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Fiche TP EXAO N2 : ENZYMOLOGIE

Influence de la temprature et du pH sur la cintique enzymatique.

Suivi dune cintique enzymatique par Oxymtrie- la CATALASE

1 Introduction

La catalase est une enzyme prsente dans le navet, elle catalyse la dcomposition du peroxyde dhydrogne (H2O2) issu des oxydations cellulaires :

2 H2O2 ------------> O2 + 2 H2O


Aprs avoir extrait la catalase du navet, le dgagement dO2 peut tre mesur par EXAO en utilisant une sonde oxygne. En faisant varier la concentration de substrat (H2O2) concentration denzyme constante, il est possible dtudier la cintique enzymatique de la raction ainsi que de mettre en vidence la notion de complexe enzyme substrat.

2 Matriel ncessaire pour un poste

- 2 interface USBLINK (rf. PS-2100) ou 1 interface POWERLINK (rf. PS-2001) - Sonde oxygne (rf. PS-2108) - pHmtre (rf. PS-2102) - Sonde de temprature (PS-2125) - Logiciel gnraliste DATASTUDIO - Enceinte cellulaire (rf. ENCYTO) - Agitateur magntique et turbulent - Pipettes gradues (1ml et 25ml) - 1 navet - 1 broyeur (pour un groupe de TP) - Matriel de filtration (des filtres caf peuvent suffire) - H2O2 diffrentes concentrations (0,125V - 0,25V - 0,5V 1V 2,5V 5V)

3 Prparation

Dcouper un navet frais en morceau (sans lplucher) puis broyer dans un mixeur. Ajouter de leau distille (100 ml deau distille pour 10 ml de jus de navet). Filtrer et conserver lextrait au froid. Lextrait peut tre conserv une nuit au rfrigrateur. Prparer les solutions dH2O2 aux diffrentes concentrations prcises ci-dessus et conserver au rfrigrateur. Astuce : En conservant les solutions au froid, cela permet de retarder le dmarrage de la raction enzymatique dans lenceinte afin de prendre le temps dobserver le phnomne.

Prparer la sonde oxygne comme indiqu sur sa notice. Il nest pas strictement ncessaire de ltalonner pour cette exprience.

4 Manipulation

Verser 20ml de la solution contenant la catalase dans lenceinte cellulaire. Placer le turbulent dans lenceinte. Lancer lagitation (vitesse lente moyenne). Fermer lenceinte. Introduire la sonde oxygne dans lenceinte. Note : Il nest pas ncessaire de boucher le second trou du bouchon car le dgagement doxygne li la dgradation de lH2O2 est suffisamment important pour ngliger loxygnation lie lagitation. Lancer les mesurer en cliquant sur le bouton dmarrer de la barre de tche. Au bout de 70 secondes, injecter 0,5 ml de la solution dH2O2 0,125V. Il est possible de reprer le moment de linjection en introduisant une note grce loutil Note. Observer lvolution de la courbe pendant 2 minutes. Recommencer la mme opration avec les autres concentrations dH2O2 (et bien entendu une nouvelles solution denzyme chaque fois).

5 Rsultats
Exemple de rsultats :

A laide de loutil danalyse, lire sur les courbes la quantit de dioxygne libr 20 secondes aprs lintroduction du substrat et de mme aprs 40 secondes. Tracer la courbe vitesse de raction en fonction de la concentration de substrat . Loption tableur du logiciel DATASTUDIO peut vous aider tracer cette courbe, il suffit dintroduire ces valeurs dans un tableau vierge puis deffectuer un glisser coller des donnes vers un nouveau graphique.

Daprs les mesures la forme de ce graphique, on dduit la notion de complexe enzyme substrat.

, linfluence de la temprature et du pH sur la cintique enzymatique.

2) Influence de la temprature Systme exprimental : quivalent celui de lexprience ci-dessus, une sonde de temprature va permettre de mesurer la temprature. Exprience : Faire varier la temprature laide dun bac glace ou dun bain-marie et observer linfluence de la temprature sur la vitesse dapparition du dioxygne. 3) Influence du pH Systme exprimental : quivalent celui de lexprience ci-dessus, un pH-mtre va permettre de mesurer le pH. Exprience : Faire varier le pH laide dune solution acide ou basique et observer linfluence du pH sur la vitesse dapparition du dioxygne.