em rede, nacional esto sendo
conduzidos em solos com populao estabelecida.
No Cerrado, em experimentos conduzidos durante trs safras, somente na primeira safra no
houve efeito benfico da reinoculao. Nesses experimentos, pde-se observar, ainda, o melhor esta-
belecimento das estirpes SEMIA 5080 e SEMIA 5079 (Tabela 2.22), justificando a recomendao
dessas estirpes em inoculantes comerciais (Vargas et aI., 1992b). Nos trs experimentos que tenderam
a responder reinoculao, os ganhos variaram de 80 kg a 291 kg.ha-\ correspondendo a um incre-
mento na produtividade de 4 % a 12 %.
67
Tabela 2.22. Efeito da reinoculao na produtividade da soja e ocorrncia dos soro grupos nos
ndulos*. Segundo Vargas et aI., 1992b.
Tratamento Ndulos ocupa- Produtividade Ndulos ocupa- Produtividade
dos pela estirpe de gros dos pela estirpe de gros
introduzida (%) (kg.ha-
I
) introduzida (%) (kg.ha-
1
)
A** D** A** D**
-----
1988/89 - - - - -
-----
1989/90 ------
Testemunha 1928 3826
5019 + 587 33 25 2074 82 86 3497
5080 O 20 2008 2 51 3598
5079 68 73 2028 19 44 3799
-----
1990/91 -----
-----
1991/92------
Testemunha 3575 2321
5019+587 43 58 3763 94 92 2589
5080 1 24 3705 1 56 2612
5079 15 23 3744 1 57 2511
Experimentos conduzidos pela EMBRAPACPAC durante trs safras ~ 1 1 1 solos do Cerrado com populao estabelecida. Mdias de quatro repeti
es .
.. A = antes da reinoculao e O = depois da reinoculao.
Em um solo no Paran, com populao estabelecida de 2,21.10
5
clulas.g-
1
de solo, respostas
positivas inoculao foram obtidas por Nishi & Hungria (1993). No solo em estudo, no havia
predominncia de nenhum soro grupo e todas as estirpes introduzidas foram capazes de ocupar, em
mdia, 50% dos ndulos das plantas, representando um incremento de 140% em relao testemunha
no inoculada. Quando o experimento foi instalado na safra seguinte, pde-se observar que as estirpes
introduzidas na safra anterior voltaram aos nveis de ocupao encontrados inicialmente (Figura 2.17).
Atravs da reinoculao dessas estirpes, porm, a porcentagem de ocupao dos ndulos novamente
aumentou, evidenciando a importncia da reinoculao anual da soja, pois somente atravs dela pde-
se atingir os nveis de ocupao dos ndulos necessrios maximizao do processo de fixao do N
2
.
Em continuao a esse mesmo experimento, pde-se observar, ainda, que quando o trigo, cultivar
BR-23, foi semeado aps a soja, em parcelas que haviam sido inoculadas, o rendimento e teor de N
dos gros foram superiores nos tratamentos que haviam apresentado o melhor desempenho simbitico
na safra anterior (Figura 2.18). Desse modo, o trigo semeado nas parcelas que haviam sido inoculadas
com a SEMIA 5019 produziu 396 kg.ha-
I
a mais do que nas parcelas sem inoculao, mostrando que
a inoculao da soja deixou mais N no solo para a cultura seguinte.
68
60
Inoculollo
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Figura 2.17. Efeito da reinoculao de soja, em um latossolo roxo do
Paran com populao de 2,21.10
5
clulas.g-
1
de solo,
na porcentagem de ocupao dos ndulos pelas estirpes
introduzidas no inoculante. Segundo Nishi & Hungria
(1994).
-- y= 14.889+0.19133x R=0.74456
72
-o 70
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60
240 250 260 270
N Tota I SoJo (kg N/ha)
( P ~ 0,02)
...
280 290
Figura 2.18. Relao linear entre o N total da soja na safra 92/93 e o
N total do trigo, plantado sobre as mesmas parcelas da
soja, na safra 93/94, sem receber qualquer adubao.
Vaiares referentes s mdias de quatro parcelas.
69
2.15. Concluses
Os estudos sobre a simbiose da soja tm mostrado grandes avanos, particularmente nas reas
de gentica e fisiologia do microssimbionte. No Brasil, a inoculao uma tcnica de baixo custo que
resulta na economia de milhares de dlares para o pas por ano. Em solos de primeiro ano de cultivo,
os ganhos no rendimento da soja pela inoculao so indiscutveis. Em solos j cultivados, os ganhos
geralmente so menos expressivos, mas da ordem de 5 % a 15 %. Alm disso, atravs da reinoculao
da soja, estirpes mais eficientes so introduzidas e a cultura deixa de retirar N do solo, bem como o
enriquece atravs dos restos culturais, podendo resultar em beneficios para as culturas posteriores. No
Brasil, existem diversas linhas de pesquisa promissoras em andamento, incluindo a seleo de estirpes
mais eficientes e competitivas e gentipos de soja com maior capacidade de fixao de N 2' Esses
estudos, associados melhoria na qualidade dos inoculantes comercializados no Brasil, podem resul-
tar em aumentos expressivos na produtividade da soja.
2.16. Referneias Bibliogrficas
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CAPTULO 3
FIXAO BIOLGICA DO NITROGNIO EM FEIJO
Ricardo S. Araujol
3.1. Introduo
O feijo constitui uma das principais fontes de protena da dieta do brasileiro, sendo consumi-
do por todas as classes de renda do pas. Entretanto, o consumo per capita caiu nos ltimos anos
(Vieira, 1988), refletindo uma queda no poder aquisitivo do consumidor, uma elevp.o do preo do
produto e uma reduo na oferta de feijo no mercado, provavelmente decorrente da reduo na pro-
dutividade da cultura.
Um dos fatores mais limitantes produtividade do feijoeiro a baixa disponibilidade de nutri-
entes, sobretudo fsforo e nitrognio, nos solos agrcolas. A adio de nitrognio na forma de fertili-
zantes cara e, em muitos casos, ineficiente, principalmente devido a perdas do elemento causadas
por prticas culturais inadequadas. As leguminosas evoluiram obtendo nitrognio da simbiose forma-
da com bactrias fixadoras de nitrognio, os rizbios. Essa simbiose conhecida e explorada comer-
cialmente h mais de cem anos, sendo a soja e os adubos verdes os exemplos de maior sucesso conhe-
cidos.
H um descrdito crnico na capacidade de o feijoeiro fixar nitrognio atmosfrico suficiente
para expressar seu potencial produtivo, quando em associao com o Rhizobium, recomendando-se
indistintamente o uso de fertilizante nitrogenado para a cultura (EMBRAPA, 1993). Entretanto, resul-
tados de vrios anos de pesquisa apontam na direo contrria, sugelindo que possvel que a cultura
do feijoeiro se beneficie, em nvel de campo, da fixao do nitrognio. A exemplo da cultura da soja,
se o uso da inoculao do feijoeiro se tornar uma prtica comum na agricultura, isto poder represen-
tar uma economia de divisas para o pas. Considerando-se uma rea plantada com feijo, de aproxi-
madamente 5 milhes de hectares, e uma recomendao mdia de adubao nitrogenada com 60 kgde
N . ha-
1
, os gastos com o fertilizante, sulfato de amnio ou uria, totalizam 320 ou 200 milhes de
dlares, respectivamente. Contudo, essa adubao na maiOlia das vezes no suficiente para que a
cultura atinj a seu potencial produtivo, pois a eficincia de uso do fertilizante nitrogenado pelo feijoeiro
muito baixa, o que faz com que seja necessria a aplicao de muito mais fertilizante.
Em contrapartida, considerando-se o preo (superestimado) de um dlar, por dose de inoculante,
e uma aplicao de uma dose de inoculante por hectare, os custos cairiam para cinco milhes de
dlares, representando uma grande economia de divisas que poderiam ser direcionadas para ouh'os
aspectos da melhOlia da produtividade agrcola, e ouh'os insumos exh'emamente importantes para a
cultura do feijo. Mesmo que a inoculao no seja suficiente para suprir todo o nih'ognio e seja
necessria a realizao de adubaes nih'ogenadas em cobertura, a eliminao ou reduo da aduba-
o no plantio j representa uma economia a ser considerada.
I Pesquisador, Ph.D., EMBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijo (CNPAF), Caixa Postal 179, CEP 74001-970. Goinia, CiO.
92
Neste captulo apresentado um resumo dos resultados de pesquisa sobre inoculao do feijoeiro,
e discutida a viabilidade do uso da inoculao na prtica.
3.2. O Microsimbionte
A pesquisa sobre o microsimbionte do feijoeiro teve um grande impulso nas dcadas de 80 e
90, e hoje se conhecem melhor algumas das propriedades e caractersticas desejveis desses organis-
mos. s resultados mais relevantes so apresentados a seguir, de acordo com as caractersticas estuda-
das.
3.2.1. Nomenclatura/especificidade hospedeira
O feijoeiro foi sempre considerado uma leguminosa de nodulao especfica, tendo como
nicomicrosimbionte o Rhizobium phaseoli, posteriormente denominado R. leguminosarnm biovar
phaseoli (Rlp). Essa nova denominao resultou de esfudos genticos que mostraram que R.
leguminosarnm, R. tr(folii e R. phaseoli diferem apenas no plasmdio simbitico, tendo o restante de
seu genoma idntico. Por essa razo, as trs espcies foram agrupadas na espcie R. leguminosarnm,
identificando-se a especificidade por meio dos biovares viciae, trifolii e phaseoli, respectivamente
(Jordan, 1984). A transferncia do plasmdio simbitico entre os biovares lhes confere a habilidade de
n09-Jllao cruzada dos hospedeiros.
Rlp, porm, era um grupo muito heterogneo de isolados (Beynon & Josey, 1980; Roberts et
aI., 1980; Catteau et aI., 1984), tendo sido dividido em Tipos I e II, de acordo com a presena ou
ausncia, respectivamente, de mltiplas cpias (reiteraes) de seqncias de DNA ligadas fixao
de nitrognio e de acordo com a capacidade de nodular outros hospedeiros (Martinez et aI., 1985;
Flores et aI., 1987). Inicialmente, pensou-se que as mltiplas cpias desses genes representassem uma
vantagem evolutiva para Rlp (Martinez et aI., 1985; Romero et aI., 1988), mas depois observou-se que
as reiteraes esto relacionadas constante variabilidade de diversos fentipos de Rlp (Sobern-
Chavez et aI., 1986; Flores et aI., 1988).
Os estudos das diferenas entre os Tipos I e II de Rlp levaram Pinero et aI. (1988) a concluir
que a incluso de todos os isolados, capazes de nodular o fci.joeiro, em uma nica espcie ou biovar
uma irrealidade gentica, podendo erros de taxon01;riia. Os autores sugeriram ainda uma
classificao baseada em caractersticas genotpicas, e no fenotpicas. Em 1991, Martinez-Romero
et aI. apresentaram os resultados de laboriosos estudos que culminaram na separao dos isolados do
Tipo 11 emuma nova espcie, R. tropici (Rt), definindo assim um novo microsimbionte do feijoeiro
com a capacidade de nodular, tambm, a Leucaena. Com essa diviso, todos os isolados capazes de
nodular a Leucaena e o feijoeiro, e que no apresentam reiteraes gnicas, passaram a ser classifica-
dos como Rt, enquanto aqueles que nodulam exclusivamente o feijoeiro e apresentam reiteraes
foram classificados como Rlp.
Recentemente, os Rlp foram novamente subdivididos, dando origem espcie R. etli (Re;
Segovia et aI., 1993), que agrupa os lizbios que nodulam exclusivamente o feijoeiro e que foram
isolados dos solos do Mxico e das Amricas Central e do- Sul. Os rizbios que nodulam apenas o
feijoeiro e que foram isolados dos da Europa e Amrica do Norte continuam pertencendo
espcie Rlp. Em pouco tempo, portanto, o feijoeiro deixou de ser uma leguminosa de nodulao
93
especfica e se tornou uma das leguminosas de nodulao mais promscua, o que hoje confirmado
por saber-se que l;zbios isolados de diversas outras leguminosas so capazes de induzir a formao
de ndulos eficientes ou ineficientes no feijoeiro (Eardly et aI., 1985; Martinez et aI., 1985; Bromfield
& Barran, 1990; Hungria et aI., 1993; Laguerre et aI., 1993). As principais caractersticas de cada uma
das espcies so apresentadas na Tabela 3.1.
Tabela 3.1. Principais caractersticas das espcies de Rhizobium definidas como microsimbiontes
do feijoeiro comum.
Espcie de
Rhizobium
R. l. bv. phaseoli
R. etli
R. tropici
Origem
Europa e parte do
hemisfrio norte
Mxico e centros
de origem do feijo
Solos tropicais
3.2.2. Eficincia simbitica
Hospedeiros
Feijo
Feijo
Feijo
Leucaena
Caractersticas
Ecolgicas
Reiteraes dos genes nif,
perdas de eficincia;
sensvel a estresses
ambientais.
Como RIp.
Sem reiteraes; tolerncia
a temperatura e acidez
elevadas; geneticamente
estvel.
Por muito tempo diversos pesquisadores relataram problemas de instabilidade na eficincia
nodular das estirpes de rizbios utilizadas na inoculao do feijoeiro (Flores et aI., 1988), Nesse
perodo quase todos os h'abalhos eram realizados com estirpes obtidas do exterior, j que no havia
disponibilidade de muitos isolados locais com eficincia comprovada. Hoje sabemos que a maioria
dessas estirpes eram de RIp e/ou Re, sujeitas portanto a um elevado grau de instabilidade gentica
(Sobern-Chavez et aI., 1986; Flores et aI., 1988), o que pode explicar, pelo menos em parte, a grande
variabilidade na nodulao e fixao de nitrognio pelas estirpes conh'ole. Em vrios experimentos
realizados no laboratrio de microbiologia do Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijo (CNPAF),
da EMBRAPA, as estirpes recomendadas para o feijoeiro foram empregadas como controle nos testes
para avaliao e seleo de isolados locais eficientes. Como na maiOl;a dos outros casos, constatou-se
variabilidade nesses parmetros ao longo dos experimentos (Tabela 3.2), dificultando a comparao e
seleo dos isolados em teste pela ausncia de estirpes-referncia confiveis.
O inoculante comercial para o feijoeiro no Brasil, hoje, composto por duas estirpes,
SEMIA4077 (CIAT899, Rt), proveniente da Colmbia, e SEMIA4064 (UMRl135, RIp), proveniente
de Minnesota, Estados Unidos. Esta ltima tem mosh'ado perda da capacidade de nodular e da efici-
ncia em nvel de campo, e diversos pesquisadores tm sugerido sua eliminao do inoculante, e sua
substituio por uma ou mais novas estirpes, mas de Rt, j que sua maior estabilidade gentica, asso-
ciada a suas ouh'as caractersticas favorveis (Tabela 3.1), apontam o seu potencial para sucesso na
94
inoculao do feijoeiro, em condies tropicais (Hungria et aI., 1993). Os programas atuais para
avaliao e seleo de estirpes buscam, portanto, isolados de Rt com alta eficincia na nodulao e
fixao de nitrognio em associao com o feijoeiro.
Tabela 3.2. Nitrognio total fixado por diferentes estirpes de Rhizobium spp., recomendadas para a
inoculao do feijoeiro, em associao com plantas de feijo (cv. Negro Argel), cresci-
das em vasos de Leonard, no CNPAF.
.
N total fixado (mg. pl -1)
Estirpe
abr./82 jun./82 out./82 jan./83 dez./83 dez./84 jan./85 maio/85
*
SEMIA476 74 4 88 NT NT NT NT NT
SEMIA487 91 67 58 NT NT NT NT NT
SEMIA491 52 7 39 NT NT NT NT NT
SEMIA492 111 28 126 63 127 13 23 218
SEMIA4002 99 89 127 59 160 NT NT NT
SEMIA4021 87 106 114 NT NT NT NT NT
SEMIA4026 110 69 41 NT NT NT NT NT
* NT = no testada.
Uma das caractersticas que conferem maior eficincia simbitica a certos rizbios a capaci-
dade de recic1ar, atravs do sistema "uptake hydrogenase" (Hup; Schubert & Evans, 1976), o hidrog-
nio evoludo durante a fixao de nitrognio. Esse sistema oxida o hidrognio produzido e os eltrons
recuperados pela reao so devolvidos cadeia de transporte, consrvando energia (Emerich et aI.,
1979). Essa conservao de energia pode proporcionar um aumento na eficincia da fixao de nitro-
gnio (Evans et aI., 1985). Apesar de h alguns anos Piha & Munns (1987) terem sugerido que se
buscassem rizbios capazes de reciclar hidrognio para inocular o feijoeiro, s recentemente foi reali-
zado um trabalho em que se identificaram combinaes entre gentipos de feijoeiro e rizbios que
expressam a caracterstica Hup (Navarro et aI., 1993). Esses autores, entretanto, observaram um efeito
significativo da variedade de feijo na atividade Hup, sugerindo que a planta exerce controle sobre a
expresso dessa caracterstica bacteriana, o que pode levar a diferentes nveis de eficincia simbitica,
dependendo da combinao estirpe x variedade. Esse tipo de controle foi observado tambm em
ervilha (Dixon, 1972), soja (Gibson et aI., 1981) e caupi (van Berkun, 1990). Finalmente, em trabalho
recente, van Berkun et aI. (1994) demonstraram que o sistema Hup uma caracterstica marcante de
Rt, sendo encontrada com baixa freqncia em Rlp e Re. Isto refora a necessidade de se buscarem
melhores estirpes de Rt para emprego em inoculantes, e de testes dessas estirpes, a nvel nacional, em
combinao com as diferentes variedades de feijo cultivadas.
95
3.2.3. Persistncia no solo
Um dos conceitos mais antigos emlizobiologia, especialmente no que se refere s caracters-
ticas das bactrias inoculadas, que estas devem ter a habilidade de colonizar o solo e sobreviver ali,
na ausncia do hospedeiro, at a estao de plantio seguinte. Entretanto, para que isso acontea,
necessrio que as bactrias do inoculante tenham uma alta competncia saprofitica para competir (por
nutrientes) no apenas com a microflura do.solo (microrganismos no-simbiticos), mas tambm com
os rizbios preestabelecidos no soto (que competem por recursos limitados com o inoculante, por
exemplo, o nmero de stios infectveis nas razes). Na maioria dos solos onde se cultiva o feijoeiro
existe uma populao naturalizada de lizbios capazes de nodular a cultura, como demonstraram
diversos levantamentos de nodulao espontnea. Por exemplo, em 1982, foi realizada pela equipe do
CNPAF uma viagem s regieS'produtoras de feijo no Estado de Gois, com o objetivo de coletarem-
se amostras de ndulos para o isolamento de estirpes nativas. Nessa coleta foram enconh-ados ndu-
los, em maior ou men'or quantidade, em todos os locais visitados, obtendo-se uma coleo de 490
isolados (Tabela 3.3).
Tabela 3.3. Nmero de isolad6S de Rhizobium spp., isolados de ndulos espontneos de feijoeiro,
coletados em diferentes localidades nas regies produtoras de feijo no Estado de Gois,
1982.
Localidade Nmero de Isolados
Anicuns 40
Carmo do Rio Verde 45
Catura 40
Ceres 14
Firminpolis 39
Gois 30
Inhumas 49
Itabera 39
Itapuranga 71
Itau 48
Jaragu 34
Nazrio 10
Uruana 31
Total 490
96
Recentemente, observou-se nodulao espontnea abundante em plantas de feijo da cultivar
Diamante Negro (grupo comercial preto), em Gois, em um campo que fora pastagem por 40 anos
antes da introduo do feijo, e na cultivar Apor (grupo comercial carioca), em rea de produo de
feijo sob irrigao onde nunca foi feita a inoculao. Isto confirma a baixa especificidade do feijoeiro,
em relao s exigncias quanto ao seu microsimbionte, e demonstra as dificuldades que o inoculante
tem que enfrentar ao ser introduzido no solo, sugerindo que a resposta inoculao poder tambm
depender do histrico de cultivo da rea plantada.
Os rizbios que nodulam o feijoeiro podem ter seus genes de nodulao induzidos por diversos
flavonides liberados pelas sementes e razes de feijo (Hungria et aI., 1992). No se pode descartar,
portanto, a possibilidade dessa induo ocorrer por compostos liberados por outras leguminosas pre-
sentes na rea de cultivo, na ausncia do feijoeiro, ampliando sua gama de hospedeiros alternativos e
oferecendo uma vantagem para o estabelecimento e permanncia no solo das estirpes inoculadas.
Entretanto, isso pode representar um problema no futuro, no evento da pesquisa criar novos inoculantes
a serem introduzidos no solo, pois eles tero que competir com aqueles previamente estabelecidos.
Talvez a alternativa seja a obteno de bactrias competitivas (para que consigam beneficiar a cultura
quando introduzidas), mas que sejam especficas para o feij oeiro de modo que no sobrevivam no solo
de uma estao de plantio para outra. A nica exigncia seria a reinoculao a cada plantio.
3.2.4. Competitividade nodular
A nutrio nitr"ogenada das culturas que dependem do nitr"ognio fixado est diretamente rela-
cionada eficincia das bactrias que ocupam os ndulos. Nem sempre os rizbios naturalizados so
os mais eficientes na fixao de nitrognio (Baldwin & Fred, 1929; Dunham & Baldwin, 1931), con-
tribuindo muito pouco ou nada para a nutrio nitr"ogenada do feijoeiro. A alternativa, ento, a
inoculao das sementes com estirpes mais eficientes (Baldwin & Fred, 1929). Porm, nesses casos,
a inoculao das sementes com lizbios mais eficientes s tr"ar benefcios para a cultura se o inoculante
for composto por rizbios mais competitivos (Nicol & Thornton, 1941). Esse conceito foi proposto h
mais de 50 anos, porm, infelizmente, ainda pouco se conhece sobre os mecanismos que conferem
maior competitividade a certas estirpes.
Define-se competitividade nodular como a relao entr'e a representao numrica de uma
determinada estirpe de Rhizobium. no inculo, e sua representao numrica nos ndulos do hospedei-
ro. Uma estirpe considerada competitiva quando, representando menos de 50% do inculo, ocupa
mais de 50% dos ndulos do hospedeiro. Entretanto, a ocupao nodular uma medida indireta _da
competitividade de uma estirpe, pois pode ser alterada em conseqncia da dose de inculo. Em solos
com populao estabelecida de rizbios especficos para uma determinada cultura, a inoculao em
massa pode resultar em melhor ocupao no dul ar pelo inoculante, como demonstrado para soja (Dunigan
et aI., 1984; Weaver & Frederick, 1974) e tr"evo (Martensson, 1990). Nesses casos, foi necessrio
empregar uma dose de inoculao (por semente) mil vezes maior que a populao do solo, mas nem
sempre esse procedimento funciona (Meade et aI., 1985).
Os exemplos citados ilustr"am a complexidade de se obterem respostas inoculao em solos
com populao estabelecida. O grupo NiITAL, no Hava, computou resultados de experimentos de
inoculao de leguminosas, realizados em diversos anos e em diversas localidades naquele Estado,
97
com o objetivo de se estabelecerem modelos matemticos que permitissem predizer a resposta de uma
leguminosa inoculao levando em considerao a populao do solo (Thies et aI., 1991a, b). De
acordo com os dados, a resposta das leguminosas inoculao variou com o local e a espcie. A
inoculao resultou em aumento significativo da produtividade do feijoeiro em apenas 50% das vezes,
principalmente em solos com baixa populao de rizbios especficos 100 . g-l solo) para a cultura
(Thies et aI., 1991a). Em trabalho subseqente, os autores observaram que, na ausncia de rizbios
naturalizados no solo, a magnitude da resposta inoculao diretamente proporcional disponibili-
dade de N no solo, e desenvolveram um modelo matemtico para prever a resposta inoculao,
levando em conta a populao nativa de rizbios e o N do solo (Thies et aI., 1991b).
Como dito anteriormente, muito difcil encontrarem-se plantas de feijo sem ndulos. Alm
disso, o carter de promiscuidade nodular do feijoeiro mais uma barreira a ser transposta para que a
inoculao- tenha sucesso. preciso, portanto, que num primeiro passo na busca de inoculantes mais
eficientes, seja feito um levantamento qualitativo e quantitativo da populao naturalizada de rizbios;
preciso que se conhea bem o "inimigo" para elaborar a melhor estratgia numa batalha. Os resul-
tados conhecidos, por exemplo, no deixam claro se Rt intrinsecamente mais ou menos competitivo
que Rlp/Re, pois so contraditlios (Martinez-Romero & Rosenblueth, 1990; Streit et aI., 1992; Straliotto
et aI., 1992). A competitividade relativa entre Rt e Rlp/Re pode, tambm, ser alterada de acordo com
as condies do solo (Wolff et aI., 1991). Amaioria dos levantamentos indica que 90% da populao
dos solos onde o feijoeiro cultivado composta por Rlp ou Re (Martinez et aI., 1985, 1988; N.M.H.S,
comunicao pessoal), mas ainda faltam dados sobre levantamentos de ndulos provenientes de plan-
tas cultivadas em solos onde nunca houvera feijo. Provavelmente sero necessrias estratgias dife-
rentes caso a inoculao v ser feita em um solo onde predomina Rt ou Rlp/Re.
3.2.5. Tolerncia a estresses
O feijoeiro nodulado extremamente sensvel a estresses, tais como alta temperatura e baixo
pH do solo, associado ou no a nveis txicos de A1
3
+ (Piha & Munns, 1987). Uma das alternativas
para se buscar melhor resposta inoculao nessas condies seria, portanto, a inoculao com estir-
pes tolerantes alta temperatura e/ou acidez do solo, de acordo com cada situao. Em um trabalho
preliminar, Hungria & Franco (1993) no encontraram nenhuma estirpe de Rlp que mantivesse a
fixao de nitrognio ativa a 35C ou 38C. Em contrapartida, Cunha & Franco (1988) haviam obser-
vado que as rvores Leucaena leucocephala e Prosopis juliflora, inoculadas com estirpes tolerantes
alta temperatura, mantinham uma fixao ativa a 35C e 38C. Sabendo que certas estirpes, isoladas
dessas e outras rvores, so capazes de nodular e fixar nitrognio em associao com o feijoeiro,
Hungria et aI. (1993) observaram fixao de nitrognio a 40C, sob condies controladas, pelo feijoeiro
inoculado com estirpes de Rt, sugerindo que essas estirpes tm potencial para melhorar a
inoculao em reas tropicais sujeitas a temperaturas elevadas, como observado por Karanja & Wood
(1988a) e S et aI. (1993).
Os efeitos da acidez do solo so notados tanto sobre a planta quanto sobre seus simbiontes.
Em solos cidos, a sobrevivncia dos rizbios comprometida, o que acarreta reduo na nodulao.
H resultados na literatura que demonstram que algumas estirpes de Rt so resistentes ao da
acidez e do alumnio (Cunningham & Munns, 1984; Graham et aI., 1982; Karanja & Wood, 1988b;
98
Vargas & Graham, 1988), tendo sido mais competitivas na nodulao do feijoeiro cultivado sob condi-
es de acidez elevada (Ramos et aI., 1987; Vargas & Graham, 1989; Wolff et aI., 1993). Esses resul-
tados reforam a potencialidade da inoculao do feijoeiro com estirpes de Rt nos solos tropicais, e
justificam a busca dessas estirpes para a composio do inoculante comercial.
Alm dos efeitos nocivos da temperatura e acidez elevadas, os rizbios inoculados esto sujei-
tos a outros tipos de estresse, como deficincia hdrica e salinidade do solo, e a estresses biticos
como, por exemplo, a presena, no solo, de antibiticos ou outras substncias txicas produzidas por
membros da microflora do solo. Em relao salinidade, Santos et aI. (1990) observaram resposta
inoculao do caupi (Vigna unguiculata) com estirpes de Bradyrhizobium sp. previamente selecionadas
como tolerantes a alto nvel de salinizao. Essas observaes sugerem que a inoculao vivel, e as
respostas positivas, quando se empregam as plantas e bactrias apropriadas para cada condio. O
papel mais importante da pesquisa identificar essas combinaes.
3.3. A Planta Hospedeira
. O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) teve origem no continente americano, tendo sido
levado ao Velho Mundo c0!ll0 planta ornamental aps o descobrimento da Amrica (Zimmermann &
Teixeira, 1988): Dois centros de origem/domesticao foram definidos para o feijoeiro comum, um na
Mesoamlica e outro na zona Andina (para revises veja Gepts, 1988; Debouck & Tohme, 1989). Os
materiais originados desses centros apresentam variaes em caracteres morfolgicos como tamanho
da semente, idade de florao, hbitos de crescimento, em marcadores moleculares como a faseolina,
isoenzimas e DNA mitocondrial, e na efetividade da simbiose com o Rhizobium (Kipe-Nolt et aI.,
1992). A posio sistemtica do gnero Phaseolus, conforme Vilhordo et aI. (1988) a
seguIr.
Diviso: Angiospermae
Classe: Dicotyledoneae
Subclasse: Archichlamydae
Ordem: Rosales
Sub ordem: Leguminosineae
Famlia: Leguminosae (Fabaceae)
Subfamlia: Faboideae
Tribo: Phaseoleae
Subtribo: Phaseo/ineae
Gnero: Phaseolus
O gnero Phaseolus compreende mais de 100 espcies dipllides (2n = 22), mas apenas quatro
delas, P. vulgaris L., P coccineus L., P. acutifolius Gray varo latifoNus Freem e P. lunatus varo lunatus,
so cultivadas comercialmente (Zimmermann & Teixeira, 1988). Neste captulo discutida a espcie
cultivada de maior importncia econmica, P. vulgaris L.
99
3.3.1. Hbitos de crescimento
O feijoeiro comum apresenta quatro tipos de planta, classificados de acordo com o hbito de
crescimento (Vilhordo et aI., 1980):
Tipo I - crescimento determinado, porte arbustivo, com ramificao ereta, fechada;
Tipo n - crescimento indeterminado, porte semi-arbustivo, com ramificao ereta, fechada;
Tipo In - crescimento indeterminado, porte semi-arbustivo, com ramificao aberta;
Tipo IV - crescimento indeterminado, porte prostrado ou trepador.
A durao do ciclo da cultura varia com o hbito de crescimento, tendo as cultivares do Tipo I
o ciclo mais curto, cerca de 60 a 70 dias do plantio colheita (cultivares precoces) e as do Tipo IV o
ciclo mais longo, com mais de 100 dias do plantio colheita (cultivares tardias). As cultivares dos
Tipos n e In apresentam ciclos intermedirios, durando cerca de 80 a 100 dias do plantio colheita, de
acordo com a cultivar e com as condies ambientais.
Graham & Halliday (1977), Graham & Rosas (1977) e Graham (1978) demonstraram diferen-
as entre cultivares na habilidade de fixar nitrognio no campo; nesses estudos, os autores observaram
que as cultivares trepadoras (Tipo IV) eram consistentemente superiores s demais na nodulao e
fixao de nitrognio, enquanto as do Tipo I eram consistentemente inferiores (Tabela 3.4 e Figura
3.1). Variabilidade genotpica tambm foi demonstrada por Westerman & Kolar (1978) e Pereira et aI.
(1984), que sugeriram que tal variabilidade poderia servir de base para o melhoramento gentico dessa
caracterstica no feijoeiro.
Tabela 3.4. Parmetros da fixao de nitrognio em oito cultivares de feijoeiro comum, com diferen-
tes hbitos de crescimento, quando cultivadas no campo. Adaptada de Graham (1981).
Cultivar Hbito de Idade de Peso de Ativ. Red. de
Crescimento Florao Ndulos Acetileno
(dias)*
(mg. pl-I)** (flmol C
2
H
4
. pl-I . h-
I
)**
P635 I 42 8,8 0,8
P536 I 41 73,4 10,0
P417 II 55 23,1 7,5
P561 II 43 69,1 8,8
P589 III 60 46,9 8,5
P498 III 50 118,4 32,2
P717 IV 48 99,3 17,4
P590 IV 66 545,6 37,7
* Tempo at que 50% das plantas apresentassem pelo menos uma 110r abelia.
** Valores mximos obtidos para cada parmetro dUrlUlte o ciclo.
.-
I
.c.
.-
I
o.
N
U
21
15
9
o 3
E
~
25 39
TEMPO
100
67 81
PLANTIO (dias)
Figura 3.1. Perfil da fixao de nitrognio (reduo do acetileno) ao longo do
ciclo de quatro variedades de feijo, com diferentes hbitos de
crescimento (indicado entre parnteses). Segundo Graham (1981).
Recentemente, Hardarson et aI. (1993) compilaram e analisaram resultados de experimentos
realizados em todo o mundo visando a quantificao da fixao de nitrognio pelo feijoeiro em simbiose,
e observaram que nos diferentes experimentos o feijoeiro fixou de 35% a 70% do nitrognio total
encontrado nas plantas (Tabela 3.5), sendo os valores mais altos obtidos quando as condies ambientais
eram favorveis ao desenvolvimento da cultura. Os autores observaram ainda que, em geral, as culti-
vares com tipos mais indeterminados e trepadores fixaram mais nitrognio que as cultivares de hbito
determinado, mas que entre estas ltimas, aquelas com maturao ligeiramente mais tardia podem
fixar um pouco mais que as mais precoces. Esses resultados indicam que h possibilidade de se
melhorar a fixao de nitrognio pelo feijoeiro atravs de uma seleo criteriosa e do melhoramento
gentico.
Vrios trabalhos j foram realizados na tentativa de se elucidarem as causas das diferenas no
potencial de fixao de nitrognio por diferentes sistemas simbiticos, e os resultados de alguns deles
podem ser aplicados ao feijoeiro. Os trabalhos de Lawrie & Wheeler (1973), Minchin & Pate (1973),
Lawn & Brun (1974), Streeter (1974), Hardy & Havelka (1976) Herridge & Pate (1977), Mahon
(1977) e Wilson et alo (1978) indicaram que a disponibilidade de carboidratos, provenientes da
fotossntese, para os ndulos, um dos fatores mais limitantes fixao de nitrognio. No feijoeiro,
cultivares trepadoras parecem transferir mais carboidratos para os ndulos que as cultivares com ou-
tros hbitos de crescimento (Graham, 1981). Graham & Rosas (1977) observaram que as cultivares de
porte arbustivo, logo aps a germinao, absorvem N do solo mais rapidamente que as trepadoras, o
que pode reduzir o suprimento de carboidratos aos ndulos (Small & Leonard, 1969), diminuindo a
fixao de nitrognio.
101
Tabela 3.5. Variabilidade na fixao de nitrognio por cultivares de feijo testadas em diversas lo-
calidades. Segundo Hardarson et alo (1993).
Localidade Ano NDAr* Fixao N de cultivares
(%) (kg. ha-
l
)
ustria 1987 27-67 25-165 29
Brasil, Goinia 1987 12-25 4-12 17
Piracicaba 1987 12-25 11-53 7
Chile 1987 38-60 27-62 21
1988 27-60 25-115 12
Colmbia 1985 32-47 18-36 9
Guatemala 1989 (Vero) 69-73 92-125 10
1989 (Inv.) 22-57 12-50 10
Mxico, Irapuato 1987 5 .. 58 7-108 20
Colima 1988 (Inv.) O-50 0-70 17
Peru 1986 (Inv.) 24-56 15-59 20
1988 (Vero) l3-56 7-81 22
Nitrognio total derivado do ar pela fixao simbitica.
3.3.2. Ciclo da cultura
A durao do ciclo da cultura e, conseqentemente, do perodo ativo de fixao de nitrognio
pode influenciar o resultado final. Por exemplo, Zapata et aI. (1987a) observaram que a soja tem
fixao inicial limitada, com a parte mais substancial ocorrendo aos 74 dias aps o plantio; ao final do
ciclo, 50% do N na soja foi proveniente da fixao. J em fava (Viciafaba), a fixao mais expressiva
ocorreu dos 60 aos 110 dias aps o plantio, e a cultura terminou o ciclo com 75% do N proveniente da
fixao (Zapata et aI., 1987b). Em feijo, Franco et aI. (1979) observaram que a fixao de nitrognio,
medida pela reduo do acetileno (Hardy et al., 1968) foi baixa durante as duas primeiras semanas
aps o plantio, com um pico na florao e subsequente queda acentuada. Teoricamente, portanto,
plantas que comecem a fixar nitrognio mais cedo e mantenham um perodo de fixao ativa mais
longo podero se beneficiar com maior quantidade de N fixado incorporado nas vagens.
A eficincia da fixao de nitrognio pelo feijoeiro pode ser afetada pela idade em que as
plantas comeam a translocar o N fixado para as vagens (Pefia-Cabriales et al., 1993), o que tambm
ocorre na soja e caupi (Hungria &Neves, 1987; Neves & Hungria, 1987), que, por sua vez, depende
dos gentipos da planta e da bactria. As vagens em desenvolvimento podem competir por produtos
da fotossntese e reduzir o crescimento nodulare a fixao de nitrognio (Lawn & Brun, 1974). Entre-
102
tanto, Hansen et aI. (1993a) observaram que a remoo dos frutos em formao, de plantas de feijo,
a partir dos 37 dias aps o plantio, estimulou a respirao nodular e no afetou a eficincia dos ndu-
los, sugerindo que a atividade simbitica no foi negativamente afetada pela competio por carboidratos
entre os ndulos e os frutos. Os autores conc1uiram ainda que a precocidade da reproduo no ciclo do
feij oeiro no parece ser responsvel pela performance inadequada de fixao de nitrognio no campo.
Em um estudo do desenvolvimento da fixao de nitrognio pelo feijoeiro, Peia-Cabriales et
aI. (1993) observaram que a maior taxa de assimilao de nitrognio ocorreu durante a fase reprodutiva,
coincidindo com o perodo em que a quantidade e a atividade dos ndulos da coroa da planta decres-
ceram. Os autores sugeriram que essa contradio poderia ser explicada pela fixao ocorrida nos
ndulos formados nas razes secundlias do feijoeiro (nodulao mais tardia), que selia essencial para
suprir a planta com N, o que foi posteriormente confirmado por Hardarson et aI. (1989) e Wolyn et aI.
(1989).
Uma estratgia para melhorar a fixao de nitrognio pelo feijoeiro seria a extenso do perodo
de atividade fixadora, buscando-se combinaes de planta e bactria capazes de suportar uma nodulao
efetiva precoce e de manter os ndulos em atividade por mais tempo. A nodulao efetiva precoce j
foi observada e apontada como um fator que aumenta a fixao de nitrognio pelo feijoeiro por diver-
sos autores (Hungria & Thomas, 1987; Barradas & Hungria, 1989; Barradas et aI., 1989; Chaverra &
Graham, 1992; Kipe-Nolt et aI., 1993; Kipe-Nolt & Giller, 1993). Se os ndulos formados nas razes
secundrias tm papel importante na fixao de nitrognio pelo feijoeiro, cabe pesquisa determinar
maneiras de fazer com que o inoculante atinja essas razes, garantindo assim que esses ndulos sejam
formados por estirpes mais eficientes que as do solo.
3.3.3. Nmero de ndulos
Em um trabalho pioneiro, Dbereiner (1966a) demonstrou que havia uma correlao positiva
e significativa entre a quantidade de tecido nodular ativo e a quantidade de nitrognio acumulado em
plantas de feijo dependentes do N fixado. Posteriormente, Wadisisuk & Weaver (1985) observaram
a mesma correlao em caupi. Essas observaes sugerem que uma estratgia que resulte em mais
ndulos por planta pode contribuir com maior fixao de nitrognio para a cultura. Recentemente,
Pereira et aI. (1993) demonstraram ser possvel aplicar tcnicas convencionais de melhoramento gen-
tico para obterem-se plantas de feijo com maior nodulao, e que o ganho gentico em nmero de
ndulos acompanhado por ganho na quantidade de nitr'ognio fixado (Tabela 3.6). Os autores
sugerem que um dos benefcios advindos da maior suscetibilidade nodulao seria a formao de
maior nmero de ndulos nas razes secundlias que, segundo Wolyn et aI. (1989), contribuem com
uma grande proporo do N fixado pelo feijoeiro.
A correlao entr'e a maior nodulao e o aumento na fixao de nitrognio pelo feijoeiro,
entretanto, no linear. Hansen et aI. (1993) observaram que uma mutante supernodulante de feijoeiro
apresentou uma massa nodular duas vezes maior e um nmero de ndulos seis vezes maior que os
parentais. Entr'etanto, a fixao de nitrognio foi quase igual, sugerindo que a supernodulao resulta
em formao de ndulos menores, com menor eficincia relativa. So necessrios estudos mais deta-
lhados das plantas com maior nmero de ndulos, no sentido de se quantificar, no campo, sua fixao
de nitrognio e a contribuio dessa fixao para o aumento da produtividade da cultura.
103
Tabela 3.6. N odulao de plantas de feijo aps trs ciclos de seleo visando o aumento do nmero
de ndulos. Segundo Pereira et aI. (1993).
CiclolPopulao* NNd Peso Nd-rng/pl N Fixado
(% Cont.)** (%Cont)
(kg . ha-
1
)
Co
Controle (Med.pais) 102 (100) 134 (100) 43
Populao Total 94 (92) 138 (103) ND
Indiv. Selecionados 130 (127) 153 (114) ND
C
1
Controle (Med. pais) 158 (100) 226 (100 ND
Populao Total 162 (102) 269 (119) ND
Indiv. Selecionados 235 (149) 304 (135) 44
C
2
Controle (Med. pais) 111 (100) 151 (100) ND
Populao Total 175 (158) 210 (139) ND
Indiv. Selecionados 234 (211) 242 (160) 53
* co' C
l
e C
2
so ciclos de seleo correspondentes populao basal (Co) e dois ciclos de recombinaes atravs de intercruzamentos (C
l
e C
2
).
** Porcentagem em relao ao controle.
3.3.4. Seletividade nodular
Alguns gentipos de soja carregam genes que lhes conferem a habilidade de restringir a
nodulao de suas razes por bactrias de determinados sorogrupos encontrados nos solos (ver captu-
lo anterior). Essa habilidade foi logo vista pelos microbiologistas como mais uma arma para solucio-
nar o problema da falta de competitividade dos inoculantes, pois atravs de melhoramento podelia ser
possvel manipular o hospedeiro de forma a alterar a especificidade na nodulao, favorecendo a
ocupao dos ndulos por estirpes melhoradas, em solos onde predominem estirpes de sorogrupos
que so excludos dos ndulos pelo hospedeiro (Devine & Weber, 1977; Devine & Breithaupt, 1980).
No feijoeiro e em outras leguminosas, esse tipo de especificidade no conhecido. Entretan-
to, conhecem-se casos em que a planta exerce controle sobre a velocidade com que os ndulos so
iniciados por determinadas estirpes, como no trevo (Jonas & Hardarson, 1979), soja (Cregan & Keyser,
1986) e alfafa (Hardarson et aI., 1982). Em trabalho recente, em que foram avaliados 50 gentipos de
feijoeiros selvagens e cultivados, Kipe-Nolt et aI. (1992) observaram uma tendncia dos gentipos de
origem Mesoamericana em nodular mais rapidamente com RIp do que com Rt. Em contrapartida,
alguns dos gentipos de origem Andina tenderam a nodular mais rapidamente com Rt. Esses resulta-
104
dos indicam a importncia do germoplasma selvagem, como fonte de caractersticas desejveis a
serem transferidas para as valiedades cultivadas, e sugerem uma interessante linha de estudos que
merece mais ateno, uma vez que pode oferecer uma soluo simples para um problema to comple-
xo.
Um outro aspecto interessante a aparente capacidade de certas cultivares em selecionar, den-
h"o da populao de lizbios do solo, aqueles mais eficientes na fixao de nih"ognio. Esse tipo de
seletividade foi observado recentemente com a cultivar de feijo Apor. Durante dois anos, em expe-
rimentos realizados em rea de um produtor de feijo em Jussara - GO, Pereira e colaboradores no
observaram resposta daquela cultivar inoculao ou adubao nitrogenada, obtendo boa produtivi-
dade (dados no publicados). Essa ausncia de resposta adubao nitrogenada e inoculao pelo
feijoeiro pode refletir uma de duas possibilidades: a) o solo rico em nitrognio, ou b) os rizbios
nativos so eficientes o suficiente para promover a produtividade da cultura.
Na tentativa de elucidar essa situao foi conduzido naquela propriedade um experimento que
incluiu uma linhagem no-nodulante de feijoeiro como testemunha (Araujo, dados no publicados).
Se o solo fosse rico em nih"ognio, a linhagem no-nodulante no deveria responder adubao
nih"ogenada, ao passo que se o solo fosse rico em rizbios eficientes deveria haver resposta aduba-
o. Naquelas condies, a cultivar Apor no respondeu adubao ou inoculao, enquanto a
linhagem no-nodulante apresentou resposta linear adubao nitrogenada (Tabela 3.7). Esses dados
sugerem que h possibilidade de se obterem boas produtividades com a fixao de nitrognio, desde
que se utilizem variedades apropriadas, cultivadas nas condies adequadas. A capacidade das culti-
vares atualmente recomendadas para cultivo em nodular com os rizbios do solo merece estudos.
Tabela 3.7. Produtividade do feijoeiro irrigado em resposta adubao nitrogenada em um solo
arenoso em Jussara-GO, 1993.
Adubao* Produtividade (kg. ha-
1
)**
Linhagem Variedade
NORH 54*** Apor
PK 902 b
r,
2157
NPK 1314 ab 2008
NPK+N 1578 a 2258
* PK = 80 kg de P
2
0
S
' h e 60 kg de K
2
0 . l J a ~ ; NPK = PK + 30 kg de N . h a ~ no plantio; NPK + N = NPK + 30 kg de N . h em cobertura.
** Nmeros seguidos pela mesma letra, na mesma coluna, so significativamente diferentes de acordo com o teste de Tukey (a. = 0,05).
*** Linhagem llo"llodulallte de feijo.
105
3.3.5. Nodulao na presena de N no solo
Os efeitos negativos do nitrognio combinado sobre o nmero e o tamanho dos ndulos de
leguminosas so conhecidos h muitos anos (Fred & Graul, 1916; Strowd, 1920), sendo posteriormen-
te observados efeitos negativos sobre a massa e a atividade do tecido nodular, sugerindo mltiplos
efeitos sobre os sistemas simbiticos (Streeter, 1988). Uma forma de aliviar esse problema o conhe-
cimento dos mecanismos que causam efeitos negativos, com a conseqente busca de maneiras para
san-los. Uma outra alternativa a busca de gentipos de plantas e bactrias que tolerem a presena
do nitrognio combinado, estabelecendo uma simbiose funcional.
Em um screening de gentipos de soja, Herridge & Betts (1988) encontraram alguns que fo-
ram capazes de nodular e fixar nitrognio quando cultivados em solo rico em N. Os autores sugeriram
que esses gentipos representavam boas fontes de caractersticas desejveis a serem introduzidas atra-
vs de programas de melhoramento. Recentemente, Francisco Jr. & Akao (1993) observaram que a
habilidade da soja nodular na presena de N regulada pela parte area da planta, por um mecanismo
que tambm afeta a resposta autoreguladora da nodulao. A alterao nesses mecanismos d origem
a plantas mutantes supernodulantes, capazes de suprir uma possvel inibio da fixao de nih'ognio
pelo N combinado com a' produo de maior massa nodular.
Em estudos sobre o microsimbionte da alfafa, R. meli/ati, Dusha et aI. (1989) observaram que
os genes ligados iniciao da nodulao, nodABC, tm sua expresso regulada pela presena de N, e
obtiveram mutantes capazes de nodular a alfafa na presena de amnia. O mesmo tipo de regulagem
foi sugelido para Brac(vrhizobiumjaponicum por Wang & Stacey (1990). Nelson (1983) observou
diferenas enh'e estirpes de R. leguminosarum bv. viciae no grau de inibio da atividade da nih'ogenase
na presena de N combinado, sugerindo a possibilidade de se aumentar a fixao de nitrognio em
ervilha pela seleo de rizbios tolerantes ao nitrognio.
Em feijo, entretanto, no se conhecem mutantes supernodulantes ou mesmo indicaes preci-
sas de que algum gentipo de planta ou estirpe seja capaz de nodular normalmente na presena de N
no solo. Os relatos de efeitos do N combinado na simbiose do feijoeiro so contraditrios. Franco &
Dbereiner (1968), por exemplo, observaram que a aplicao de uma dose equivalente a 20 kg de N .
ha-
1
proporcionou um aumento substancial na nodulao, enquanto Trinchant & Rigaud (1984) de-
monstraram que a aplicao de N - nitrato na concenh'ao de 3,5 mM causou uma reduo no forne-
cimento de poder redutor para a dinitrogenase, conh'ibuindo para uma reduo na fixao de nih'og-
nio. Mais recentemente, Silva et aI. (1993) observaram que a aplicao foliar de nih'ognio para o
feijoeiro inoculado foi menos supressiva que a aplicao ao solo, e obtiveram aumento significativo
na nodulao e atividade da nitrogenase com esse tratamento. Os autores sugeriram que deve haver
possibilidade de se aumentar a fixao de nih'ognio pelo feijoeiro com a aplicao de "doses home-
optica" de nih'ognio por via foliar.
Esses dados coincidem com algumas observaes empricas da nodulao espontnea da cul-
tivar Apor, em rea de cultivo sob irrigao com piv cenh'al, em Jussara - GO. Nessa propliedade
no foi feita a inoculao das sementes e o feijo foi plantado com uma adubao de 600 kg . ha-
1
da
frmula 4-30-16 (equivalente a cerca de 24 kg de N . ha-
1
) e recebeu adubaes foliares semanais
(cerca de oito) com 10 kg de N . ha-
1
(uria). Foi encontrada nodulao abundante e efetiva (ndulos
com colorao interna vermelha) em todas as 100 plantas coletadas ao acaso dentro do piv (dados
106
no publicados), sugerindo a possibilidade de se estar trabalhando com uma variedade de feijo capaz
de suportar nodulao e fixao de nitrognio satisfatrias na presena de N combinado. Mais estu-
dos so necessrios para que essas situaes possam ser elucidadas.
Finalmente, foi observado por Sanjuan & Olivares (1989) que um dos plasmdios da estirpe
GR4 de R. meliloti (Rm) carrega uma seqncia de DNA denominada nfe (nodule formation efficiency),
cuja expresso est sob controle da expresso da regio nffA (ligada sintese da dinitrogenase - ver
captulo anterior) que, por sua vez, regulada pela concentrao de N no meio. A expresso de nfe
aumenta a competitividade nodular da estirpe GR4. Apesar de no ter sido encontrada em outras
estirpes de Rm, essa regio gentica oferece uma fascinante idia para a manipulao da competitividade
de outras estirpes de Rhizobium. Por exemplo, bactrias que contenham a regio rife e que sejam
capazes de nodular e fixar nitrognio normalmente na presena de N combinado, podero ter vanta-
gens competitivas sobre os rizbios do solo, permitindo resposta inoculao em solos com popula-
o estabelecida. Essa linha de pesquisa merece mais ateno.
3.4. Fatores Externos que Afetam a Simbiose Rltizobiul1l x Feijoeiro
Em termos agrcolas, no basta que haja disponibilidade das melhores variedades de uma
determinada cultura para garantir a produtividade; necessrio que se proporcionem s culturas as
condies de cultivo adequadas, de acordo com recomendaes tcnicas, para se atingir o potencial de
produtividade em cada caso. O feijoeiro nodulado, como todas as culturas, requer condies ideais de
umidade, fertilidade e preparo do solo, temperatura e controle de pragas e doenas para que a produ-
o seja satisfatria. So apresentadas a seguir informaes sobre alguns aspectos agronmicos rele-
vantes.
3.4.1. Preparo e fertilidade do solo
As exigncias nutricionais das plantas noduladas so maiores que as daquelas que recebem N
mineral, pois h necessidade de manter no apenas a planta e o rzbio, mas tambm de atender a
requerimentos especficos do sistema simbitico. O feijoeiro sempre foi caracterizado como cultura
de subsistncia, sendo cultivado em pequenas propriedades e nas reas de solos mais frteis dessas
propriedades (Moraes, 1988). Entretanto, a necessidade de aumentar a produo de alimentos e a
garantia de um mercado consumidor tm animado produtores a expandir a rea cultivada, inclusive
com o investimento de capital em preparo e correo do solo, mecanizao e irrigao complementar.
Essas prticas j so uma meia garantia de aumento na produtividade do feijoeiro, principalmente se
associadas ao plantio de cultivares modernas e mais produtivas.
Em relao ao preparo do solo, todas as culturas sofrem reduo no crescimento do sistema
radicular em decorrncia de compactao das camadas subsuperficiais do solo. A formao dessa
camada ocorre ptincipalmente em solos de textura pesada, devido ao excesso de mecanizao, sendo
as gradagens grandes responsveis pela formao do chamado "p-de-grade". O sistema radicular
truncado pelo p-de-grade representa menor rea para sernodulada, alm de sujeitar a planta a estresses
como deficincia hfdlica e desnutrio, uma vez que as raizes, que se concentram nas camadas mais
superficiais do solo, no conseguem buscar gua e nutrientes suficientes. O plantio direto ou cultivo
mnimo uma alternativa para se reduzirem os problemas fsicos do solo, e tem sido testado com
107
relativo sucesso na cultura do feijo. Entretanto, faltam resultados concretos de trabalhos de pesquisa
para que essa prtica se torne uma recomendao para a cultura.
A adubao recomendada para a cultura do feijo no Brasil pode ser generalizada em cerca de
250 kg de uma frmula do tipo 4-30-16 por hectare, adicionada de zinco, plincipalmente nos solos de
cerrado, e de outros micronutrientes de acordo com as necessidades detectadas pela anlise do solo. A
adubao nitrogenada recomendada para o feijoeiro , em mdia, de 60 kg de N . ha-
1
, sendo normal
a aplicao de metade da dose no plantio e a outra metade em cobertura, dividida ou no em duas ou
mais parcelas. A resposta da cultura a essa adubao vai depender da cultivar plantada. Em diversos
experimentos recentes, por exemplo, constatou-se que a cultivar Apor no parece responder aduba-
o nitrogenada ou, se responde, o incremento na produo em relao s plantas noduladas por estir-
pes nativas ou pelo inoculante questionvel, muitas vezes no compensando a adubao (Tabela
3.8.). Por essa razo, tem-se recomendado que seja eliminada a adubao nitrogenada no plantio em
favor da inoculao das sementes, fazendo-se uma adubao de cobertura durante a fase vegetativa
(Figura 3.2), caso a cultura apresente sintomas de deficincia de nitrognio. No caso de adubos
formulados, j contendo nih'ognio, os estudos preliminares indicam que essa dose de N no alta o
suficiente para inibir a formao dos ndulos, mas h necessidade de mais estudos para confirmar tais
resultados,
Tabela 3.8. Produtividade da cultivar de feijo Apor, em ensaios em rede realizados no Estado de
Gois, plantio da seca, 1993.
Localidade Produtividade (kg . ha-
1
)*
SI Inoculao CI Inoculao NPK**
Pirenpolis 2181 2136 2154
Goianira 2094 2113 2252
* Mdias de quatro repeties.
* * Adubao com 30 kg de N . hal- no plantio + 30 kg de N . hal- em cobel1ura.
Os solos h'opicais so conhecidamente pobres em fsforo. Por isso, a adubao fosfatada no
plantio fundamental para a produtividade do feijoeiro. Quanto ao feijoeiro inoculado, a recomenda-
o no diferente, j tendo sido apontado por vrios autores que em experimentos onde se pretende
estudar o desempenho de leguminosas inoculadas imprescindvel que a cultura disponha de nveis
adequados de todos os nuh'ientes (Cassman et aI., 1981; Frana et aI., 1973; Gates & Wilson, 1974;
Hernandez & Focht, 1985; Lynd & Ansman, 1989, 1990). Em h'abalho recente, Tsai et aI. (1993)
observaram que a nodulao e a fixao de nih'ognio pelo feijoeiro respondeu positivamente ao au-
mento nos nveis de P, K e S do solo, e que quando o feijoeiro recebeu um balano adequado de
nutrientes, no houve inibio, mas sim um efeito sinergstico da adubao nitrogenada sobre a
nodulao e fixao do nitrognio, .
108
2500
o Controle Fase vegetativa ElJFlorao
2000
,-..
cu
.=
'"'Sll
o 1500
~
-=
cu
-=
....
~
....
....
1000
=
-=
= ...
~
500
O ~ . . . . . L _ -
Rio Tibagi
Carioca WBR22.34
Cultivar
Figura 3.2. Produtividade do feijoeiro inoculado, resultante da realizao de adubao nitrogenada
em cobertura, em diferentes fases do ciclo da cultura.
Em relao aos micronuhientes, o molibdnio tem papel vital na fixao de nih'ognio pelos
rizbios e na assimilao do nitrato absorvido do solo pela cultura (Marschner, 1986). A maioria dos
solos dispe de teores adequados de molibdnio, porm as interaes do elemento com a acidez do
solo muitas vezes o tornam indisponvel ao feijoeiro. Recente trabalho realizado em Minas Gerais
(Vieira et aI., 1992) demonsh'ou que a aplicao foliar de 20 g de Mo . ha-
1
resultou em aumentos
significativos da produtividade do feijoeiro inoculado, substituindo parcial ou completamente a adu-
bao nitrogenada nas condies do ensaio. Entretanto, esses resultados no podem ser generaliza-
dos, pois as respostas vo depender das condies de cada local de cultivo, Com efeito, em ensaios em
rede nacional para velificar a resposta da cultura adubao foliar com molibdnio, somente em
Viosa (MG) e no Esprito Santo tm sido observadas respostas positivas (dados no publicados).
Mais estudos so necesslios antes que se possa recomendar essa prtica para a cultura.
3.4.2. Acidez do solo
O feijoeiro, por ser uma planta sensvel acidez do solo, no cresce nem produz bem em solos
cidos (Moraes, 1988). Este tipo de solo, alm das deficincias em Ca e Mg, pode apresentar outros
problemas, como nveis altos de alumnio e mangans. As informaes a respeito da tolerncia do
feij oeiro acidez so relativamente escassas. H relatos que o pH timo para o crescimento da planta
109
situa-se entre 5,5 e 6,7 (Malavolta, 1976; Munns & Fox, 1976), e que o feijoeiro intolerante a nveis
de AI trocvel acima de 3 ppm (Ruschel et aI., 1968; Abruna et aI., 1975). Entretanto, existem diferen-
as entre cultivares de feijoeiro quanto tolerncia ao AI (Foy et aI., 1967; Spain et aI., 1975; Miranda
--& Lobato, 1978), e entre os rizbios quanto tolerncia ao pR, ao AI e ao Mn (Graham & Parker,
1964; D6bereiner, 1966; Graham et aI., 1982; Cunningham & Munns, 1984; Karanja & Wood, 1988a,
b; Vargas & Graham, 1988).
Dados de levantamentos de nodulao espontnea em feijoeiros cultivados no Estado de Gois
demonstram que a nodulao mais abundante quando as plantas so crescidas em pR mais prximo
da neutralidade (Figura 3.3). Essas observaes sugerem que o pR do solo afeta a quantidade de
rizbios disponveis para nodular a planta hospedeira, o que pode ter implicaes na competitividade
do inoculante, como demonstrado por Wolff et aI. (1993).
A calagem reduz os efeitos da acidez e das toxicidades de AI e Mn sobre a nodulao do
feijoeiro (D6bereiner, 1966b; Morales et aI., 1973; Graham et aI., 1980), alm de beneficiar a cultura
pela adio de Ca e, s vezes, Mg. A recomendao de calagem deve ser baseada na anlise do solo da
rea de cultivo. Em casos onde no se realiza a cal agem, a escolha da variedade de feijo e do inoculante
mais apropriado se torna o passo mais importante para que se obtenha uma produtividade razovel.
8 0 ~ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ~
60
!
"CI
=
-
=
~
. 40
~
"CI
=,
Z
20
o
5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 7.3 7.5
pH do solo
Figura 3.3. Distribuio de isolados de ndulos espontneos de feijoeiros coletados no Estado de
Gois, conforme o pH do solo.
110
3.4.3. Tratamento das sementes com defensivos agrcolas
Em muitos casos, e principalmente em reas onde o feijo cultivado todos os anos com ou
sem rotao de culturas, torna-se necesslio o tratamento das sementes com fungicidas e/ou insetici-
das para evitar que a incidncia de doenas e pragas afete o stand da cultura, reduzindo a produtivida-
de. Em plantios onde se pretende fazer a inoculao, imprescindvel que os rizbios inoculados
sejam tolerantes aos defensivos empregados no tratamento da semente; caso contrrio, haver morte
das bactrias e a inoculao falhar. Os resultados sobre a compatibilidade enh"e defensivos e inoculantes
(De Polli et aI., 1986) so relativamente antigos, faltando informaes sobre os produtos atualmente
registrados e recomendados para uso no tratamento das sementes de feijo. O nico estudo recente foi
realizado por Ramos & Ribeiro lr. (1993), testando o efeito dos fungicidas Ridomil 25%, Benlate
50%, Vitavax 75%, Banrot 40%, e Difolatan 80%, aplicados nas sementes sete dias antes da inoculao,
sobre a sobrevivncia das bactlias nas sementes. Os autores observaram que a estirpe CIAT899 (Rt)
teve melhor sobrevivncia nas sementes h"atadas que as estirpes CIAT652 e CPACl135 (Rlp). Os
fungicidas Benlate e Banrot foram os que causaram maior mortalidade das bactrias. Em adio, o
\
tratamento das sementes com Benlate reduziu a ocorrncia das bactlias inoculadas nos ndulos.
Em estudos semelhantes, realizados no laboratrio de microbiologia do CNPAF, observou-se
que o h"atamento das sementes com os fungicidas Benlate, Captan, Vitavax, Terraclor, Rizolex,
Rhodi auran, Tecto-100 e a mistura comercial de Vitavax + Thiran, nas doses recomendadas pelos
fablicantes, no causou morte total da estirpe CIAT899 nas sementes (dados no publicados), no
acarretando diferenas na quantidade de ndulos formados nas plantas provenientes de sementes plan-
tadas imediatamente aps, ou 24 horas aps o h"atamento e inoculao. Contudo, h que se considerar
que esses experimentos foram conduzidos em condies estreis, no se podendo exh"apolar para a
situao de plantio no solo. So necessrios estudos posteriores para verificar a eficcia do tratamen-
to das sementes com esses produtos em solos naturalmente infestados com fungos, e seu efeito sobre
a ocorrncia do inoculante nos ndulos.
Em relao aos inseticidas aplicados nas sementes, tambm h uma carncia de informaes.
Resultados de testes desenvolvidos no laboratrio de microbiologia do CNPAF sugeriram que o trata-
mento das sementes com Furadan (Carbofuran) no afeta os lizbios (CIAT899), que crescem normal-
mente em placas a cujo meio de cultura o inseticida foi adicionado (dados no publicados). Na falta de
resultados mais consistentes, recomenda-se como alternativa o uso do inseticida na forma granulada,
que aplicado ao sulco de plantio no far contato com as bactrias aplicadas s sementes. Uma ouh"a
alternativa para se empregarem inoculantes no plantio de sementes tratadas selia a utilizao de
inoculantes granulares. Entretanto, essa forma de inoculao no apreciada por produtores e o
produto praticamente indisponvel no mercado.
Finalmente, pouco tambm se conhece sobre os efeitos de herbicidas sobre os lizbios. Roslycky
(1985a) obteve variantes de diversas espcies de Rhizobium com adaptao para resistncia ao herbicida
Paraquat (1, l' - dimethyl - 4, 4' bipyridylium chloride) e observou que a nodulao, o acmulo de
matria seca, o vigor e a cor das plantas inoculadas com essas bactrias no foram alterados. Estes
dados demonstram a possibilidade de se obterem inoculantes capazes de tolerar os defensivos empre-
gados, mas deve-se levar em conta que algumas das modificaes decorrentes da adaptao para
tolerncia ao princpio ativo podem ser danosas s bactlias (Roslycky, 1985b). Existem duas manei-
111
ras principais de aplicao de herbicidas: pr-plantio, incorporado ao solo, e ps-plantio, pulverizado
aps a emergncia da cultura. TeOlicamente, os herbicidas aplicados pr-plantio tm mais chances de
afetar negativamente os rizbios, j que as sementes inoculadas faro contato com o solo tratado. Por
outro lado, os herbicidas aplicados ps-plantio s devero afetar os rizbios quando chegarem aos
ndulos, aps serem absorvidos e translocados para as razes pela planta, mas seus efeitos sobre a
atividade nodular so desconhecidos.
3.4.4. Inoculao das sementes
A inoculao das sementes a maneira de se promover o contato dos rizbios com as razes
emergentes da plntula, de forma que tenham acesso aos stios de infeco para a formao dos ndu-
los. imprescindvel que existam bactrias vivas na superfcie das sementes no ato do plantio. De um
modo geral, a inoculao consiste na mistura do inoculante turfoso com um veculo que serve como
adesivo. Esse veculo pode ser uma soluo de goma arbica pura, polvilhos caseiros ou acar cristal
(sacarose), no devendo ser empregadas colas comerciais porque possuem fungicidas e conservantes
txicos aos rizbios. A goma arbica e o acar cristal promovem a sobrevivncia das bactrias
inoculadas na superfcie das sementes, sendo a soluo de acar cristal aquela que permite que haja
bactrias vivas nas sementes pelo perodo mais longo (Figura 3.4).
7 . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ~ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ~
6
gua
Goma arbica a 10%
Q,I
....
Sacarose a 20%
= 5
Q,I
E
Q,I
~
.-
Q,I
4 ;;..
'C':S
.-
;;..
rIl
cu
3
-
=
- 'CI.I
Y
CII
2
=
~
o
-
1
o 1 2 3 4 5 6 10
Tempo aps a inoculao (dias)
Figura 3.4. Logaritmo do nmero de clulas viveis de Rhizobium tropici CIAT899 na superfcie de
sementes de feijo inoculadas com inoculante turfoso misturado em gua, goma arbica
ou sacarose, e mantidas temperatura ambiente.
112
Para fazer a inoculao das sementes do feijoeiro mistura-se uma dose de 250 g de inoculante
em um copo (do tipo americano) com gua a que se adicionaram duas colheres de sopa de acar
cristal, gerando uma lama preta. Essa lama , ento, aplicada a 40 kg de sementes, misturando-se bem
para que as sementes fiquem completamente revestidas pelo inoculante. A inoculao pode ser feita
sobre o cho (cimento) limpo, sobre uma lona, em sacos plsticos ou, preferencialmente, em um
tambor de eixo descentralizado, sempre sombra. As sementes inoculadas devem ser deixadas secar
sombra, e seu plantio deve ser feito imediatamente aps a secagem, no mesmo dia da inoculao.
Quando se faz a inoculao das sementes para plantio em reas onde nunca se utilizou o inoculante,
recomenda-se uma dose de 500 g de inoculante para cada 40 kg de sementes. No caso de inoculao
e tratamento das sementes com defensivos, as sementes devem ser tratadas com os produtos qumicos
antes da inoculao. Para mais detalhes sobre os cuidados com o inoculante e a inoculao, veja o
captulo anterior.
3.5. Concluses
Os estudos sobre a simbiose do feijoeiro progrediram bastante nos ltimos anos, sobretudo no
que diz respeito definio taxonmica dos microsimbiontes. O fato de se ter conhecimento da
inadequao dos inoculantes previamente empregados para o feijoeiro significa que praticamente todo
o h'abalho ter que ser refeito, no sentido de se aprender mais sobre os diversos aspectos da simbiose
do feijoeiro com o Rhizobium tropici, o microsimbionte preferencial para as nossas condies. Alm
disso, necessrio que se identifiquem novas estirpes mais eficientes e competitivas que possam ser
empregadas nos inoculantes. As variedades modernas de feijo apresentam maior aptido produtiva e
melhor adaptabilidade para a produo de gros nas diferentes regies produtoras de feijo no Brasil.
Apesar dessas vmiedades geralmente responderem adubao nitrogenada, alguns resultados suge-
rem que elas tm boa capacidade simbitica, merecendo portanto mais estudos. A conscientizao
atual da maioria dos produtores sobre a necessidade de se tecnificar a cultura do feijoeiro tem propor-
cionado pesquisa a oportunidade para a realizao de testes de inoculao nas mais diversas condi-
es, inclusive com irrigao complementar e em vrzeas, onde antes no se cultivava feijo. Num
futuro prximo a pesquisa dever ser capaz de apontar as melhores combinaes enh'e parceiros
simbiticos para que se possa fazer da inoculao do feijoeiro uma prtica to comum e rentvel
quanto a inoculao da soja.
3.6. Referncias Bibliogrficas
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CAPTULO 4
FIXAO BIOLGICA DO NITROGNIO EM ESPCIES ARBREAS
Ftima M. S. Moreira
1
4.1. Introduo
Espcies vegetais que formam simbiose com microrganismos fixadores de N
2
(EFN) podem
dispensar total ou parcialmente a adubao nitrogenada e ainda contribuir para outras espcies con-
sorciadas ou em sucesso, garantindo a auto-sustentabilidade do ecossistema com relao ao N. As
EFN tm, em geral, maior concentrao de N nos tecidos do que espcies no-fixadoras (Tabela 4.1).
No caso das espcies arbreas, a maior concentrao de N associada maior produo de biomassa
(folhas, galhos, razes, ndulos etc.) possibilita uma contribuio significativamente maior de matria
orgnica para o solo, com baixa relao C:N.
Alm dos efeitos benficos diretos da matria orgnica sobre a frao mineral do solo (estabi-
lizao dos agregados, maior reteno de gua etc.) evitando sua degradao, ocorre aumento da
disponibilidadade d ~ N no ecossistema que pode ser utilizado por diversas espcies de microrganis-
mos e de plantas, aumentando a diversidade biolgica (Parrota, 1992; Maschio et aI., 1992). Por outro
lado, a maior extenso do sistema radicular, tanto a nvel horizontal como vertical, permite o retorno
ao sistema produtivo' de nutrientes perdidos atr-avs da lixiviao para camadas mais profundas do
solo.
Entr-e as diversas espcies arbreas fixadoras de N
2
, existe ainda uma ampla variabilidade de
utilizao econmica, como: madeira, forragem, adubao verde, lenha, flora agrcola, gomas, celulo-
se e papel, carvo, alimentao humana e animal, cercas vivas, produtos medicinais e aromticos,
substrato para produo de cogumelos comestveis, quebra-ventos etc. (NAS, 1979; Nair et aI., 1984;
Sharma & Madan, 1993). Deve-se ressaltar tambm o enorme potencial ainda no explorado de vrias
espcies nativas. Todas estas caractersticas tornam as rvores que fixam N
2
atr-avs de simbioses e ~
importantes componentes de sistemas naturais, agroflorestais, agrosilvipastoris, "alley cropping" etc.
A famlIa Leguminosae, por exemplo, representa uma parcela significativa na composio
florstica de vri.os ecossistemas naturais, como a Floresta Amaznica (Ducke, 1949), o cerrado brasi-
leiro (Kirkbride Jnior, 1984) e remanescentes da Mata Atlntica (Oliveira Filho et aI., 1994). Vrios
gneros e espcies nativas destes ecossistemas so capazes de formar simbiose com bactlias fixadoras
de N
2
dos gneros Rhizobiw/l e Bra(0)rhizobium (Allen & Allen, ,1981; Faria et aI., 1989; Moreira et
aI., 1992).
A biodiversidade das florestas nativas, principalmente das tropicais, pode ser considerada um
recurso material de valor intestimvel. Sua preservao garantir a geraes futuras uma fonte de
recursos genticos para os mais diversos fins. Neste contexto, a crescente demanda mundial por
celulose, papel, lenha, carvo e madeira no poder mais ser suprida pelo extrativismo predatrio, mas
sim por reflorestamentos de acordo com os princpios do desenvolvimento sustentado. A produo de
IProfessoia Adjunta, Ph.D., Escola Supelior de Agricultura de Lavras (ESAL), Caixa Postal 37, EP 37200-000, Lavras, MG.
122
alimentos, plincipalmente nos pases subdesenvolvidos ou em desenvolvimento, no dever mais se-
guir o modelo "monoculturas com altas doses de adubos e outros insumos". Vrios resultados indi-
cam que possvel passar da falcia para a prtica. rvores fixadoras de N
2
esto enh"e as importantes
alternativas.
Tabela 4.1. Teor foliar de nitrognio em espcies arbreas que formam ou no simbioses fixadoras
de nitrognio.
Espcie fixadora de N
2
Alnus glutinosa
Gliricidia sepium
Erythrina sp.
Albizia saman
Inga edulis
Leucaena leucocephalla
Sesbania rostrata
S. sesban
Mdia
Espcie no-fixadora de N
2
Brachystegia boehmii
B. microphylla
Julbernardia
Diplorhynchus condylocalpum
Eucalyptus saligna
Cordia trichotoma
Araucal'ia
Pinus elliottii
Mdia
%N
3,84
3,74
3,52
3,20
3,18
3,94
5,60
4,30
3,92
%N
1,84
2,24
2,04
1,30
0,71
1,75
1,72
1,23
1,60
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H6gberg (1986)
Haag (1983)
Haag (1983)
Haag (1983)
Haag (1983)
4;2. Sistemas Fixadores de N
2
em rvores
4.2.1. Simbiose de rizbio com leguminosas
4.2.1.1. Introduo
123
Na famlia Leguminasae (ou Fabaceae) esto includos 650 gneros e 18.000 espcies, o que a
coloca entre as maiores famlias de angiospermas, sendo somente superada pelas Campasitae e
Orchidaceae (Polhil et aI., 1981). A famlia compreende espcies de todos os tipos de hbitos de
crescimento (rvores, arbustos, ervas e lianas) e tambm espcies de importncia econmica em di-
versas reas como a agricultura, a silvicultura e indstria, entre outras.
Segundo Tutin (1958), a freqncia de espcies lenhosas nas subfamlias Mimasaideae e
Caesalpiniaideae bastante alta: 95% e 97%, respectivamente. Nas Papilianaideae, somente 38%
das espcies so lenhosas. At 1981, somente 15% das espcies da famlia haviam sido examinadas
quanto sua capacidade de nodular, isto , de formar simbiose com bactrias fixadoras de N
2
, aqui
denominadas coletivamente por rizbios (Allen & Allen, 1981). A grande maioria das espcies flores-
tais, principalmente as tropicais, no havia sido pesquisada.
O Brasil tem a maior rea de florestas tropicais do mundo, aproximadamente 3.574.800 km
2
,
que quase trs vezes superior segunda maior rea de florestas tropicais, a da Indonsia, com 1.138.950
km
2
. A diversidade em espcies uma caractelstica marcante de florestas tropicais, podendo-se
afirmar que estas, e em particular a Amaznia, representam o maior reservatrio de espcies vegetais,
animais e microbianas, muitas das quais ainda com potencial desconhecido ou no explorado. Nos
ltimos anos, levantamentos intensivos da capacidade de nodular de espcies florestais brasileiras
forneceram informaes sobre um nmero significativo da espcie e gneros (Tabelas 4.2 e 4.3).
Atualmente, a nvel mundial, 20% das espcies e 57% dos gneros foram examinados (Faria et aI.,
1989). Resultados obtidos sobre caractersticas intrnsecas dessas simbioses e suas relaes ecolgi-
cas demonstraram um enorme potencial adaptativo a diferentes condies edafoclimticas, assim como
um amplo grau de variabilidade, que pode ser explorado em programas de melhoramento dessas esp-
cies integrados maximizao da fixao biolgica de N
2
.
Tabela 4.2. Espcies de leguminosas florestais brasileiras examinadas recentemente quanto a capaci-
dade de nodular*, de acordo com a subfamlia.
Subfamlia
Caesalp in ia ideae
Mimasaideae
Papilianaideae
N de espcies
examinadas
123
107
158
Espcies com ndulos
27
78
107
%
22
73
68
* Vasconcelos & Almeida (1979); Sylvester-Bradley et a!. (1980); Magalhes et ai. (1982); Faria et a!. (1984a, b); Magalhes & Fernandes (1984);
Magalhes (1986); Matos (1986); Magalhes & Silva (1986/87); Faria et a!. (1987); Moreira et a!. (1992); Souza et a!. (no prelo); Barbel; &
Moreira (1994).
124
Tabela 4.3. Gneros de leguminosas brasileiras examinados recentemente quanto capacidade de
nodular*.
Gnero noduIfero
Abarema (M)
Affonsea (M)
Ateleia (P)
Bowdichia (P)
Cadia (P)
Cedrelinga (M)
Centrolobium (P)
Cyclolobi'Lllrl (P)
Dalhstedtia (P)
Diplotropis(P)
Etaballia (P)
Gagnebina (M)
Marmaroxylon (M)
Melanoxylon (C)
Moldenhaurea (C)
Platycialnus (P)
Plathymenia (M)
Plathypodium (P)
Poecilanthe (P)
Pseudopiptadenia (M)
Pseudosamanea (M)
Vouacapoua (C)
Gnero no-noduIfero
AcrocaJ'pus (C)
Aldina (P)
Amburana (M)
Apulia (C)
Bacoa (P)
Cenostigma (C)
Dinizia (M)
Elizabetha (C)
Exostyles (M)
Heterostemon (C)
Goniorrachis (C)
Grazielodendron (P)
(P)
Luetzelburgia (P)
Monoptel)lX (P)
Poeppigia (C)
Pterodon (P)
Sweetia (P)
Taralea (P)
Tetrap I eura (M)
Vatairea (P)
Vataireopsis (P)
Gnero com
informaes conflitantes
Acosmium (M)
Brownea (C)
Delonix (C)
Dialium (C)
DicOlynia (C)
Hym.enaea (C)
Myrocalpus (P)
Myroxilon (P)
Phyllocalpus (C)
" Schizolobium (C)
Zollernia (P)
>I< Sylvester-Bradley et a!. (1980); Magalhes et a!. (1982); Magalhes (1986); Faria et a!. (1984b, c); Faria et a!. (1987a); Moreira et a!. (1992);
Magalhes e Fernandes (1984); Bonetti et a!. (1984); Souza et a!. (submetido); Faria et a!. (1989); Barberi e Moreira (l994).
4.2.1.2. Filogenia de LegulIlinosae e sua relao com as simbioses
Mais de 75% dos caracteres usados para delimitar gneros em Leguminosae so reprodutivos
e parecem ter evoludo mais rapidamente que os caracteres vegetativos (Small, 198"9). Polhi11 et aI.
(1981) basearam-se principalmente em caracteres reprodutivos para estabelecer os principais grupos
de divergncia da famlia Leguminosae (Figura 4.1). Segundo estes autores, os gneros mais arcaicos
parecem ser os de espcies arbreas extratropicais da Caesalpinioideae - Gleditsia, Gymnocladus,
Ceratonia, Zenia e Cercis. Os quatro primeiros gneros parecem incapazes de nodular e quanto ao
ltimo, ainda existem controvrsias. A capacidade de nodular da maior parte das espcies nas Dialiinae
" ainda no foi determinada. As informaes sobre a nodulao nos gneros Dialium e Dycorinia ainda
so controvertidas. A capacidade de nodular em Cassiinae mais freqente.
o
f
f
c
Q)
o
tribos tropicais
srie epulvinada
o
f
Q)
f
r
avanadas temperada :2
t
f
p\ Pf
aliana genistide
P
Cassiinae Acacieae &
Amherstieae
Grupos'. d.e Peltophorum & \ complexo galegide
o
C Ingeae M.
C Caesalplnla C.
P
c
i 1
/
Q)
f
o
o
Q)
f

Dialiinae M.imoseae Detarieae
Sophoreae 8auhini inae a..
C M
\
C P C
"-
/
/
i
-N
Grupo de Dimorphand ra
Grupo de Sclerolobium
V>
C
\ /
C
/
o
Q)
Ceratoni inae Grupo de Gled itsia Cercidinae u
'o
C
C
C
......
Q)
L-
U
c= Caesa/pineoideae; P= Papi/ionoideae; e Mimosoideae
Figura 4.1. Suposta divergncia dos principais grupos de Leguminosae, segundo Polhill et at. (1981); onde:
C = Caesalpineoideae; P = Papilionoideae; e M = Mimosoideae.
126
As descobertas de fsseis ainda fornecem poucas evidncias sobre os primrdios da evoluo
da famlia. Certamente, as trs subfamlias estavam bem estabelecidas e amplamente dispersas no
eoceno, mas registros anteriores so esparsos (Polhill et a1., 1981). A principal irradiao da famlia
pode ter surgido de dois pequenos grupos relacionados - o grupo pantropical de DimOlphandra e o
grupo sul-americano de Sclerolobium. O grupo de Dimorphandra reconhecidamente de transio e
seus gneros tm caractersticas pouco relacionadas mas que, juntas, se aproximam da organizao
caracterstica de Mimosoideae (Benthan, 1865; Brenan, 1967; Steenis, 1975), que inclui, entre outros,
o desenvolvimento de ndulos radiculares.
A evoluo posterior em Mimosoideae, de Mimoseae a Acacieae e Ingeae est associada
evoluo de vrias caractelsticas reprodutivas. Dois teros das espcies de Mimosoideae ocorrem
nos gneros Inga, Miinosa eAcacia que parecem ter seu centro de Oligem na regio tropical mida da
Amrica do Sul (Irwin, 1981). Nodulao reportada em vrias espcies desses gneros.
O tipo de flor que pode ter sido caracterstico dos ancestrais da parte restante, que constitui a
maior parte da famt1ia, est preservado no grupo de Sclerolobium. Com poucas modificaes, este
tipo de flor ocorre nas Caesalpinioideae mais avanadas, nas Detarieae, Amherstieae e nas
Papilionoideae. omo as Mimosoideae, mas diferente das Caesalpinioideae (exceto algumas), as
Papilionoideae geralmente desenvolvem ndulos radiculares que, nas tribos mais avanadas, mostram
Vlios graus de especializao.
Nas Papilionoideae, a subfamlia com maior disperso e uma das mais intensivamente estuda-
das, o modelo de divergncia mais fcil de se traar. O modelo proposto por Polhi11 (1981) (Figura
4.2) bastante aceito por outros autores (ltwin, 1981). As Swartizeae esto na linha divisria entre
Caesalpinioideae e Papilionoideae. Polhill et aI. (1981) assinalam que a ocorrncia de ndulos
radiculares nas Swartizeae, alm de outras caractersticas, indica que elas esto melhor enquadradas
em Papilionoideae do que em Caesalpinioideae. Estima-se que 97% das Papilionoideae so capazes
de nodular. A irradiao das Papilionoideae complexa, existindo um reconhecimento geral dos
vrios componentes principais, com Sophoreae constituindo o grupo base da divergncia, sendo o
cenh'o da subfamilia dominado pelo enorme "complexo galegoide"(as tribos Galegae e Dalbergieae).
As Galegae podem ser separadas em outras tribos herbceas temperadas (Loteae, Viceae, Trifolieae,
etc.) - a srie apulvinada. A srie restante, pulvinada, predominantemente h'opical e pode ser subdi-
vidida em um centro - Tephrosieae e Robinieae - e vrias tr-ibos mais avanadas, com uma tendncia
regional (exceto a pantropical Phaseoleae) em direo tanto ao Velho como ao Novo Mundo. Separa-
da de todos esses grupos est a "Aliana genistide", compreendendo as tribos Genisteae e Podalyrieae,
divididas em vrias tr-ibos regionais centr-alizadas em reas com clima mediterrneo.
As supostas divergncias de Leguminosae em geral e de Papilionoideae (Polhill et aI., 1981;
Polhi11, 1981) no implicam em que conceitos evolucionlios tenham alcanado o estgio de proposi-
o de uma rvore filogentica. No entanto, representam os dados mais atualizados de divergncia
para a familia e a subfamilia como um todo.
20 CORONILLEAE
9 QESMODIEAE 10 PHASEOLEAE
" 8 INDIGOFEREAE
19 LOTEAE . \
23 TRIFOLlEAE . . 1/ PSORALEEAE' 12 AMORPHEAE
22 / / 13 SESBANIEAE
21 16 GdLEGEAE .. 7 ROBINI'E-14 AESCHYNOMENEAE
18 HEDYSAREAE/" /
6 TEPHROSIEAE
29 CROTALARIEAE 5 ABREAE _____ 24 BRONGNIARTIEAE
LlPARIEAE_ BOSSIAEEAE
ADESMIEAE
.....

32GENISTEAE
27 PODALYRIEAE 25 MIRBELlEAE
"-31 DALBERGIEAE
30 EUCHRESTEAE- 2 SOPHOREAE-3_ DIPTERYXEAE
I
1 SWARTZIEAE
Figura 4.2. Suposta divergncia dos principais grupos de Papilionoideae, segundo Polhill (1981).
128
4.2.1.3. Forma e anatomia dos ndulos
A forma dos ndulos determinada pela posi o e comportamento de seus meristemas, exis-
tindo basicamente dois tipos: os que no se ramificam e os que se ramificam. Nos primeiros, o
meristema esfrico, circundando uma rea central fixadora de N
2
" Nos ltimos, o meristema
apical , o que acarreta um alongamento inicial com possvel diviso posterior para formar vri os ra-
mos, cada um com seu prprio meristema apical. O tecido onde ocorre a fixao de N
2
em todos os
tipos de ndulo efmero, durando, geralmente, algumas semanas. Nos ndulos que se ramificam
aps sua senescncia, o tecido progressivamente reposto por um novo que se forma nas pontas das
ramifi caes, o que torna este tipo de ndulo potencialmente perene. J os tipos de ndulos que no
se ramificam so efmeros como seu tecido fixador. Corby ( 1988) denominou cinco tipos de ndulos
em Leglll1linosae: aeschinomenide. desmodiide, caesalpinide (anter iormente astraga1ide),
crotalariide e lupinide. Os aeschinomenides e desmodiides tm meristemas esfricos diferindo,
principalmente, quanto presena de lenticelas (desmodi ide). Os outros tipos tm meristema apical,
sendo o caesalpini ide o maior deles (Figuras 4.3 e 4.4). O tipo caesalpiniide ocorre em todas as trs
subfamlias, enquanto os outros quatro so predominantes na subfamlia Papilionoideae. A distribui-
o dos tipos de ndulos que ocorrem em cada tribo no diagrama de Pol hill ( 1981) para divergncia
em Papilionoideae , com raras excees, bastante relacionada com o modelo de evoluo de formas
de ndulos sugerido por Corby ( 1988), ou seja, o tipo caesalpiniide, considerado primitivo, predo-
minante nas tribos mais primitivas, enquanto os quatro tipos de ndulos supostamente mais avanados
ocorrem predominantemente nas tribos mai s avanadas. Faria et aI. ( 1984a, I 987a) reportaram for-
mas de ndulos encontradas em vrias espcies nativas.
Figura 4.3. Ndulo de Swartzia schombllrgki
coletado em floresta de terra firme
na Amaznia.
Figura 4.4. Ndulos de Cedreliga
catenaejrmis, muda em
vlven o.
129
4.2.1.4. Modos de infeco por rizbio
Atualmente so conhecidos trs modos pelos quais o rizbio pode iniciar a infeco em
leguminosas para formar ndulos: 1) via plos radiculares (o mais conhecido); 2) via feridas (geral-
mente causadas pela emergncia de razes laterais ou adventcias no caso de ndulos caulinares de
Sesbania e Aeschinomene, por exemplo); e 3) via clulas da epiderme (intercelular). A infeco por
plos radiculares, considerada um estdio mais avanado, predominante nas espcies herbceas,
forrageiras e de gros das tribos mais avanadas como Trifolieae, Vicieae e Phaseoleae (Sprent et aI.,
1989). Nas espcies arbreas, os dois ltimos tipos parecem predominar (Faria et aI., 1987b; Sprent &
Cordeiro, 1992).
O estdio posterior envolve a formao de cordes de infeco, exceto para algumas espcies
como em Arachis e Stylosanthes, dos quais pode haver ou no liberao de rizbio. Cordes de infec-
o persistentes, onde no ocorre liberao de rizbio foram relatados em Parasponia spp. (Ulmaceae)
(Trinick, 1979), as nicas espcies no leguminosas que formam simbiose com rizbio, e foram con-
sideradas uma resposta atpica de uma no leguminosa ao rizbio. Posteriormente, foram encontra-
dos, pela primeira vez em leguminosas arbreas do gneroAndira (Papilionoideae) (Faria et aI., 1986).
Agora sua ocorrnciaj conhecida nos grupos mais primitivos de leguminosas arbreas nodulferas,
como Dimorphandra e Sclerolobuim, em outras Caesalpinioideae examinadas, dos gneros
Campsiandra, Melanoxylon, Moldenhaurea, Tachigali e Chamaecrista, e nas Papilionoideae, dos g-
neros Hymenolobium, Cyclolobium, Dahlstedtia e Poecilanthe (Faria et aI., 1987b; Sprent & Cordei-
ro, 1992). Porm, no foram encontradas em Mimosoideae, confirmando a maior afinidade filogentica
entre as subfamlias Caesalpinioideae e Papilionoideae.
4.2.1.5. Taxonomia do microsimbionte
At 1974, a taxonomia das bactrias fixadoras de N
z
que formam ndulos em leguminosas era
baseada, principalmente, na capacidade de nodular e fixar N
z
com determinadas espcies de
leguminosas. As limitaes desta classificao deconiam da promiscuidade simbitica de vrias
estirpes de rizbio e da insuficincia de dados sobre nodulao, pois s 8% a12% das espcies exis-
tentes na famlia Leguminosae haviam sido examinadas quanto capacidade de nodular (Graham,
1976). Alm disso, a maioria dos estudos sobre nodulao era direcionada quase que exclusivamente
s culturas agrcolas importantes, entre outras, a soja, o feijo, a ervilha, a alfafa e o trevo, espcies
estas restritas a poucos grupos de divergncia da subfamlia Papilionoideae.
A taxonomia atual de rizbio, encontrada no Manual de Sistemtica Bacteriolgica de Bergey
(Jordan, 1984), j no foi baseada somente nas caractersticas simbiticas e tentou considerar tambm
as caractersticas intrnsecas da bactria. Entretanto, esta classificao ainda est direcionada para as
leguminosas de importncia agrcola. Nela esto definidas h's espcies de Rhizobium: R.
leguminosarum, R. meliloti e R. loti, que abrangem as estirpes chamadas de "crescimento rpido".
Outro gnero - Bradyrhizobium - foi criado para as estirpes chamadas de "crescimento lento". Neste
gnero, a espcie B. japonicum est definida para as estirpes de crescimento lento que nodulam a soja.
Os demais grupos de crescimento lento no gnero Bradyrhizobium, a chamada "miscelnea caupi",
no esto definidos em nvel de espcie, existindo atualmente a tendncia de se colocar neste grupo
qualquer rizbio de crescimento lento, no identificado, isolado de leguminosa tropical. A posio
130
taxonmica dos isolados de crescimento rpido da maioria das espcies arbreas tambm no est
definida; com exceo de algumas estirpes de crescimento rpido, isoladas de Leucaena e Mimosa,
classificadas como R. loti. Isto dificulta o estudo e a obteno de inoculantes especficos eficientes
e a recomendao de inoculantes para espcies afins. Jordan (1987) assinalou que as estirpes da
"miscelnea caupi" representam um grupo altamente heterogneo e divergente de microrganismos,
dentro do qual as relaes taxonmicas no esto ainda bem definidas. de se esperar, portanto, que
todo o gnero Bradyrhizobium seja reorganizado nos prximos anos. J em 1976, Graham chamava
ateno ao fato de que a classificao de rizbio, ento vigente, seria gradualmente modificada
medida que um maior nmero de estirpes, principalmente aquelas provenientes do grande reservatrio
de leguminosas tropicais, fosse examinado.
Trabalhos posteriores publicao da ltima edio do Manual de Bergey demonstr"aram, com
o auxlio de tcnicas mais sofisticadas e precisas, que mesmo a tribo Papilionoideae uma fonte de
lizbio com grande vmiabilidade a ser explorada. Recentemente, um novo gnero e cinco novas
espcies de Rhizobium foram descritas: Azorhizobium caulinodans, para rizbio de crescimento lento,
que forma ndulos no caule de Sesbania ros-ata (Dreyfus et aI., 1988); R. ji-edii, para rizbio de
crescimento rpido, que nodula eficientemente variedades de soja selvagem da China (Scholla &
Elkan, 1984; Chen et aI., 1988); R.hualatii (Chen et aI., 1991); R. galegae, para lizbio de crescimento
rpido, isolado de Galega spp. (Lindstr6m, 1989); e R. tropici e R. etli, para estirpes isoladas de
Phaseolus vulgaris em reas tr"opicais (Martinez-Romero et aI., 1991; Segovia et aI., 1993). Est
sendo proposto, ainda, um novo gnero - Photorhizobium - com uma nica espcie - P thompsonianum
- o primeiro rizbio fotossinttico, isolado de ndulos caulinares de Aeschynomene indica (Eaglesham
et aI., 1990) e uma nova espcie de Bradyrhizobium - B. elkanii - para estirpes isoladas de soja
(Kuykendall et aI., 1992).
Atr"avs dos levantamentos da capacidade de nodular e/ou fixar nitr"ognio de espcies de
leguminosas florestais da regio amaznica, realizados pelo SMS/DCAlINPA
2
, e da Mata Atlntica,
realizados pelo CNPAB/EMBRAPA
3
, acumulou-se uma coleo de estirpes de rizbio isoladas de
uma ampla vmiedade de gneros e grupos de divergncia de Leguminosae. Numa tentativa de definir
a posio taxonmica dessas estirpes foram estudadas suas caractersticas culturais, seus padres de
protena celular total, obtidos por SDS-PAGE, e a relao entre essas caractersticas e a filogenia de
LegUlninosae, comparando-as s espcies e gneros de rizbio j descritos na literatura (Moreira,
1991; Moreira et aI., 1993). Os resultados demonstr"aram uma ampla diversidade de tipos culturais
entre a maioria dos gneros e grupos de divergncia de Leguminosae, em relao ao tempo de cresci-
mento, modificao do pH do meio de cultura e quantidade de goma produzida. Em todos os grupos
das trs subfamlias houve predominncia de estirpes de crescimento lento (CL), ocorrendo em menor
proporo as estirpes de crescimento rpido (CR), intermedirio (CI) ou muito lento (CML). Com
relao anlise numrica computadorizada dos padres de protena celular total de 171 estirpes,
comparadas a espcies atualmente descritas, foram obtidos 23 grupos com nveis de similaridade
iguais ou maiores a 86%, e 30 estirpes com padres de similaridade inferiores a 86% (Tabela 4.4).
Cinco destes grupos consistiam exclusivamente de estirpes tipo e referncia de : R. leguminosarum, R.
2Seo de Microbiologia do SololDepartamenlo de Cincias AmbienlaislInstituto Nacional de Pesquisas da Amaznia.
3Centro Nacional de Pesquisa de AgrobiologialEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria.
131
lati, R. meli/ati, R. trapici e A. caulinadans. Quatro grupos foram similares a espcies de rizbio
conhecidas. Um deles, o grupo 12, composto por 92 estirpes, foi similar estirpe tipo ATCCI0324
Bradyrhizabiumjapanicum. O grupo 2, com seis estirpes, foi similar aR.lati. O grupo 18, contendo
trs estirpes de Leucaena, foi similar aR. fredii e uma estirpe de Leucaena se agrupou com R. galegae
(grupo 8). Os outros 14 grupos podem representar novas espcies ou biovares e devem ser estudados
posteriormente.
Tabela 4.4. Grupos eletroforticos (SDS-PAGE), tipos culturais e origem de 171 estirpes isoladas de
espcies florestais nativas da Amaznia e Mata Atlnti ca e de estirpes tipo e referncia de
espcies de lizbio atualmente descritas. Modificado de Moreira et aI. (1993).
Grupo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Nde
estirpes
2
6
2
3
6
1
2
92
4
2
6
2
2
3
2
2
2
2
Origem*
P2
C3,M2
M2,M3
M2,Pl
M2, M3, P4, P6
M2
P7
. Cl, C2, C3, C4,
Ml,M2,M3,
Pl, P2, P4, P5
P7
M3,P4,P7
P6,C4,M2,M3,P3
M3
P7
M2
Pl, P5
M2,M3
MI, P5, C2
Caractersticas
culturais**
CR, cido
CR ou I, cido ou neutro
CR, cido ou neutro
CR, cido
CR, cido
CR, cido
CR, cido
CR, cido
CL, alcalino
CR, cido
CR,cido
CL,CML
Alcalino ou cido
(S 2 estirpes)
CL, alcalino
CI, alcalino
alcalino
CL, alcalino
CL, alcalino
CR, cido
CR, cido
CML, alcalino
CR, cido
CL, alcalino
Estirpes tipo e/ou
referncia (Origem*)
R. lati (Pll)
R. loti (P 11)
R. tropici (P7)
R. galegae (P 1 O)
A. caulinodans (P6)
R. leguminosarum
(P7, P9, P12)
B.japonicum (M3,P7)
R. fredii (P7)
R. meliloti (P9)
* Grupos de divergncia em Legumillosae de acordo com Polhill (1981) e Polhill et aI. (1981): CI = grupo de Dim0!7'/talldra; C2 = grupo de M3 =
Acacieae e lllgeae; P I = Swartzieae; P2 = Da/bergieae; P3 = A/breae; 1'4 = Mil/etieae; P5 = Sophoreae; P6 = Robillieae; 1'7 = Phaseo/eae; P8 =
Aeschyllomelleae; P9 = Trifolieae; PIO = Ga/egeae; 1'1 1= Loteae; PI2 = Viceae.
** Em meio YMA (Vincellt, 1970); sendo:CR = crescimento rpido; CL = crescimento lento; CI = crescimento intermedirio entre CR e CL; CML =
crescimento muito lento; alcalino = alcaliniza o meio de cultura; cido = acidifica o meio de cultura; neutro = no modifica o pH do meio.
Nota: 30 outros grupos foram formados por uma nica estirpe. Estas foram isoladas de CI, C2, C4, M2, M3, PI, P2, P4, P5 e 1'7.
132
As estirpes CL e CML formaram um conjunto com padres de protena celular total menos
heterogneo do que o das estirpes CR e CI. Estirpes do grupo XII, composto predominantemente por
estirpes de CL alcalinizantes, ocorreram em todos os grupos de Caesalpinioideae e Mimosoideae
estudados, desde os mais primitivos at os mais avanados, e tambm em quase todos os grupos de
Papilionoideae abrangidos por este estudo. Isto indica que este grupo parece ser o tronco ancestral de
onde se derivaram as demais espcies de tizbio, confirmando a hiptese de Nortis (1965). Os resul-
tados deste trabalho, abrangendo vtios grupos de divergncia das h"s subfamlias de Leguminosae,
estenderam para toda a farrnlia as observaes de outros autores paraPapilionoideae (Young & Johnston,
1989), de que, aparentemente, no existe relao entre as filogenias atuais de tizbio e de Leguminosae.
Grande diversidade entre tizbios isolados de espcies arbreas foi tambm demonstrada por
Zhang et aI. (1991), Lajudie et aI. (1992) e Dupuy et aI. (1992). Com a diversidade existente entre
isolados de espcies arbreas e tambm indicaes de vatiabilidade nas espcies j desctitas, ou entre
isolados de espcies herbceas, previsto um nmero considervel de proposies de novas espcies
e gneros nos prximos anos. Essas proposies devero seguir regras mais rgidas para evitar, por
exemplo, descries inadequadas ou casos em que estirpes tipo no estejam disponveis (Graham et
aI.,1991).
4.2.1.6. Especificidade, efetividade e eficincia
As diferentes espcies de leguminosas hospedeiras apresentam diversos graus de especificidade.
Esta caracterstica foi examinada num nmero relativamente pequeno de espcies arbreas e mesmo
nessas espcies, poucas estirpes de rizbio foram testadas. Por isso, impossvel fazer generalizaes
para o grupo como um todo. Com base nos resultados j obtidos (Tabela 4.5), pode-se afirmar que
existe alta variabilidade quanto a especificidade enh"e l;zbio e espcies arbreas. Algumas espcies
apresentam um grau relativamente alto de promiscuidade, como Acacia seyal eA. frnesiana, enquan-
to outras, como Sesbania marginata e Pithecellobuim edwallii, parecem ser altamente especficas,
existindo enh"e estes dois grupos um gradiente de especificidade ou promiscuidade.
Na maior parte dos testes houve variao da efetividade das estirpes sobre o crescimento das
plantas hospedeiras. Para algumas espcies, estirpes homlogas foram efetivas, mas para ouh"as fo-
ram pouco efetivas ou at mesmo ineficazes. A efetividade de estirpes isoladas e inoculadas em
espcies do mesmo gnero tambm pode apresentar variabilidade, e algumas estirpes podem at mes-
mo no induzirnodulao, dependendo da espcie, como em Acacia (Dreyfus & Dommergues, 1981)
e Aeschinomene (Alazarcl, 1985).
Vrios gneros de leguminosas arbreas, nas trs subfamlias, podem ser nodulados por estir-
pes CR ou CL, como DimOlphandra, Chamaecrista, Campsiandra, Anadenanthera, Leucaena,
Piptadenia, Plathymenia, Prosopis, Acacia, Albizia, Calliandra, Enterolobium, Inga, Pithecellobium,
Swartzia, Andira, CentrolobiuIn, Dalbergia, Machaenlln, Den'is, LonchocclIpus, Sesbania e Clitoria
(Lim & Ng, 1977; Pankhurst, 1977; Dreyfus & Dommergues, 1981; Lawrie, 1983; Padmanabhan et
aI., 1990; Moreira, 1991). Para algumas espcies, a nodulao por estirpes CR e CL mosh"ou-se
efetiva e em ouh"as s um grupo nodulou efetivamente (Jenkins et aI., 1987). Estes resultados indicam
grande potencial para respostas inoculao com estirpes selecionadas de rizbio.
133
Tabela 4.5. Especificidade ou promiscuidade na nodulao de leguminosas arbreas por diferentes
estirpes de Rhizobium spp.
Estirpes inoculadas Estirpes nodulferas
Espcies testadas Hospedeiros Referncia**
N N N N % Efetivi-
total gneros espcies total dade*
Pithecellobium edwalii 39 15 21 1 3 nd Ribeiro et aI. (1987)
Sesbania marginata 18 11 12 1 6 nd Campelo (1976)
Aeschynomene vi/osa 15 1 7 2 13 E Alazard (1985)
Albizia lebbeck 39 15 21 13 33 nd Ribeiro et aI. (1987)
Acacia albida 39 15 21 13 33 nd Dreyfus &
Domergues (1981)
Aeschynomene sensitiva 6 2 6 3 50 E, e Dupuy et aI. (1992)
Acaeia albida 15 3 8 8 53 I Lajudie et aI. (1992)
Acaeia senegal 15 3 7 8 53 E, e, I Lajudie et al. (1992)
Sesbania grandiflora 15 3 8 9 60 E, e, I Lajudie et al. (1992)
Aeschynomene pratensis 15 1 7 10 67 E,I Alazard (1985)
Aeschynomene afhlspera 6 2 6 4 67 E, I Dupuy et aI. (1992)
Sesbania rostrata 15 3 8 10 67 E, e, I Lajudie et al. (1992)
Acaeia molssima 18 11 12 12 67 nd Campelo (1976)
Leucaena leucocephalla 46 nd 4 43 93 E, e, I Trinick (1980)
Acaeia seyal 15 3 8 14 93 E, e, I Lajudie et al. (1992)
Acaeia farnesiana 17 nd 4 16 94 E, e, I Tlinick (1980)
Acacia seyal 10 3 7 10 100 E, e, I Dreyfus &
Dommergues (1981)
.. Grau(s) de efetividade encontrado(s) entre as estirpes nodulferas; onde: E = efetivo; e = pouco efetivo; I = inefectivo; nd = no determinado .
.. * Embora outras espcies tenham sido estudadas por estes autores, selecionaram-se, em cada trabalho, as espcies relativamente mais promscuas
e mais especficas.
A eficincia relativa de ndulos (Schubert & Evans, 1976) de Prosopis glandulosa foi maior
para isolados CR (> 0,50) do que CL 0,80) conforme Jenkins et al. (1987), e no se correlacionou
com a efetividade simbitica medida pela concentrao total de N na parte area (J enkins et aI., 1987;
Virginia et aI., 1984). Diferenas estatisticamente significativas (> 22%) no contedo de N e acmulo
de matria seca foram observadas entre plantas de Sesbania sp. inoculadas com estirpes Hup+ e plan-
tas inoculadas com estirpes Hup- (Saini et aI., 1987). Os efeitos do metabolismo de hidrognio no
crescimento de leguminosas de gros podem ser separados em duas classes: ausente ou significante
(Neves & Hunglia, 1987). Para espcies arbreas necessrio que se realizem mais testes (espcies
vegetais e estirpes simbiontes) de modo a obter dados mais conclusivos.
134
Faria et aI. (1984a) avaliaram a eficincia de estirpes de rizbio em simbiose com seis espcies'
arbreas atravs da relao entre o contedo de N na planta e peso de ndulos. Estirpes em simbiose
com plantas de N total acima da mdia foram consideradas eficientes. Estirpes induzindo N total
acima da mdia e peso de ndulos abaixo da mdia foram consideradas de eficincia superior e s
foram obtidas para quatro espcies (uma para cada espcie). Plantas em simbiose com a maior parte
destas estirpes consideradas eficientes tiveram cerca da metade do N total das plantas que receberam
adubao nitrogenada, o que pode indicar um baixo potencial do nitrognio obtido do ar (FBN) nestas
espcies ou condies inadequadas para que todo o potencial se expresse.
4.2.1.7. Fatores que limitam a FBN em leguminosas arbreas
Ausncia de nodulao ou nodulao ineficaz em determinada espcie, sob determinadas con-
dies ambientais, decorrente de fatores limitantes ao estabelecimento, desenvolvimento e funcio-
namento da simbiose. Estes fatores podem ser:
1 Caracteristicas intrinsecas da espcie hospedeira que a tornam incapaz de nodular ou fixar N
2
em
baixas taxas;
2) Ausncia de estirpes microsimbiontes especficas ou efetivas;
3) Edficos (pH, toxicidade de alumnio; deficincia de nutrientes, especialmente fsforo, nih-ognio
combinado etc.); e
4) Climticos (extremos de temperatura e umidade etc.).
J foi dito que existem informaes sobre a capacidade de nodular de uma boa parte de esp-
cies arbreas. Caso a espcie no possua nenhuma referncia na literatura, com relao a esta carac-
teristica, o melhor mtodo cultiv-la em condies de viveiro, em substrato naturalmente frtil ou
com adubao adequada, evitando adubao nitrogenada e excesso de matria orgnica que podem
inibir a nodulao. Tambm pode ser feita uma inoculao com mistura de estirpes oriundas de outras
espcies arbreas (Magalhes et aI., 1982; Faria et aI., 1984a, 1987a; Moreira et aI., 1992). Vrios
h-abalhos de levantamento tm sido realizados em condies de viveiro, pois nos ecossistemas flores-
tais em clmax a nodulao geralmente ausente ou pouco freqente devido s condies de equilbrio
no ambiente quanto ao nitrognio, ou seja, os "inputs" de N ah-avs da decomposio da matIia
orgnica ou mesmo da gua da chuva so suficientes para supIir as baixas demandas. De modo geral,
as anlises do sistema radicular podem ser feitas de quatro a seis meses aps o plantio, porm algumas
espcies (Andira spp., por exemplo), podem necessitar de um tempo maior para o aparecimento de
ndulos.
A ausncia de estirpes especficas no solo ou a presena de populaes de Iizbio ineficazes
tornam necessria a inoculao com estirpes selecionadas quanto eficincia e adaptao s condi-
es climticas e edficas locais. Diversos mtodos tm sido descritos com este propsito (Vincent,
1982), porm, para as espcies arbreas nativas de solos cidos h-opicais, ainda necessrio um ajuste
dessas metodologias que foram, em sua maiOlia, desenvolvidas para espcies herbceas de reas tem-
peradas.
H indicaes que existem diferenas com relao ao potencial de fixao de N
2
enh-e espcies
arbreas (Sanginga, 1992). Leucaena leucocephala e Gliricidia sepium podem fixar de 200 kg a 300
kg de N, enquanto Faidherbia (Acacia) albida apenas 20 kg a 30 kg de N. Este mesmo autor assinala
135
que podem ter efeito na quantidade e proporo do N
2
fixado: espcie e gentipo da planta;
microsimbionte; idade da planta; e manejo de fatores ambientais.
Sanginga (1992) relata variaes entre 20% e 68% no nitrognio obtido do ar (FBN) entre
plantas de Gliricidia sepium, de diferentes procedncias, enquanto que para plantas de Leucaena
leucocephala e Acacia albida, a variao encontrada foi respectivamente 37% a 74% e 6% a 37%, de
acordo com a procedncia (Sanginga et aI., 1990a).
A acidez e toxicidade de alumnio, fatores comumente associados aos solos tropicais, podem
afetar as simbioses de leguminosas herbceas (Carvalho, 1978; Munns & Franco, 1981). Para as
simbioses de rizbio com leguminosas arbreas foi observada uma alta freqncia de estirpes de
rizbio tolerantes a pH cido (Silva & Franco, 1984; Souza et aI., 1984; Moreira, 1991; Lesueur et aI.,
1993). Alguns resultados demonstraram tolerncia a at 100 mM de AI (AlzCSO 4)2)' quando os testes
so realizados em meio slido (Silva & Franco, 1984; Lesueur et aI., 1993), enquanto em meio lquido
algumas estirpes apresentaram tolerncia e outras foram extremamente sensveis (Lesueur et aI., 1993).
Silva & Franco (1984) observaram maior freqncia de estirpes tolerantes acidez (pH 4,5)
nas Caesalpinioideae (85,7%) e menor freqncia nas Papilionoideae (28,8%). As Mimosoideae
apresentaram 48,8% de estirpes tolerantes. Estirpes CR so geralmente consideradas menos toleran-
tes acidez do que estirpes CL. Porm, a procedncia da estirpe pode ser mais importante na sua
relao de tolerncia do que a caracterstica do crescimento (Silva & Franco, 1984). Estirpes nativas
de solos cidos se mostram mais adaptadas a estas condies do que estirpes isoladas de pH mais
elevado (Figura 4.5).
INPA 1-14b
INPA 1-07b
ORS leucaena
D. o (560 nm)
1,5 1,5
1,5
1,0 1,0 1,0
0,5
pHi pHf
0,5
pHi pHf
0,5
pHi pHf
x 4,4 5,5 x 4,4 4,0 x
4,4 4,5
e:. 6,8 7,2
o 5,6 4,6
o 5,6 5,4
e:.
6,6 7,6
e:. 6,8 6,5
40 80 120 160 40 80 120 160
40 80 120 160
TEMPO (horas)
Figura 4.5. Crescimento de estirpes de rizbio em meios lquidos diferindo quanto ao pH (pHi = pH
inicial do meio; e pHf= pH final).
INPA 14B isolada de Cliforia racemosa CL, alc. INPA 07B e ORS Leucaena isoladas de
Leucaena sp. CR, cido. Estirpes INPA 14B e INPA 07B isoladas de solos cidos da
Amaznia (pH == 4,0) e estirpe ORS Leucaena isolada de solo do Senegal, com pH prxi-
mo neutralidade.
136
o hospedeiro parece ser mais afetado pela acidez do que o rizbio. Aeacia mangium, Faidherbia
(Aeacia) albida e Leueaena spp. so afetadas pela acidez do meio (pH = 4,5), podendo existir diferen-
as significativas entre as procedncias de uma mesma espcie com relao a esta suscetibilidade
(Lesueur et aI., 1993; Hutton, 1984). Estas espcies, porm, so originrias de solos com pH mais
elevado. Em florestas tropicais, e particularmente na Amaznia, diversas leguminosas arbreas cres-
cem e nodulam em condies naturais, em valores de pH extr"emamente baixos (pH < 4, O) (Magalhes
& Blum, 1984; Moreira et aI., 1992). Franco (1984) assinala que a acidez gerada pelaFBN na rizosfera
dessas plantas pode ser benfica, aumentando a disponibilidade de P para as plantas atravs da
solubilizao de rochas fosfatadas.
Fsforo
A deficincia de fsforo um dos principais fatores limitantes do crescimento de plantas nos
solos tr"opicais, principalmente devido imobilizao por fixao nos xidos de AI e Fe. Simbioses
mutualsticas com fungos micorrzicos ocorrem em vrias leguminosas permitindo que estas espcies
tenham bom desenvolvimento e nodulao em solos com baixos teores de nutrientes, especialmente o
P (Jasper et aI., 1989; Herrera et aI., 1993). De Faria et aI. (1993) observaram que o crescimento e
nodulao de espcies arbreas foram estimulados pela inoculao com MVA, e que baixos teores de
P foram suficientes para obter os maiores incrementos, indicando que estas espcies tm baixo reque-
rimento de P. A resposta a P tambm pode variar enh"e gentipos de espcies arbreas (Sun et aI.,
1992).
Temperatura
Uma das simbioses mais sensveis a temperaturas altas a do feijoeiro. Resultados recentes
demonstr"aram que estirpes isoladas de leguminosas florestais tolerantes a altas temperaturas e efici-
entes na nodulao do feijoeiro podem ser uma valiosa fonte de recursos genticos para aumentar o
potencial da FBN nesta cultura (Hungria et aI., 1993). A temperatura crtica para FBN em Cyamopsis
tetregonoloba, por exemplo, situou-se enh"e 37C e 40C e acima de 40C no caso de plantas depen-
dentes de N mineral (Arayangkoon et aI., 1990). Estirpes tolerantes a altas temperaturas podem
formar simbioses altamente eficientes com leguminosas arbreas, como por exemplo em Mimosa
fZoeeulosa (Cunha et aI., 1994).
Umidade
Simbioses de leguminosas com rizbio podem se estabelecer em condies exh"emas de seca,
como diversas espcies de Acacia no Sahel afiicano, ou em condies de longos perodos de inunda-
o, como vrias espcies nativas da Amaznia, demonsh'ando uma ampla versatilidade adaptativa.
Em regies semi-lidas (zona ecoclimtica do Sahel), importantes populaes de BradyrhizobiwrL
vivem em solo sob vegetao de Acaeia aiNda at 34 m de profundidade ao nvel do lenol fretico
(Dupuy et aI., 1992). No deserto de Sonoran (Estados Unidos), populaes maiores que 5,9 x 10
3
clulas.g-
1
de solo foram encontr"adas a 6 m de profundidade ao nvel do lenol fretico sob Prosopis
glanduiosa (Jenkins et aI., 1987).
137
Na Amaznia, as margens dos rios so inundadas periodicamente, podendo os perodos de
inundao se estender a at cinco meses. Quando o nvel das guas desce abaixo do nvel do solo
possvel observar, em muitas espcies de leguminosas, uma massa abundante de ndulos aflorando na
superfcie do solo. A nodulao nos ecossistemas periodicamente inundados significativamente
maior que nos de terra firme (Moreira et al., 1992). Muitas leguminosas frutificam, no perodo de
inundao, utilizando a hidrocria como estratgia para disperso de suas sementes (Moreira & Moreira,
submetido).
A inoculao com fungos micorrzicos tambm pode conferir maior tolerncia seca em
leguminosas arbreas nodulferas (Osonubi et al., 1991).
N combinado
Espcies arbreas podem ser mais afetadas pelo N combinado do que culturas anuais porque
ocorre ampla variao da FBN em virtude da idade e redistribuio do N na planta e no perfil do solo,
devido mineralizao da liteira (Sanginga, 1992).
A aplicao de 40 a 80 kg de N pode reduzir em 50% a FBN em Leucaena leucocephala
(Sanginga et aI., 1989). O grau de inibio pode variar de acordo com a fonte de N aplicada. Baixos
nveis de nitrato diminuiram mais a produo de ndulos em Acaeia auriculiformis do que baixos
nveis de amnio (Goi et aI., 1992). Por outro lado, pequenas doses de N podem beneficiar a FBN.
Em Cyamopyis tetragonoloba, a quantidade de N fixado duplicou em resposta aplicao de uma
dose "starter"de Nmineral (Arayangkoon et aI., 1990).
As respostas de diferentes procedncias de uma mesma espcie ao N combinado tambm po-
dem variar. Sanginga (1992) sugeIu dois modos de aumentar a FBN em espcies arbreas na presen-
a de N combinado: desenvolver parceIas rizbio/hospedeiro mais tolerantes ou explorar diferenas
genticas entre rvores para fixar N
2
na presena de altos nveis de N no solo.
4.2.2. Simbioses com Frankia
4.2.2.1. Introduo
Actinomicetos fixadores de N
2
do gnero Frankia estabelecem simbiose, com formao de
ndulos radiculares, em cerca de 279 espcies de angiospermas, a maioria de porte arbustivo ou arbreo
(Baker & Mullin, 1992). O nmero de espcies vegetais actinorrzicas (i.e., que formam simbiose
com Franlda) bem infeIor ao das simbioses de rizbio com leguminosas (Tabela 4.6). No entanto,
so de extrema importncia, pois:
- a capacidade de formar simbiose com Fnwlda se estende a oito famlias botnicas, indicando maior
versatilidade simbitica deste microsimbionte;
- muitas espcies actinorrzicas so colonizadoras agressivas e capazes de crescer em solos degrada-
dos;
- muitas espcies so produtoras de madeira, lenha e carvo ou tm outros usos com potencial econ-
mico e ecolgico.
Contudo, existe um enorme potencial para descoberta de novas espcies actinonzicas, dado
que trabalhos intensivos de levantamento em muitos ecossistemas no foram realizados (Gauthier et
aI., 19.84). Na Amaznia, por exemplo, no ocorrem os gneros at agora reportados, como acti-
norrzicos, mas algumas famlias botnicas s quais pertencem so representadas por outros gneros.
138
Tabela 4.6. Caractersticas smbiticas e culturais de rizbio e Franlda.
Caractersticas
Simbiticas
FaITlllias botnicas com
as quais pode estabelecer
simbiose
Nmero de espcies
hospedeiras conhecidas
atualmente*
Tipo de infeco
Origem do ndulo
Localizao do tecido
vascular
Rizbio
Leguminosae
Ulmaceae
=300
plos radiculares,
epiderme, feridas
crtex da raiz
externo s clulas
onde esto os
bacterides
Presena de hemoglobina +
Cultnrais
Temperatura tima
pH timo
Tempo de gerao
Inibio da FBN por
N-combinado**
Crescimento sob N
2
**
6,0 - 7,0
1,4 - 44,1 h
+
+
.. Incluindo tambm espcies herbceas e lianas .
.... Considerando resultados de algumas estirpes.
Frankia
Casuarinaceae
Myricaceae
Batulaceae
Elaegnaceae
Rhamnaceae
Coriariaceae
Rosaceae
Datiscaceae
279
plos radiculares,
epiderme
pericic10 da raiz
Referncia
Trinick, 1979
Bond & Wheeler (1980)
Becking (1982)
Vrios
Baker & Mullin (1992)
Sprent (1989)
Miller & Barker (1986)
no centro do ndulo -
+
6,3 - 6,7
24 - 48 h
+
+
Appleby et aI. (1983)
Tjepkema (1984)
Jordan (1984)
Zhongze et aI. (1986)
Jordan (1984)
Zhongze et aI. (1986)
Hernandez & Focht (1984)
Zhongze et aI. (1986)
Jordan (1984)
Zhongze et aI. (1986)
Jordan (1984)
Zhongze et at. (1986)
139
Comparando-se com as simbioses de rizbio com leguminosas, observa-se que existem pou-
cos resultados sobre as simbioses com Franlda. Um dos motivos relacionado dificuldade de
isolamento do endfito. primeiro isolamento de Franlda foi realizado quase 100 anos aps o pri-
meiro isolamento de rizbio (Beijerinck, 1888) de ndulos de Comptonia peregrina (Syn Myrica
asplenifolia) (Callaham et aI., 1978). As principais limitaes para o isolamento de Franlda so devi-
das a anatomia dos ndulos, que dificulta a eliminao de contaminantes, e sua baixa taxa de cresci-
mento em meios de cultura, considerados ainda no seletivos (Tabela 4.6).
Casuarina e Alnus so os gneros de importncia econmica mais estudados. Estimativas da
FBN em espcies destes gneros se situam entre 40 kg e 300 kg de N.ha-
1
ano-
1
(Becking, 1973),
indicando grande potencial em sistemas sustentados.
4.2.2.2. Morfologia, taxonomia e diversidade do microsimbionte
Quatro estruturas morfolgicas de Franlda podem ser encontradas no interior dos ndulos:
filamentos de hifa, vesculas, esporngios e esporos (Mansour & Torrey, 1991). Esporngios podem
ocorrer tambm em miclios externos ao ndulo (Cusato & Tortosa, 1993). Embora todas as estirpes
de Frankia testadas possuam a capacidade gentica de formar esporngios in vitro, no interior dos
ndulos s foram observados esporos em 16 espcies de nove gneros: Alnus, Casuarina, Ceanothus,
Comptonia, Dlyas, Elaegnus, Hippophae, Myrica e Purshia (Torrey, 1987). Dois tipos distintos de
estirpes podem ser facilmente reconhecidos Sp.+ (esporulantes no interior de ndulos) e Sp.- (no
esporulantes), que parecem diferir em sua capacidade infectiva, na efetividade e competio para
formao de ndulos (Kurdali et aI., 1990).
A formao de vesculas parece associada atividade da FBN, pois h evidncias de que as
vesculas so o stio da N
2
ase, protegendo-a dos efeitos do 02 (Meesters et aI., 1987). EmboraFranlda
em simbiose com Casuarina s produza hifas no interior de ndulos que fixam N
2
ativamente (Zhang
& Torrey, 1985), isolados de Casuarina formaram vesculas in vitro e tiveram atividade da nitrogenase,
podendo ambas as caractelsticas ser simultaneamente inibidas por N combinado (Zhang et aI., 1984;
Zhongze et aI., 1986).
Nos ltimos anos, apesar das dificuldades (Baker & O'Keefe, 1984), muitas estirpes deFranlda
foram isoladas em culturas puras de hospedeiros dos gneros Comptonia, Alnus, Elaegnus, Casuarina,
Ceanothus, Colletia, Discaria, Retanilla e Trevoa (Car, 1993). Todos os isolados de ndulos foram
atribudos ao gnero Frankia com base em:
1) Caractelsticas morfolgicas tais como: formao de esporngios e vesculas em culturas lquidas;
2) Composio qumica de certos constituintes celulares, como: parede celular tipo lII, fosfolipdeo
tipo PI e presena de 2-0-metil-manose;
3) Habilidade de fixar nitrognio e nodular plantas (Lechevalier, 1984).
Em nvel de gnero, existe uma razovel homogeneidade, enquanto em categorias taxonmicas
inferiores foi observado um grau considervel de heterogeneidade (Lechevalier & Ruan, 1984). M-
todos moleculares de anlise do perfil de restrio do DNA genmico por endonuc1eases, determina-
o da composio de bases do DNA e homologia DNA/DNA tambm demonstraram diversidade
gentica entr'e estirpes de FremIda, pois s foram encontr'ados baixos nveis de homologia (Akkermans
et aI., 1991).
140
Como os ndulos de Franlda geralmente apresentam colorao interna branca, por muitos
anos se pensou que eles no contivessem hemoglobina. Resultados recentes, utilizando novos proce-
dimentos, confirmaram a presena de hemoglobina em ndulos de Casuarina (Appleby et al., 1983;
Tjepkema, 1984; Sellstedt et al., 1994).
4.2.2.3. Relaes simbiticas
Devido s dificuldades para isolamento de Franlda, vrios experimentos de inoculao em
hospedeiros utilizaram suspenso de ndulos macerados como fonte de inculo. Estudos comparando
esta fonte de inculo ao inculo procedente de culturas puras mostraram diferenas significativas nas
respostas obtidas (Gauthier et a1., 1984; Mirza et a1., 1994). Estas diferenas podem ser atribudas
presena de mais de uma estirpe no ndulo, devido sua infeco mltipla. Assim, embora a infeco
de um nico plo radicular seja necessria para formao do ndulo, geralmente a infeco de vrios
plos radiculares prximos leva formao de um nico ndulo. Desta forma, culturas puras ofere-
cem respostas mais consistentes sobre propriedades simbiticas das estirpes, embora os resultados at
agora obtidos forneam um quadro ainda confuso.
A existncia de espe?ificidade intergenrica na famlia Casuarinaceae j foi sugerida (Gauthier
et al., 1984). Contudo, vrias estirpes isoladas de Casuarina spp. falharam na nodulao de espcies
do mesmo gnero (Zhang et a1., 1984). A estirpe EuIl, isolada de Elaegnus 'Lunbellata, tambm no
nodula o hospedeiro do qual foi isolada, mas nodula outras espcies de Alnus, Myrica e Comptonia
(Baker et al., 1980). A estirpe ORS021001, isolada de Casuarinajunghuhniana, no nodula espcies
de gneros da mesma famlia (Alloocasuarina e Gymnospoma). Entretanto, vrias estirpes isoladas
de Casuarina nodulam membros de Elaegnaceae, como Hippophae e Elaegnus, sendo, por isso, suge-
rido que membros dessa famlia so hospedeiros promscuos (Zhang et a1., 1984). No entanto, a
estirpe AvCIlspp, isolada de Alnus, no nodula espcies daquela famlia (Baker & Torrey, 1980).
Alnus spp. (Betulaceae) e Myrica (Myricaceae) foram noduladas efetivamente pela mesma estirpe
(Baker & Torrey, 1980; Huss-Danell, 1991). No trabalho em que foi testado o maior nmero de
estirpes de Franlda (50) em cultura pura (Baker, 1987), estas foram divididas em quatro grupos de
especificidade hospedeira: 1) estirpes que nodulamAlnus e Myrica; 2) estirpes que nodulam Casuarina;
3) estirpes que nodulam somente Elaegnaceae e Myrica e 4) estirpes que s nodulam Elaegnaceae.
Enh'e os hospedeiros, Myrica c e r ~ l e r a foi a que apresentou maior promiscuidade simbitica. A falta
de estirpes que nodulem espcies das famlias Coriariaceae, Datiscaceae, Rhamnaceae e Rosaceae e
de resultados sobre um maior nmero de inoculaes cruzadas enh'e isolados j obtidos e vrias esp-
cies de hospedeiros resulta num quadro ainda incompleto sobre as propriedades simbiticas de Franlda.
Ah'ibuem-se h's funes atividade da hidrogenase: proteger a nih'ogenase do 02' prevenir a
inibio da N
2
ase por H
2
e recapturar a energia que poderia ser perdida como H
2
. A maioria das
simbioses de Franlda estudadas apresentou atividade da hidrogenase (Sellstedt et al., 1994). Nos
ndulos de Casuarina, onde as vesculas no esto presentes, a atividade da H
2
ase particularmente
importante, conferindo proteo N
2
ase conh'a o 02 (Sellstedt & Winship, 1987). Valores altos de
eficincia relativa (RE) da nih'ogenase (0,81-1,00) foram enconh'ados em simbioses de Casuarina
spp. com a estirpe HFPCcI3, dando suporte a esta hiptese.
141
4.2.2.4. Fatores limitantes
Mesmo em reas de distribuio natural, algumas espcies actinorrzicas podem no apresen-
tar nodulao e, fora de sua rea de distribuio, a ocorrncia de ndulos rara (Gauthier et aI., 1984).
Nestes casos, a inoculao com estirpes adequadas necessria. Inculos comerciais de Franlda
ainda no so disponveis devido a problemas de isolamento e cultivo j mencionados. O melhor
mtodo, quando culturas puras no forem disponveis, a inoculao dos "seedlings" com ndulos
ativos (reduo de acetileno), isolados da prpria espcie, macerados. Diversos resultados tm de-
monstrado efeitos positivos da inoculao com Franlda no desenvolvimento de plantas, tanto via cul-
turas puras como por ndulos macerados (Torrey, 1982; Weber et aI., 1987).
O gentipo da planta tambm pode influenciar o potencial da FBN. A porcentagem de N
derivado da FBN (% Ndfa) vmiou de 14% a 76%, entr"e diferentes procedncias de Casuarina
cunninghamiana, e de 25% a 75% para C. equisetifolia (Sanginga etal., 1990b). Em clones da mesma
espcie de Alnus spp., obtidos a partir de culturas de tecidos, observou-se alta vmiao na fixao,
tendo os melhores clones excedido em 51 % at 76% o crescimento de "seedlings". Estes resultados
indicam que podem-se obter ganhos genticos a curto prazo atravs de melhoramento do hospedeiro.
A inoculao dos clones com Franlda resultou tambm em aumentos significativos de 25% a 33% na
produo de biomassa (Hendrickson et aI., 1993).
4. 2.3. Outras simbioses
Dentr"e as simbioses de espcies arbreas com microrganismos fixadores de N
2
, as de rizbio
e Franlda se destacam por sua importncia econmica e ecolgica. No entanto, so reportadas outras
simbioses para espcies arbreas. Por exemplo, Ardisia e Psychotria, gneros das famlias Myrsinaceae
e Rubiaceae, respectivamente, so nodulados nas folhas por uma bactria no identificada (Miller &
Donelley, 1987; Miller et aI., 1983). Cycas e Macrozamia (Gymnospermae) so noduladas nas razes
por cianobactrias de gnero Nostoc (Siqueira & Franco, 1988). Poucos resultados so disponveis
para estas simbioses.
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CAPTULO 5
NUCORErrZASARBUSCULARES
Jos Oswaldo Siqueira
l
5.1. Introduo
Micorrizas so associaes simbiticas mutualistas formadas entre certos fungos do solo e
razes da maioria das espcies vegetais, constituindo-se no estado natural das razes da maioria das
plantas. Elas tm sido objeto de estudo desde o sculo passado, quando, em 1885, o botnico alemo
Albert Bernard Frank usou o termo micorriza para descrever este fenmeno de ocorrncia generaliza-
da na terra e especulou sobre seus efeitos benficos para a nutrio e crescimento das plantas, posio
contrria aos estudiosos da poca, que as consideravam de natureza parastica (Trappe & Berch, 1985).
Mais tarde, o prprio Frank demonstrou experimentalmente a natureza mutualista das micorrizas,
considerando-as "um rgo morfologicamente independente, mas com dependncia fisiolgica nti-
ma e recproca". Os fatos e consideraes feitos por ele foram confirmados pelos pesquisadores
atuais e serviram de base para a micorrizalogia, que ocupa hoje posio de destaque no mundo todo.
As micorrizas existem desde h 400 milhes de anos, e o carter mutualista das mesmas
contribui para sobrevivncia e evoluo das plantas terrestres e dos fungos (Harley & Smith, 1983),
pois o fungo simbionte aumenta a capacidade da planta de absorver nutrientes do solo, favorecendo
sua nutrio, enquanto a planta fornece fotossintatos para o fungo que incapaz de realizar fotossntese.
O mutualismo entre o fungo e as razes favorecido pela: a) existncia de uma fase biotrfica persis-
tente; b) compatibilidade estrutural e fisiolgica entre os parceiros; e c) pela habilidade dos simbiontes
de atuarem de maneira regulvel.
Baseando-se na morfoanatomia das razes colonizadas (Figura 5.1), as micorrizas so agru-
padas em ectomicorrizas, ectendomicorrizas e endomicorrizas (Tabela 5.1), diferindo substancial-
mente em relao a outras caractersticas funcionais e ecolgicas. As ectomicorrizas so caracteriza-
das pela penetrao apenas intercelular do crtex pelo miclio fngico e formao da "rede de Hartig"
em substituio lamela mdia e do manto que recobre a superfcie da raiz. A micorrizao ocorre
apenas nas razes laterais ou absorventes, as quais sofrem modificaes morfolgicas muito acentua-
das e visveis a olho desarmado. As ectendomicorrizas so geralmente ectomicorrizas com penetrao
intracelular, havendo diferenas anatmicas de acordo com a planta hospedeira como em subgrupos
das conferas e de espcies das Ericales, como nos gneros Arbutos e Monotropa. As endomicorrizas
caracterizam-se pela ausncia de manto externo, alteraes morfolgicas visuais e pela penetrao
inter e intracelular do fungo no crtex. Elas so de ocorrncia generalizada e subdivididas em Ericides
(ordem Ericales x Ascomicetos), Orquidides (Orchidaceae x Rhizoctonia) e Vesculo-arbusculares
lProfessor, Ph.D., Escola Superior de Agricultura de Lavras (ESAL), Caixa Postal 37, CEP 37200-000, Lavras. MG.
152
Vesculo-arbusculares ou Arbusculares (maioria das espcies x Zigomicetos da ordem Glomales). As
endomicorrizas ericides e orquidides, bem como os outros dois tipos, so de ocorrncia restrita a
certos ecossistemas, de pouco interesse agronmico e no sero abordadas neste captulo. Aspectos
bsicos e aplicados destes tipos demiconizas, podem ser encontrados em Marks & Kozlowski (1973),
Harley & Smith (1983) e A1len (1992), dentre outros.
M
Manto
( facultativo
Rede de
Hartig
ECTENDOMICORRIZA
FOTOASSIMILADOS
NUTRIENTES
ENDOMICORRIZA
ORQUIDIDE
Figura 5.1. Sistemas micorrzicos e suas caractersticas anatmicas.
Azigosporo
Clamidosporo
Es poro
-[53
Tabela 5.1. Caractersticas diferenciais dos diversos tipos de micorrizas.
Tipo de micorriza
Arbuscular ou vesculo-arbuscular
EctomiCorriza
Ericide
Orquidide
Ectendomicorriza
Principais caractersticas
Ocorre na maioria das plantas vasculares ( 300 mil esp-
cies).
Zigomicetos da ordem Glol17ales ( 140 espcies).
Cosmopolita, mas tipo predominante nos trpicos.
Penetrao inter e intracelular (arbsculos).
Vesculas em certas espcies e esporos caractersticos.
Fungo asseptado e biotrfico obrigatrio.
Sem evidncia de especificidade hospedeira.
rvores e arbustos especialmente as de clima temperado
Maioria Basidiomicetos e poucos Ascomicetos ( 5000
espcies).
Predominante em clima temperado e menos comum nos
trpicos.
Penetrao apenas intercelular (rede de Hartig). Forma-
o do manto e alterao morfolgica visvel a olho de-
sarmado.
Apresenta celia especificidade hospedeira.
Membros das Ericales com razes finas como Calluna e
Vaccinilll1l.
Ocorrncia muito reduzida, restrita a certos ecossistemas.
Ascomicetos (septados) com penetrao inter e
intracelular(hifas enroladas).
Elevada especificidade hospedeira.
o Membros da famlia Orchidaceae com estirpes de
Rhzoctolla (septado).
Ocorre nas florestas tropicais e temperadas.
Penetrao inter e intracelular (pelotes).
Alta especificidade hospedeira.
Membros das Erica/es como Arblltos e lviollotropa.
Basidiomicetos, muitos dos quais so ectomicorrzicos.
Penetrao inter e intracelular, manto (facultativo) com
rede de Hmiig.
Acentuada modificao morfolgica na raiz.
Elevada especificidade hospedeira.
154
As micorrizas arbusculares (MAs) parecem ter evoludo nos trpicos (Pirozynski, 1981),
apresentam pouca ou nenhuma especificidade na relao fungo-hospedeiro e ocorrem de modo gene-
ralizado na maioria das espcies e ecossistemas, sendo consideradas uma simbiose universal (Nicholson,
1967). Excees notveis condio no-micornzica, incluem membros das famlias Brassicaceae,
Comelinaceae, Juncaceae, Proteaceae, Cyperaceae, Chenopodiaceae e outras. Das espcies de inte-
resse agronmico, 87% das Crucferas (nabo, canola, mostarda, repolho), 61 % das Chenopodiaceae
(beterraba), 37% das Poligonaceae ("buckwheat"), 4% das leguminosas (tremoo) e membros da
Amarantaceae no formam MAs (Thompson, 1994). As razes para a resistncia das plantas
micorrizao parecem ser de natureza evolucionria e no so conhecidas com exatido. No entanto,
a condio no-micorrzica pode resultar do seguinte: a) produo e acmulo no crtex de compostos
fungistticos, como certos compostos aromticos em leguminosas, como tremoos, e glicosinolatos
nas crucferas; b) quantidade insuficiente de exsudatos ou de certos constituintes destes; c) ausncia
de fatores qumicos estimulantes que atuariam como sinais moleculares ou mediadores nutricionais; e
d) outras razes, como ausncia de reconhecimento e aderncia do fungo ao hospedeiro e barreira
fsica ou qumica na parede celular. Mecanismos distintos podem atuar nas diferentes espcies no-
micorrzicas. Estima-se que as MAs ocorrem em quase 300 mil espcies e so to velhas quanto as
plantas terrestres (Jeffries, 1987). Devido a essa ocorrncia generalizada e aos benefcios para a
planta hospedeira e para o funcionamento do ecossistema, elas so de grande significncia ecolgica
e agrcola e tm sido objeto de grande volume de pesquisa bsica e aplicada (AlIen, 1992; Janos, 1983;
Jeffries, 1987). As MAs so de interesse especial para as regies tropicais e subtropicais, especial-
mente para o Brasil devido: al baixa fertilidade dos solos e elevado requerimento de nutrientes pela
maioria das culturas; b) condies ambientais estressantes; c) alta proporo de minifundirios com
pequeno poder aquisitivo; d) suprimento limitado de fertilizantes em certas reas; e) alto custo dos
financiamentos agrcolas; f) possvel exausto dos depsitos de fosfatos; e g) preocupao crescente
com a qualidade ambiental, visando minimizar os impactos da poluio do solo e gua e do
desmatamento sobre o ambiente.
Assim, as MAs so componentes importantes dos ecossistemas e desempenham papel crucial
para sua funcionalidade e sustentabilidade. A biologia, ecologia, efeitos no crescimerito das plantas e
aplicaes dos fungos formadores das MAs so abordados nos tpicos seguintes deste captulo.
5.2. Formao e Funcionamento da Simbiose
As MAs resultam de uma seqncia complexa de interaes entre a hifa fngica e clulas das
razes que estabelecem uma relao simbitica representada por um estado diflmico com perfeita
integrao morfolgica, fisiolgica e funcional. Embora algumas etapas fenolgicas do estabeleci-
mento desta simbiose sejam bem caracteriiadas, muito pouco se conhece dos mecanismos bioqumicos
e moleculares da interao fungo-planta. Ao contrrio do que se verifica em outros sistemas simbiticos
entre plantas e microrganismos, no existe evidncia de especificidade na relao fungo-planta nas
MAs, no que refere colonizao, mas existe, no entanto, um alto grau de "compatibilidade funcio-
naI" que determina a efetividade simbitica da relao (Gianinazzi, 1991; Koide & Schreiner, 1992).
As expresses fenotpicas nas MAs so determinadas pelo genoma do fungo e da planta, dos
quais quase nada conhecido at o' presente. A capacidade de formar MAs restrita a um grupo de
fungos pertencentes a trs famlias da ordem Glomales dos Zigomicetos (ver item 5.3.1.), das quais
so conhecidas em torno de 140 espcies, distribudas em apenas seis gneros. Estes fungos so
simbiontes obrigatrios, com reproduo assexuada e ainda no foram cultivados em meios de cultura
155
na ausncia de razes vivas. carter de biotrfico obrigatrio dificulta os estudos bsicos da biolo-
gia destes fungos, bem como limita sua aplicao em larga escala. Ainda no so conhecidos os genes
e os fatores genticos que controlam o ciclo de vida, a infectividade (ou virulncia) e eficincia
simbitica destes fungos e os aspectos moleculares da sua relao com a planta hospedeira. O ciclo de
vida dos fungos MAs envolve etapas distintas (Tabela 5.2) na ausncia e presena de razes vivas.
Esh'uturas reprodutivas, como esporos (Figuras 5.2 e 5.3), hifas e miclio, sobrevivem como propgulos
na ausncia de razes e, quando na presena destas, colonizam o crtex radicular e estabelecem relao
simbitica, que garante a produo de novos propgulos e tambm de um ciclo policclico (Wilson &
Tommerup, 1992). Na rizosfera, os esporos germinam, produzem miclio, hifas infectivas e apressrio,
ah'avs do qual peneh'am a raiz, onde se estabelece e coloniza parte do crtex, e diferencia formando
os arbsculos (estruturas intracelulares), que so os pontos de troca de metablitos entre os parceiros
da simbiose. Formados os arbsculos, ocorre a integrao morfolgica, fisiolgica, bioqumica e
funcional e o estabelecimento do "mutualismo", resultando no micoh'ofismo (absoro de nUh'ientes,
via fungo), que favorece o crescimento da planta e o biotrofismo (fluxo de fotossintatos do hospedeiro
para o fungo), e garante a propagao e sobrevivncia do fungo (Siqueira, 1991). Os principais com-
ponentes e fases do ciclo dos fungos e MAs, bem como os eventos biolgicos e fatores envolvidos no
estabelecimento e funcionamento das MAs, so bem discutidos em Brundrett (1991) eAbbott & Robson
(1991) e encontram-se resumidos na Tabela 5.2. Siqueira (1991) e Koide & Schreiner (1992) discu-
tem as fases e os principais aspectos da relao fungo-planta, os quais esto resumidos a seguir:
a) Germinao dos esporos - pode ser favorecida na rizosfera, mas no sofre influncia especfica da
presena da raiz, exsudatos ou seus componentes.
b) Crescimento assimbitico na rizosfera e na superfcie das razes - estimulado por fatores nutIicionais
produzidos e liberados pelo hospedeiro, os quais induzem a melhor utilizao de reservas endgenas
do esporo ou atuam como ativadores de genes de crescimento. Alguns compostos volteis, CO
2
e
flavonides podem atuar como agentes estimulantes.
c) Reconhecimento e formao de apressrio - uma etapa ainda pouco conhecida, mas pode envol-
ver a induo de genes especficos que conh'olam o carter simbitico do fungo e a resistncia do
hospedeiro invaso. Por ser um sistema no-patognico, a planta no apresenta respostas tpicas
como aquelas verificadas na relao patgeno-hospedeiro. Compostos orgnicos presentes nos
exsudatos, como os flavonides, podem facilitar o contacto clula-clula entre os simbiontes e
facilitar a colonizao micorrzica. As indicaes do envolvimento de genes do desenvolvimento
das MAs no hospedeiro, como os genes "Myc especficos", "Myc repressores" e "Myc facilitadores",
so evidncias do mecanismo preciso de conh'ole desta simbiose (S.E.Smith, Comunicao pesso-
al).
d) Penetrao da raiz e colonizao do crtex - parecem estar sujeitas a uma regulao funcional
resultante do alto grau de compatibilidade fungo-planta, envolvendo respostas fisiolgicas como a
produo de enzimas e hormnios. A presena de enzimas especficas "micorrizinas" indica o
envolvimento de mecanismos genticos e a perfeita integrao bioqumica entre os parceiros.
e) Formao de arbsculos e estabelecimento da relao simbitica - resultam de mecanismos ainda
desconhecidos que podem envolver uma complementaridade gentica da relao fungo-planta, ad-
quirida durante os milhes de anos da co-evoluo. Estas podem ser mediadas por mecanismos
tticos ou sinais moleculares, os quais esto sob controle gentico (letra d) e so modulados pelo
ambiente.
156
f) Funcionamento do mutualismo - a planta fornece fotossintatos que servem como fonte de energia e
possivelmente fatores de crescimento, enquanto o fungo absorve e transfere nutrientes minerais
como o fsforo. Mecanismos de ajustes fisiolgicos na planta compensam o dreno energtico
causado pelo fungo na raiz.
Em termos prticos; o estabelecimento das MAs determinado pela densidade de propgulos,
que determina o potencial de inculo ou infectividade, e pelas caractersticas do hospedeiro, como sua
prpria suscetibilidade micorrizao e crescimento das razes, considerando qJ,le a chamada "hifa
infectiva" intercepta uma raiz suscetvel por acaso. No h. atrao especfica ou direcionada do
crescimento micelial na rizosfera (Ver Allen, 1992, captulo 1).
Tabela 5.2. Principais fases e eventos do ciclo dos fungos e das micorrizas arbusculares. Adaptado
de Brundrett (1991).
Fase ou componente do ciclo
Propgulos fngicos
(esporos, hifas, razes)
Razes do hospedeiro
Rifa na superficie da raiz
Penetrao da raiz e
colqnizao do crtex
Stios de troca
Processos de troca ativa
Rifa ativa no solo
Senescncia das
estruturas fngicas
Formao de propgulos
Senescncia da raiz
Evento, mecanismo e fatores
Sobrevivncia, disperso, dormncia, ativao, crescimento
micelial.
Suscetibilidade, razes novas, nutrio, taxa de crescimento e
exsudao.
Proliferao, reconhecimento do hospedeiro, hifa infectiva,
apressrio.
Compatibilidade com hospedeiro e alterao morfolgica do
fungo.
Penetrao celular, ramificao (arbsculos) e resposta do
hospedeiro.
Durao limitada e regulada pela relao fungo-planta-ambi-
ente.
Absoro de nutrientes, explorao do solo, colonizao se-
cundria e terciria.
Degenerao dos absculos, armazenamento nas vesculas.
Esporos, miclio e razes colonizadas.
Perda do crtex (morte e parasitismo) e reciclagem dos nutri-
entes.
157
Figura 5.3. Esporo sem hifa de sustentao
(sessil), do gnero Entrophospora.
com dimetro mdio = 100 ~ l .
Figura 5.2. Esporo do tipo azigosporo. com hifa
de sustentao, pertencente ao gnero
Scutellospora, espcie no descrita,
coletado em solo de cerrado. com
dimetro mdio = 150 ~ .

o
158
Embora algum avano tenha ocorrido nos ltimos cinco anos, muito pouco se conhece sobre
as bases moleculares do estabelecimento das MAs. Siqueira (1991) discute trs aspectos importantes
deste tpico:
a) Sinais moleculares - Plantas de trevo deficientes em fsforo produzem exsudatos radiculares capa-
zes de promover grande estmulo no crescimento do fungo, ao contrrio daquelas bem supridas em
fsforo (Elias & Safir, 1987). Respostas semelhantes so vetificadas para culturas de clulas de
planta hospedeira crescendo em meio pobre em nutrientes (Paula & Siqueira, 1990). Vrias subs-
tncias foram isoladas e identificadas nestas plantas (Nair et aI., 1991; Rhlid et aI., 1993). Amos-
tras autnticas destes compostos estimulam o crescimento assimbitico de fungos MAs e a coloni-
za.o mic.orrzica. Apesar das evidncias experimentais, ainda no existem provas qualificativas e
definio dos mecanismos de ao destas substncias sobre o fungo e sua relao com a planta.
b) Mecanismo de reconhecimento e formao de apressrio - A formao de apressrio um evento
feno tpico bem definido, mas o mecanismo de reconhecimento fundamentado em evidncias
circunstanciais nas MAs, baseando-se em analogia desta associao com outros sistemas simbiticos.
necessrio conseguir evidncias bioqumicas do reconhecimento fungo-planta. A descoberta de
mutantes Myc representa grande avano nesta rea.
c) PenetTao, colonizao e formao de arbsculos - Requer a formao de apressrio e atividade
enzimtica bem balanceada. Mecanismos de controle da penetrao e induo da formao de
arbsculos precisam ser elucidados.
Um quarto aspecto importante do estabelecimento das MAs a regulao da transferncia de
metablitos entre o fungo e a planta e o custo energtico da simbiose. Diversos estudos apontam que
plantas miconizadas translocam entre 5% a 15% mais carbono fixado para as razes que plantas sem
MAs (ver Schwab et aI., 1991). Assim, as MAs representam elevado custo energtico para a planta
hospedeira, que se ajusta smbioticamente de modo a compensar este dreno extra de energia que
consumido nas razes. No entanto, estima-se que os custos para manter as MAs so da mesma ma!,'11i-
tude que aqueles gastos com a absoro de nutrientes "per se" e, seguramente, muito menores do que
se a planta hospedeira tivesse que produzir razes suficientes para atingir atividade de absoro equi-
valente a das razes micorrizadas. Desse modo, esta simbiose representa uma estratgia vantajosa
para a planta enfrentar condies estressantes de crescimento e, certamente, uma garantia de sobrevi-
vncia do fungo, que biotrfico obtigattio.
5.3. Ecologia das MAs
5.3.1. Avaliao da ocorrncia
As MAs constituem a regra na natureza, e no a exceo, sendo de ocolTncia generalizada
nas Fanergamas, e os fungos que as formam so predominantes dentre aqueles normalmente encon-
trados na rizosfera ou colonizadores de razes. Apesar de ser o tipo de micorrza predominante nas
plantas vasculares, as MAs no despertavam muita ateno at pouco tempo, porque os fungos que
formam as MAs so biotrficos obtigatrios e, portanto, no aparecem nos isolamentos de microrga-
nismos do solo ou de razes e porque a associao to bem balanceada que razes miconizadas no
mostram sintomas visuais da simbiose. Ao contrlio do que se verifica nas ectomicortizas, que po-
dem ser detectadas pelas alteraes visuais das razes colonizadas e presena dos corpos de frutificao
macroscpicos dos fungos simbiticos (basiodicarpos e ascocarpos, na maiotia), nas MAs no ocor-
rem alteraes morfolgicas vistas a olho desarmado e os fungos so microscpicos (Figu.-a 5.2).
Para detectar e quantificar a presena das MAs, so necessrios procedimentos especficos, quais
159
sejam: a) observao e avaliao microscpica das razes quanto presena do fungo e estruturas
tipicas como arbsculos, vesculas e esporos; b) extrao e separao dos esporos do solo, cuja presen-
a indicativo da ocorrncia da associao no ecossistema; e c) bioensaio para determinao da
infectividade do solo e do nmero mais provvel (NMP) de propgulos no solo. As diversas alterna-
tivas operacionais para a avaliao da ocorrncia das MAs e suas relaes ecolgicas acham-se resu-
midas na Figura 5.4.
Amostras de razes lavadas podem ser observadas diretamente pela presena de estruturas
fngicas usando microscopia de fluorescncia, mas isto requer muita experincia do observador e tem
aplicao muito I imitada a certas espcies vegetais. O procedimento mais seguro e amplamente
empregado consiste na clarificao e alvejamento das razes com produtos qumicos e posterior colo-
rao com corantes, como azul de trpano e fucsina cida, os quais evidenciam com muita segurana
as estruturas microscpicas do fungo na raiz. O procedimento laboratorial relativamente simples,
existindo diversas alternativas conforme descrito em Dalp (1993). Os resultados obtidos para colo-
nizao micorrzica dependem do procedimento adotado, podendo ser expressos de diversas maneiras
como, por exemplo, porcentagem dos segmentos colonizados, porcentagem do comprimento de raiz
colonizada, intensidade da colonizao e porcentagem de colonizao arbuscular. Dois aspectos im-
portantes na avaliao da colonizao so a amostragem e a identificao das eshuturas fngicas nas
razes. Deve-se selecionar apenas as razes finas 2mm de dimetro) e tomar o cuidado de distinguir
as eshuturas dos fungos Glomelianos daquelas dos saprfitas ou parasitas, normalmente tambm
associados s razes. Os fungos MAs (Glol1lales) so asseptados (hifas cenocticas, sem septos) en-
quanto os outros, na grande maioria, so septados e podem ser distinguidos mesmo com baixa ampli-
ao microscpica. Os fungos das MAs so caracteJizados microscopicamente pela presena de hifas
no-septadas e/ou eshuturas tpicas inter e intracelular no crtex e miclio externo (extra-radicular),
tambm asseptado. Os arbsculos so fonnados dentro das clulas enquanto as vesculas, que s
ocorrem em certas espcies de FMAs, podem ser formadas entre ou no interior das clulas. Algumas
espcies de fungos formam tambm esporos dentro das razes, como espcies c1amidospricas do
gnero Glol1llls (Ex. Glomlls intraraclices). Neste caso, distinguem-se esporos intra-radiculares das
vesculas, pela espessura e estrutura das paredes. Esporos tm paredes muito espessas (que podem ser
laminadas) enquanto as vesculas tm paredes finas.
Outra maneira de avaliar a ocolTncia das MAs o isolamento e extrao dos esporos dos
FMAs do solo, para contagem do nmero de esporos, e a determinao da densidade de propgulos e
infectividade do solo, pelo mtodo do nmero mais provvel (NMP). Os diversos procedimentos
encontram-se tambm descritos em Dalp (1993). Enhe estes, o mais eficiente e simples o
peneiramento via mida, que consiste em fazer uma suspenso do solo em gua e o peneiramento
atravs de uma srie de peneiras com malhas, vmiando de 0,35 mm a 0,45 mm de abertura. Os
mateJiais retidos nas peneiras intermedirias e na mais fina so retirados e cenhifugados em gua e
sacarose (1 M), em cenhifugas com rotor hOlizontal com tubos balanantes. Os esporos ficam no
sobrenadante dos tubos e so lavados com gua corrente e transferidos para placas para observao e
contagem em microscpio estereoscpico, em baixa ampliao. Grupos homogneos de esporos so
montados em lminas, contendo fixadores como PVL (lcool polivini1 em lactofenol), para caracteri-
zao microscpica detalhada (100-1000 vezes de aumento) e posteIior classificao taxonmica
(Schenck & Perez, 1987).

160
AMOSTRA DE RIZOSFERA
I I I
Bioensaio Separao Multiplicao

_Densidade de propgulos
Infectividade
\
Armazenagem
\
An lise Extrao __ --',';--__ VASOS DE CULTIVO
qurmica - - - t ' (Multiplicao)

- -........ \ I
'- \ +
*
Colorao
Contagem ",\ Testes de
,-__ ____ , \ I
Inoculao
*
Lminas Densidade total

Caracterizao
\

Identificao --.. Taxonom ia -
\
\
Avaliao
,/' da
/ colonizao
/
\ I / Lminas
\ I / ".
\ I / //
',,,, , ,; /
RESULTADOS (
1
COLEO DE CULTURAS
HERBRIO
IOCORRgNCIA E RELAES ECOLGICAS I
Figura 5.4. Seqncia operacional para avaliao da ocorrncia e relaes ecolgicas das MAs.
Os fungos que formam as MAs pertencem classe Zigomicetina, ordem GlolllClles, que tm
apenas as famlias GlolllClceCle, ACCllIlosporaceae e GigasporaceCle, cada uma com apenas dois gne-
ros, cujas principais caractersticas encontram-se na Tabela 5.3. A taxonomia destes fungos basea-
da essencialmente em caractersticas fenotpicas dos esporos, que so assexuados e apresentam eleva-
da diversidade de cor, tamanho, forma (Figuras 5.2 e 5.3) e' caractersticas da parede (espessura,
arranjamento e nmero), dentre outras (Morton & Benny, 1990). So conhecidas atualmente cerca de
140 espcies descrtas, as quais ocorrem nos diversos ecossistemas terrestres, sendo o gnero Glolllus
o que apresenta maior nmero de espcies (em torno de 70) seguido por ACClulospora e Sclltellospora.
As espcies vegetais diferem quanto suscetibilidade micorrizao, existindo espcies que
no formam micorrizas de tipo algum. Considerando as informaes disponveis para as plantas
tropicais, Trappe (1987) relata que 13,4%. das espcies so no-micorrzicas, 70,9'% formam MAs e
15,7% formam outros tipos de simbiose radicular com os fungos. Grandes diferenas intra-especfi-
cas e em nvel de ecotipo, clone e cultivar quanto micorrizao podem ocorrer, principalmente em
espcies cultivadas submetidas a intenso programa de melhoramento gentico, que pode, ao longo do
tempo, selecionar indivduos pouco suscetveis ou at mesmo resistentes micorrizao (Hetrick et aI.
1992; Johnson & Pfleger, 1992).
Tabela 5.3. Famlias, gneros e principais caractersticas dos fungos MAs (Morton & Benny, 1990; Morton, 1988).
Famlia Gnero Tipo de esporo Dimetro N" de Rifa de Clnlas Esporo- Ves-
mdio(J.!) paredes snstentao anxiliares carpo cuIas
Acalllosporaceae Acaulospora Azigosporo 100-300 2-5 sessil no no/sim sIm
Acalllosporaceae Entrophospora Azigosporo < 100 2-5 sessil no no sim
'"
Gigasporaceae Scutellospora Azigosporo >300 3-6 bulboso sIm no no
Gigasporaceae Gigaspora Azigosporo >200 1-2 bulboso sim no no
Glomaceae Glo/11uS Chlamidosporo <200 1-3 forma funil no sim/no sIm
Glomaceae Sc/erocystis Chlamidosporo < 100 1 forma funil no sim sIm
162
A ocorrncia das MAs ento determinada pela vegetao e pelo ambiente do ecossistema
(Johnson et a1., 1992b). Trufem & Bononi (1985) propuseram a existncia de quatro padres de
ocorrncia de fungos MAs em ecossistema no-alterado do Estado de So Paulo, que so:
a) Espcies que ocorrem na maioria dos hospedeiros durante todo o ano;
b) Espcies que ocorrem em grande densidade no solo, mas so restritas a certos hospedeiros e pocas
do ano;
c) Espcies com baixa densidade, mas sem restrio de hospedeiros ou poca do ano; e
d) Espcies com baixa densidade em poucos hospedeiros e em pocas restritas.
Os esporos acham-se presentes em quase todos os solos, sendo extremamente reduzidos ou
inexistentes naqueles fumigados, severamente perturbados pela eroso, minerao, construo civil e
longos perodos de pousio ou inundao (Abbott & Robson, 1991; Brundrett, 1991). A disperso dos
propgulos ocorre por disseminao ativa, atravs do crescimento do miclio e razes colonizadas, e
por disperso passiva, pelo vento, micofagia, oligoquetas, pssaros, insetos, gua, transporte de solo e
de mudas de plantas. A diversidade fngica vara muito em virtude do ecossistema (Tabela 5.4),
sendo encontradas de duas a 33 espcies por ecossistema (Brundrett, 1991).
Tabela 5.4. Ocorrncia e diversidade relativas de fungos MAs em diferentes ecossistemasl
agrossistemas.
Ecossistema IAgrossistema (Exemplo) Fungos MAs
Ocorrncia Diversidade
No-alterado (cerrado, mata) Baixa Alta
Agro-baixo insumo (rotao de cultura) Alta Mdia/Baixa
Agro-manejo intensivo (hortalias, irrigao) Baixa Muito baixa
Altamente alterado (rea de minerao) Muito baixa Baixa
5.3.2. Fatores qne afetam a ocorrncia
As MAs so reguladas pelas caractersticas da planta, do fungo e pelos fatores ambientais
(solo e clima). O conhecimento das relaes ecolgicas no sistema micorrzico essencial para pro-
gramar o uso efetivo desta simbiose na agrcultura comercial e para conhecer e avaliar a atividade
destes fungos e sua simbiose como um componente funcional dos ecossistemas. Grande volume de
informaes acha-se disponvel sobre os efeitos dos diversos fatores que afetam a formao, funo e
ocorrncia das MAs, conforme listados na Tabela 5.5. As condies ou fatores que geralmente redu-
zem a ocorrncia das MAs encontram-se na Tabela 5.6.
163
Tabela 5.5. Principais fatores que afetam a fonnao e ocorrncia das MAs, confonne o componente.
Componente
Solo
Planta
Ambiente
Manejo
Principais fatores
Disponibilidade de nutrientes, pH, elementos txicos, salinidade, textura, es-
trutura e agregao, densidade, umidade, organismos.
Espcies, variedade, cobertura vegetal, nutrio, idade, ciclo e taxa de cresci-
mento, alelopatia, sistema radicular, exsudao, senescncia.
Intensidade luminosa, temperatura, estao do ano, precipitao, poluio at-
mosfrica e do solo.
Histrico da rea, tipo de cultivo, eroso, irrigao, fertilizantes e corretivos,
controle de ervas daninhas, pastejo e uso de biocidas.
Tabela 5.6. Condies e fatores que reduzem a ocorrncia das MAs (Johnson & Ptleger, 1992;
Thompson, 1994; Abbott & Robson, 1991).
Condio
Eliminao da vegetao
Perda da camada arvel do solo
Cultivo intensivo
Sistema de produo
Melhoramento vegetal
Uso de fertilizantes
Uso de pesticidas
Inundao e empilhamento do solo
Mecanismo ou processo
Desmatamento, fogo, pastejo intensivo, poluio atmosfrica.
Eroso, decaptao do solo, compactao.
Quebra da macro estrutura contendo miclio.
Monocultura prolongada, cultivo de espcie no-hospedeira,
pousio prolongado.
Seleo inadvertida para gentipos no-micorrzicos.
Quantidades elevadas ou desbalanceadas.
Produtos sistmicos e fumigantes.
Reduz a viabilidade dos propgulos e a colonizao.
164
A relao entre a colonizao micorrzica e densidade de esporos com as propriedades fsicas
e qumicas do solo variam consideravelmente. Em geral, a incidncia das MAs maior quando as
condies de crescimento esto abaixo do timo para a espcie hospedeira. Colonizao e esporulao
so mximas em solos de baixa fertilidade, sendo a disponibilidade de N e P os fatores que comumente
exercem maior influncia (Figura 5.5a). Os nveis de P no solo interferem na colonizao e na
esporulao dos fungos MAs (Figura 5.5b e 5.5c), sendo os efeitos deste nutriente na colonizao
diferentes entre espcies, pois atuam via nutrio da planta e, por isto, a quantidade de nutriente
requerida para inibir a colonizao depende da capacidade de absoro e translocao da espcie
vegetal. O cultivo dos solos pobres do cerrado, com conseqente aplicao de calcrio e fertilizantes,
favorece a micorrizao das culturas (Siqueira et aI., 1989). A presena de metais, como o Zn, Cu e
Mn, em concentraes elevadas, inibe a germinao dos esporos e pode reduzir a colonizao
micorrzica. Os fatores fsicos, como inundao, compactao e alta umidade (m aerao), reduzem
a micorrizao e a ocorrncia das MAs. As condies biolgicas do solo so tambm de grande
importncia. Existem vrios predadores de hifas, como os colmbolos, hiperparasitas e antagonistas,
que reduzem a viabilidade dos esporos no solo. Mas, existem tambm organismos sinergistas com os
fungos MAs, como o caso de bactrias produtoras de enzimas hidrolticas que facilitam a penetrao
das razes pelo fungo, sendo conhecidas como "helpers". Outros microrganismos, como rizbio,
solubilizadores de e diazotrficos de vida livre, geralmente tm relaes sinergistas com as
MAs (Linderman, 1992).
50
b)
c
o +
o
10
f..)
o
50 a)
c
o
10
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N ou P adicionado, tJg/g
c)
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80 100
'iij
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20
P disponvel, flg/g
a
P
+--+.
40 60 80 100
disponvel, 1-19/g
Figura 5.5. Efeitos da adio de N e P na colonizao micorrzica da soja (a) e do P disponvel no
solo, na colonizao (b) e esporulao (c) do milho e soja, inoculados com G. mac/Vcwpw/l
(Paula & Siqueira, 1987a; Fernandes et aI., 1987).
165
A camada arvel do solo o principal reservatrio de propgulos de fungos MAs (Bellgard,
1993) e qualquer fator que exera impacto sobre esta exercer grande influncia na ecologia das MAs
CHabte et aI., 1988). Estes incluem o cultivo intensivo, eroso, contaminao, decaptao do solo,
fogo intenso, pousio, desmatamento e compactao. Os aspectos de manejo do solo sero comentados
mais adiante.
Dentre as caractersticas da planta que afetam as MAs, destacam-se as variaes inter e intra-
especficas, o estado nutricional, ciclo e taxa de crescimento e a produo de substncias alelopticas.
Mesmo dentro de famlias tipicamente micorrzicas, existem espcies que resistem colonizao,
como o caso das leguminosas que so altamente micotrficas, mas o gnero LupillllS e outros no
formam MAs. Os efeitos dos aleloqumicos sobre as micorrizas ainda no so bem conhecidos (ver
Siqueira et aI., 199Ia), mas existem evidncias da atividade destes quimicos naturais sobre as MAs.
Os aleloquimicos podem atuar como inibi dores ou estimulantes da micorrizao e interferem na ocor-
rncia dos fungos MAs. Compostos aromticos comumente encontrados no solo, como os cidos
fenlicos, quercetina e escopoletina, quando aplicados em concentraes de 0,2 mM, estimulam a
colonizao micorrzica do trevo (Fries, s.d.). Em solos com monocultura de aspargos, em Michigan,
Estados Unidos, a quantidade de fenlicos em extratos aquosos aumentou em 70%, em relao ao solo
adjacente sem aspargos, atingindo 63J.lg de fenlicos . g" de solo (Pedersen et aI., citados em Siqueira
et aI. 1991 a). Os principais cidos fenlicos encontrados neste sistema inibem o crescimento micelial
e a colonizao micorrzica.
Os efeitos dos pesticidas dependem basicamente do modo de ao do produto e da taxa e
freqncia de aplicao. Os herbicidas geralmente no tm efeitos inibitrios e alguns podem at
mesmo estimular a colonizao. Os nematicidas e inseticidas geralmente tambm no exercem efei-
tos adversos quando aplicados nas dosagens recomendadas. J os fungicidas tm efeito muito variado
devido ao modo de ao. Os benzimidazoles so os mais prejudiciais, enquanto o Fosetyl-AI e metalaxyl
estimulam a micorrizao. Os fumigantes de solo tm efeitos devastadores, pois eliminam os propgulos
e a colonizao. Os efeitos da aplicao dos pesticidas sobre as MAs so muitas vezes dificeis de
serem avaliados, pois atuam diretamente sobre os fungos MAs, ou indiretamente sobre a planta hospe-
deira e sobre aspectos quimicos do solo ou sua biota. Mesmo os produtos que no atuam adversamen-
te SObre}lS MAs podem causar alteraes quantitativas e qualitativas sobre esta simbiose, pois quando
usados continuamente podem provocar alteraes na vegetao e no equilbrio biolgico do solo.
Em estudo sobre a ocorrncia das MAs em Minas Gerais, verificou-se em amostras de 165
locais que a colonizao variou de O a 91 %, e a densidade total de esporos de O a 277 esporos.50 CC"
de solo (Siqueira et aI., 1989). Nos ecossistemas no-alterados, a colonizao mdia foi de 13%,
enquanto nos agrossistemas esta foi de 38%. Valores mdios de colonizao e densidade de esporos no
solo para ecossistemas selecionados (Tabela 5.7) revelam enorme variao quantitativa entre os
ecossistemas, refletindo suas condies quimicas e biolgicas. Neste mesmo estudo, verificaram-se
tambm variaes qualitativas na distribuio das espcies fngicas. Foram encontradas 33 espcies
identificadas, alm de vrias outras no descritas, sendo a diversidade mdia de espcies por ecossistema
igual a 19 e 12 para ecossistemas naturais e agrossistemas, respectivamente. Comparando-se os
ecossistemas quanto ocorrncia de espcies com indice de ocorrncia maior ou igual do que 4%,
verifica-se maior ocorrncia de certas espcies de Glol/lus e Acaulospora nos agrossistemas, e de
Scutellospora, Entrophosphora e Gigaspora nos ecossistemas no-alterados. Outro aspecto interes-
sante verificado neste estudo foi a alterao na composio das espcies dominantes, consideradas
aquelas com ndice de ocorrncia superior a 50% da ocorrncia mxima. Nas amostras de cerrado
166
natural havia oito espcies predominantes contra apenas trs, em mdia, nos agrossistemas estudados.
O cultivo destes solos aumenta a populao de fungos MAs, mas reduz a diversidade de espcies,
tornando o sistema biolgico mais vulnervel a alteraes. As modificaes na composio de esp-
cies refletem alteraes nas caractersticas qumicas do solo, resultantes das prticas de cultivo como
arao, gradagem, calagem e adubao. No entanto, tem sido difcil correlacionar a ocorrncia das
espcies com caractersticas qumicas do solo (Siqueira et aI., 1989; Fernandes & Siqueira, 1989;
Schenck et aI, 1989) mas, pelo menos para algumas espcies e variveis, certas tendncias sO bastan-
te claras (Tabela 5.8). Por exemplo, A. 1Il01'/'Owae, A. spillosa e E. colombialla tm incidncia
reduzida em solos com pH mais elevado, ao contrro do que se verifica para o G. elUllicalulII. Outras
tendncias so verificadas para os nveis de AI+] e P no solo.
Tabela 5.7. Valores mdios para colonizao micorrizica e densidade de esporos no solo em
ecossistemas do Estado de Minas Gerais (Siqueira et a!., 1989).
Ecossistema
Arroz
Milho
Soja
Algodo
Mandioca
Cana-de-acar
Citros
Eucaliptos (adultos)
Pastagem braquiria
Cafeeiro
Gramneas nativas
Leguminosas forrageiras
Cerrado (natural)
Razes colonizadas Densidade de esporos
(%) (No. 50 cc
l
)
33 67
36 84
18 61
17 99
20 90
19 62
53 120
2 37
33 52
35 20
36 23
62 98
14 46
As alteraes no pH so fatores de grande importncia para a ecologia e distribuio dos
fungos MAs. Quando populaes fngicas originadas de solos com pHs diferentes foram multiplica-
das em solo cido, com e sem calcrio, verificaram-se diferenas muito acentuadas na composio das
espcies e que estas modificaes dependem da composio inicial da populao (Figura 5.6). Glomus
occulf!lmldiaplwlll/lll e Gigaspora margarita dominavam (em proporo de esporos) no solo cido e
167
foram substitudas de modo diferenciado por GIOIllIlS etllllicatlllll, quando o solo recebeu calagem. O
mesmo no ocorreu no solo muito cido, cuja populao era dominada por Acalllo.lpo/rl scmhiclIlata.
Baseando-se nestes resultados e nos obtidos por Sierverding (1991), algumas generalizaes podem
ser feitas com relao interao pH-fungos MAs nos solos tropicais, havendo espcies com prefern-
cia ou tolerncia a certas condies.
a) Predominam em condies de elevada acidez - Glo/lllls diapllC/Il11Ill, Glol/llls occlIltlllll,
Entroplzospora colombiana, SClIIellospora sp., G!gaspora lIlargarita, Acolllw,pora loev!s.
b) Preferem solos pouco cidos ou neutros - Glo1l111s JIl0sseae, GloJllus c1aJ71Ill, Sclemcystis sp., Glol/1us
fasciclllatllm, GIO/llllS etzmicatlllll.
c) So indiferentes acidez do solo -Acalllospora scrobiclIlata, Acau/ospora morl"Owae, G/IJIlllfol"
agrega/lIl1l.
Tabela 5.8. Incidncia relativa das principais espcies fngicas encontradas em Minas Gerais, em
relao a classes de pR, AI e P no solo. Adaptado de Siqueira et aI. (1989).
Fator
edfico
(classe)
pH
<50
5-6
>6,5
<0,5
0,5 - 1,0
> 1,0
P (Meh1ich)
< 6,0
6 - 12
> 12
Espcies fngicas*
Asc Amo Asp Ame Ssp Spel Get Gdi Ecol
--------- %.de incidncia dentro da classe----------
33
39
29
38
22
24
20
50
47
43
36
14
32
30
29
31
45
27
14
18
14
13
17
19
17
15
13
6
5
8
4
12
14
12
O
2
29
17
14
17
17
9
21
10
14
lO
12
14
6
19
5
13
10
9
O
13
29
12
9
O
8
5
18
10
14
12
12
12
10
12
15
5
12
O
O
9
14
18
18
10
4
* A"c = A.scrobiculata; Amo"" A. morrowae; A ~ p = A.spinosa; Am\! = A.mellea; Ssp = SCllwllospora sp; Spl!l = S. pelll/cida; Gl!t = Glamlls
etunicatllm; Gdi = G././iaphanulI/; e Eeol = Enrrophmpora colombiana.
168
Sem calcrio (pH 4,9) Com calcrio (pH 6,0
ORIGEM DOS FUNGOS
Solo com pH 6,0
Solo com pH 5,5
Solo com pH 4,8
~ G/omus occultum /G. diophonum
ffilill G/o mus etunicotum
86%
0,,'
14%
:-;
Gigosporo morgarito
o Acoulospora scrobicu/ato
Figura 5.6. Efeito da cal agem de solo cido na esporulao de fungos MAs de diferentes origens
(Siqueira et a!., 1990).
169
Embora os fungos MAs sejam considerados generalistas, existem diferenas causadas pelo
tipo ou seqncia de cultura na composio de espcies. Estudos recentes em solos cultivados do
meio oeste americano (Johnson et aI., 1992a) revelam resultados surpreendentes, relacionando altera-
es na populao de fungos MAs com o efeito da rotao na produtividade das culturas. A monocultura
prolongada com milho favorece a populao de G10IllUS occlIltlllJ/, que se correlaciona negativamente
com a produtividade desta cultura, porm correlaciona-se positivamente com a produtividade da soja
em rotao. A monocultura da soja favorece GIOlllllS lIliCmCWpulIl, que se correlaciona negativamen-
te com a nutrio e produtividade da soja, mas mostra-se benfica para o milho. Estes eshldos indi-
cam que a monocultura prolongada seleciona fungos de rpido crescimento e esporulao, sendo
portanto uma seleo para sobrevivncia e no para efetividade ou eficincia. Isto pode resultar na
seleo de espcies inefetivas ou parasticas para a cultura, contribuindo para o chamado "declnio da
monocultura". Praticando-se a rotao de culturas, pode-se reverter este processo, favorecendo as
espcies efetivas que contribuiro para a nutrio e produo da cultura em rotao. Este , portanto,
um modelo desenvolvido com base nos resultados obtidos na rotao milho-soja nos Estados Unidos,
sendo sua validade para outras condies ainda sujeita a evidncias experimentais. Contudo, verifica-
se que na monocultura do cafeeiro no Brasil, predominam na rizosfera espcies de Acalllospo/'il, prin-
cipalmente A. scrobiclIlata que pouco efetiva para esta cultura. A comunidade fngica controlada
pelo solo e pela cultura (Johnson et aI., 1991; 1992b). Na mesma cultura, o nmero total de espcies,
densidade de esporos e espcies fngicas varia muito entre locais (Tabela 5.9), indicando a grande
influncia do ambiente sobre a ecologia das MAs. Comparando-se as espcies predominantes em
cafeeiros no sudeste brasileiro (Fernandes & Siqueira, 1989; Oliveira et aI., 1990; Lopes et aI., 1983),
tem-se, em ordem decrescente de ocorrncia:
A. scrobiculata, A. 1Il0ITOlVae, A. JIlel/ea, A. apendiclIla, GloJlllls etl/llicahllll (Sul de Minas).
A. scrobiculata, A. JIlorro1l'ae, EntropllO.I'pora coloJllbiana, A. spinosa, Glof/llls etllnicatuJll (Alto
Paranaba e Trin6'1110 Mineiro).
GIOf/lllsjllsciclIlatllJll, A . .I'cmbiclIlata, A. laevis, SClItel/ospotrl pel/lIcida e Gigll.\pora gigantea (So
Paulo).
Alm da monocultura, o pousio prolongado, o cultivo com espcies no-micorrzicas, a ero-
so do solo e o cultivo extensivo exercem enorme efeito negativo na ocorrncia das MAs (Thompson,
1994; Brundrett, 1991 l. Diversos estudos mostram que a alterao dos solos aglcolas reduz o desen-
volvimento das MAs em at 80'% e isto tem conseqncias para a nutrio, produtividade e
sustentabilidade das culturas, conforme resumido na Figura 5.7. A reduo na colonizao pode ter
conseqncias drsticas a mdio e longo prazo para a produo agrcola. Para compensar o efeito da
alterao na queda de produtividade e diminuio dos efeitos benficos das MAs, maiores quantida-
des de fertilizantes so geralmente aplicadas. Isto contribuir para reduzir ainda mais a colonizao
das razes. Desse modo, a reduo da intensificao do cultivo, como a adoo do cultivo mnimo,
contribuir para a conservao da atividade das MAs no a6'TOssistema. De fato, as MAs contribuem
mais para a absoro de P pelo milho em solo com cultivo mnimo que em solo sob cultivo convenci-
onaI (Kunishi et aI., 1989).
difcil fazer generalizao ou predies sobre a ocorrncia e diversidade dos f ~ n g o s MAs,
mas sua ocorrncia geralmente alta em sistemas cultivados com baixo input e muito baixa, e at
mesmo inexistente, em condies muito alteradas como em solos degradados pela minerao, cons-
truo civil ou pela eroso. A diversidade, por outro lado, alta nos ecossistemas em clmax, como no
cerrado brasileiro, e baixo nos agrossistemas, principalmente na monocultura. As condies domi-
170
nantes nos ecossistemas manejados intensivamente e sem rotao de culturas reduzem a ocorrncia e
importncia das MAs. No obstante, as tendncias de modificaes para sistemas mais equilibrados
biologicamente, como reduo no uso de agroqumicos, cultivo mnimo e rotao de culturas, podem
contribuir para aumentar a ocorrncia e funo das MAs nos sistemas agrcolas.
Tabela 5.9. Ocorrncia de fungos MAs em lavouras de milho em diferentes locais (Siqueira et aI., 1989;
Maia & Trufem, 1990; Trufem & Bononi, 1985; Rich & Schenck, 1981).
Localizao Espcies predominantes
Minas Gerais
Pernambuco 16
So Paulo 9
Flrida 14
.. Amplitude e valor mdio de todas as observues,
6-34
(21)
0,2 - 2,6
(1,4)
0,2 - 2,4
(1,0)
<0,60
Glo/71US etullicatum.
1l1orrowae,
AcaulD.lpora scrohiclllata,
colo/11hiwlCl,
Acalllospora '\l!i/lo.m,
SC1/tello.\pora gil/71orei,
Acaulmpora /71l!lIea,
Gigaspora margarill/.
Acalllospora laevis,
Acalllmpora scrohiclllala,
Acalllospora appe/ldicllla,
Glo/71usfasciclllalll/71,
Glo/711/s OCCl1ltllll1,
Gigm7JOra heterogama,
Sclerocystis SllO/IS/IlJl.
Gigaspora heterogama,
Scutello.\pora lIigrll,
Scl1tellD.lpora pell1/cida,
Glol11l1s macroC//plll11,
Glo/11l1s caledonicll/l1,
Sclltello.\pora gilmorei,
G101111/.I' macroc//7mm.
Gigaspora /I1argariltl,
G101111/.I' I11C1crocW1Jllll1,
Glo/11u.l' c1al1ll11,
G1011111S etllllicatlll7l,
Gigmpora heteroga111a,
Glol111/s mossae,
G 1011111sfasciclllal1l111 .
171
Cultivo Intensivo
Quebra da
macroestrutura
Rompimento do
miclio fngico
(
Propgulos)
Reduz colonizao
' .
I-- a micorrlzlca

Diminui a absoro
de gua e nutrientes
Maior aplicao de
fertilizantes e defensivos
Favorece
Distrbios
L...-_____ -+ Severidade
Exige
nulricio no I S ~
de doenas
Estresse hdrico
r----------l
Queda da produtividade
Reduo da sustentabi I idade
Figura 5.7. Conseqncias do cultivo (alterao) do solo na micorrizao e produo agrcola.
5.4. Efeitos no Crescimento do Hospedeiro
Os efeitos das MAs no crescimento das plantas foram inicialmente detectados por Asai (1943),
que relatou crescimento reduzido de certas espcies quando cresciam em solo esterilizado. Dez anos
depois, Mosse (1953) demonstrou a formao das MAs e, em 1957, verificd\! qe mudas de macieira
inoculadas com esporocarpos de Endogone (hoje Glolll!ls) crescei-am maisoe continham teores mais
elevados de nutrientes. Na dcada de 60, vrios outros estudos mostraram resultados semelhantes
com milho e outras espcies (Gerdemann, 1968). No entanto, os efeitos estimulantes do crescimento
172
das plantas s ficaram mais evidentes, e mereceram mais ateno, aps os problemas de crescimento
reduzido de mudas de espcies frutiferas. cultivadas em viveiros com solo fumigado. terem sido atri-
budos eliminao dos propgulos de fungos MAs (Kleinschmidt & Gerdemann, 1972) e no
toxicidade residual do fumigante. Nesta mesma poca, Ross (1971). demonstrou que, em solo infes-
tado com propgulos de fungos MAs, a produo da soja era 122%, 67% e, 12% maior do que em solo
isento destes propgulos. em nveis de P baixo, media e alto, respectivamente.
Estes estudos despertaram interesses por lodo o mundo e a micorrizalogia tornou-se o assun-
to prioritrio de pesquisa em diversas especialidades das cincias vegetais e do solo. Os efeitos das
MAs no crescimento das plantas variam muito. Aumentos de produo de culturas anuais, devidos
inoculao, variam de 5% a 290%, enquanto que os beneficios para o crescimento ou produo de
mudas pr-colonizadas e transplantadas variam de 50% a 8000% (Siqueira & Franco, 1988). Algumas
espcies nem mesmo crescem na ausncia de fungos MAs (Figura 5.8). Os efeitos benficos so
muito complexos e, em muitos casos, bastante: inconsistentes, pois dependem de muitos fatores (Ta-
bela 5.10) que atuam direta ou indiretamente sobre o sistema micorrizico e seus componentes. A
capacidade do fungo de estimular o crescimento da planta conhecida como "efetividade simbitica",
a qual determinada pelas caractersticas dos componentes da sill\.bjose, principalmente do fungo, que
pode apresentar diferentes graus de efetividade, sendo at mesmo ineficaz ou parasitico. De modo
similar, a planta hospedeira, pelas suas caractersticas, varia quanto ao grau de beneficio da associa-
o, conhecido como "dependncia micorrizia". que definida como o grau pelo qual ela depende
das MAs para o crescimento normal em uma dada condio de crescimento. Quanto a esta caracters-
tica, as plantas so classificadas em:
a) Altamente ou obrigatoriamente dependentes - por exemplo, mandioca, citres. algodo, leguminosas
tropicais, cebola, cafeeiro, pimenta-do-reino, trema (Figura 5.8).
b) Dependentes - por exemplo. soja, milho, feijoeiro, braquiria, sorgo, tomateiro, trigo, seringueira,
cacau.
c) No-dependentes - plantas no-micorrizicas, corno as crucferas, beterraba, conferas.
Figura 5.8. Efeito da micorrizao no crescimento da
trema (Trema micrantha); onde: C = no
inoculada e M = inoculada com fungos
MAs.
173
Tabela 5.10. Fatores determinantes de efetividade/eficincia simbitica nas MAs.
Componente
Planta.
Fungo
Relao
fungo-planta
Caracterstica
Sistema radicular
Fatores principais
Tipo, ramificao, plo radicular, rea de superfi-
cie, longevidade e taxa de crescimento.
Requerimento nutricional Taxa de absoro, concentrao no tecido, deman-
da, distribuio, eficincia de uso, consumo de luxo
e realocao.
Outras Tolerncia a estresse, suscetibilidade a doenas. taxa
Infectividade
Rifa externa
Esporulao
Interface
Taxa metablica
Troca de metabolitos
Regulao funcional
. fotossinttica e de crescimento e ciclo vegetativo.
Taxa de germinao e de colonizao. colonizao
secundria. formao e durao dos arbsculos.
Taxa de crescimento, capacidade de absoro e
translocao. atividade metablica e longevidade.
Ontogenia, dormncia, quiescncia, crescimento
micelial e intensidade de esporulao.
Dreno de fotossintatos (custo energtico).
Transferncia do P absorvido.
Alteraes fisiolgicas.
Integrao funcional.
Os efeitos da inoculao em algumas espcies cultivadas, em condies de baixo e alto P no
solo, encontram-se na Tabela 5.11. Verifica-se que as espcies respondem de modo diferenciado ao P
e micorrizao. A espcie de fungo tambm influencia a resposta da planta (Figura 5.9). Neste
exemplo, os fungos A. sClObiculata e G. margarita mostraram-se pouco efetivos para o algodoeiro, ao
contrrio dos demais estudados.
A magnitude dos benefcios da micorrizao depende dos fluxos de nutrientes do fung6 para
a planta e de fotossintatos da planta para o fungo (estimados em 10% a 15% da fotossntese total),
sendo estes determinados pelas suas caractersticas (Tabela 5.10) e pelas condies de crescimento do
meio (do solo, na maioria dos casos). Plantas micorrizadas geralmente apresentam teores mais eleva-
dos de certos nutrientes, principalmente daqueles com mobilidade reduzida no solo, corno o caso do
P e Zn. Isto, associado. ao fato de que os benefcios das MAs diminuem com a aplicao de nutrientes,
evidencia que o principal mecanismo de estmulo no crescimento da planta via nutrio, no sendo,
contudo, o nico .. Desse modo, os benefcios das MAs para o crescimento da planta envolvem meca-
nismos nutricionais e no nutricionais, resumidos na Tabela 5.12 e comentados a seguir.
174
Tabela 5.11. Efeitos das MAs no crescimento (matria seca, g . planta'l) de algumas espcies de
plantas no-inoculadas (Ni) e inoculadas (M), em condies de alto e baixo P no solo
(Sieverding, 1991).
Espcie
Baixo P 20) J.I.. g-I solo Alto P (> 100) J.l.g . g-I solo
Ni M Efeito* Ni M Efeito
Mandioca 0,3 4,3 14,3 .0,5 16,4 32,8
Caupi 1,0 2,6 2,6 13,7 36,3 2,6
Estilosantes O, I 1,3 13,0 2,7 12,2 4,5
Andropogon 0,2 1,3 6,5 34,2 32,2 0,9
Feijoeiro I, I 3, I 2,8 8,3 25,0 3,0
Milho 1,2 4,8 4,0 59,4 53,7 0,9
Arroz 3,8 3,8 1,0 30,6 31,6 1,0
Soja 3,3 4,4 1,3 8,7 19,3 2,2
Cafeeiro 0,5 0,5 1,0 1,0 2,5 2,5
* Nj'l\1.
5.4.1. Efeitos nutricionais
As alteraes nutricionais (Tabela 5.13) so os efeitos mais consistentes das MAs. Plantas
micorrizadas geralmente acumulam maiores quantidades de macro e micronutrientes, como tambm
de Br, I, CI, AI, Si e metais pesados. J os teores de N, K, Ca, Mg e Na geralmente so menores,
enquanto os de S04 -2, PO 4 _" NO,-, e CI- so geralmente maiores nas plantas com MAs (Marschner &
Dell, 1994; Siqueira & Saggin-Jnior, 1994). A diminuio nos teores resulta de efeitos de diluio
provocados pelo maior crescimento das plantas micorrizadas. Isto, no entanto, depende da disponibi-
lidade relativa de cada nutriente na soluo do solo.
Aumento nos teores de P constitui o mecanismo principal de resposta das plantas em solos de
baixa fertilidade, como os dominantes nos trpicos (Mosse, 1981). De fato, a efetividade simbitica
de populaes indigenas de fungos de solo de cerrado correlaciona-se positivamente com aumentos na
porcentagem de P na parte area da soja (Paula et aI., 1988). Os fungos mais efetivos foram capazes
de duplicar os teores de P na soja. De um modo geral, o efeito da micorrizao diminui com a eleva-
o do P no solo (Saggin-Jnior et aI., 1994). Quando a planta bem suprida, ela no depende da
absoro via hifa (micotrofia), e a presena do fungo na raiz seria um investimento energtico supr-
fluo ou sem retorno. Assim, a planta controla a colonizao de acordo com sua necessidade, atravs
de um balano delicado existente entre nivel de P no solo, desenvolvimento e atividade do fungo na
raiz e resposta da planta, variando o efeito de micotrfico em nveis subtimos de P a efeitos parasticos
em condies supratimas de P no solo. Plantas bem supridas em P no se tornam imunes coloniza-
o (Figura 5,5b) e, mesmo em baixa colonizao, o fungo ainda capaz de representar dreno signi-
ficativo de fotossintato e promover inibio de crescimento (Peng et aI., 1993).
10

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175
Asc -A. scrobiculata
Gim - G morgarita
Acm - A. morrowae
Gma - G. macrocarpum
Gig- G gregrio
Gcl- G. clarum
I nc -Inoculao mltiplo
Baixo P
Alto P
Figura 5.9. Efeito da inoculao, com diferentes fungos MAs, no crescimento
do algodoeiro, em solo com diferentes nveis de P (Siqueira et
al.,1986).
Tabela 5.12. Principais efeitos promotores do crescimento vegetal das MAs.
Efeitos nutricionais
Aumento na absoro de nutrientes.
Utilizao de algumas formas no disponveis.
Armazenamento temporrio de nutrientes.
Favorecimento de microrganismos benficos.
Aumento na nodulao e fixao de N
2

Amenizao dos efeitos adversos do pH, AI,
Mn e outros na absoro de nutrientes.
Efeitos no-nutricionais
Favorecimento na relao gua-planta.
Produo e acmulo de de cresci-
mento.
Reduo dos danos causados por patgenos.
Maior tolerncia a estresses ambientais e fa-
tores fito txicos.
Melhoria da agregao do solo.
176
Tabela 5.13. Efeitos generalizados das MAs na nutrio da planta hospedeira.
Nutriente
Nitrognio
Fsforo
Mangans
Zinco e Cobre
Ctions bsicos e Enxofre
Principal efeito e mecanismo
Concentrao no tecido reduzida e quantidade acumulada
aumentada. Altera absoro e fixao biolgica.
Concentrao e acmulo nos tecidos so aumentados devido ao
melhor aproveitamento de P do solo. .
Concentrao geralmente reduzida devido menor absoro e efei-
tos de diluio.
Concentrao e acmulo aumentados devido maior absoro.
Reduz efeito da deficincia induzida por alto P.
Efeitos na concentrao dependem da disponibilidade e do ba-
lano. Quantidade acumulada geralmente aumentada. So efei-
tos secundrios ou indiretos das MAs.
Os mecanismos pelos quais o P e outros nutrientes afetam a colonizao ainda no so bem
elucidados, existindo vrias hipteses (Siqueira, 1991; Koide, 1991), todas relacionadas aos efeitos do
P na quantidade de exsudatos e no metabolismo de carboidratos da planta, sendo, portanto, efeitos
indiretos, via nutrio da planta. Deve-se ressaltar que, em concentraes muito elevadas de P ou
outros nutrientes, a germinao e crescimento micelial dos fungos MAs na rizosfera podem ser inibi-
dos. Os nveis de P requeridos para inibir a colonizao variam entre as espcies.
O favorecimento das MAs na absoro de nutrientes muito complexo e resulta de mecanis-
mos fsicos, qumicos, fisiolgicos e microbiolgicos, destacando-se:
a) Aumento na superfcie de absoro e explorao do solo (efeito fisico);
b) Aumento na capacidade de absoro da raiz (efeito fisiolgico);
c) Modificaes morfolgicas e fisiolgicas adicionais na planta, e espaciais e temporais nas raizes
micorrizadas em relao s sem micorrizas;
d) Absoro de nutrientes disponveis, no acessveis s razes no-micorrizadas diretamente pelas
hifas ou, indiretamente, atravs de favorecimento no desenvolvimento de razes;
e) Utilizao de formas no disponveis para as razes no micorrizadas atravs da solubilizao e
mineralizao, no caso das ectomicorrizas, e de modificaes na d i n ~ i c a do equilbrio do nutrien-
te, entre a fase slida e liquida do solo, no caso das MVA;
f) Armazenagem temporria de nutrientes na biomassa fngica ou nas razes, evitando sua imobiliza-
o qumica ou biolgica e lixiviao;
g) Favorecimento de microrganismos mineralizadores e solubilizadores de nutrientes e diazotrficos
na micorrizosfera;
h) Amenizao dos efeitos adversos do pH, AI, Mn, metais pesados, sal in idade, estresse hdrico e
ataque de patgenos do sistema radicular, sobre a absoro de nutrientes:
o.
177
Hifas e miclio externo crescem solo adentro e aumentam a explorao do solo, permitindo a
absoro de nutrientes fora da zona de esgotamento. A explorao de microstios ricos em nutrientes,
inexplorados pelas razes no-micorrizadas, resulta em grande eficincia no aproveitamento de P do
solo e utilizao pela planta (Figura 5.10). fluxo de P via fungo a base de funcionamento desta
simbiose. P absorvido da soluo do solo pelas hifas por um processo ativo, transfonnado em
grnulos de polifosfato, os quais so transportados pela corrente citoplasmtica at os arbsculos,
onde so hidrolisados pelas fosfatases, liberando Pi, que transferido passivamente para o hospedeiro
e h'anslocado via xilema para as folhas onde atua de modo regulatrio sobre a simbiose (ver Siqueira
& Franco, 1988; Schwab et al., 1991). No sentido oposto ocorre o fluxo de fotossintatos que susten-
tam o crescimento e atividade metablica do fungo na raiz e no solo.
a. 400
OI
E
.....
~ 3 0 0
OI
E
a:- 200
o
"O
o
18. 100
<1
~
+=
+
+
..
(o )
x Sem micorrizos
!'ia Fungos indgenas
+ Glomus mocrocorpum
~ :
::J
1530 60
120
P,os aplicado, mg/kg
~ 6 0
( b)
o
"O
+
o
~
. ~ 45
c-
o
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245
o
1530 60 120 245
P,Os aplicado, mg/kg
Figura 5.10. Efeito de MAs na utilizao (a) e recuperao do P (b) aplicado em um latossolo pela
cultura da soja (Siqueira & Paula, 1986).
Os estudos iniciais realizados com J2p indicavam que plantas miconizadas tinham acesso s
mesmas formas de P no solo que aquelas sem MAs (Bolan, 1991) e, ainda, que as plantas com MAs
eram capazes de explorar de modo mais eficiente o P do solo. No entanto, sabe-se hoje que as MAs
so capazes de mobilizar P do solo atravs de modificaes qumicas na rizosfera, incluindo a
mineralizao do P orgnico (Jayachandran et al., 1992). De acordo com as revises de Bolan (199 J)
e Siqueira (1991), a mobilizao do P do solo resulta dos seguintes mecanismos:
a) Produo de cidos orgnicos especficos eficazes na solubilizao ou alterao da dinmica das
formas de P no solo;
b) Elevao dos teores de CO, na lizosfera pela maior atividade heterotrfica da micorriza comparada
com razes no-colonizadas;
c) Produo de quelantes e complexantes capazes de mobilizar principalmente P ligado a ferro; e
d) Maior populao de microrganismos solubilizadores e mineralizadores de fosfatos.
De fato, em estudo conduzido em laboratrio da Escola Superior de Agricultura de Lavras
(ESAL), ficou evidenciado que a braquiriae o estilosantes so capazes de absorver P fixado ou retido
no solo quando inoculados com fungos MAs (Alves, 1988). fracionamento das fonuas de P no solo,
aps o cultivo das plantas, revelou menores quantidades de AI-PO, e Fe-PO, nos tratamentos com
178
MAs, indicando a capacidade das plantas micorrizadas de mobilizar o P retido. Isto, sem dvida, se
reveste de grande interesse para a produo agrcola nos trpicos, onde os solos apresentam elevada
capacidade de reteno de fosfatos, como os latossolos brasileiros.
O influxo de nutrientes na planta resultante da interao entre os fatores do solo e das razes
absorventes, em que as MAs participam ativamente. Quando plantas micorrizadas so tratadas com
fungicidas que matam as hifas, o influxo de P na planta reduzido drasticamente (Hale & Sanders,
1982), evidenciando a importncia da absoro de P via miclio rungico. Este efeito, no entanto,
reduzido em condies de elevado P na soluo do solo. Conforme discutido em Siqueira & Franco
(1988), o influxo pode ser descrito pela seguinte equao:
C
I=Imax
Km+C
onde: Imax = influxo mximo; C = concentrao na superfcie da raiz; e Km = constante de Michaelis
- Menten.
Verifica-se que I depende de C na superfcie, a qual controlada pela difuso do nutriente no
solo at a superfcie absorvente, e que a difuso funo do gradiente de concentrao, LiC, entre um
ponto no solo e a superfcie da raiz. LiC , ento. expressa da seguinte maneira:
[P-solo]- [P-raiz]
LiC =
sendo: [P-solo] = concentrao P no solo; [P-raiz] = concentrao de P na superfcie da raiz; e LiX =
distncia do P at a superfcie de absoro.
Baseando-se nestes modelos simplistas, tem-se que o influxo (I) de P nas plantas cultivadas
em solos de baixa fertilidade pode ser aumentado atravs:
a) Do aumento de P na soluo do solo, que eleva [P-solo] e aumenta LiC e C - o que possvel pela
adio de fertilizantes;
b) Da diminuio do Ax, que aumenta LiC e, conseqentemente, a difuso e o influxo - que pode ser
conseguido atravs da seleo de gentipos e manejo do' solo para maior produo de razes, e
atravs das MAs, que aumentam a eficincia de absoro em termos espaciais e temporais;
c) De alteraes fisiolgicas na absoro como reduo do Ian. As MAs podem atuar neste mecanis-
mo.
A importncia das MAs , portanto, maior na absoro de nutrientes que apresentam difuso
reduzida no solo. De fato, elas podem ser responsveis pela absoro de at 80% do P, 60% do Cu,
25% do N, 25% do Zn e 10% do K da planta (Marschner & Dell, 1994). Apesar das alteraes
fisiolgicas, a absoro feita principalmente pelo miclio externo, que aumenta a rea de absoro.
179
O' Keefe & Sylvia (1991), usando modelos de absoro e considerando dimetro mdio de 8 .lm e 250
Jlm para hifa e razes, respectivamente, estimaram que o aumento de rea de superfcie devido as MAs
pode atingir 1800%, e que o influxo de P pode ser aumentado em 477'% para um aumento de apenas
3% na rea de superfcie. Estes valores, embora estimados, indicam a magnilIlde dos efeitos nutricionais
das MAs.
A quantidade de hifa ou miclio extra-radicular correlaciona-se com efetividade simbitica e
varia enormemente, em conseqncia do fungo, da planta e do ambiente, alcanando valores de at
32cm de hifa. cm" de raiz colonizada ou26m de hifa. g_1 de solo. O' Keefe & Sylvia (1991) salientam
tambm que, alm da elevada capacidade de absoro das hifas,' elas apresentam taxa de extenso 823
vezes maior que a das razes. No entanto, as hifas extra-radiculares so inibidas por alto P e Cu,
consumidas pelos colmbolos e inativadas por biocidas, como o benomyl (Ver Allen, 1992, captulos
4,7el0).
A presena de MAs exerce enorme influncia no requerimento externo de P das culturas
(Yost & Fox, 1979). Em estudo em Latossolo Roxo da regio de Lavras, o requerimento externo de P
foi reduzido em 34% e 56% para o milho e soja, respectivamente, pela presena do fungo GIOlllllS
lIlacrocwpulIl (Fernandes et a!., 1987). A avaliao do requerimento externo de P para algumas esp-
cies pode ser superestimada em at 100 vezes, se realizada na ausncia de MAs (Howeler et a!., 1987),
como se verifica com a mandioca, estilosantes e citros. Os aspectos biolgicos, relacionados ao dfi-
cit de P na planta e resposta micorrizao so bem discutidos em Koide (1991). A resposta da planta
depende da sua eficincia de utilizao do P absorvido, sendo controlada pelas caractersticas
morfolgicas, fisiolgicas e fenolgicas que determinam sua demanda, pela capacidade de absoro e
pelo dficit de P (Figura 5.11), cujos valores delimitam o grau de micotrofismo da planta. Segundo
Koide (1991), as MAs beneficiam a planta pela reduo do dficit de P, que resulta do maior supri-
mento deste nutriente (Figura 5.11). Assim, quanto maior for a demanda de P, maior o dficit e
maior o benefcio ou dependncia da planta (Manjunath & Habte, 1991) e menor sua eficincia de
utilizao de P na ausncia de micorriza (8aon et a!., 1993). De fato, os estudos deste laboratrio
comprovam esta relao (Siqueira, 1990). O efeito equivalente estimado da inoculao com fungos
MAs foi de 20, 30, 60, 120 e 200 kg de P . ha-
I
, respectivamente para a braquiria, milho, soja,
cafeeiro e estilosantes, que apresentam dependncia micorrizica e demanda de P crescentes e eficin-
cia de utilizao de P do solo decrescente.
A absoro de outros nutrientes tambm influenciada pelas MAs e est envolvida nas res-
postas em crescimento. Micronutrientes que apresentam baixa mobilidade tm baixa difuso no solo
e as MAs aumentam sua absoro (Marschner & Dell, 1994). Isto o caso de Zn e Cu, cuja presena
de MA pode aliviar deficincia pelo aumento na absoro, tal como se verifica para o P. Em milho
crescendo em solo calcrio, as MAs foram responsveis pela absoro de 16% a 25% do Zn, e 52'% a
62% do Cu (Li et a!., 1991). As MAs tambm aliviam os efeitos de deficincia destes nutr"ientes
induzidas por altos nveis de P (Siqueira & Saggin-Jnior, 1994). Em contraste, os teores de Mn so
geralmente menores em plantas micorrizadas, e isto parece ser devido a efeitos indiretos, resultantes
de alteraes microbiolgicas induzidas pelas MAs na rizosfera, principalmente diminuio na popu-
lao de bactrias redutoras de Mn (Marschner & Dell, 1994). Isto, contudo, no exclui outros meca-
nismos, como absoro seletiva pelas hifas dos fungos MAs. Resultados semelhantes so tambm
relatados para alguns metais pesados, podendo as MAs contribuirem para maior tolerncia das plantas
toxicidade destes elementos.
....
"O
......
o...
"O
180
a) //
/
L'/
Demando de P /
/'
Dficit //
/
/
/
/ )Suprimento de P
/
/
Disponibilidade de P no solo ..
\
Figura 5.11. Deficincia de P na planta (a) e sua reduo pela presena de MAs (b); onde: Me NM =
plantas com e sem MAs e dP/dt = suprimento de P para a planta. Adaptado de Koide
(1991).
As MAs tambm interferem direta ou indiretamente na aquisio de N pelas plantas. Hifas
fngicas so capazes de absorver N nas formas orgnica e inorgnica, transferindo-as para a planta
(Ames et a!., 1983). Estudos em fase de concluso, em laboratrio da ESAL, indicam que certas
espcies arbreas s respondem a N-mineral quando so miconizadas, fato tambm verificado para
plantas de batata-doce obtidas por micropropagao (Paula et a!., 1991). Plantas micorrizadas apre-
sentam maior assimilao de NH
4
, produo de glutamina e translocao de N via xilema (Cliquet &
Stewart, 1993), mas no h evidncias de alteraes na rota metablica do N na planta. Se os efeitos
das MAs na absoro de N pelas plantas forem to generalizados quanto aqueles verificados para o P,
o papel das MAs na funcionalidade do ecossistema ser maior do que se pensa atualmente (Barea,
1991). Por mecanismo indireto, as MAs favorecem a aquisio de N atravs de relaes sinergistas
com microrganismos e sistemas fixadores de N
z
atmosfrico, principalmente com rizbio (Linderman,
1992; Allen, 1992). No caso da simbiose rizbio-Ieguminosas, que muito limitada por P nos solos
tropicais, os benefcios das MAs parecem resultar da melhoria na absoro de P, que aumenta a produ-
o de razes e a fotossntese. Isto resulta em maior nodulao e fixao do N
z
(Barea, 1991). A
capacidade fixadora de N
z
' medida pela atividade da nitrogenase (Nzase), tambm maior em plantas
micorrizadas, aparentemente devido ao fluxo mais constante de P nos ndulos, favorecendo assim os
mecanismos energticos e bioqumicos da fixao. Em estudo em solo de cerrado, a aplicao de P
(120 kg de PZ05' ha") e a inoculao com G. IIlGCIVCWpUIIl dobraram a quantidade de N acumulada na
parte area da soja, em relao ao tratamento sem MA (Paula & Siqueira, 1987a). A relao rizbio-
MA de grande interesse nos trpicos, onde os solos so extremamente deficientes em N e P. Algu-
mas leguminosas nem mesmo nodulam na ausncia das MAs (Mosse, 1981). Outros efeitos nutricionais
das MAs, como a absoro de K e de micronutrientes e alteraes na relao gua-planta, podem
tambm interferir na fixao simbitica do Nr
181
Mais, recentemente, a transferncia de nutrientes entre as razes da mesma planta e entre
plantas, mediadas pelas hifas fngicas que atuam como canais de ligao, tem ganho muita evidncia
(Francis & Read, 1994). Este fenmeno de grande importncia nos ecossistemas no-alterados e
tambm nos agrossistemas baseados em consorciao de culturas envolvendo gramneas e leguminosas
fixadoras de N
2
', os quais apresentam elevada sustentabilidade (Peoples & Herridge, 1990). A presen-
a das interconexes de hifa contribui para maximizar a transferncia de N e outros nutrientes entre as
culturas consorciadas (Hamel et aI., 1991). No obstante, a significncia disto, em condies de
campo, ainda requer evidncias experimentais.
5.4.2. Efeitos no-nutricionais
Os efeitos no nutricionais das MAs sobre o hospedeiro encontram-se listados na Tabela
5.12. O favorecimento da relao gua-planta, depois dos benefcios nutricionais, o efeito mais
importante das MAs para as plantas. A colonizao aumenta a resistncia das plantas seca, embora
existam trabalhos com resultados contrrios a este (Sylvia & Williams, 1992). O aumento da resistn-
cia seca geralmente atribudo melhoria do estado nutricional (Nelsen, 1987), mas outros fatores,
modificados pela colonizao, tambm influenciam os benefcios das MAs na relao gua-planta.
Estes incluem: alteraes na elasticidade das folhas, potencial de gua e turgor das folhas, taxa de
transpirao, abertura estomatal e alteraes nas razes (comprimento e profundidade). Paula & Siqueira
(l987b) verificaram que, em casa de vegetao, plantas de soja resistem mais ao dficit hdrico e
recuperam o turgor mais rapidamente quando o nvel adequado de gua do solo restabelecido. O
milho inoculado com G.efl/Ilicalllm mostrou-se mais tolerante ao estresse hdrico no campo que sem
inoculao (Sylvia & Williams, 1992). Como as MAs so mais ativas em condies subtimas de
nutrio, existe uma interao muito forte entre o estado nutricional-micorrizao-tolerncia ao estresse
hdrico, o que sem dvida interessa agricultura tropical. Plantas de soja crescendo em latossolo roxo
com alto nvel de umidade (100% do volume total de poros preenchidos com gua) mostram sintomas
foliares tpicos de toxicidade de Mn, os quais foram ausentes em plantas inoculadas com fungos MAs
(Paula & Siqueira, 1987b). Cabe salientar que o efeito protetor das MAs contra o excesso de Mnj foi
mencionado neste captulo. Outros aspectos fisiolgicos das MAs na relao gua-planta so aborda-
dos em Nelsen (1987) e Sylvia & Williams (1992).
As plantas micorrizadas exibem tambm alteraes metablicas, fisiolgicas e anatmicas
diversas. Vrias auxinas, citoquininas, giberelinas e vitaminas acumulam-se em maior quantidade em
plantas com MAs. Se estas so resultantes da interao fungo-planta ou de seus benefcios primrios,
como da melhoria nutricional, ainda uma questo sem resposta. Diversos especialistas consideram
que a maioria das alteraes fisiolgicas resulta dos benefcios nutricionais, mas as alteraes nas
substncias reguladoras do crescimento devem ser reguladas diretamente pela simbiose, pois so ne-
cessrias para o funcionamento (fluxo de metablitos) da associao (Schwab et aI., 1991; Smith et
aI., 1994).
Os efeitos metablicos das MAs incluem, principalmente: a) aumento do nmero de vrias
organelas; b) aumento da atividade enzimtica; c) aumento da abertura estomatal; d) aumento da taxa
de respirao e absoro de CO
2
(em at 20%); e) aumento da exsudao radicular; f) reduo do
contedo de amido (em at 50%); g) elevao na relao CIP e N/P; h) alterao na composio de
aminocidos; i) acmulo de cidos graxos pouco comuns, como 16: I (l1c), e do pinitoI. Estas altera-
es so bem evidentes e interferem em outros processos como na nutrio e na microbiota associada.
182
A reduo dos malefcios causados pelos fatores biticos tambm comumente relatada nas
MAs. Os fungos MAs nas razes no atuam como agentes de biocontrole, mas amenizam os efeitos ou
danos causados pelos nematides, fungos patognicos do sistema radicular e algumas pragas. As
MAs reduzem a incidncia de doenas na maioria dos casos conhecidos, mas podem aumentar em
algumas situaes. Patgenos foliares, por exemplo, podem ser favorecidos pelas MAs (ver Bagyaraj,
1984). No caso dos nematides, a interao com os fungos MAs pode resultar em aumento, reduo
ou nenhum efeito sobre o ataque, mas existem evidncias de maior resistncia de plantas micorrizadas
e reduo na reproduo dos nematides. Como tambm se verifica em relao aos patgenos
radiculares, os efeitos dos fungos MAs dependem de qual organismo se esLbelece primeiro nas razes.
A interao micorrizas com pragas ainda pouco explorada. Rabin & Pacovsky (1985)
demonstraram que larvas de Heliothis zeu e Spodoptera .Ii1lgiperdu tiveram crescimento e pupao
reduzidos quando alimentadas com folhas oriundas de plantas micorrizadas. Isto parece ser devido ao
acmulo de substncias txicas ou com ao repelente, como compostos aromticos nas plantas
micorrizadas. Estes resultados abrem novas perspectivas para as MAs no contexto da produtividade
agrcola nos trpicos e precisam ser melhor avaliados no Brasil. Alguns pesticidas podem interferir
na micorrizao, como se verifica com o uso do Carboxin, Captan e fungicidas sistmicos. Estes
podem controlar o agente alvo, mas podem tambm reduzir a micorrizao e tornar a cultura mais
exigente em nutrientes e mais suscetvel ao dficit temporrio de gua. A interao MA-patgenos
pode tambm estar envolvida no declnio das monoculturas, que geralmente se manifesta com defici-
ncias nutricionais e ataque de patgenos radiculares. Os estudos conduzidos com aspargos nos Esta-
dos Unidos so evidncias destas relaes, envolvendo inclusive a ao de aleloqumicos (Siqueira et
aI., 199Ia). Os mecanismos envolvidos nestas respostas no so conhecidos, mas resultam do melhor
vigor das plantas miconizadas.
As MAs podem tambm atuar como amenizadoras de estresses abiticos diversos, como
acidez, metais pesados, esh'esse osmtico e produtos qumicos (Sylvia & Williams, 1992). Algumas
gramneas, como Brachiuria deClll/lbells e PalliclIlIl virgatlllll L., crescem melhor e absorvem menos
AI e mais Ca e P quando so micorrizadas (Koslowsh:y & Boerner, 1989; Siqueira et aI., 1990). As
MAs podem aumentar a absoro de metais pesados, mas protegem as plantas da toxicidade destes,
quando em concentraes moderadas (Sylvia & Williams, 1992). Os fungos MAs podem tambm
aliviar os efeitos fitotxicos de doses sub-letais de fito toxinas. Siqueira et aI. ( 1991 b) demonstraram
que a aplicao do isoflavonide formononetina, em solo contendo 13 ppb residual do herbicida da
Scepter (Imazaquin) e fungos MAs indgenas, reduziu a fitotoxicidade do herbicida residual para o
milho e sorgo. Estes efeitos no foram observados quando o solo foi autoclavado para eliminar os
propgulos dos fungos MAs. Como j foi exposto, a formononetina estimula a micorrizao, que
atravs de mecanismos desconhecidos protege as plantas da fototoxicidade induzida por Scepter. Embora
ainda sem resultados experimentais, acredita-se que as MAs possam proteger as plantas de outros
produtos fitotxi coso
As hifas dos fungos MAs e seus polissacardeos extracelulares desempenham funo impor-
tante na agregao do solo (Tisdall, 1994). Denh'o dos agregados, as hifas fonnam uma rede que
atinge at 50 m de hifa por grama de agregado estvel, contribuindo de modo significativo para a
estabilizao dos mesmos. Estudos realizados na Austrlia (Tisdall, 1994) mostram relaes muito
estreitas entre o cultivo e o comprimento total de hifa e a proporo de agregados estveis. Solos
cultivados ou em pousio continham menos de 5m hifa . g-l de solo e menos de 5% de agregados
estveis, enquanto no solo virgem havia em torno de 17 m de hifa e 24% de agregados estveis.
183
Assim, os agregados so estabilizados pelas MAs que so, por outro lado, protegidas pelos agregados.
Modelo conceitual para os efeitos das MAs na distribuio dos agregados por tamanho mostra que as
razes finas e as hifas so os principais fatores determinantes do dimetro mdio geogrfico (Miller &
Jastrow, 1992). Como solos bem agregados so menos afetados pela eroso e mais produtivos, os
efeitos das MAs na agregao contribuem para a.produtividade e sustentabilidade agrcola e para a
conservao ambiental.
5.5. Tecnologia das MAs
Uma das estratgias para alcanar a sustentabilidade de qualquer ecossistema maximizar o
uso dos microrganismos e processos biolgicos benficos do solo, dentre os quais destacam-se as
MAs. Esta a.sociao apresenta enorme potencial biotecnolgico, exercendo grande impacto na agri-
cultura e qualidade ambiental.
As MAs ocorrem na maioria das espcies de interesse econmico, e os beneficios da
micorrizao para o crescimento, nutrio e sanidade das plantas variam marcadamente em virtude
dos componentes d sistema micorrzico (planta, fungo e solo) e do manejo destes componentes
(Johnson & Pfleger, 1991). Quando se pretende explorr esta simbiose, diversos aspectos destes
componentes precisam ser considerados (Tabela 5.14). Conforme a caracterstica ou condio de
cada componente tm-se estratgias diferentes e esperam-se sucessos variados. Para culturas no-
micotrficas (no-micorrzicas), recomenda-se, no caso de agrossistema, a rotao com uma espcie
micotrfica para aumentar o nmero de propgulos no solo. Culturas micorrizo-dependentes devem
ser inoculadas e o grau de sucesso esperado com a inoculao pode ser alto, dependendo das outras
condies. Outro aspecto a fertilidade do solo. Os efeitos da micorrizao so mximos em condi-
es de fertilidade mdia ou baixa (Figura 5.9) onde a inoculao, se praticada, ter sucesso. Em solo
de fertilidade muito baixa, recomenda-se a correo antes da inoculao, enquanto em solos muito
frteis devem-se reduzir as quantidades de nutrientes aplicadas via adubao. A densidade e qualida-
de dos propgulos do solo. que determinam sua infectividade, ou seja, capacidade de formar MAs
espontneamente, constituem outro aspecto importante. Os fungos indgenas do solo podem ocorrer
em densidade baixa ou alta ou, at mesmo, estar totalmente ausentes, e a efetividade simbitica destes
pode tambm variar muito. Deve-se praticar a inoculao em solos com baixa densidade de propgulos
de baixa efetividade, enquanto em solos com alta densidade de fungos efetivos deve-se manejar o
sistema de modo que esta populao seja mantida sem muita alterao. O sucesso desta prtica, no
entanto, difcil de ser previsto (M iller et aI., 1994). Considerando todos estes aspectos, inoculaes
bem sucedidas so esperadas nas seguintes condies:
a) Solos com baixa infectividade ou totalmente isentos de propgulos de fungos MAs. Exemplos:
solos degradados, fumigados, cultivados com plantas no-hospedeiras ou em pousio por perodos
prolongados;
b) Solos com condio nutricional abaixo do timo para o crescimento mximo da cultura;
c) Em condies ambientais estressantes;
d) Locais com alta incidncia de doenas do sistema radicular;
e) Quando espcies ou isolados fngicos efetivos e adaptados s condies edafoclimticas forem
disponveis para inoculao;
184
f) Quando a fertilidade do solo e aplicaes de fertilizantes e corretivos forem monitorados cuidado-
samente;
g) Quando a oferta de fertilizantes ou os preos se tornarem limitantes para os agricultores;
h) Quando tecnologia apropriada para produo, armazenagem e comercializao de inculo se tornar
disponvel.
Tabela 5.14. Principais aspectos a serem considerados na utilizao dos fungos MAs: condies do
solo e planta, estratgia recomendada e grau de sucesso esperado. Adaptado de Siqueira
& Saggin lr. (1994).
Condies
(planta, solo, fungo)
I - Relao fungo-planta
Condio micorrzica da planta Grau de dependncia
----------------------
Micorrzica Altamente dependente
Micorrizica Dependente
No-micorrizica No se aplica
11 - Condies qumicas do solo
Fertilidade Efeito da micorrizao
----------------------
Alta Depressivo
Mdia Benfico
Baixa Muito benfico
Muito baixa Nenhum
IH - Fungos nativos no solo
Propgulos no solo Efetividade
----------------------
Ausentes No se aplica
Baixa densidade Baixa
Baixa densidade Alta
Alta densidade Baixa
Alta densidade Alta
Estratgia
adotada
Inocular
Inocular
Rotao cultura
Red. adubao
Inocular
Inocular
Adubar e inocular
Inocular
Inocular
Manejar
Inocular
Manter
Grau de
sucesso
Muito alto
Alto
Muito baixo
Muito baixo
Mdio
Muito alto
Alto
Muito alto
Alto
Alto
Baixo
Baixo
18S
A inoculao no ser bem sucedida em solos frteis ou naqueles submetidos a adubaes
pesadas, pois a alta disponibilidade de nutrientes inibe o estabelecimento da simbiose e, mesmo que
ela se estabelea, os beneficios para a planta sero reduzidos, inexistentes ou, at mesmo, as MAs
podem atuar como parasitas. Assim, a condio tima de fertilidade que maximiza a respostas das
MAs precisa ser determinada. Em solos com fertilidade muito baixa,a aplicao de nutrientes. espe-
cialmente de P, pode aumentar os efeitos da inoculao, dependendo da espcie cultivada (Tabela
5.11) . Isto est relacionado ao dficit de P que determinado pela demanda de P pela planta e supri-
mento pelo solo (Figura 5.1 t). Relao semelhante deve existir para outros nutrientes que tm a
"
absoro favorecida pelas MAs, especialmente Zn e Cu. Menge et aI. (1982) verificaram que. em
solos da Califrnia, Estados Unidos, contendo acima de 34, 12 e 27 ppm de P (Olsen), ln e Mn.
respectivamente, o citro no responde inoculao com G.[asiclllamltl (= G.deserricola). De acordo
com esse estudo, a inoculao seria benfica em 77% dos solos da Califrnia plantados com citros.
As condies biolgicas do solo so tambm de grande infiuncia nas respostas inoculao.
Os efeitos da inoculao so maiores em solos fUll)igados, mas ocorrem tambm em solos no-esteri-
lizados (Figura 5.12). Em solos no-fumigados, o fungo introduzido tem que competir com fungos
indgenas, geralmente bem adaptados, e com antagonistas. hiperparasitas e outros componentes da
biota do solo. A produtividade da mandioca, em resposta inoculao com fungos MAs, decresceu de
15% a 28% em solos com at 2 \3 esporos. 100 g.1 para 12% e 11 %. em solos contendo 823 e 1717
esporos 100 g.1 de solo, respectivamente (Sieverding, 1991). Do mesmo modo, a resposta do
estilosantes inoculao foi minima em solos com mais de 20% de colonizao pelos fungos indge-
nas (Mosse, 1981). No entanto, a infectividade da maioria dos solos agrcolas baixa, podendo-se
obter respostas inoculao, como se verifica para o cafeeiro (Figura 5.12) e soja em solo de cerrado.
Figura 5.12. Efeito da inoculao do cafeeiro com
Gigaspora margarita (MAR), em solo
no-fumigado e adubado com difentes
quantidades de P.
186
As MAs no so compatveis e nem mesmo necessrias em sistemas manejados intensiva-
mente, mas podem "representar as razes de uma agricultura sustentvel". A importncia relativa e
potencial das MAs para a produo agricola mundial decresce na seguinte ordem: agrossistemas de
baixo insumo, sistemas altamente alterados e sistemas manejados intensivamente. Contudo, as pres-
ses para reduo no uso de fertilizantes e biocidas, a adoo de sistemas de rotao e cultivos reduzi-
dos, melhor integrao com os ambientalistas e o desenvolvimento de tecnologias para explorao das
MAs contribuem para aumentar sua importncia para os atuais sistemas intensivos de produo agr-
cola. Nos sistemas alternativos de produo, como no LISA ("low input sustainable agriculture") e
agricultura orgnica, as MAs desempenham papel de grande importncia (Douds-Jnior et aI., 1993).
Em condies controladas de produo, como aquelas com plantas envasadas e substratos esteriliza-
dos, mudas em viveiros com solos fumigados .e programas de recuperao de reas degradadas, as
MAs so geralmente essenciais para garantir o sucesso da explorao.
Apesar do enorme potencial e do grande volume de estudos, a explorao dos fungos MAs
em larga escala ainda apresenta vrios obstculos, sendo os principais apresentados a seguir:
a) Biologia do fungo ainda pouco conhecida. O carter biotrfico obrigatrio dificulta estudos da
biologia bsica e multiplicao em larga escala;
b) Falta de inoculantes aceitos comercialmente. Apesar de vrias tentativas, a comercializao dos
fungos MAs ainda muito limitada. Vrias empresas internacionais colocaram no mercado produ-
tos como Nutri-Link (NPl-Estados Unidos), Mykovan (Filipinas), Mycori-Mix (Primier Peat-Ca-
nad) e Vaminoc (UK e Japo), mas nenhum teve aceitao ampla.
c) Mercado muito fragmentado devido diversidade dos sistemas onde o uso promissor;
d) Expectativas irreais dos diversos segmentos envolvidos na explorao dos fungos MAs;
e) Falta de resultados consistentes e previsveis a campo e de anlise de custo e benefcios.
A falta de inoculante aceito comercialmente representa o principal obstculo para a explora-
o comercial dos fungos MAs. Mesmo existindo vrias alternativas para multiplicao do fungo in
vivo rSylvia & Jarstfer, 1994), utilizando-se meios inertes sem solo e hidroponia, inoculantes aceitos
comercialmente so ainda raros. Mesmo assim, os fungos MAs podem ser multiplicados em solos ou
substratos desinfestados e utilizados para inoculaes. Para se conseguir isto, fungos devem ser isola-
dos ou introduzidos, multiplicados e selecionados para inoculao ou mesmo para serem fornecidos
aos produtores ou fornecedores de inoculantes (Figura 5.13). Organismos selecionados so utiliza-
dos para inoculaes diversas e a viabilidade tcnica e econmica do processo pode ser avaliada. A
partir das etapas iniciais de um programa de pesquisa, constatou-se, em laboratrio da ESAL, que a
inoculao do cafeeiro com fungos MAs, em solos pobres dos trpicos, vivel na cafeicultura brasi-
leira (Siqueira et aI., 1993a). Mudas de cafeeiro devem ser inoculadas com isolados de G/OII/lIS
etlllJicatlllll nativos do agrossistema cafeeiro selecionados quant efetividade simbitica, ou com
Gigaspora lIlargarita, tambm de ocorrncia. natural noscafeel;os. Mudas de cafeeiro inoculadas na
repicagem para sacos plsticos, sementeiras mveis (bandejas) ou tubetes, crescem mais rapidamente
e com maior vigor que aquelas sem inoculao. Estes aspectos se manifestam tambm quando estas
so transplantadas para o campo (Siqueira et aI., 1993b). A pr-colonizao das mudas durante a
formao representou aumento de produtividade mdia, em trs anos, equivalente a 7 sacas (de 60 kg)
de caf beneficiado. ha" . ano", Apesar de no se conhecerem os custos exatos da inoculao nas
condies brasileiras, pode-se afirmar que a pr-colonizao das mudas economicamente vivel,
considerando os custos de U$ 5,00 , 1000 mudas" (equivalente a U$ 12,50 , ha"), praticados nos
Estados Unidos. Estudos conduzidos em laboratrio da ESAL indicam, em vrios experimentos.
187
aumentos de produtividade mdia do cafeeiro da ordem de 60% devido pr-colonizao das mudas
e plantio de lavouras em solo de cerrado (Siqueira e( al., 1993a): Testes de inoculao realizados por
agricultores, mediante o fornecimento de inoculante (solo infestado), tambm demonstram as vanta-
gens da inoculao. Procedimentos semelhantes podem ser adotados para outras culturas que passam
por fase de formao de mudas e para espcies destinadas a reflorestamento ou recuperao de reas
degradadas (Franco et a1., 1992). Portanto, embora ainda sem uma tecnologia amplamente utilizada,
a aplicao das MAs em sistemas de produo de mudas uma realidade vivel.
Culturas de fungos
nativos ou introduzidos
1
Multiplicao em
hospedeira
planta
1
Aval i a o da efetividade
eficincia simbitica
~
Fornecedores
de
(,no,",on,.
el/
Mu I tiplicao em larga escala
e inoculao
/ ~
Plantas Substratos Mudas Culturas
m icropropagadas inertes em viveiro anuais
Viabilidade tcnica e econmica
Figura 5.13. Principais etapas do desenvolvimento de tecnologia para uso da MAs.
188
o uso das MAs em culturas de ciclo curto, como produtoras de gros, mais difcil de ser
praticado via inoculaes. A maioria dos solos agrcolas tem propgulos de MAs, mas geralmente
estes no se encontram em nveis suficientes para alcanar taxas de colonizao capazes de garantir
beneficios a culturas de ciclo curto, como a soja e o milho. A colonizao das razes deve atingir seu
mximo antes do pico de demanda de nutrientes (P) (O'Keffe& Sylvia, 1991), quando o dficit de P
mximo. Como isto no ocorre, devido baixa infectividade do solo, a inoculao geralmente
benfica quando existe dficit nutricional. Diversos estudos realizados no exterior apontam os bene-
fcios da inoculao (por exemplo, Baltruschat, 1987), mas deixam claro a inviabilidade econmica da
tecnologia, devido principalmente elevada quantidade de inoculante necessria e ao custo de produ-
o e aplicao do mesmo.
Alternativamente, pode-se manejar a populao fngica do solo atravs de rotao de cultu-
ras, visando aumentar a densidade de propgulos e colonizao micorrzica. Mas, segundo Mosse,
(1986), citado por MilIer et aI. (1994), "devido diversidade dos fungos MAs, ao conhecimento ina-
dequado das relaes fungo-solo e variabilidade de resposta das plantas, difcil predizer os efeitos
da modificao dos sistemas micorrzicos na produo agrcola ". Assim, o manejo das MAs em
campos de produo, embora de grande interesse biolgico e ambiental, parece difcil de ser consegui-
do. No obstante, em casos como os de solos sob pousio prolongado, cultivados com planta no-
hospedeiras e nas monoculturas prolongadas, prticas como a rotao de culturas podem aumentar a
infectividade do solo. As condies micorrzicas do solo e a dependncia das culturas so fatores
importantes na definio de sistemas de rotao, devendo-se considerar o seguinte:
a) utilizar culturas com baixa dependncia micorrzica, em solos com baixa infectividade;
b) utilizar culturas com elevada dependncia micorrzica, em solos com alta infectividade;
c) utilizar, em solos infestados com patgenos, plantas no-hospedeiras destes.
A descoberta de compostos aromticos capazes de estimular a miconizao (Nair et aI., 1991;
Siqueira et aI., 1991 b) abre novas perspectivas para aplicao das MAs em sistemas agrcolas. A
aplicao de formononetina no solo, por ocasio da semeadura, acelera a micorrizao. Este compos-
to acha-se patenteado nos Estados Unidos como bioestimulante de solo (US patents n 5002603, 5085682
e 5125955) e, conforme resultados preliminares (Tabela 5.15), apresenta enorme potencial para o
desenvolvimento de tecnologia para a agricultura brasileira e mundial. H necessidade, porm, de
ampla experimentao a campo, para determinar solos e condies onde a aplicao do composto
tenha efeito garantido.
Tabela 5.15. Efeito da aplicao de formononetina sinttica nas produtividades do milho e da soja,
em latossolo na regio de Lavras (Siqueira et aI., 1992).
Variveis
Produtividade (kg . ha")
Aumento produo (%)
Aumento receita (U$ . ha")
Impacto estimado (U$ bi)
Quantidade aplicada (g . ha")
Na agricultura bmsill!irn.
Controle
3555
Milho
Formononetin3
4405
24
72
0,9
125
Soja
Controle Formononetina
1510
2289
52
140
1,6
250
189
5.6. Referncias bibliogrficas
ABBOTT, L.K.; ROBSON, A.D. Factors influencing the ocurrence ofvesicular-arbuscular mycorrhizas.
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CAPTULO 6
A BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO E SUA IMPORTNCIA
NOS ECOSSISTEMAS TERRESTRES
6.1. Introduo
David A. Wardle
1
Mariangela Hungria
2
A biomassa microbiana do solo definida como o corriponente microbiano vivo do solo e
composta de bactrias, fungos, microfauna e algas. O conceito de que, para determinados estudos,
toda a populao microbiana poderia ser tratada como um todo, foi proposto por Jenkinson (1966).
Para se ter uma idia da diversidade e quantidade de microrganismos, Ritz et a!. (1994) citam que em
apenas 1 cm
3
de solo sob pastagem pode conter milhes de bactrias, milhares de protozorios, cente-
nas de metros de hifas de fungos, centenas de fungos, insetos e outros organismos maiores.
A biomassa microbiana um componente crtico de todos os ecossistemas naturais ou mani-
pulados pelo homem, porque o agente regulador da taxa de decomposio da orgnica e da
ciclagem dos elementos (Jenkinson & Ladd, 1981), atuando, portanto, como fonte e dreno ("source"
e "sink") dos nutrientes necessrios ao crescimento das plantas (Ladd et a!., 1985). J foram consta-
tadas relaes estreitas entre a biomassa microbianae a produtividade das plantas (Okano et a!., 1987),
taxa de amonificao (Holmes & Zak, 1994), taxa de decomposio de resduos vegetais (Flannagan
& Van eleve, 1983) e a biomassa dos nveis trficos superiores (Wardle, 1994a).
Desde o desenvolvimento da tcnica de incubao-fumigao para quantificar a biomassa
microbiana (Jenkinson & Powlson, 1976), o nmero de estudos sobre esse tema tem aumentado subs-
tancialmente, muitos dos quais relacionados ao desenvolvimento de metodologias para quantificar a
biomassa, o que foi discutido recentemente por Kunc (1994), Powlson (1994) e Wardle (1994b).
Mais recentemente, com o desenvolvimento das fcnicas de biologia molecular, os estudos
sobre aspectos fisiolgicos e genticos da biomassa e sobre a diversidade da comunidade microbiana
tambm tm sido intensificados. Em relao diversidade bacteriana, por exemplo, Torsvik et a!.
(1994) observaram que, pela extrao e anlise do DNA das do solo, foi possvel detectar
uma diversidade cerca de duzentas vezes encontrada nos estudos tradicionais de caracteri-
zao fenotpica ill vitm. Outros mtodos moleculares, como o uso de PCR ("polymerase chain
reaction") e hibridizao com seqncias 16S rRNA, foram recentemente compilados por Ritz et a!.
( 1994).
Neste captulo so abordados os principais aspectos ecolgicos da biomassa microbiana, par-
ticularmente em relao influncia dos fatores ambientais biticos e abiticos.
'Pesquisador, Ph.D" AgRcs\!lIrch Ruakum Agriculluml ReSl.!arch Celller. Privalc Hag 3123, Hamilton, New ZenJalll1.
2Pesquisadom, Ph.D . EMBHAI'A-Ccnlru Nil.l.:ional d..: P\!sl[uisa de Soja (CNI'Su), Cnixa !'ostal1fJl. CEI' H600J-(170, Londrina,PR.
196
6.2. Fatores Qumicos
6.2.1. Teores de carbono e nitrognio
A dinmica da biomassa microbiana est estreitamente correlacionada dinmica da matria
orgnica do solo. A maioria dos sistemas naturais fortemente limitada por nuhientes (Gottschal,
1990), o que faz com que os microrganismos tenham crescimento lento ou mesmo fiquem em estado
dormente. Nessas condies, as clulas ficam estressadas e, durante longos perodos, pode ser consta-
tada a ausncia de replicao do cromossomo (Chesboro, 1990).
A biomassa microbiana responde rapidamente adio de carbono (C) e nih'ognio (N) pron-
tamente disponveis (Nordgren, 1992), o que sugere que a maiOlia dos componentes da microflora
est limitada pelo C e pelo N (Knapp et aI., 1983; Cochran et a!., 1988). A biomassa microbiana,
entretanto, est mais freqentemente relacionada ao N do que ao C do solo (Martens, 1987; van de
Werf & Verstraete, 1987) e a proporo do C orgnico do solo imobilizado na biomassa microbiana
(ou a relao C da biomassa:C orgnico) est freqentemente correlacionada negativamente com a
relao C:N no solo (Wardle, 1992). Os dados apresentados por Beare et aI. (1990) demonstram que
a biomassa microbiana na cobertura vegetal morta correlacionada positivamente com o teor de N e
negativamente com o teor de C dessa cobertura. Muitos estudos sobre a decomposio da cobertura
vegetal morta mostraram que o N, e no o C, regula a atividade dos microrganismos decompositores e
as taxas de decomposio (Swift et a!., 1979; Taylor et a!., 1989). Isso fica evidenciado, por exemplo,
em um estudo sobre a decomposio de palha de higo (TriticuIII aestivuIII L.) e de tremoo (Lupil111S
allllls L.), conduzido no norte do Paran, onde foi observado que a palha da leguminosa, com maior
concentrao inicial de N e menor relao C:N, resultou em uma taxa de mineralizao lquida de
54 kg a 82 kg de N.ha-
I
em 130 dias, enquanto que a mineralizao da palha de higo foi de 13 kg a
47 kg de N.ha-
I
(Andrade et a!., 1993b). Deve-se salientar, porm, que a importncia do C e do N nos
mecanismos regulatrios da atividade da biomassa microbiana pode variar substancialmente entre os
diversos tipos de solo (Gallardo & Schlesinger, 1992; Wardle, 1992).
Fatores que alteram os teores de matria orgnica do solo normalmente provocam tambm
alteraes na biomassa microbiana. Isso particularmente evidente quando resduos de plantas so
adicionados ao solo (Sorenson, 1983; Dalal et a!., 1991), ou quando ocorre um decrscimo no teor de
matria orgnica (West et a!., 1986; Bonde et aI., 1988).
A qualidade da matria orgnica tambm importante para estimular a biomassa microbiana e
adies de resduos de alta qualidade podem aumentar a relao C microbiano:C orgnico nos solos
(Powlson et a!., 1987; Saffigna et a!., 1989). O C e N presentes na cobertura vegetal morta e nos
compostos derivados da cobertura vegetal morta so, de um modo geral, aproveitados imediatamente
pela biomassa microbiana, conforme tem sido demonstrado em estudos com istopos (Amato & Ladcl,
1980; Ladd et a!., 1981; Ocio et a!., 1991).
As relaes entre a biomassa microbiana e o teor de N mineral do solo, ou mesmo a resposta
adio de N mineral no campo so contraditrias (Wardle, 1992). Alguns estudos chegam a mostrar
um efeito negativo da adio de N na biomassa microbiana (S6derstr6m et a!., 1983; Ohtonen &
Markkola, 1991), o que pode estar relacionado a um estmulo da nihificao, aos efeitos negativos do
on nitrato na microflora (Verhaegen et aI., 1988) ou, ainda, ao estmulo no crescimento da planta,
resultando em maior competio entre a planta e os microrganismos por nuhientes.
197
Embora vrios estudos tenham sido feitos para investigar a resposta da biomassa microbiana
ao C e N da matlia orgnica, pouco se sabe sobre a resposta da biomassa microbiana a outros elemen-
tos, como o fsforo. A maioria dos estudos conduzidos investigou a resposta da biomassa microbiana
adio de fertilizantes contendo N e P, de modo que os efeitos no podem ser separados (Wardle,
1992). Os nveis de P limitam a biomassa microbiana em algumas situaes, mas no em outras
(Scheu, 1990), e a adio de P pode exercer efeitos estimulatrios (Biederbeck et aI., 1984) ou neutros
(Tate et aI., 1991). H evidncias, tambm, de que a biomassa microbiana pode mostrar uma relao
positiva com o teor de enxofre e potssio do solo (Lawrence & Germida, 1988).
Finalmente, parece haver concordncia que a reduo nos teores de C e N da matria orgnica
provoca um decrscimo no teor da biomassa microbiana. reas sob pastagem tm maior biomassa do
que solos cultivados (Drury et aI., 1991; Pfenning et aI., 1992) e menor do que solos sob vegetao
natural, como florestas (Ayanaba et aI., 1976; Srivasava & Singh, 1991). A retirada de florestas pode
resultar, a longo prazo, em efeitos negativos na biomassa microbiana (Luizou et aI., 1992; Mazzmino
et aI., 1993).
Resultados encontrados no Brasil geralmente contrastam com os obtidos em regies tempera-
das, apresentando maior ciclagem da biomassa. Desse modo, a queimada da vegetao natural reduz a
biomassa microbiana (Fritze et aI., 1993), tendo provocado uma queda de 87'Yo no teor desta, confor-
me estudo conduzido na Regio Amaznica (Pfenning et aI., 1992). Na Regio Sul do Brasil tambm
foi constatado que redues no teor de matlia orgnica causadas pelo cultivo do solo refletem na
biomassa microbiana. No Paran, a retirada da mata natural (Figura 6.1) ou do campo nativo no Rio
Grande do Sul reduziu o teor de C e N do solo. Em apenas quatro anos foi constatado um decrscimo
drstico no teor de biomassa microbiana no solo descoberto (Figura 6.2) e decrscimos menores,
porm substanciais, quando o campo nativo foi substituido por guandu e milho (39'%), siratro (33%1),
aveia e milho (47%), ou pangola (48%) (Cattelan & Vidor, 1990a,b).
4 0.4 a
a
a
~
Londrina
i D Campo Mourllo a
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o
Z

U
O 0.0
Mata Convencional Mata Convencionai
Figura 6.1. C-orgnico e N-totalno solo, na camada de O-I O cm, aps sete anos e meio de cultivo em
um LR eutrfico em Londlina, PR, e em um LR lico em Campo Mouro, PRo Letras
indicam diferenas estatsticas no nvel de 5%, pelo teste de Tukey, para cada local. Se-
gundo Santos (1993 l.
60
50
40
30
20
10
O
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o
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o

(J)
Figura 6.2. Biomassa microbiana, avaliada pelo mtodo de fu-
migao-incubao (mg.100 g-I solo), e atividade
microbiana, estimada pela liberao de CO
2
do solo
no-fumigado, durante 20 dias, em um PVE do
Rio Grande do Sul, sob diferentes sistemas de cul-
tivo. Avaliaes realizadas na camada de 0-5 cm
do solo. Valores mdios de 12 pocas. Segundo
Cattelan & Vidor (1990b).
Alguns sistemas de plantio tambm permitem teores mais elevados de matria orgnica. Um
exemplo tpico o do plantio direto em relao ao plantio convencional. No plantio convencional so
utilizadas as operaes de cultivo primrio, com arao (arado de disco, aiveca ou escarificador),
seguidas pelo cultivo secundrio, com grade de disco pesada. A arao e gradagem podem, ainda, ser
feitas em uma nica operao, com uma grade de disco. J no plantio direto, bastante utilizado no sul
do Brasil, a semeadura realizada sob resduos da cultura anterior sem movimentao do solo, exceto
na linha de semeadura, o que. permite grande acmulo de resduos vegetais (Figura 6.3). Quando
comparado ao plantio convencional, o plantio direto favorece o acmulo de matria orgnica (Figura
6.4) e a biomassa microbiana (Figura 6.5). Essa diferena observada na biomassa microbiana entre o
plantio direto e convencional nos solos do Paran muito mais elevada do que as observadas em
regies temperadas, que ficam em torno de 10% a 20'X, (Wardle, 1992, 1994a).
199
Fi:;ura 6 . .1. Soja (GI)'('jl/e IIW\" L. Merrill) sob o sistema de p l a n ~
tio direto, mostrando a cobertura morta com aveia
preta (Avella slrigosa). Cortesia de Dr. Eleno Torres
(EMBRAPA-CNPSo).
Nesses estudos, porm, dificil separar os efeitos diretos, da adio de C e N pela adio de
matria orgnica, dos efeitos indiretos, causados pelas menores variaes de temperatura e umidade,
fatores estes que esto diretamente relacionados atividade da biomassa microbiana. A adio de
6,6 t de palha.ha-
I
a um solo descoberto no Rio Grande do Sul, por exemplo, reduziu a temperatura
mxima do solo de 38" C para 3D" C (Morote et ai., 1990). No Paran, a temperatura mxima, a 3 cm
em solo sob plantio direto, atingiu 36"C, enquanto que sob plantio convencional foi de 46"C, consta-
tando-se, ainda, menor disponibilidade de gua (Sidiras & Pavan, 1985). Essas diferenas na tempe-
ratura e umidade do solo podem ser responsveis, em grande parte, pela reduo do nmero de clulas
de certos microrganismos do solo, como os fixadores de nitrognio, fungos micorrzicos vesculo-
arbusculares (Voss & Sidiras, 1985; Andrade et aI., 19933), actinomicetos, solubilizadores de fosfato.
Por outro lado, foram observados incrementos de 57% na proporo de esporos de bactrias. que so
formas de resistncia que aparecem sob condies de estresse (Cattelan & Vidor, I 990b ).
6.2.2. Relaes com as plantas
As plantas normalmente estimulam a biomassa microbiana, principalmente porque a rizosfera
est constantemente exudando formas prontamente disponveis de C e N (Smith & Paul, 1990), que
so absorvidas pela micro flora, o que fica evidenciado por estudos com istopos (Bottner et aI., J 984;
Schnrer & Rosswall, 1987).
Esse padro de estimulo, entretanto. no universal, e as plantas s vezes reduzem a biomassa,
provavelmente pela competio por nutrientes com as raizes (Okano et al., 1991), como mostra a
Figura 6.6. Foi sugerido, ainda, que as plantas podem estimular ou inibir a biomassa. dependendo de
qual fora for determinante, o estimulo da rizosfera ou a imobilizao (van Veen et aI.. 1989).
60
50
40
30
20
10
0-1
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c
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"t:I
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o
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a.
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7-10
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C - Orgdnico (%)
I
a
mI

PC
PD
Figura 6.4. Carbono orgnico em um LR eutrfico, aps sete anos
e meio de cultivo, sob plantio direto ou convencional na
regio de Londrina, PRo Mdias de quatro repeties
seguidas pela mesma letra no diferem estatisticamen-
te, no nvel de 5% pelo teste de Tukey entre os sistemas
em cada profundidade. Segundo Santos (1993).
CAMADA DE 0- 15 cm
a
PD>PC
em
b
52%
O
Convencional
Direto
Figura 6.5. Biomassa microbiana em um LR, sob plantio convencional ou
direto. A biomassa foi expressa pelo teor de N (Ilg N.g-
1
de solo
seco) e avaliada pelo mtodo de fumigao com clorofrmio e
extrao com sulfato de potssio (0,25 M). Mdias de sete cole-
tas realizadas durante 14 meses, cujos valores diferiram estatisti-
camente no nvel de 5% pelo teste de Tukey. Segundo Andrade et
aI. (1993a).
201
Como as plantas regulam a fonte de nutrientes para os microrganismos e contribuem qualitati-
va e quantitativamente para o acmulo de matria orgnica, a natureza da comunidade vegetal muito
importante. Conseqentemente, os estudos sobre sucesso de plantas normalmente mostram padres
previsveis de acmulo de biomassa, pelo menos nos estdios iniciais (Halvorson et aI., 1991; Fenn et
aI., 1993). Essas mudanas so, quase que certamente, relacionadas s limitaes de C e N (Zak et aI.,
1990; Bosatta & gren, 1994) e, nos estdios posteriores, possivelmente devido ao P (Scheu, 1990).
Flutuaes temporais da biomassa microbiana tambm so menores nos sistemas posteriores de su-
cesso (Santruckova, 1992), sugerindo que a dinmica da biomassa microbiana estabiliza medida
que o ecossistema desenvolve.
BIOMASSA MICROBIANA
(pg N/g SOLO SECO)
N OI ~ UI cn
.....
O
O O O O
O
Moi - 92
Antes do Trigo
Q
Ago- 92
o
Out - 92
Nov- 92
Antes da Soja ..
Jan - 93
O"
Abr- 93
o da Soja
Jun - 93
O"
Figura 6.6. Teor de biomassa microbiana, avaliada pelo mtodo de
fumigao-incubao, durante um ano agrcola de plan-
tio de soja e trigo, em um LR do Paran. Segundo
Andrade et aI. (1993a).
202
As espcies de plantas tm grande influncia na biomassa microbiana e, de um modo geral,
plantas de espcies diferentes em um mesmo solo resultam em nveis diferentes de biomassa microbiana
(Drury et aI., 1991; Sparling et aI., 1992), o que normalmente resulta de diferenas qualitativas e
quantitativas na adio de matria orgnica ao solo. Os sistemas de rotao e sucesso de culturas
influenciam a populao microbiana pela presena de determinadas espcies de plantas. Nos sistemas
de rotao com soja/milho/trigo e sucesso milholtrigo e soja/ trigo, os microrganismos foram favore-
cidos pela presena da leb'llminosa (Andrade et aI., 1993a; Colozzi-Filho et aI., 1993). Resultados
semelhantes foram observados no consrcio de feijo e milho e na monocultura do feijo em relao
do milho (Andrade et aI., 1993c). Anderson & Domsch (1989) tambm observaram que as rotaes
de cultura podem estimular a biomassa microbiana e a relao C da biomassa:C orgnico, indicando
provavelmente maior diversidade dos microhabitats do solo devido maior variabilidade nos tipos de
tecido. De fato, Andrade et aI. (1993c) constataram que com o consrcio milho/feijo as espcies de
fungos MVA e de RhizoblIIl foram mais numerosas nos solos que na monocultura com milho. Essa
riqueza de comunidades vegetais em sistemas agrcolas parece exercer efeitos pronunciados na din-
mica da biomassa microbiana, implicando geralmente em incremento no teor e maior biodiversidade
(Wardle & Nicholson, dados no publicados). Com certeza, parte dos resultados citados no item
anterior, sobre diferenas na biomassa microbiana com diferentes coberturas de solo, resulta tambm
da diversidade de espcies vegetais (Wardle, 1992).
6.2.3. pH do solo
A biomassa microbiana normalmente relacionada positivamente com o pH do solo (Wardle,
1992). Em alguns locais, entretanto, a biomassa dos solos cidos bem adaptada s condies cidas
(Nioh et aI., 1993). Embora a acidificao freqentemente exera efeitos negativos na biomassa
microbiana, o grau de inibio bastante varivel. Em algumas situaes, a biomassa s inibida
quando o pH atinge valores muito baixos, como 2,0 e 3,0 (Baath et aI., 1979). A importncia do
aumento do pH no incremento da biomassamicrobiana tambm foi demonstrada pela adio de calcrio
(von Ltzow et aI., 1993; Smolander & Malkonen, 1994). Entretanto, embora a cal agem inicialmente
estimule a biomassa microbiana, segundo Andrade et al.(1994), aps um valor determinado do pH
comea a ocorrer inibio (Figura 6.7) . Ao reexaminar dados de literatura, Wardle (1992) encontrou
que, na anlise da variao espacial da biomassa microbiana, o efeito do pH geralmente menos
importante do que o teor de C ou N, mas que o pH apresenta importncia semelhante a do C e N
quando a variao espacial da relao C:N considerada.
Um fator relacionado ao baixo pH o aumento no teor de alumnio, que pode ser txico aos
microrganismos do solo. A biomassa em solos sob vegetao (com eucalipto, por exemplo) foi infe-
rior a das amostras de solo sob mata nativa, o que foi explicado pelo menor teor de alumnio neste
ltimo solo (Della Bruna et aI., 1991).
6.2.4. Metais pesados e pesticidas
Os metais pesados podem influenciar fortemente a biomassa microbiana, sendo bastante im-
portante quando a contaminao ocorre de um modo contnuo por vrios anos (Brookes & McGrathm,
1984). Corno exemplo, tem-se que a biomassa microbiana afetada por altos nveis de cobre, poden-
203
do-se observar que a relao C:N da biomassa reduzida nas proximidades das minas de cobre (Bth
et aI., 1991). Os fungicidas freqentemente exercem efeito inibitrio nos componentes fngicos da
biomassa microbiana (Anderson et aI., 1981), mas os herbicidas tendem a exercer efeitos variveis,
geralmente de menor importncia e intensidade, quando comparados com a variao espacial e tem-
poral da biomassa microbiana (Wardle & Parkinson, 1991). So poucos os relatos confiveis que
demonstram que quando os herbicidas foram aplicados em concentraes realistas afetaram a biomassa
microbiana. Muitos estudos que relataram efeitos inibitrios de herbicidas em nivel de campo estavam
provavelmente avaliando os efeitos indiretos pela alterao da cobertura vegetal (Wardle, 1994a).
-----------..!.--- -- -- -,---- 7>,-----,
Nematides
predadores
de bactrios
Nemafldes
predador.s
de fungos
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I
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1
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I
I
I
1 __________________ J
Macrofouna
soprofoga
Mocrofauno
predadora
Figura 6.7. Relaes entre a biomassa microbiana do solo (bactlias e fungos) e
outros componentes da biota do solo.
6.3. Fatol'es Fsicos do Solo
6.3.l. Textura
A textura do solo exerce efeitos importantes na biomassa microbiana, e um teor elevado de
argila estimula a manuteno da biomassa. Isso provavelmente ocorre porque a argila aumenta a ab-
soro dos produtos orgnicos e nutrientes, serve como tampo s mudanas de pH e protege os
microrganismos contra predadores (Smith & Paul, 1990). Na Amaznia, por exemplo, a biomassa
microbiana foi avaliada em 81 hlg C.g-
1
de solo na camada superficial de um latossolo amarelo muito
argiloso sob mata natural, enquanto que em ouho latossolo, com menor teor de argila, o acmulo foi
de 463 flg C.g-
1
de solo (Pfenning et aI., 1992). Recalculando diversos dados de literatura, Wardle
204
(1992) demonsh'ou que, de um modo gemi, a biomassa microbiana, mas no a relao C da biomassa:C
orgnico, fortemente correi acionada com o teor de argila no solo. Este resultado sugere que o prin-
cipal papel da argila no estmulo da biomassa microbiana est relacionado sua habilidade de reter C
e N orgnicos.
6.3.2. Estl'UtUl'3
A biomassa microbiana do solo tambm alterada pela esh'utura do solo e, com o aumento no
tamanho e estabilidade dos agregados, geralmente ocorre um incremento no teor da biomassa (Drury
et aI., 1991; Carter & Mele, 1992). Em sistemas de cultivo onde as prticas de preparo do solo so
minimizadas, a estabilidade dos agregados do solo aumenta. Quando o sistema convencional foi
comparado com o plantio direto em solos do Paran, o ltimo favoreceu a estabilidade dos agregados,
avaliada pela maior proporo de agregados maiores do que 4mm e maior dimetro mdio geomtrico
das partculas (Santos, 1993). Essas condies do plantio direto favorecem o desenvolvimento de
hifas de fungos (Hendlix et aI., 1986) e, aparentemente, existe um mecanismo de reh'oalimentao
enh'e a esh"Utura do solo e a formao de cadeias de hifas de fungos.
6.4. Microclima do Solo
Normalmente a biomassa microbiana declina rapidamente com a secagem do solo e aumenta
com a recuperao do teor de umidade. Estudos com istopos indicam que uma proporo significa-
tiva do C e N da biomassa microbiana pode ser liberada durante os ciclos de secagem e umedecimento
(Mammoto et aI., 1982). Contudo, existem alguns relatos de relaes negativas entre a biomassa e a
umidade do solo, que ocorreram pelo estmulo de predadores sob alta umidade (Flanagan & van Cleve,
1977) ou morte das razes durante longos peIodos de seca, que estimulam o crescimento de fungos
tolerantes (Ross et aI., 1984). Outros esrudos que detectaram relaes negativas ou aleatrias entre a
biomassa microbiana e a umidade do solo provavelmente indicam problemas metodolgicos, ou mes-
mo que as avaliaes da biomassa microbiana variam com os gradientes de umidade do solo (Wardle
& Parkinson, 1990).
A biomassa microbiana composta de diversas espcies, que apresentam diferentes !,'Taus de
suscetibilidade secagem. Alm disso, a biomassa microbiana em solos submetidos a ciclos freqen-
tes de secagem e umedecimento , de um modo geral, mais resistente deficincia hdrica do que a
biomassa de solos que no passam por ciclos de umidade (Sparling et aI., 1981 l. As condies de seca
reduzem a disponibilidade de solutos e, portanto, razovel assumir que os microrganismos adapta-
dos seca sejam tolerantes a pelodos longos sem nutLientes (Rosacker & Kief, 1990). Por outro lado,
o metabolismo anaerbio menos ativo do que o aerbio e, provavelmente por isso, a biomassa de
solos continuamente alagados inferior a dos solos com boa aerao. Em um solo de vrzea na Ama-
znia, a biomassa foi duas a h's vezes inferior a do solo com boa aerao (Pfenning et aI., 1992).
A temperarura do solo tambm afeta a biomassa microbiana, embora no se tenha um entendi-
mento perfeito sobre os processos envolvidos. Temperaruras elevadas podem encorajar a atividade
microbiana com a conseqente deficincia de substrato, resultando no declnio da biomassa microbiana
(Joergensen et aI., 1990). Entretanto, a biomassa microbiana mostra relaes variveis com a tempera-
rura, o que est presumivelmente relacionado com a temperarura tima das espcies presentes em um
205
detenninado sistema (Wardle, 1992). Ciclos de congelamento e descongelamento podem ser impor-
tantes na ciclagem microbiana, uma vez que o descongelamento rapidamente seguido por cresci-
mento microbiano, auxiliado, ainda que parcialmente, pela disponibilidade de substrato (Flanagan &
van Cleve, 1983).
As flutuaes na biomassa microbiana so governadas, pelo menos em parte, pela umidade e
temperatura do solo. razovel, portanto, esperar variaes sazonais elevadas no teor de biomassa
microbiana em locais onde as diferenas climticas entre as estaes do ano sejam grandes e, como
exemplo, Flanagan & van Cleve (1977) e Cochran et aI. (1989) citam as reas subpolar e boreal e
Singh et aI. (1989) as reas com estaes midas e secas pronunciadas. No caso da comparao entre
o plantio direto e o plantio convencional, certamente grande parte do efeito positivo do primeiro siste-
ma na biomassa microbiana (Andrade et aI., 1993a) se deve s menores variaes da umidade e tem-
peratura do solo (Sidiras & Pavan, 1985). Wardle (1992) identificou, atravs da anlise de dados da
literatura, quatro respostas da biomassa microbiana s variaes sazonais, que foram denominadas de:
1) resposta positiva ao aumento no teor de umidade do solo; 2) resposta negativa ao aumento no teor
de umidade; 3) resposta positiva ao aumento na temperatura; e 4) resposta positiva produo de
razes. As respostas da biomassa s mudanas sazonais so importantes nos estudos de modelagem
utilizados para prever a ciclagem microbiana. Segundo esses modelos, a ciclagem mais rpida em
climas quentes (que freqentemente apresentam menor variao entre as estaes. Contudo, admite-
se que a ciclagem microbiana em climas mais fi'ios, com extremos de temperatura durante o ano, possa
ser maior do que se acredita.
6.5. Intelaes nMicas
A biomassa microbianano um componente isolado no sistema do solo; ao contrrio, interage
estreitamente com muitos outros componentes. Bactrias e fungos ocupam um nvel trfico interme-
dirio na rede de decomposio alimentar, onde so dependentes da disponibilidade de recursos provi-
dos por nveis trficos inferiores (principalmente plantas, como discutido anteriormente) e tambm
por nveis trficos mais elevados (ex. nematides, protozorios, caros, colmbolos).A posio trfica
da biomassa microbiana mostrada na Figura 6.7. As massas fngicas e bacterianas so, portanto,
aparentemente influenciadas pela dinmica de qualquer um dos !,'TUPOS com os quais interagem.
6.5.1. PIotozorios e nematides
A estimulao da microflora do solo, pela adio de substrato, por exemplo, parece induzir um
aumento na macrofauna associada (nematides, protozorios). Mas esse incremento na macrofauna
pode, por outro lado, causar uma supresso da microflora atravs da presso alimentar e presso fsica
(Clarholm, 1984). Isto parece ocorrer mais com bactrias do que com fungos, e qualquer aumento
potencial das bactrias induzido por retorno de matria orgnica ou efeitos da rizosfera parece ser
anulado por essas presses dos protozorios e nematides (Ingham et aI., 1986). As bacterias so
usualmente consumidas ao acaso e menos adaptadas do que os fungos em suportar a presso da
macrofauna do solo. Os fungos possuem uma gama de adaptaes, tanto morfolgicas como qumi-
cas, na competio com protozorios e nematides, e embora a biomassa fngica s vezes seja reduzi-
da (Wasilewska et aI., 1975), os efeitos no so usualmente severos. Aparentemente, portanto, a biomassa
206
bacteriana regulada por foras "de cima para baixo" (pela macrofauna, por exemplo), enquanto que
os fungos so regulados "de baixo para cima", ou seja, pela disponibilidade de substratos e nveis de
matria orgnica (Wardle & Yeates, 1993; Ward1e, 1994a). As interaes entre a microfauna e a biomassa
microbiana (principalmente bactrias) incrementam a cic1agem microbiana, que tem implicaes im-
portantes para intensi ficar a disponibilidade de nutrientes (Bouwman et aI., 1994) e o crescimento das
plantas (Ingham et aI., 1985).
6.5.2. caros e colmbolos
Os co1mbolos (ordem Collembola) e muitas espcies de caros so "saprfagos", significan-
do que se alimentam de restos de vegetais e de hifas fngicas que crescem atravs deles. Muitas
espcies se alimentam seletivamente sobre hifas fngicas presentes na superficie dos restos vegetais.
Na verdade, quando os caros e colmbolos se alimentam de fungos, isso benfico para os fungos do
solo, provavelmente resultando em estmulo ao crescimento das hifas, o que ocorre pela remoo de
hifas senescentes, pela transformao de resduos e pelo estmulo disperso (Visser, 1985). Um
crescimento compensatrio considervel dos fungos pode ser constatado se ocorrer um grau elevado
de fragmentao do habitat pelos colmbolos (Bengtsson et aI., 1993). A biomassa fngica e a produ-
tividade so, freqentemente, maximizadas na presena de uma populao intermediria de
microarh'podes, mas em solos com alta intensidade geralmente ocorre supresso da biomassa fngica
(Hanlon, 1981). O aumento da massa fngica e a liberao de nutrientes, causados por uma populao
intermediria de microartrpodes do solo, podem resultar em uma importante contribuio
mineralizao da matria orgnica do solo e dos restos culturais (Seastadt, 1984).
6.5.3. Macrofauna
O grupo mais conhecido e estudado da macro fauna o das oligoquetas terrestres (minhocas).
A influncia das oligoquetas sobre os microrganismos resulta da modificao do material ingerido por
elas ao passar pelo trato intestinal. Dejetos das oligoquetas contm conjuntos modificados de micror-
ganismos, e as bactlias tendem a ser intensificadas, provavelmente s custas dos fungos (Daniel &
Anderson, 1992). Isto acontece, possivelmente, porque as oligoquetas estimulam alguns microrganis-
mos atravs da modificao da natureza qumica e fsica do seu ambiente e, simultaneamente, pela
digesto de outros microrganismos, principalmente fungos (Edwards & Fletcher, 1988). O resultado
que a composio da massa microbiana alterada, enquanto que a biomassa total geralmente no
afetada (Scheu, 1990, 1994). As oligoquetas podem tambm ter efeito indireto na microflora do solo,
pelo incremento da infiltrao, revolvimento de restos culturais para camadas profundas e intensifica-
o da produtividade das plantas (Wardle, 1994a).
Outros grupos da macroflora podem, potencialmente, exercer efeitos importantes na biomassa
microbiana, embora isto tenha sido pouco estudado. A macro fauna saprfago (por exemplo, miripodes,
besouros, formigas, cupins) pode ser extremamente abundante em alguns ecossistemas, e a passagem
de materiais ah'avs de seus lTatos intestinais pode ter efeitos diretos e importantes na microflora do
solo (Anderson et aI., 1983; Wolters, 1989). A macrofuuna predatria (por exemplo, aranhas, carabdeos,
estafilindeos) pode estimular a biomassa microbiana ao se alimentar daqueles organismos que con-
somem microrganismos (Kajak et aI., 1993; Wardle, 1994a).
207
6.6. Dis'ibuio Global da Biomassa Microbiunu
Enquanto a maioria dos estudos fica concentrada na investigao da biomassa microbiana em
um escala geogrfica relativamente estreita, as diferenas entre os ecossistemas s podem ser avalia-
das se for utilizada uma escala geogrfica mais ampla. Para avaliar os fatores que influenciam a
biomassa microbiana em uma escala global, Wardle (1992) recalculou os valores de C e N da biomassa
encontrados em 112 trabalhos (listados no apndice I de Wardle, 1992). Esses es111dos foram realiza-
dos desde a regio polar at os trpicos, e a sua anlise foi realizada com a finalidade de relacionar a
biomassa do solo com as propriedades fsicas e qumicas do solo e com o macroclima. Nessa anlise,
o C e o N da biomassa microbiana foram fortemente correlacionados com os nveis de C e N em
florestas, solos cultivados e pastagens. Esses efeitos foram mais fortes do que os efeitos relacionados
ao macroclima. A biomassa foi positivamente relacionada ao pH somente nos solos cultivados, no
apresentando correlao com a relao C:N. Entretanto, quando se considerou a relao C microbiano:C
orgnico, relaes negativas foram encontradas com a relao C:N do solo, enquanto que as relaes
com o pH foram positivas, particularmente em ecossistemas florestais.
Em bases globais, o C da biomassa microbiana foi negativamente correlacionado com a tem-
peratura do ms mais fiio em solos cultvados, pastagens ou solos orgnicos de floresta, mas no em
solos mnerais de florestas. Essa relao negativa parece estar relacionada com a maior atividade
microbiana em climas quentes, resultando em perda de matlia orgnica do solo e, portanto, reduzin-
do a fonte de sustentao da biomassa. A precipitao anual no mostrou uma correlao consistente
com a bomassa microbiana. A relao C microbiano:C orgnico foi independente do macroclima,
exceto nas florestas, onde foi enconl1'ada uma relao positiva com a temperatura do ms mais frio. Os
resultados dessa anlise, portanto, sugerem que a biomassa microbiana, em uma escala global,
influenciada pl;mariamente pela "qualidade" do solo, e que os efeitos macroclimticos so secund-
lios. Isto ocorre porque os microrganismos so geralmente adaptados ao clma de sua rea geogrfica,
provavelmente porque evoluram nesse ambiente.
Quando esses 112 estudos foram classificados em grupos de ecossistemas, observaram-se
diferenas enh'e os ecossistemas (Tabela 6.1). A biomassa microbiana em florestas tropicais imobili-
za uma proporo maior de C orgnico total do que em florestas temperadas, especialmente de conferas;
isso, porm, no ocorre em relao ao nitrognio. Esse padro parece no ocorrer tambm em solos
cultivados, mas so necessIios mais estudos, particulamlente nas regies tropicais, para confirmar
essa premissa. Em solos cultivados, os nveis de C e N da biomassa microbiana tambm so menores
do que nos solos sob floresta ou pastagem, mas a proporo entre o C orgnico no solo e o N na
biomassa microbiana no menor, indicando que a converso de sistemas naturais (ou perenes) em
sistemas cultivados reduz a biomassa microbiana, particularmente pela reduo dos nveis totais de
matIia orgnica do solo.
Os dados na Tabela 6.1 podem ser usados para fornecer uma medida aproximada do C e N
imobilizados na biomassa microbiana. Tal informao de interesse nos estudos sobre a contribuio
dos microrganismos nos ciclos do C e N (Smith & Paul, 1990). Quando esses dados so combinados
com os dados globais de C e N fornecidos por Smith & Paul (1990) e Anderson (1991), as estimativas
do C e N globais na biomassa microbiana, em Gt (onde: I Gt = 10 15 g) so: tlorestas tropicais (C =
3,68, N = 0,43); floresta boreal confera (C = 1,82, N = 0,25); floresta temperada (C = 1,48, N =
208
0,20); savana(C=3,73, N=0,38); pastagemtemperada(C=3,03, N=0,48); e tundra(C=0,18,
N = 0,03). Essas figuras sugerem que as massas de C e N globais que esto alocadas na biomassa
microbiana so de, respectivamente, 13,9 Ot e 1,83 Ot, representando 1,4 'X, e 2,8%, respectivamente,
do C e N armazenados na Terra.
Tabela 6.1. Valores mdios do C (C mic) e do N (N mic) da biomassa microbiana e da relao C mic:C
orgnico total do solo CC org) e N total do solo (N tot) em uma srie de ecossistemas,
resultantes de uma reviso de 112 estudos. Modificado de Wardle (1992).
Ecossistema C mic
(llgC.g-1 solo)
Floresta tropical mida 986
Floresta tropical seca 653
Floresta temperada
(angiosperma) 877
Floresta temperada
(confera)
Pastagem tropical
pastagem temperada
Terra cultivada
tropical
Terra cultivada
climas amenos
Terra cultivada
climas frios
736
342
1011
240
331
461
C mie.(C org)-I
(x 100)
1,99
3,21
1,43
0,93
2,87
2,04
1,96
2,47
2,68
N mie
(llgN.g-1 solo)
100
65
93
35
170
48
47
66
N mic.(N total)-I
(x 100)
4,41
3,44
3,19
4,24
3,66
3,99
2,73
3,32
Relativamente, pouco se sabe sobre o tempo de ciclagem da biomassa microbiana, mas as
estimativas variam de alguns meses (Smith & Paul, 1990) a at dois anos (Jenkinson & Ladcl, 1981).
Se for assumido que esse tempo de um ano e que a Terra um sistema estvel, a contribuio da
decomposio dos tecidos microbianos no CO
l
atmosflico global de cerca de 65 ppm (se 1 Ot =
0,47 ppm), ou 2,2 % dos nveis globais de c-cal' lsso sugere que a biomassa microbiana tem uma
contribuio razovel nas entradas de CO
2
atmosflico, sendo aproximadamente igual a 50% do CO
2
209
proveniente da decomposio mundial (SQlith & Paul, 1990). Deve-se salientar, ainda, que os outros
50% esto tambm relacionados com a atividade microbiana, embora no entrem diretamente na for-
mao da biomassa, mas que so gerados pela ineficincia microbiana durante a sntese e manuteno
dos microrganismos.
6.7. Significado das Estimativas da Biomassa Microbiana
Enquanto a biomassa microbiana fornece uma indicao da quantidade de nutrientes imobili-
zados nos compartimentos lbeis da matria orgnica do solo, as avaliaes da biomassa, sem a asso-
ciao a outros dados, no informam sobre a atividade biolgica dos solos, decomposio ou ciclagem
de nutrientes (Jenkinson, 1988). As avaliaes da biomassa microbiana so mais teis, portanto, quan-
do combinadas com outros componentes do solo, como nos estudos sobre interao trfica (Andren et
aI., .1990), ecossistemas (Flanagan & van Cleve, 1983), atividade do solo (N ordgren, 1992), produtivi-
dade primlia (.Jenkinson et aI., 1992) ou em conjunto com outras avaliaes sobre estresses e altera-
es ecolgicas. Informaes teis tambm podem ser obtidas pela avaliao da biomassa microbiana
em diferentes pocas do ano, desde que essa um indicativo dos fluxos de nutrientes que podem
ocorrer, e como eles interagem com o crescimento das plantas. Como exemplo, Singh et aI. (1989)
encontraram que, em florestas tropicais secas, o declnio na liberao de nutrientes devido s varia-
es sazonais coincidiu com o perodo em que a absoro de nutlientes pelas plantas era mxima.
Resultados semelhantes foram encontrados no Brasil, conforme discutido anteriormente (Figura 6.6).
H evidncias, tambm, de que somente parte da biomassa microbiana ativa (van de Werf & Verstraete,
1987).
Como cbncluso, pode-se dizer que a biomassa microbiana varia consideravelmente em ter-
mos temporais e espaciais, determinados por fatores abiticos e biticos. O desafio para o futuro ser
determinar as conseqncias diretas dessas variaes nos ecossistemas e na produtividade dos siste-
mas aglcolas auto-sustentveis.
6.8. Referncias Bibliogrficas
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CAPTULO 7
BIODEGRADAO DE XENOBIONTES: POTENCIALIDADES E LIMITES
Tomaz Langenbach
l
7.1. Importncia da Biodegradao
Produtos qumicos chamados xenobiontes, que no existiam na natureza, so utilizados atual-
mente em quase todas as atividades humanas. A introduo destes produtos permitiu o controle de
pragas, a utilizao de embalagens de plstico, o uso de eletricidade mediada por transformadores
com bifenil-policlorados (PCB), o uso de detergentes e muitos outros exemplos que podeliam ser
citados. Apesar do emprego destas substncias trazer, indubitavelmente, grandes vantagens, tambm
criou problemas novos, dentre os quais o da eliminao aps seu uso, pois muitos destes produtos
persistem por longo perodo de tempo, acumulando-se no ambiente. No incio, no existia uma preo-
cupao com esta questo mas, pouco a pouco, foram surgindo problemas que exigiam um cuidado
especfico com a degradao destes compostos. Todas as substncias qumicas existentes na natureza
so biodegradveis, no se acumulando no ambiente, pois h sistemas enzimticos capazes de degrad-
las entre as plantas, os animais e os microrganismos. Conseqentemente, muitos dos produtos qumi-
cos introduzidos no ambiente so biodegradveis por ao de enzimas previamente existentes na na-
tureza. Outros produtos, porm, no so sujeitos ao destas enzimas e persistem e podem acumu-
lar-se gradativamente no ambiente.
Em ecotoxicologia, importante distinguir toxicidade e persistncia, sendo esta ltima conse-
qncia de uma maior ou menor biodegradabilidade. A toxicidade o efeito deletrio a algumas
formas de vida, enquanto o termo persistncia significa a degradabilidade de uma substncia (Deelen,
1989). O acmulo gradativo de produtos pode implicar em um efeito retardado, muitas vezes
imprevisvel, de difcil reverso. O plstico no txico, mas persistente. Os pesticidas
organofosforados so muito txicos, mas facilmente biodegradveis.
O acmulo de certas substncias concentra-se sobretudo na matria orgnica do solo e sedi-
mentos e tambm em plantas, algas e animais (lAEA, 1980; Frehse, 1991). Este acmulo de produtos
pode acarretar desde a reduo at a extino de populaes de animais ou, muito freqentemente,
favorecer o aparecimento de mutantes resistentes a estes produtos. Esta ltima situao explica por-
que muitos inseticidas, funf,'cidas e bactericidas, dentre outros, perderam a eficcia. A bioconcentrao
a capacidade de uma forma de vida incorporar certos produtos em uma concentrao muito superor
quela do ambiente, seja gua ou solo. A biomagnificao ocorre quando este acmulo ganha dimen-
so maior, passando pela cadeia alimentar e atingindo, muitas vezes, o homem. Em peixes, por exem-
plo, foi encontrado que o DDT foi biomaf,'Ilificado em at 60.000 vezes em relao concentrao na
gua (Connell, 1990). A presena destes produtos no solo permite a absoro pela planta, podendo
acumular-se nas razes ou, por translocao, atingir outras partes do vegetal.
I Professor, Ph.D., Universidnde Fedeml do Rio de Janeiro (UFIU), Instituto de Microbiologia, Cidade Universitria, CCS, Bloco 1, CEP 21944-970,
Rio de Janeiro. lU.
218
Quando comparados s toxinas naturais, os pesticidas utilizados amplamente na agricultura
tm seu efeito txico agravado por serem pouco especficos, necessitando da aplicao de concentra-
es relativamente altas e ocasionando uma acumulao maior. A pouca especificidade permite, ain-
da, sua atuao sobre formas de vida que no so o seu alvo. Como exemplo, os pesticidas podem
promover a eliminao dos inimigos naturais das pragas, o que pode acarretar no recrudescimento de
uma praga. Como resultado, o nmero de pragas vem aumentando.
A gravidade dos problemas decorrentes do uso de substncias no-biodegradveis maior do
que muitas de suas vantagens, por isso, o seu uso foi-se restringindo gradativamente. A nica forma
de controlar o uso de substncias no-biodegradveis, como os pesticidas ou os detergentes, que se
distribuem sobre amplas regies, atravs da restrio de seu uso. Isto sempre um processo muito
difcil, pois o conflito de interesses entre a preservao ambiental e a produo impede, muitas vezes,
a retirada do uso de certas substncias de circulao, particularmente nos pases do terceiro mundo.
A eliminao de produtos persistentes, oriundos de processos industriais, concentrados em
depsitos de lixo qumico, ou que se acumularam em decorrncia de acidentes, ocorre por meio de
tratamentos especficos, que podem ser de queima ou microbiolgicos. A comparao quanto
eficincia e custos essencial para a escolha do tratamento mais indicado para cada situao.
A queima um processo que, para ser satisfatrio, requer uma combusto completa que evite
a formao de compostos organoclorados de alta toxicidade. Geralmente, a queima de lixo feita a
temperaturas abaixo de 1300 C, o que pelmite a formao contnua de dioxinas, consideradas entre as
substncias mais txicas conhecidas. O acidente de Seveso, na Itlia, em meados da dcada de 70,
um exemplo da toxicidade da dioxina. A queima adequada deve garantir no s uma temperatura
acima de 1300"C, como manter condies constantes de combusto em todas as partes do forno, o que
bastante complexo. Com isto, a instalao e operao destes fornos torna-se to onerosa que, no
Brasil, pouqussimos equipamentos deste tipo esto em atividade. Contudo, importante ressaltar
que, quando adequadamente utilizado, este mtodo permite eliminar substncias txicas em casos nos
quais a biodegradao encontra os seus limites. H outros mtodos de eficincia menos comprovada,
como os fotossensibilizadores ou a utilizao direta de radiao ultravioleta, muitos deles em fase
experimental.
A biodegradao microbiana tem enormes vantagens. Em primeiro lugar, como os
microrganimos esto presentes em todos os ambientes, o processo pode ser realizado no prprio local.
impossvel incinerar-se um solo de milhes de hectares contaminados com pesticidas, mas a
biodegradao est em curso em todos estes hectares. Em segundo lugar, um processo que permite
grande desenvolvimento: 1- pela seleo de mutantes capazes de degradao mais eficiente; 2- pela
engenharia gentica, que permite a transferncia de genes responsveis pelas enzimas de degradao
a microrganismos j ambientados no local; 3- pela versatilidade nas estaes de tratamento; e 4- me-
diante a potencializao da biodegradao pelos microrganismos j existentes na rea poluda, atravs
de um procedimento chamado biorremediao. Finalmente, seus custos so muito mais baixos do que
aqueles do processo de incinerao e, por isso, a biodegradao, s vezes, se torna o nico mtodo
vivel. Se estes aspectos deixam clara a importncia da biodegradao, sua eficincia no cobre todas
as situaes, motivo pelo qual a persistncia de determinadas substncias por longos perodos ocorre,
freqentemente, no ambiente. Este tema discutido no ltimo item deste captulo.
219
7.2. A Importncia dos Microrganismos na Biodegradao
A primeira questo a ser colocada : at que ponto os microrganimos so vtimas destas subs-
tncias que, com freqncia, so txicas para animais e plantas? Muitos pesticidas afetam apenas as
vias metablicas de animais e plantas, que so diferentes das dos microrganismos, e por isto no os
atingem (Hassall, 1990). Exemplo disso so os inseticidas que atuam no sistema nervoso, interferindo
com a acetilcolinesterase. Freqentemente, estes produtos funcionam como fonte de carbono, nitro-
gnio ou enxofre, beneficiando o crescimento microbiano. Por outro lado, alguns produtos atuam
sobre o crescimento e a sobrevivncia de populaes microbianas. Aps exaustivas pesquisas, con-
cluiu-se que os pesticidas no solo, em geral, no tm efeitos maiores e mais duradouros sobre os
microrganismos, quando utilizados dentro das recomendaes (Sommerwille & Greaves, 1987). Ao
contrrio, sabe-se hoje que os microrganismos no so vtimas, pelo contrrio, so importantes justa-
mente pelo seu enorme potencial de biodegradao. Evidentemente, isto no inclui produtos
antimicrobianos, como os bactericidas ou os fungicidas, cuja finalidade precisamente atuar sobre
determinados microrganismos. efeito destes produtos no elimina todas as bactrias ou fungos e,
geralmente, revertido no tempo.
Por que os microrganismos tm uma importncia relativamente maior na biodegradao do
que plantas e animais. A importncia da capacidade de biodegradao de animais e plantas inegvel,
mas suas potencialidades so menores do que aquelas oferecidas pelos microrganismos. A degrada-
o dos pesticidas no ambiente tropical determinada, sobretudo, pela ao microbiana e pela radia-
o solar.
Nos animais, nas plantas e nos microrganismos, o metabolismo e o destino dos xenobiontes
guardam diferenas importantes. Nos animais superiores, o metabolismo possibilita a converso dos
xenobiontes em molculas polares de fcil excreo (Dorough & Ballard, 1982) Estas reaes ocor-
rem em rgos especializados, como o fgado, atravs da funo das oxidases mistas, como a famlia
dos citocromos P-450. Nas plantas no h rgos de excreo. Observa-se, freqentemente, a forma-
o de conjugados solveis ou insolveis, que ficam imobilizados em determinados tecidos por longo
tempo ou se destacam da planta por senescncia (Shimabukuro et aI., 1982). Quanto aos microrganis-
mos, muitos xenobiontes so utilizados como fonte de carbono e, portanto, de energia (Matsumura,
1982). Freqentemente, a comunidade microbiana degrada xenobiontes at o CO
2
. Nestes casos, o
processo chamado de mineralizao e constitui a nica forma de garantir uma degradao total da
substncia. J a completa oxidao de um pesticida a CO
2
no significante na planta.
Os microrganismos so encontrados em todos os ambientes, desde o solo superficial at cama-
das a centenas de metros de profundidade, em regies midas ou desrticas, em gua doce ou salgada
de qualquer profundidade, no ar, em ambientes domsticos ou industriais, em altas ou baixas tempera-
turas e em ambientes poludos ou no. Assim, a biodegradao pode ocorrer em toda esta gama de
ambientes. Animais e plantas sobrevivem em ambientes muito mais restritos. Os microrganismos
tm vias metablicas muito diversificadas, al.l;,'1lIl1as inexistentes em animais e plantas, como a fer-
mentao, alguns tipos de metabolismo anaerbio, metabolismo quimioautotrfico e o metabolismo
atravs de isoenzimas.
A adaptabilidade dos microrganimos enorme. Cada gerao ocorre, geralmente, num curto
perodo de tempo, de at 30 minutos, garantindo, desta forma, uma alta probabilidade de aparecimen-
220
to de mutantes. Para se ter uma idia, considerando o tempo de gerao de 30 minutos chega-se, a
partir de uma clula, a aproximadamente um milho de clulas, em nove horas e trinta minutos e a um
bilho de clulas em 15h. O aparecimento de um mutante resistente penicilina ocorre na proporo
de um para cada 10 milhes de clulas. interessante notar que, quando o ambiente muito adverso,
parece que a taxa de mutagenicidade aumenta entre os microrganismos. Sob intenso estresse, os
microrganismos no tm mais a possibilidade de atender grande demanda energtica para realizar o
reparo de seu DNA, persistindo todos os tipos de defeitos genticos, o que aumenta a taxa de mutao.
Conseqentemente, a probabilidade de aparecimento de um mutante adaptado quelas condies ini-
cialmente adversas maior e, com isto, as possibilidades de sobrevivncia da populao aumentam
(Koch, 1993). Outra grande vantagem deste crescimento a de formar, em pouco tempo, grandes
biomassas, muito superiores quelas formadas por animais ou plantas no mesmo perodo.
7.3. Processos Metablicos
Nesta seo, os processos de biodegradao microbiolgica so prorizados, fazendo-se algu-
mas referncias a animais e plantas.
7.3.1. Tipos de metabolismos
So destacadas, aqui, algumas modalidades metablicas pelas quais os microrganismos podem
degradar um xenobionte. A biodegradao pode ocorrer pela ao enzimtica. Neste caso, distinguim-
se os seguintes metabolismos:
Incidental - ocorre quando as enzimas de degradao fazem parte do metabolismo celular, sem que
o xenobionte tenha importncia como fonte de carbono.
Cometabolismo - ocorre pela induo enzimtica por substncias anlogas, como, por exemplo, o
uso de bifenilas corno substrato, para cuja degradao so induzidas enzimas capazes de degradar
PCR Neste caso, as enzimas no discriminam o substrato do xenobionte; o metabolismo, porm,
no completo e, portanto, no permite que esta substncia funcione como fonte de energia para o
crescimento .
Catabolismo - quando o xenobionte utilizado como fonte de energia; sendo necessrias, neste
caso, concentraes maiores da substncia para garantir o crescimento microbiano.
7.3.2. Produtos do metabolismo microbiano na degradao de xenobiontes
A degradao de xenobiontes tambm pode ser feita por substncias liberadas pelos microrga-
nismos no ambiente.
7.3.2.1. pH
A fcil degradao de certos xenobiontes bem conhecida em determinada faixa de pH. Ob-
servaes in vitro mostram que os microrganismos tm grande influncia no pH, podendo alcaliniz-
lo, quando o meio rico em protenas, ou acidific-lo na presena de carboidratos.
7.3.2.2. Fotossensibilizadores
Sabe-se que alguns fotossensibilizadores so capazes de degradar xenobiontes. Os microrga-
nismos podem liberar para o meio substncias que promovem as fotorreaes. Um dos mecanismos
221
consiste em captao da energia luminosa pelo fotossensibilizador e sua transmisso direta para a
molcula do xenobionte. Segundo outro mecanismo, estas substncias fotossensibilizadoras funcio-
nam como receptores ou doadores de eltrons e/ou como grupos reativos, como o H+ ou OH-, que
promovem, por sua vez, a transformao do xenobionte. A ferredoxina e as flavoprotenas das algas
so fotossensibilizadores moi ecul armente bastante estveis, que permitem um tempo de sobrevivn-
cia, aps a morte celular das algas, capaz de promover a degradao de pesticidas.
7.3.2.3. Cofatores
Os cofatores, como a porfirina, tm origem microbiana e so liberados no ambiente, tornando-
se capazes de promover reaes no-enzimticas de declorinao do DDT e DTE. possvel que
substncias como glutation, citocromos, NADH, entre outras, tambm sejam fatores de degradao de
xenobiontes no ambiente.
7.3.3. Reaes
7.3.3.1. Hidrlise
A hidrlise qumica ou enzimtica uma das reaes mais importantes, correspondendo
adio de uma molcula de gua ao xenobionte, transformando-o, muitas vezes, em substncia no-
txica. Uma das razes da alta freqncia com que estas reaes ocorrem , provavelmente, a excreo
de enzimas hidrolticas pelo microrganismo, as chamadas exoenzimas. Elas hidrolisam molculas
grandes, miando ouh'as menores, que podem, com isto, ser transportadas para o interior celular.
Exoenzimas so encontradas em ambientes terrestres e aquticos. Scheunert (1992) destaca como
exemplos deste tipo de reaes a hidrlise da ligao ster dos inseticidas organofosforados e a de!,'Ta-
dao dos carbamatos e dos piretrides (Tabela 7.1). Reaes de hidrlise ocorrem tanto em animais
como em plantas.
7.3.3.2. Reduo
Uma das reaes mais comuns de reduo a de dehalogenao, cuja importncia se deve,
sobretudo, ao fato de ser condio para reaes subseqentes de degradao da mesma molcula
(Tabela 7.2) (Schneurt, 1992). Uma das possibilidades que esta reao ocorra em condies anaerbias
promovidas enzimaticamente pelo FADH, situado na membrana de E. t.:oli, transformando o DDT em
TDE. Ouh'o sistema de reduo, acoplado oxidao mista atravs do citocromo P-450, encontrado
em alguns microrganismos (Figura 7.1) (Matsumura, 1982). Este sistema s funciona em condies
anaerbias. Por fim, reaes no-enzimticas, envolvendo cofatores de flavoproteinas, como o FAD,
FMN ou ribofIavina resistentes a proteases e ao calor, tambm podem promover reaes de reduo
(Figura 7.2). Reaes de reduo de pesticidas tambm so enconh'adas em plantas. No ambiente, o
potencial de oxidorreduo um fator importante a ser considerado. A degradao de determinados
organoclorados, como beta e gama HCH (Iindane), est relacionada a um potencial redox entre -40 e
-100 m V, encontrado durante alguns dias aps inundao. Esta condio anaerbia estimula a prolife-
rao de C/ostrliulIl sp. e a atividade de ouh'os anaerbios eficazes na biodegradao.
222
Tabela 7.1. Transformaes dos pesticidas no solo por hidrlise enzimtica.
Hidrlise de
ster carboxlico
ster de sulfato
Carbamatos
Nitrilos
Epxidos
Declorinao
Frmulas
R - COOR' -t R -COOH
o
11
R-CH
2
-O -S-OH -t
II
O
O
II
R- CH
2
0H e/ou HO - S - OH
R-NH-C-R'-t
11
O
11
O
R- NH
2
e/ou HOOClt
R-C=N -tR-C
"".0
"NH
-tR- CO OH
I I
-C-C--t-C-C-
\/
I I
O OHOH
- C - CI-t - C - OH
I I
2
Exemplos
Malation, Kelevan
Disul
Benomil, Carbaril
cido Nitrilo 2,4-
Diclorobenzico,
Cipermetrin
Dieudrin
Tricloroacetato,
cido 4-Cloroben.zico
223
Tabela 7.2. Transformao dos pesticidas no solo por oxidao enzimtica.
Reaes
C-Idroxilao
C-Carboxilao
Metiloxidao
Epoxidao
Formao de cetana
Clivagem
Clivagem
C-dehidrogenase
N-demetilao
N-oxidao
S-oxidao
Substituio de S por O
Clivagem de ter
Frmulas
R-H-+R-OH
R- CH, - R: -+ R-CHOH- R'
R-CH, -OH-+R-COOH
R- CH
J
-+ R-CH,OH
/0,
R-C C - R-+ R-C - C-R
I I I I
H H H H
R - CH, - R' -) R- CO - R:
R -CHOH- R: -+ R-CO- R'

R - COOH + HOOC - K
R- C - R' -+ RCOOH
II
O
R- CHCI- CHCI - R'-+
R - CCI CC! - R'
R- N-R' -+ [R- N - R]
I I
CH] CH,OH
-+R-NH-R' -
R- NH, - R--NH
R- NH,-+ R- NO
-+R-NO,
R - NH, + H,N - R'


I
O
R - S - R' -> R - SO - K
-+R- SO,-R'
R - SH + HS - R' ->
R-S-S-R'
/OR /OR
(RO), P -+ (RO), P
- -
R-O-R-+ROH
Exemplos
Cipennetrin,
2,4-dicIorotlmol,
Carbofuran
Metabolito de Cipennetrina
Bromacil
Aldrin, heptacIor
Carbofuran
Aldrin, anili)}j:s clorilladas
Kelevan
Lindane
Feniluria
Anilinas clorinadas
Aldicarb, carboxin
Paration
Etileno, uria
2,4-D
224
substrato para
..-
,
"
- ------..... (oxidao (5)
r--L-J
: Ox. P
450
: r- --1 r-'"
'T---" lOx. P
450
r, ---:: 5 :
I L----f! L_J
I \
I aerbia \'---,
o,: I Red. P4SO! NADPH
+\ inibio por co-j redutase.
\ \substrato para
CI-\ anaerbia I Red. P
4501
reduo
(R-CI)
R-
Figura 7.1. Via metablica proposta para a reduo do pesticida pela funo das
oxidases mistas em condies anaerbias.
pesticida
produto
reduzido
flavina
flavina
oxidada
flavoprotena- H
condio
anaerbica
Figura 7.2. Degradao do pesticida pelo sistema de cofator flavina-flavoprotena.
7.3.3.3. Oxidao
Muitas reaes de oxidao so conhecidas, como: a epoxidao dos ciclodienos; a oxidao
dos tiosteres a sulfxidos e a sulfonas; a dealquilao oxidativa de alquilaminas; a abertura de anel
aromtico, como o 2,4-D; e a decarboxilao (Tabela 7.3) (Schneurt, 1992). importante salientar
que as reaes de abertura do anel aromtico s foram observadas em microrganismos. Estas reaes
se do ah'avs de hidroxilao e incluem reaes de epoxidao. Podem ocorrer na presena de cloro
na molcula, e quanto maior o nmero de tomos de cloro, menor a biodegradabilidade. Por isso, os
PCBs com maior nmero de tomos de cloro tm biodegradao lenta e difcil, quando comparados
aos PCBs com pouco cloro.
225
Tabela 7.3. Transformao dos pesticidas no solo por reduo enzimtica.
Reao de reduo
C=C
CS"C
Grupo N0
2
Grupo sulfoxido
Clivagem S-S
Declorinao
Debrominao
Eliminao de N0
2
Frmula
R - CH = CH - R' -7
R - CH
2
- CH
2
- R'
R-CsC-R'-7
R - CH = CH - R: .
R- NO -7 R-NH
2 . 2
R - S - S - R' -7 R - SH
R-C1-7R-H
R-Br -7 R-H
R-NO -7 R-H
2
Exemplos
DDMU (metabolito do DDT)
Buturon
Paration, Fenitrotion
Sulfxido de forato
Tiram
DDT, cic1odienos, benzenos e
fenis c1orinados
1,2-Dibromo-3-cloropropano
Pentacloronitrobenzeno
Observaes em mutantes deficientes em dihidroxibenzoato dehidrogenase evidenciaram que
estas enzimas so importantes na declorinao de compostos haloaromticos. Parece que a declorinao
tambm pode ser feita pela participao do oxignio molecular na presena de uma dehidroxilase.
Muitas das reaes de oxidao ocorrem em microrganismos, plantas e animais por intermdio
das oxidases mistas com a participao do citocromo P-450, embora por meio de um processo meta-
blico diferente das reaes de reduo.
7.3.3.4. Conjugao
Na conjugao, o xenobionte reage com subsh'atos endgenos, como carboidratos, aminocidos
ou glutation, formando compostos com peso molecular maior. As molculas adquirem, assim, maior
polaridade e se tornam mais hidroflicas, o que possibilita sua eliminao. A declorinao de substn-
cias organocloradas pelo glutation, glicose-cistina-glicina (Figura 7.3), uma reao particularmente
importante em plantas e, em menor importncia, em animais. Esta conjugao mediada pela enzima
glutation-S-transferase que, no caso do HyplwlIlicrobiulIl sp .. mostrou baixa especificidade, sendo
considerada uma reao fortuita (Hardman, 1991).
CI


R,HN N NHRz

atrazina

226
HS-CHz-CH-COOH
I
NH


R,HN N NHRz
z lsorgo

HOOC- CH-CH -S-C'L-CH-COOH
z . "21
NH
produtos solveis
----.. e insolveis


R,HN N NHRz
Figura 7.3. Metabolismo da atrazina por conjugao com glutation.
7.3.3.5. Isomerizao
So reaes promovidas pelos microrganismos, em que a frmula primria se mantm mas a
conformao molecular fica alterada. A transformao do gama HCH em alfa HCH, que reduz forte-
mente o grau de toxicidade, citada como exemplo.
7.3.4. Diversidade metablica e biodiversidade microbiana
A biossntese de molculas corno aminocidos apresenta uma via metablica com poucas vari-
aes. As reaes de catabolismo, ao contrrio, possuem diversas vias metablicas para um mesmo
produto, em diferentes microrganismos (Clarke, 1984). s vezes, algumas vias metablicas distintas
podem ser encontradas num mesmo microrganismo para um mesmo produto. H urna velha teoria,
formulada por Kluyver, que sugere que os microrganismos tm enzimas degradativas com baixa
especificidade a diferentes substr'atos, de forma que a mesma enzima pode degradar muitos compos-
tos diferentes. Embora se saiba que isto uma extrema simplificao, a ambigidade de muitas
enzimas catalticas, em relao a substratos, de considervel importncia. Muitas enzimas, como as
decarboxilases e as isomerases, guardam grande semelhana nas seqncias de aminocidos, sugerin-
do a duplicao e a divergncia a partir de um gene comun ancestral.
Para que se entenda a variao das vias catablicas preciso considerar a biodiversidade
microbiana, entendida corno a relao entre a diversidade dos microrganismos e o tamanho relativo de
suas populaes. Poucos microrganismos so capazes de biodegradar completamente uma substncia
e os xenobiontes, geralmente, so degradados por um consrcio de muitos microrganismos (Slater &
Lovat, 1984). No entanto, muito importante estudar separadamente a participao de cada microrga-
nismo no processo de degradao. O teor de matria orgnica no solo aumenta a biomassa microbiana
227
e a biodiversidade e, por conseguinte, influi sobre a biodegradao de um produto. Em solos tropicais,
a incorporao de matria orgnica ao solo aumenta a atividade microbiana e, conseqentemente,
acelera a degradao de muitos pesticidas.
Em ambientes naturais existe, geralmente, uma baixa disponibilidade de nutrientes, o que res-
tringe o crescimento de determinadas populaes e aumenta o nmero de clulas mortas, que se rom-
pem e liberam metablitos, inclusive macromolculas como o DNA. Por isso, a passagem deste DNA
para outras clulas, num processo denominado transformao, ganha importncia na natureza. A
conjugao, que permite a transferncia de material gentico plasmidial, um mecanismo significati-
vo da flexibilidade gentica. Desta maneira, o potencial gentico pode ser intercambiado entre esp-
cies bastante distantes de microrganisos e, assim, promover a evoluo de novas vias metablicas
(Boyle, 1993). Recentemente, a importncia destes processos foi confirmada em estudos que utiliza-
ram microrganismos geneticamente engenheirados ("genetic engineered microorganism" - GEMS),
cujos genes introduzidos puderam ser rastreados no solo e identificados em diferentes microrganimos.
A biodegradao de um pesticida no solo pode ser induzida pela aplicao de um produto que,
inicialmente, leva um tempo maior para sua degradao. A aplicao repetida do mesmo produto
reduz o tempo de adaptao do microrganismo, aumentando a velocidade de biodegradao. Em
solos nos quais os microrganismos esto bem adaptados a determinados pesticidas, a biodegradao
destes to grande que compromete a eficincia de seu emprego (Racke & Coats, 1990).
7.4. Mtodos Qumicos para a Caracterizao da Biodegradao
7.4.1. Mtodos in especficos
Inicialmente so apresentados, de forma sumria, os mtodos no-especficos de quantificao
da biodegradao (Zitko, 1984). Estes dados so requeridos, com freqncia, pela legislao para
caracterizar se um produto biodegradvel. Nestes casos, solues com determinada concentrao da
substncia em teste so inoculadas e incubadas por determinado tempo, avaliando-se o desapareci-
mento da substncia. Os mtodos utilizados para isto so comparativos. A biodegradao pode ser
medida de vrias formas, conforme detalhado nos subi tens seguintes.
7.4.1.1. Produo de CO
2
A degradao completa de um produto leva formao de CO
2
, que captado por substncias
qumicas contendo NaOH. Aps a incubao, a soda restante titulada e, com isto, pode-se determi-
nar a quantidade de CO
2
produzida. clculo estequiomtrico permite a quantificao da substncia
degradada. Antes da incubao preciso ter o cuidado de eliminar o CO
2
do ar no frasco. Este sistema
pode funcionar em frasco fechado, ou por passagem continua de ar, com a eliminao prvia do CO
2
(Figura 7.4). Este mtodo pode ser utilizado com o produto marcado com 14C, o que pelwite separar
o CO
2
proveniente da substncia em estudo do CO
2
produzido pelo inculo ou nutriente adicionado ao
meio. A avaliao da produo muito utilizada para estudos de biodegradao de materiais de
limpeza, desinfetantes e tambm para estudos de biodegradao da matria orgnica do solo.
228
ar
o
o
o
o o
o
o
o
KOH
Figura 7.4. Aparelho para detenninar a decomposio de produtos orgnicos no solo.
7.4.1.2. Demanda bioqumica de oxignio (DBO)
um mtodo semelhante ao desClito anteriormente. A diferena que ao invs de quantificar
a biodegradao pelo CO
2
produzido, neste mtodo mede-se o oxignio liberado. muito utilizado
para caracterizar ambientes poludos, mas este mtodo funciona somente em solues relativamente
concentradas de substncia, na faixa entre 10 e 100 mg . L-I.
7.4.1.3. Demanda qumica de oxignio (DQO)
Neste mtodo, a amostra incubada, como anteriormente descrito, e a matria orgnica res-
tante dosada com dicromato de potssio em 50% de cido sulfrico, com a presena de sulfato de
cobre como catalizador. Como a quantidade inicial da substncia conhecida, ao subtrair-se a quanti-
dade residual tem-se a biodegradao.
7.4.1.4. Carbono orgnico dissolvido (COD)
A lgica deste mtodo idntica do DQO, exceto que a matria orgnica convertida em
CO
2
ou metano, e avaliada por cromatografia gasosa ou espectrofotometria de infravermelho. Este
mtodo, assim como o DQO, pode ser utilizado em concentraes menores do substrato.
7.4.2. Mtodos especficos
Os mtodos especficos so utilizados, geralmente, em estudos mais refinados, que exigem a
quantificao e identificao do produto inicial, chamado resduo, e dos transformados, chamados
229
metablitos. Para isto, necessrio um processo de extrao destas substncias do solo, utilizando
solventes orgnicos, para purific-Ias em seguida, finalizando com a anlise. No h uma metodologia
universalmente aceita e padronizada para a extrao de pesticidas do solo, de forma que se encontra
uma certa variao metodolgica nos diferentes trabalhos, correspondendo a eficincias tambm vari-
adas. Quanto etapa da purificao, fica-se no dilema de aprimor-Ia, perdendo-se eficincia, ou
garantir a alta recuperao com amostras pouco purificadas. Alm dos mtodos analticos de separa-
o e quantificao citados a seguir, pode-se usar o espectro fotmetro, o espectro fotmetro de
fluorescncia e o infravermelho.
7.4.2.1. Cromatogl'afia de camada fina (TLC)
A separao do produto, neste processo, feita sobre uma placa coberta com slica, o que
corresponde fase estacionria. Em seguida, aplica-se a amostra, utilizando-se um eluente para a
corrida, o que configura a fase mvel do processo. O eluente geralmente composto de uma mistura
de solventes adequados para a substncia a ser analisada, indicados por manuais. A identificao corre
por conta da mobilidade relativa (Ri) dos padres das substncias a serem analisadas e a revelao
pode ser feita por ultravioleta, vapor de iodo metlico ou outras substncias especficas para cada tipo
de molcula. Quando a revelao feita por mtodos no-destrutivos, o local onde se encontra a
substncia pode ser raspado da placa, eludo e quantificado. A desvantagem, em relao aos mtodos
de cromatografia lquida (HPLC) ou cromatografia gasosa, a resoluo mais baixa, permitindo,
muitas vezes, uma certa mistura entre as diferentes substncias.
7.4.2.2. Cromatografia lquida de alta presso (HPLC)
Este tipo de cromatografia tem excelente resoluo em anlises de substncias com polarida-
des distintas. A degradao de um resduo resulta, geralmente, em metablitos mais polares e, por
isto, mais hidroflicos. As colunas nonnalmente empregadas para este fim so as de fase reversa. O
detector mais utilizado o de ultravioleta, mas conta-se, atualmente, com os de infravermelho e radi-
oatividade.
7.4.2.3. Cromatografia gasosa (CG)
utilizada para a anlise de molculas apoIares, mas tem uso verstil para outras
_ "",. "",,,,- ,.UI!
subtncias. Muitos pesticidas podem ser analisados pelo HPLC ou pelo CG. Geralmente, um dos
mtodos vantajoso para um determinado caso e, por isto, recomenda-se que um bom laboratrio de
anlise de resduos disponha de ambos os equipamentos. A cromatografia gasosa permite o uso de
uma grande variedade de detectores, como o de ionizao de chama (FID), mais comumente utilizado,
o de captura de eltrons (ECD), ideal para a anlise de organoclorados, e um detector especfico para
nitr'ognio e fsforo (NPD). O espectrmetro de. massa (MS) normalmente acoplado a um
cromatgrafo gasoso. O CG-MS um equipamento caro, que pennite uma tima identificao da
substncia correspondente a cada pico do cromatograma.
7.5. Onde ocolTe a biodegradao
Como j citado no incio deste capitulo, a biodegradao est presente em todos os ambientes.
Contudo, nos itens subseqentes so descritos sucintamente apenas os processos que envolvem o solo
o
230
como ambiente de grande potencialidade na degradao dos xenobiontes. A biodegradao um
recurso utilizado em diversas situaes, tais como aterros sanitrios e estaes de tratamento de guas
domsticas e efluentes industriais, constituindo um tema amplo cuja abordagem foge ao objetivo deste
trabalho (Fuller et aI., 1985).
7.5.1. A biodegradao dos pesticidas em solos agrcolas
A aplicao repetida de pesticidas no solo no poderia ser feita se no houvesse biodegradao.
No estudo da biodegradao, tem-se que discriminar o desaparecimento do produto aplicado e a
biodegradao propriamente dita. Os pesticidas aplicados no solo podem sofrer volatilizao, lixiviao
e adsoro forte aos colides do solo, desaparecendo, assim, das anlises qumicas do feitas
por extrao com solvente orgnico, sem que isto possa ser interpretado como biodegradab (Figura
,
7.5) (Jury et aI., 1987; Wolf et aI., 1988). essencial fazer estudos com o pesticida marcado, geral-
mente cOID'carbono-14, utilizando microcosmos adequados, que permitam acompanhar os
destinos dos pesticidas e seus metablitos e efetuar um balano completo de massa 7.6)
(Scheunert, 1992; Schroll et aI., 1992). .
entrada dos pesticidas no solo
'd
nao a sorvI o
desoro----__

res(duos
ligados
VOlatilizao-----+--_degradao
lixiviaao adsoro em
organismos vivos
Figura 7.5. Distribuio e degradao dos pesticidas no solo.
Aplicao do
pesticida
Entrada
de ar ~ i li
Entrada
de gua
Microcosmo
Armadilha qu(mica para
captao
Volteis orgnicos C02
Lixiviado
Rotmetro
Filtro de carvo
Bom ba de vcuo
Figura 7.6 Esquema da montagem experimental para estudo da distribuio dos pesticidas s o l o ~
Bomba
t:l
232
Como j foi dito, a biodegradao a transformao do pesticida em outros produtos chama-
dos metablitos que, por sua vez, podem se degradar novamente, em 'um processo que culmina na
mineralizao, isto , na liberao de CO
2
. Em experimentos de balano de massa, o CO
2
marcado
captado em armadilhas qumicas e a radioatividade quantificada por cintilao lquida. A
biodegradao , portanto, a soma da quantidade dos metablitos quantidade de pesticidas
mineralizados. Quando a taxa de mineralizao baixa no h uma degradao completa, embora,
freqentemente, o produto tenha se transformado em um metablito recalcitrante, que pode ser txico
s plantas ou aos microrganismos. A anlise destes metablitos no simples e s pode ser feita
corretamente se o processo. analtico for adequado para esta finalidade. Geralmente, o que se mede
o resduo do pesticida.
Quando a quantidade de radioatividade no-passvel de extrao por solvente orgnico e, por-
tanto, fortementeadsorvida no solo, grande, a lixiviao de contaminantes para o lenol d'gua e a
biodegradao so pequenas. A forma qumica em que se encontra o material radioativo, assim
adsorvido n.o solo, no conhecida. Neste caso, as anlises so dificultadas por no permitirem
identificar os compostos ligados matria orgnica ou argila do solo (Kahn, 1978). A presena de
resduos e/ou metablitos fitotxicos no solo constitui motivo de preocupao, pois eles podem ser
absorvidos pelas plantas ao longo do tempo, acarretando a contaminao dos alimentos (Fuhr, 1987).
7.5.2. Biorremediao e descontaminao do subsolo poludo
A biorremediao constitui um conjunto de tcnicas que permitem aumentar a biomassa
microbiana do solo, estimulando a biodegradao de xenobiontes (Bouwer, 1993). Assim, reas con-
tendo xenobiontes recalcitrantes podem ser descontaminadas. Como j foi dito, o subsolo tem popula-
o microbiana, principalmente bacteriana, na concentrao de 10
6
a 10
7
de clulas.mg-
I
solo seco.
So encontrados fungos apenas na camada superficial, de at 1,5m. medida que a profundidade do
solo aumenta, passa-se da regio insaturada de b'lla, chamada vadose, para a saturada, onde a gua
subterrnea est em movimento. Ao longo deste eixo da superfcie para as camadas mais profundas
atravessa-se, inicialmente, uma regio aerbia para, em seguida, encontrar-se uma regio anaerbia
(Figura 7.7). Com isto, o potencial redox diminui de eletronegatividade, que passa de positiva para
negativa. H, evidentemente, uma mudana na populao de microrganismos, que nas regies mais
superficiais so aerbios, realizando a biodegradao por reaes de oxidao. Na regio um pouco
mais profunda, onde a eletronegatividade menor, ocorrem reaes de desnihificao. Estas reaes
so importantes na transformao de grupos funcionais de carboxilas e alcoilas ligadas ao anel arom-
tico. Como exemplo disto citam-se o benzeno, tolueno, xileno, p-cresol etc. Na ausncia de oxignio,
as oxidases no funcionam, mas foi constatado que o oxignio utilizado proveniente da gua.
Em camadas ainda mais profundas e eletronegativas, existem as bactrias sulfato-redutoras e
as metanognicas. Estas ltimas so particularmente importantes na declorinao de organoclorados,
cujas molculas tenham muitos tomos. Verificaram-se, em PCBs, a dehalogenao parcial de at
30%" com a formao de produtos intermedirios de biodegradao, por vezes muito txicos. Quando
a molcula tem poucos tomos de cloro, as reaes de oxidao so mais eficazes. Nos processos de
biorremediao, pode-se alternar a dehalogenao anaerbia, com uma degradao posterior final
aerbia. A pesquisa com tetracloroetileno mostrou que desta forma possvel degradar inteiramente
esta molcula. No se deve desprezar a capacidade das bactrias sulfato- redutoras e do cido sulfidrico
de mediar uma condio redutora capaz de promover biodegradao.
233
Processos microbiolgicos no solo
---- maior profundidade do solo
aerbio denitrificoo Mn (IV) & Fe (ill) sulfato reduo metanognese
+ 0,5
o
Escala corresponde a: eletronegatividade, E em volts;
energia livre em kj/equivalente
-5
Figura 7.7 Escala de correlao entre processos microbiolgicos com eletronegatividade e
energia livre ao longo da profundidade do solo.
A biorremediao a manipulao das condies que podem favorecer a biodegradao por
microrganismos (Tursman & Cork, 1992). Inicialmente, necessrio conhecer a extenso
hidrogeolgica do local a ser biorremediado. passo que se segue consiste em suprir a comunidade
microbiana com energia, pois o contaminante quase sempre est presente em concentraes muito
baixas, no suprindo a demanda energtica necessria para estimular o metabolismo microbiano. A
biodegradao ocorre por cometabolismo ou pelo fato de o contaminante ser anlogo fonte de carbo-
no introduzida, sendo assim degradado casualmente. Para isto necessrio construir dois poos loca-
lizados nos limites exhemos da rea contaminada e profundidade adequada para alcanar a reb.;o
saturada. Deve-se injetar nutrientes, como N0
3
- ou P, ou gases, como oxignio ou metano, na extre-
midade do poo, a partir da qual o fluxo da gua subterrnea movimenta estes nutrientes por toda a
rea poluda at que eles sejam captados no poo de suco (Figura 7.8).
Hoje em dia, ganham dimenses maiores os problemas de contaminao da gua potvel no
subsolo e nos aqferos, crescentemente utilizados para o abastecimento de gua potvel. A introdu-
o de microrganismos obtidos no laboratrio com alta capacidade de degradao do poluente encon-
tra seus limites de adaptao de ambientao, pois muitas vezes eles no sobrevivem no ambiente.
Este o motivo pelo qual a biorremediao, por estimular os microrganismos locais, tem mostrado
melhores resultados na prtica.
7.S.3. O uso do solo para a biodegradao de xenobiontes, ou "Iand farming"
o processo que utiliza o solo superficial para a biodegradao de xenobiontes. Neste caso, o
solo, com suas excelentes propriedades de biodegradao, utilizado como um grande reator. Aplica-
se o poluente e, logo em seguida, o solo revolvido. Adicionam-se nutrientes e umidade suficientes
para estimular a biomassa microbiana. Deixa-se incubar como uma compostagem. H uma srie de
prticas que podem ser utilizadas para otimizar a degradao do poluente. essencial controlar o
desaparecimento dos poluentes de mo tio a permitir a colocao de nova carga, assim como monitorar
os lenis d'b'lla para evitar sua contaminao.
234
suprimento
de gua
bomba _-,---'"
de suco
nutrientes adicionados fonte de
(usualmente N e P) oxignio
____ ____
tela de
poo
'7
I
I
/ zona insaturada
de extrao / ( vadose) /
de gua subterrnea
gua
--
--
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zona saturada
contaminada
I
/ I I
/
I
I
I
I I
I
I
argila densa ou rocha
poo de
injeo
tela de
poo
I I r
Figura 7.8. Esquema bsico do processo de biorremediao in si/li da zona saturada.
7.6. Por que nem Todos os Xenobiontes so Degradados no Ambiente'?
Consta da literatura a persistncia no ambiente de muitos xenobiontes, como o DDT, para os
quais so conhecidos diversos microrganismos capazes de biodegrad-Ios. Como explicar esta aparen-
te contradio? Os limi tes de biodegradao no so dados pela existncia ou ausncia de enzimas e
vias metablicas, mas p acesso destas enzimas s molculas de xenobiontes. As substncias mais
persistentes so, sobretudo, as Iipoflicas, que se incorporam facilmente a outras substncias Iipoflicas
da matria orgnica do solo ou do sedimento, ou aos lipdios das membranas de plantas, animais e
microrganismos. Este processo de incorporao evita a exposio dessas molculas a enzimas ou
processos qumicos de degradao. A grande estabilidade no solo Oll nos sedimentos de componentes
orgnicos, como o cido hmico, flvico e a humina, proporciona ao xenobionte um logradouro pro-
tegido e estvel, garantindo alta persistncia neste ambiente. Os xenobiontes, bioac.umulados e assim
protegidos na membrana, ganham longevidade, pois, mesmo com a morte celular, os restos das mem-
branas so incorporados com grande freqncia a outras clulas e, a exemplo do que ocorre na
biomagnificao, tambm a oulTaS formas de vida.
Este processo de bioacumulao e persistncia de xenobiontes na biosfera s pode ser contro-
lado adequadamente de forma preventiva. Este o motivo pelo qual a maior ou menor
biodegradabilidade de uma substncia o aspecto mais importante para a permisso de seu uso.
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