Vibrio harveyi, una amenaza para las piscifactoras del sur de la Pennsula Ibrica: caracterizacin y estrategias para combatirlo

C. Gallardo, D.L. Mrquez, J. Almagro, L. Cern, A. Cruz, F. Codes, D. Lpez, A. Alves, N. Perea, R. Gmez, J. Moreno, M. Fontiveros, I. Pla.
Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias, Universidad de Mlaga 29071

Resumen Especmenes de Solea senegalensis enfermos fueron identificados en una piscifactora del sur de Espaa, los cuales mostraron diversos sntomas tales como lceras en la parte superior del cuerpo y mayor produccin de mucus epitelial. En el presente estudio de llev a cabo el aislamiento y caracterizacin del microrganismo responsable. Entre los factores que se analizaron se encuentran la actividad hemoltica, dado que este factor de virulencia es empleado de forma habitual en la industria pisccola de diversas regiones como marcadores de cepas virulentas, y la capacidad para secretar quitinasa por parte del microorganismo, dado que los crustceos han sido demostrados con anterioridad como importantes reservorios de organismos potencialmente patgenos. Adems, dado el creciente problema que supone para el medio ambiente el empleo de antimicrobianos y agentes quimioteraputicos, se analiz de la capacidad para producir compuestos bioactivos por parte de Chlorella sp, ocho especies de macroalgas recolectadas en la costa de Mlaga y de ocho especies bacterianas. Los resultados obtenidos permitieron confirmar la capacidad del aislado para degradar quitina, mientras que en el caso de la actividad hemoltica, los resultados fueron negativos para las condiciones experimentales del presente trabajo. Finalmente fueron obtenidos resultados bastante prometedores en el caso de los probiticos, en los que cinco de las cepas analizadas dieron lugar a halos de inhibicin.

Summary Solea senegalensis specimens were identified on a hatchery in southern Spain, which showed various symptoms such as ulcers on the upper body and an increase in the production of epithelial mucus. In the present study was carried out the isolation and characterization of the microorganism responsible. Among the factors that were analyzed are
the hemolytic activity, since this virulence factor is used routinely in the aquaculture industry of various regions as markers of virulent strains, and the ability to secrete chitinase, since the crustaceans have been shown previously to be important reservoirs of potentially pathogenic organisms. Moreover, given the growing problem posed to the environment the use of antimicrobials and chemotherapeutic agents, we examined the ability to produce bioactive compounds by Chlorella sp, eight species of seaweed harvested off the coast of Malaga and eight bacterial species. The obtained results confirmed the ability to degrade chitin by the isolated, whereas in the case of hemolytic activity, the results were negative for the experimental conditions of this work. Finally, very promising results were obtained in the case of probiotics, in which five of the strains resulted in inhibition halos.

INTRODUCCIN El lenguado senegals, Solea senegalensis, es un pez plano de la familia de los Soleidos, en el orden de los pleuronectiformes, el cual se distribuye por la costa Oeste africana y la costa europea del Atlntico y Mediterrneo Occidental. Se trata de una especie de alto valor comercial que tradicionalmente se ha cultivado de forma extensiva en Espaa y Portugal (Dinis et al., 1999). El principal factor que limita en la actualidad el engorde del lenguado es la incidencia de patologas de origen bacteriano, la mayora de las cuales son oportunistas y afectan igualmente a otras especies cultivadas. El control de estas enfermedades normalmente se ha llevado a cabo mediante tratamientos qumicos, lo que ha causado la aparicin de resistencias a los frmacos y diversos problemas ambientales derivados de la liberacin de estas sustancias en el medio acutico. Recientemente se han realizado estudios sobre vacunacin en el lenguado senegals (Arijo et al., 2005), sin embargo, la vacunacin solo ha sido capaz de proteger a los peces durante un corto periodo de tiempo. Debido a esto, la actividad acucola demanda otras alternativas que permitan el control de enfermedades y que, a la vez, sean respetuosas con el medio ambiente (Garca de la Banda et al. 2010). . Vibrio harveyi es una de las especies ms frecuentemente aisladas de Vibrios marinos, la cual ha sido asociada a enormes prdidas de larvas juveniles de Peneidos y muchas enfermedades oportunistas de peces marinos. V. harveyi ha sido tambin asociado con epidemias en granjas de Senegalese sole (Zorrilla et al. 2003).A pesar de su rol como importantes patgenos de organismos marinos, los mecanismos de patogenicidad de V. harveyi aun no han sido completamente elucidados. Diversas investigaciones han demostrado que existen diferencias significativas entre diferentes aislados de V. harveyi en trminos de patogenicidad, y han revelado que las proteasas, las fosfolipasas, las hemolisinas y/o otras exotoxinas pueden tener papeles importantes. Evidencias experimentales sugieren que las hemolisinas podran ser uno de los factores de mayor importancia en el desarrollo de las enfermedades (Iida and Honda 1997; Shinoda 1999; Zhang and Austin 2005). Los coppodos, rotferos y artemias son usados como importantes fuentes nutricionales para el cultivo de muchos organismos acuticos y existen antecedentes de la asociacin de estos organismos con Vibrio. Por ejemplo, Vibrio tiene una relacin de simbiosis con organismos quitinosos, como los coppodos y numerosos estudios han correlacionado la concentracin de coppodos con el nmero de V. parahaemolyticus y V. cholerae en el agua de mar (Lipp et al. 2003). La asociacin de Vibrio con estos organismos puede tener como consecuencia la transmisin de estas bacterias a larvas que son alimentadas con ellos; as mismo, la superficie de otros crustceos tales como Panaeus podra actuar como reservorio de patgenos oportunistas tales como Vibrio harveyi. (Leyton et Riquelme 2008).

Un aspecto llamativo es que la mayora de los vibrios patgenos son resistentes a antibiticos como oxitetraciclina, norfloxacina y ciprofloxacina debido al uso frecuente de stos en los sistemas de cultivo. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado una amplia resistencia de vibrios a los antibiticos comnmente usados en cultivos de camarn (Molina et al. 2002). Lo anterior plantea la urgente necesidad de buscar alternativas al uso de antibiticos para el control de patgenos. Una posibilidad es el uso de vibrionaceas nativas no patgenas como potenciales probiticos y/o simbiontes actuando como agentes de biocontrol en organismos de cultivos y as disminuir el uso de antibiticos y reducir las descargas de efluentes txico al medio ambientes (Jayasree et al. 2006, Riquelme et al. 2001). La terapia mediante el empleo de probiticos ofrece una alternativa adecuada para el control de los patgenos, superndose de este modo las consecuencias adversas de los agentes quimioteraputicos y antibiticos. Otra alternativa para la obtencin de agentes antimicrobianos naturales puede ser el empleo de algas, cuya habilidad para producir metabolitos secundarios de potencial inters ha sido extensamente documentada (Scheuer , 1990). Existen numerosos estudios sobre compuestos derivados de macroalgas con un amplio rango de actividades, tales como antibiticos, antivirales, antitumorales y antinflamatorios, y cuyas estructuras qumicas incluyen esteroles, isoprenoides y otras molculas relacionadas. A pesar de ello, los estudios sobre produccin de biocidas se refieren normalmente a un limitado nmero de especies. Por otro lado, diversas especies de microalgas tales como Nannochloropsis oculata o Chlorella sp. tambin han mostrado producir sustancias antibacterianas.

OBJETIVOS El objetivo de este trabajo fue la identificacin y caracterizacin del agente causal de una enfermedad. Por otro lado tambin se pretendi evaluar in vitro el potencial antimicrobiano de distintas cepas de probiticos, macroalgas y microalgas como posibles alternativas al empleo de antibiticos y quimioteraputicos. Finalmente, en el presente estudio tambin tiene como objetivo analizar la capacidad quitinasa del microrganismo, lo cual permitira elaborar estrategias para evitar futuras reapariciones de la enfermedad como consecuencia de su permanencia en el entorno en asociacin con organismos quitinosos.

MATERIAL Y MTODOS Sistema de cultivo . Los peces procedan de un piscifactora donde tambin se cultivaban dorada (Spartus aurata) y langostino (Penaeus sp.). Los especmenes se cultivan en tanques con agua de mar y con aireacin, en condiciones de salinidad y temperatura similares a las encontradas en el litoral de donde se extrae el agua para el mantenimiento de los peces.

Sntomas de la enfermedad En algunos de los tanques donde se cultivan los lenguados se observaron altas tasas de mortalidad (superiores al 75%). Los peces, en un principio perdieron el apetito, empezaron a nadar errticamente y finalmente, en menos de 24 horas, aparecieron muertos en los tanques. Algunos de ellos presentaron lceras en la parte superior del cuerpo que afectaban a todo el epitelio, quedando al descubierto el tejido muscular. En la mayora de los casos no se observaron sntomas externos, si acaso una mayor produccin de mucus epitelial.

Aislamiento de la bacteria . Las muestras fueron tomadas del hgado y del rin de uno de los individuos muertos como consecuencia de la enfermedad, para lo cual se emple un asa de platino y se sembr en medio solido TSA (Tryptic soy agar) al 2% de NaCl, y en medio lquido TSB (Tryptic soy broth) 2% de NaCl, incubndose a 22C. Las muestras sembradas en medio slido se realizaron en duplicado para cada rgano.

Caracterizacin fenotpica . Los fenotipos de los aislados fueron analizados, de forma independiente para cada rgano, mediante el uso de las siguientes pruebas: tincin gram (las gram positivas aparecen con coloracin azul/prpura, mientras que las gran negativas rosceo/rojizo), citocromo-oxidasa (pone de manifiesto la presencia de la enzima citocromo-oxidasa en el microorganismo, la cual oxida a la dimetil-parafenilen-diamina (reactivo incoloro), dando un producto coloreado, de forma que la aparicin de color azul oscuro indica la existencia del enzima citocromooxidasa, siendo en tal caso positivo), motilidad, test O-F (pone de manifiesto si la utilizacin de los hidratos de carbono por parte de un microorganismo se realiza por va oxidativa o por va fermentativa, que a pH cido presenta color amarillo ,considerado positivo para la fermentacin de la glucosa, mientras que a pH bsico presenta color azul y a pH neutro verde), crecimiento en agar TCBS (medio selectivo para el aislamiento de bacterias del gnero Vibrio; el resultado positivo se asocia con la presencia de colonias de color amarillo, lo cual indica que la bacteria es capaz de metabolizar la sacarosa), arginina dihidrolasa, descarboxilacin de la lisina y la ornitina (los aminocidos al perder el grupo carboxilo convierten en aminas que incrementan el pH del medio y el indicador (prpura del bromocresol) vira de amarillo a violeta, lo que indica que el resultado es positivo), prueba Voges-Proskauer (su fundamento es ver si fermenta la glucosa por la va butanodioiica; si se observa coloracin rosa-rojiza sera positiva, y si se observa coloracin amarilla sera negativa), test ONPG (prueba utilizada para diferenciar los microorganismos fermentadores lentos de lactosa, de los no fermentadores, de forma que el resultado positivo se manifiesta por colonias de color

amarillo), test del indol (mediante esta prueba se detecta la liberacin de indol en un cultivo bacteriano, la cual se debe a la degradacin del aminocido triptfano mediante el enzima triptofanasa; si se observa un anillo de color rojo en la superficie del tubo ser positiva; en caso contrario si no se forma anillo sera negativa), produccin de cido a partir de manitol (sirve para detectar si los microorganismos son capaces de fermentar el manitol, liberando productos cidos que sern detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiar a color amarillo), y las actividades enzimticas extracelulares caseinasa, gelatinasa, lipasa y lecitinasa (permiten poner de manifiesto tales actividades enzimticas; los microorganismos son sembrados con un isopo, y si forman un halo opaco alrededor de las zonas de siembra, el resultado es positivo). Los tests fueron llevados a cabo de acuerdo con la metodologa descrita por Smibert and Krieg (1981). Por otro lado, para determinar los requerimientos de sal, las bacterias fueron cultivadas en medio TSA al 0%, 6% y 8% de sal. Finalmente, las bacterias fueron cultivadas en medio TSA al 1,5% a 4C y 37C para determinar la temperatura ptima de crecimiento. Cabe destacar que todas, excepto las pruebas de la caseinasa, gelatinasa, lipasa, lecitinasa, el crecimiento en medio TSBS y los cultivos para el estudio de los requerimientos de sal , son pruebas lquidas, las cuales se sembraron mediante el empleo del asa de platino esterilizado mediante llama. Por ltimo tambin hay que apuntar que la siembra de las placas correspondientes a las pruebas de la caseinasa, gelatinasa, lipasa, lecitinasa y el crecimiento en medio TSBS se llev a cabo mediante el empleo de un hisopo estril, sembrando en crculo en el centro de la placa, mientras que las placas para es estudio de los requerimientos de sal se sembraron en estras empleando el asa de platino.

Determinacin del grado de virulencia Para llevar a cabo la determinacin del grado de virulencia de la cepa de V. harveyi aislada se procedi a resuspender la bacteria en tampn fosfato salino a una concentracin de 108 UFC/mL. Se inocul 0,1 mL de la suspensin inicial, por va intraperitoneal, a 10 lenguados, 0,1 mL de una dilucin 1/10 a otros 10 individuos, y por ltimo 0,1 mL de una dilucin 1/100 de la suspensin bacteriana a otros 10 lenguados. Pasados 15 das se contabilizaron el nmero de individuos muertos y se les tom muestras de hgado, rin y lcera.

Anlisis de la capacidad hemoltica de V. harveyi . Para estudiar la capacidad hemoltica se recurri al cultivo en agar sangre, cuya composicin fue cloruro sdico al 1% p/v, agar al 1,5% p/v y sangre de carnero al 5%. v/v. As pues, se prepar agar en PBS con 1% de NACL, tras lo cual se esteriliz durante 45 minutos a 121 C. Por otro lado se centrifugaron 2,5 mL de sangre de ternero durante

10 min a 2000 g. El precipitado recuperado se aadi en condiciones de esterilidad a la solucin estril, tras lo cual fue vertida en placas de petri. Una vez solidificados los medios las bacterias se cultivaron en cada placa empleando para ello hisopos estriles. Finalmente las placas se dejaron incubar 24 h a 22C. En el caso de que el resultado de la prueba fuera positivo debera aparecer un halo transparente
alrededor de las colonias a consecuencia de la lisis de los hemates.

Anlisis de la capacidad quitinasa . Para el estudio de la capacidad quitinasa, en primer lugar se procedi a la purificacin de la quitina de acuerdo con la metodologa propuesta por Acosta et al. (1993), partiendo de de exoesqueleto de gambas (Parapenaeus longirostris). Como paso previo al proceso de purificacin, el exoesqueleto fue calentado a ebullicin durante 10 minutos para eliminar los compuestos orgnicos solubles y las protenas superficiales asociadas. El procedimiento empleado para la purificacin de la quitina implica const de dos etapas: la desmineralizacin y la desproteinizacin. Para llevar a cabo la desmineralizacin los exoesqueletos fueron incubados con HCL 1N a temperatura ambiente y a una proporcin solido-solvente de 1:15 (w/v) bajo continua agitacin durante 2 horas. Posteriormente fueron lavados repetidamente con agua destilada para neutralizar el exceso de cido, y filtrados. Por otro lado, para llevar a cabo la desproteinizacin se incubaron en 15% NaOH a 65C durante 3 h y a una proporcin slido solvente 1:10 (w/v), despus de lo cual fueron lavados con agua destilada. . La fraccin obtenida (quitina purificada) fue pulverizada empleando para ello nitrgeno lquido, y resuspendida en agua destilada. Finalmente, tras una centrifugacin a 3000 g durante 10 min, el sobrenadante fue retirado y el precipitado liofilizado. La cantidad total de quitina pura fue de 88 mg de quitina pura por gramo de exoesqueleto. Una vez purificada la quitina se procedi a la preparacin de 100 mL del medio de cultivo base de acuerdo con Furukawa et al. (1978), el cual se modific con peptonas (Tabla 2). Los 0,3 g de quitina obtenidos fueron resuspendidos en 10 mL de medio base, tomndose otros 10 mL para preparar el control negativo. El medio estaba compuesto de sulfato amnico 1 g/L, dihidrofosfato potsico 0,2 g/L, monohidrofosfato potsico 1,6 g/L, sulfato magnsico heptahidratado 0,2 g/L, cloruro sdico 0,1 g/L, sulfato de hierro heptahidratado 0,01 g/L, cloruro clcico heptahidratado y peptonas 15 g/L. El preparado que contena la quitina fue tratado por ultrasonido a 10 m de amplitud, dos ciclos de 30 s a 50 Hzs y un ciclo de 30 s a 80 Hzs, empleando para ello un sonicador UP200S Ultrasonic Processor. Tras ello se les aadi el agar a los medios, se esterilizaron durante 15 min a 121 C y se vertieron en placa. Finalmente las bacterias fueron cultivadas en csped sobre la placa empleando para ello un hisopo estril, y realizando en cada placa un orificio central, incubndose a 22C durante 72h.

Produccin de antimicrobianos por macroalgas Las muestras de algas fueron recolectadas manualmente en el Faro de Calaburra (3630'23.03"N, 438'39.78"W) Mlaga, Espaa, durante el mes de abril de 2012, habindose identificado ocho especies diferentes: Halopteris filicina, Cystorseira tomerisufolia, Cladophora dalmtica, Ulva rgida, Corallina officinalis, Osmundea pinnatifida, Jania Rubens y Dictyota dichotoma. Las algas fueron limpiadas de epifitos y conservadas en oscuridad durante 24 h. a 4C. El estudio de la capacidad de las algas recolectadas para inhibir la proliferacin se afront a travs de dos estrategias: por un lado se analiz la capacidad de Dyctionta dichotoma para inhibir la proliferacin de V. harveyi en condiciones de co-cultivo, por otro lado, la capacidad de la capacidad antimicrobiana del resto de las especies fue evaluada in-vitro a travs de la elaboracin de extractos. Estudio de co-cultivo: V. harveyi se resuspendi en solucin salina a una concentracin aproximada 108 UFC/mL. Para la estimacin de la concentracin bacteriana se recurri al mtodo de nefelometra de McFarland, de forma que tal densidad bacteriana se alcanz cuando la tonalidad del cultivo fue similar la tonalidad que se corresponde con un valor de McFarland de 0,5. Seguidamente se aadi 0.2 mL de solucin bacteriana a una botella transparente con 200 mL de agua marina, al cual se le aadi posteriormente 4 g de alga fresca. Por otro lado tambin se emple otra botella transparente con 200 mL de agua de mar la cual actuara como control, aadiendo nicamente los 0,2 mL de solucin bacteriana. La estimacin de las bacterias cultivables se hizo mediante microtitulacin en placa, para lo cual se realizaron, tanto para la muestra control como para la muestra problema, diluciones seriadas 1:10, desde -1 a -5, Una vez realizadas las diluciones, se dividieron las placas en cuadrantes, y se colocaron en cada cuadrante 3 gotas de la misma dilucin. Este procedimiento se llev a cabo por duplicado para cada muestra, dado que se emplearon dos medios diferentes, TSBS (un medio selectivo para Vibrionaceas) y TSA salino (un medio no selectivo para estimar las bacterias totales). Finalmente tanto la muestra problema como la muestra control se dejaron incubando durante 24-72 horas para realizar el recuento de colonias crecidas. Estudio de los extractos: el anlisis de la capacidad de los extractos de algas de inhibir la proliferacin de V. harveyi in-vitro se llev a cabo de acuerdo con la metodologa propuesta por Gonzales del Val et al. (2001). As pues, para la preparacin de los extractos de algas se procedi en primer lugar a su liofilizacin. Se procedi a la obtencin de extractos tanto hidrofbicos como hidroflicos. Para la obtencin de los extractos hidrofbicos, 0,2 g de cada alga fueron maceradas en 10 mL de acetona, hasta obtener una mezcla homognea. Posteriormente los extractos en acetona obtenidos fueron transferidos a discos de papel,

los cuales se dejaron secar para reducir el efecto txico del disolvente sobre las bacterias. Finalmente los discos impregnados con los extractos se colocaron, dejando suficiente espacio entre ellos, sobre placas de medio TSA salino en las que se haban sembrado las bacterias en csped (4 discos por placa). Las placas se incubaron a 22 C durante 24 h, dndose como resultado positivo la aparicin de un halo de inhibicin del crecimiento bacteriano alrededor de los discos. Para la obtencin de los extractos hidroflicos 0,2 g de cada alga fueron macerados en 10 mL de solucin salina hasta la obtencin de una mezcla homognea. En este caso se recurri a la inoculacin por pocillos, para lo cual se realizaron cuatro orificios sobre las placas de medio TSA salino en las que previamente se haba sembrado V. harveyi en csped, y se vertieron los extractos de las algas en los pocillos hasta rellenarlos. En todos los casos las placas se dejaron incubar durante 24 horas a 22C.

Capacidad antimicrobiana de Chlorella La microalga fue proporcionada por el Departamento de Ecologa de la Universidad de Mlaga. Para analizar la capacidad de Chlorella para producir compuesto bioactivos que pudieran inhibir la proliferacin de V. harveyi se recurri a la tcnica de inoculacin por pocillos (Othman et al. 2010). As, el primer paso fue estimacin de la concentracin de Chlorella mediante el uso de una cmara de Neubauer, lo cual requiri que previamente se diluyera 1:4 en lugol. El resultado de la valoracin de la densidad celular del cultivo de partida fue 5,04 107 clulas/mL. Una vez estimada la concentracin de Chlorella, el siguiente paso fue la preparacin de dos placas de medio TSA, sobre las que se sembr V. harveyi en csped. Posteriormente a cada placa se le realizaron cuatro pocillos de 7 mm de dimetro mediante el empleo de la punta de una pipeta Pasteur. Finalmente, se enrasaron los pocillos de cada una de las placas, una con la solucin de Chlorella sin romper y la otra con la dilucin de Chlorella tras ser lisada por ultrasonido a 10 m de amplitud 30 s a 50 hzs (sonicador UP200S Ultrasonic Processor). Ambas placas se incubaron durante 24 horas a 22C, dndose por resultado positivo la aparicin de un halo de inhibicin del crecimiento de V. harveyi.

Produccin de sustancias bioactivas por cepas probiticas Las cepas potencialmente probiticas que se emplearon para realizar una seleccin segn su actividad antagonista frente a V. harveyi fueron: DCF 12.2.14/3 , DCF 12.1.14/3, DCF 12.10.14/3, DCF 12.4.14/3, DCF 12.9, P12.14/2, P15.14/3, Vibrio fisheri 14/3. Todas ellas fueron proporcionadas por el Departamento de Microbiologa de la Universidad de Mlaga.

Para llevar a cabo el estudio de la capacidad de los potenciales probiticos para secretar compuestos bioactivos con actividad antimicrobiana se recurri a la tcnica de inoculacin por pocillos (Mette et al. 2004). Para ello inicialmente se procedi a inocular en tubos de caldo de los cultivos primarios, dejndolos incubar durante 4 das. Una vez obtenidos los cultivos se procedi a preparar las placas sobre las cuales se testaran los probiticos. Para ello, en primer lugar se suspendi en 2 mL de solucin salina un cultivo de V. harveyi obtenido a partir de cultivo puro, hasta alcanzar un valor de 0,5 de turbidez McFarland. A continuacin, empleando un hisopo estril se sembraron en csped placas de agar TSAs para seguidamente practicar cuatro agujeros de 7 mm de dimetro en cada una de ellas mediante el empleo de la boca de una pipeta Pasteur de vidrio. Finalmente en los agujeros se depositaron las soluciones que contenan a los probiticos, realizando dos rplicas de cada uno de ellos. Las placas se dejaron incubar durante 24 horas a 22C.

RESULTADOS Caracterizacin fenotpica Los resultados obtenidos en las pruebas bioqumicas llevadas a cabo para la caracterizacin del microorganismo aparecen detallados en la tabla 3. A partir de ellos fue posible concluir que tanto las bacterias aisladas del hgado como del rin pertenecan a la especie Vibrio harveyi.

Tabla 3. Resultados de las pruebas bioqumicas Prueba Tincin gram Citocromo oxidasa Motilidad Test O/F Crecimiento en agar TCBS Fermentacin de la sacarosa Arginina dihidrolasa Descarboxilacin de lisina Descarboxilacin de ornitina Vogues-Proskauer Test ONPG Test del indol Test del manitol Actividad caseinasa Actividad gelatinasa Actividad lipasa Actividad lecitinasa Crecimiento a 4 C Crecimiento a 37 C Medio al 0% NaCl Medio al 6% NaCl Medio al 8% NaCl Resultado Gram negativas Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo No crecimiento Crecimiento No crecimiento Crecimiento No crecimiento

Determinacin del grado de virulencia Los resultados obtenidos tras la contabilizacin del nmero de individuos muertos a los 15 das de la inoculacin de los individuos indicaron que, en el caso de la dilucin inicial, es decir, de 108 UFC/mL, la tasa de mortalidad fue del 90%, en el caso de los individuos a los que se les inocul 0,1 mL de dilucin 1/10 la mortalidad fue del 60%, mientras que a los que se les inocul 0,1 mL de dilucin 1/100 de la suspensin inicial la tasa de mortalidad fue del 40%. De todos los individuos muertos, solo uno de los especmenes de la dosis media y dos de la dosis baja presentaron lceras en la piel.

Figura 3. Representacin del logaritmo de clulas inoculadas frente al porcentaje de mortalidad.

En todos los casos se aislaron cultivos puros de V. harveyi, excepto en dos lceras (una de dosis media y otra de dosis baja), que no se aislaron microorganismo. Para determinar el grado de virulencia del microorganismo representamos el logaritmo de clulas inoculadas frente a la mortalidad (Figura 3). Una vez hallada la ecuacin de la recta fue posible calcular la el nmero de clulas correspondiente a una mortalidad del 50%, obtenindose un valor de DL50 de 1,4104 UFC/g de pez.

Anlisis de la capacidad hemoltica Los resultados obtenidos fueron negativos tanto tras la inoculacin durante 24 h a 22C como tras la incubacin adicional que se realiz a durante otras 24 h a 37C.

Anlisis de la capacidad quitinasa

El resultado obtenido del ensayo realizado para contrastar la capacidad de V. harveyi para degradar quitina fue positivo, aprecindose a las 72 horas de incubacin un halo marcadamente transparente en la placa, principalmente alrededor del orificio realizado en el centro de la misma, lo cual es una manifestacin de la degradacin de las partculas de quitina (Figura 1).

Figura 1. Resultados del ensayo de capacidad quitinasa. (A) Placa de medio bsico enriquecida con quitina a tiempo 0. (B) Placa de medio bsico enriquecido con quitina a las 72 horas de incubacin en la cual es posible distinguir regiones en las que los grnulos de quitina han sido disueltos principalmente entorno a la regin central.

Produccin de antimicrobianos por macroalgas Estudio de co-cultivo de Dyctionta dichotoma Los resultados obtenidos en la titulacin a tiempo 0 de las bacterias llevada a cabo tras la incubacin durante 24 horas en medio TSA salino mostraron valores muy similares tanto para la muestra problema como a la muestra control, obtenindose densidades de 1'68 105 UFC/mL y 254 105 UFC/mL respectivamente. En el caso de las placas en medio TSBS sobre las que se sembraron las muestras a tiempo 0, no mostraron crecimiento significativo a las 24 horas, con lo cual se las dej incubando durante 24 hora ms, despus de lo cual si se apreci crecimiento. Los resultados de la titulacin fueron 2'98 107 UFC/mL para la muestra problema y 2'53 105 UFC/mL para la muestra control. Para analizar la evolucin de la densidad celular de Vibrionaceas cultivables tanto en la muestra problema como en la muestra control, se volvi a llevar a cabo la titulacin en medio TSBS tras la incubacin de los co-cultivos 72 horas (Figura 2). Los valores obtenidos fueron de 1,75 105 UFC/mL en el caso de la muestra control y 4,33 106 UFC/mL para la muestra problema.

Concentracin (Log UFC/mL)

Figura 2. Evolucin de la densidad bacteriana a lo largo del tiempo en la muestra problema y la muestra control.

Estudio de los extractos de macroalgas Los resultados obtenidos correspondientes a la capacidad tanto de la fraccin hidrofbica como a la fraccin hidroflica par a inhibir la proliferacin de Vibrio harveyi fueron negativos en todos los casos, no apareciendo halos de inhibicin para ninguna los extractos de algas testados.

Capacidad antimicrobiana de Chlorella En cuanto a los ensayos de inhibicin de proliferacin de V. harveyi llevados a cabo mediante la tcnica de inoculacin por pocillos, no se apreciaron halos de inhibicin ni en el caso de la incubacin de las clulas de Chlorella intactas ni en el caso de los extractos celulares tras 24 horas.

Produccin de sustancias bioactivas por cepas probiticas Tras 24 horas de incubacin, cuatro de las cepas seleccionadas para llevar a cabo el ensayo de inhibicin de la proliferacin resultaron positivas en cuanto a su capacidad para interferir con el crecimiento de V. harveyi, dando lugar a halos de inhibicin. Concretamente las cepas fueron DFC 12.2, DCF 12.4, DCF 12.9 y DCF 12.10 (Figura 2).

Dimetro (cm)

Figura 2. Media de los dimetros de los halos. Desviaciones estndar como barras (n=2)

DISCUSIN La cepa aisladas a partir de los lenguados enfermos en este estudio fue identificada y caracterizada como Vibrio harveyi, el cual ha sido descrito como el responsable de enormes prdidas en Penaeidos, habiendo tambin sido asociado a mortalidades de doradas de individuos cultivados en piscifactoras (Austin and Zhang 2006) De acuerdo con el resultado obtenido del valor de DL50 la cepa aislada en los organismos de la piscifactora puede considerarse como muy virulenta. Dado que prcticamente todas las muestras tomadas de los organismos muertos fue aislado V. harveyi en cultivo puro (salvo en dos muestras correspondientes a ulceras, en las cuales no se aisl ningn microorganismo), es posible considerar, de acuerdo con los postulados de Koch, que V. harveyi es el agente causal de la enfermedad. El hecho de que solo algunos ejemplares, y solo en dosis bajas, presenten lceras, puede ser debido a que, dado que se trata de una cepa muy virulenta, la mayora de los organismos mueren antes de que de tiempo a manifestarse dicho sntoma causado por el estado patolgico, por lo que nicamente en organismos a los que se les inocula el microorganismo en dosis bajas, y en los que la enfermedad se desarrolla a una velocidad menor, aparecen lceras superficiales. La virulencia de la cepa aislada se corresponde con su capacidad de swarming, lo cual se ajusta a la hiptesis propuesta por Zorrilla et al (2003), de acuerdo con la cual la capacidad de swarming puede ser un marcador diferencial entre las cepas virulentas y las no virulentas. Las hemolisinas son ciertamente la toxina ms producidas entre los Vibrios patgenos, ejerciendo diversos roles en el proceso infectivo (Zhang y Austin 2000). La hemolisina de V. harveyi (VHH) es un miembro de la ampliamente distribuida familia de

hemolisinas termoestables, y parece ser suficiente para la actividad hemoltica en algunas, pero no en todas, las cepas de V. harveyi (Rattanama et al., 2012). De confirmarse, los resultados obtenidos en este trabajo podran tener una enorme importancia en la prctica, dado que una de las estrategias empleadas frecuentemente en la identificacin de cepas patgenas de V. harveyi es llevar a cabo PCRs para el gen vhh (Parvathi et al. 2009), con lo que sera necesario impulsar el desarrollo de estrategias alternativas, dado que, de acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, la actividad hemoltica no es un requisito necesario para considerar a una cepa como altamente patgena. Sin embargo, la expresin de los genes VHH pueden ser dependientes de la densidad de V. harveyi u otros factores ambientales (Parvathi et al., 2009), con lo que no es posible confirmar que en la cepa estudiada los genes de la hemolisina estn ausentes. Otro factor que podra haber determinado que el resultado obtenido fuese negativo es la especie de la cual se obtuvieron los eritrocitos, dado que la susceptibilidad a la lisis vara enormemente entre unas especies y otras, siendo particularmente susceptibles los eritrocitos de salmn y de conejo (Zhang and Austin, 2000). Por todo ello, a pesar de que los resultados indican que la cepa de V. harveyi aislada es incapaz de secretar hemolisinas, estudios adicionales son necesarios para confirmarlo. Bien es conocida la capacidad de V. harveyi para establecer relaciones simbiticas con organismos como el calamar (Eupyrmna scoloper) o los camarones (Penaeus mergulensis) (Leyton y Riquelme 2008). stos y otros organismos quitinosos pueden actuar como reservorio del patgeno, dando como resultado la aparicin de episodios de mortalidad repentina en organismos como el lenguado causados por la actividad de estos patgenos oportunistas. Por esta razn, la confirmacin de la capacidad de la cepa de V. harveyi aislada puede ser determinante a la hora de prevenir futuras reapariciones de la enfermedad. La importancia de los organismos con exoesqueleto como potenciales reservorios de cepas patgenas viene apoyada por la caracterizacin en V. harveyi de ms de 10 enzimas diferentes con actividad quitinasa (Suginta et al. 2004). Por todo ello, una de las estrategias que podran adoptarse en las piscifactoras para prevenir la posible aparicin de nuevos brotes epidmicos es no emplear como fuente nutricional coppodos, rotferos o artemias, los cuales son comnmente utilizados, ya que la asociacin de vibrios patgenos con estos organismos puede tener como consecuencia la transmisin de estas bacterias a larvas que son alimentadas con ellos. As mismo, debe evitarse el contacto directo entre los lenguados y cualquier tipo de organismo quitinoso en las piscifactoras. Otro de los objetivos principales de este trabajo fue evaluar y comparar la habilidad de diversos organismos para producir compuestos bioactivos frente a V. harveyi. En el caso de las macroalgas, en estudios previos haba sido detectada actividad antimicrobiana de extractos de algunas de las especies testadas en este trabajo, como es el caso de Halopteris filicina (Kolanjinathan et al. 2009, Taskin et al. 2007), Cystoseira tomerisufolia (Abourriche et al. 2007), Ulva rigida (Tuney et al. 2006), Corallina officinalis (Taskin et al. 2007), Osmundea pinnatifida (Rhimou et al. 2010, Afzal Rizvi

2010), Dictyota dichotoma (Christobel et al. 2011) o Jania Rubens (Taskin et al. 2007). Sin embargo, en ninguno de dichos trabajos se comprob la actividad de dichos microorganismos frente a V. harveyi. De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo, ninguno de las especies analizadas presenta compuestos con actividad antimicrobiana frente a V. harveyi, dado que ni la exposicin a los extractos de etanol y a los extractos en solucin salida dieron lugar a halos de inhibicin. A pesar de ello son necesarios ensayos adicionales para confirmar la ausencia de compuestos antimicrobianos en los extractos de las macroalgas analizadas, ya que Choudhry et al. (20005) demostraron que aunque algunas cepas no son sensibles a los extractos de algas, fracciones purificadas de tales extractos si pueden mostrar actividad, lo cual puede ser debido a que la actividad antibacteriana se encuentre enmascarada por la presencia de algunos compuestos inhibidores en los extractos, como los observados por Sastry y Rao (1994). As mismo, los mtodos de extraccin empleados tambin pueden determinar el grado de susceptibilidad de V. harveyi, debido a lo cual en futuras investigaciones sera necesario realizar los extractos con otros disolventes tales como metanol, cloroformo o diclorometano. Otro factor que podra determinar el resultado negativo obtenido es el haber mantenido las algas durante 24 horas a 4C en una botella de agua de mar, de forma que la situacin de estrs ocasionada podra haber afectado negativamente a la presencia de compuestos con actividad antimicrobiana. Por esta razn sera necesario repetir el ensayo empleando especmenes recin recolectados, para de este modo confirmar el resultado. Adems del anlisis de la actividad antimicrobiana de los extractos de algas, tambin se analiz la capacidad de Dyctiota dichotomade reducir el nmero de bacterias al ser incubadas en co-cultivo. De entre todas las especies se eligi D. dichotoma debido a que anteriormente haba sido confirmada la capacidad antimicrobiana de dicha especie sobre ciertas especies bacterianas por Salvador et al. (2007). De acuerdo con los resultados, no es posible rechazar la hiptesis de que Dyctiota dichotoma acte reduciendo el nmero de bacterias, puesto que en los co-cultivos se registr un descenso del 85,47% en el nmero de vibrios presentes en el medio (pasando de 2,98 107 a 4,33 106), frente al descenso del 30% registrado en el control (desde 2,53 10 5 a 1,75 105). Hasta la fecha han sido identificado hasta 12 compuestos voltiles de diversa naturaleza en D. dichotoma mediante GC/MS, entre los que se encuentran hidrocarburos (npentadecano), terpenos (beta-cubebeno, beta-ionone, dactilol y pachidictol A) o aldehidos (miristaldehido, hexadecanal y (z)-13-hoxadecenal) , destacando de entre todos ellos el pachidictol A, que constituye el 39,54% de los aceites esenciales (Demirel et al. 2009). Sin embargo, es necesario llevar a cabo ensayos adicionales para confirmar la capacidad de esta microalga para disminuir la concentracin de V. harveyi del medio, ya que los resultados de la titulacin indicaron que junto con las algas se produjo la incorporacin al medio de cultivo de vibrios exgenos , algunos de los cuales podran corresponder a V. alginolticus (cuya susceptibilidad frente a D. dichotoma ya ha sido confirmada por estudios anteriores) , con lo que los resultados obtenidos corresponderan a un falso positivo debido al afecto del alga sobre ste ltimo, y no sobre V. harveyi. As mismo, sera necesario llevar a cabo un mayor nmero de rplicas para poder confirmar que los

resultados obtenidos son estadsticamente significativos. Por ltimo, como en el caso de los extractos, el mantener al macroalga durante 24 horas a 4C podra haber afectado a la produccin de antimicrobianos, por lo que sera recomendable repetir los ensayos empleando especmenes frescos. Los cultivos de fitoplancton son ampliamente empleados en la industria de la acuicultura con una gran variedad de propsitos, denominndose "aguas verdes", debido a los elevados niveles de especies fitoplanctnicas como Chlorella sp. que contienen (Sharif y Eguchi 2011). En el presente trabajo se evalu la capacidad de una cepa de Chlorella sp. para inhibir la proliferacin de V. harveyi, para lo cual se emplearon tanto cultivos del microalga como extractos de la misma. Los resultados obtenidos en placa indicaron que la cepa empleada, bajo las condiciones de cultivo utilizadas, no produce sustancias con capacidad antimicrobiana capaces de inhibir la proliferacin e V. harveyi, dado que no se apreciaron halos de inhibicin tras 24 h de incubacin. A pesar de ello, no es posible rechazar que Chlorella sp. pueda ejercer un efecto positivo al ser aadidas a los tanques de acuicultura cuando es empleado como "aguas verdes", dado que su influencia puede no venir determinada por la produccin de agentes antimicrobianos, sino por la liberacin de otros compuestos tales como dipptidos cclicos que acten mimetizando a los AHC, afectando as a los comportamientos regulados por quorum sensing de la bacteria, o travs de la preferencia de asimilacin y competicin por los nutrientes (Teplitski et al. 2004). El empleo de probiticos ofrece una alternativa adecuada para el control de patgenos en instalaciones acucolas, salvando las consecuencias adversas resultantes del empleo de agentes antibiticos y quimioteraputicos. La actividad inhibitoria frente a los patgenos o la competicin por los nutrientes es un criterio importante para seleccionar una cepa probitica candidata (Balczar et al. 2006). En el presente estudio 4 de las 8 cepas testadas exhibieron capacidad de sntesis de compuesto bioactivos antagonistas frente a V. harveyi, dando lugar a halos de inhibicin frente a los patgenos al ser testadas mediante el mtodo de inoculacin por pocillos. El efecto antagonista de los probiticos puede ser atribuido a la produccin de compuestos bioactivos, los cuales difunden a travs del agar inhibiendo el crecimiento de V. harveyi. De entre todas las cepas testadas, DCF 12.10 se postula como la ms prometedora, dado que fue la que dio lugar a un mayor halo de inhibicin. Sin embargo, a pesar de los positivos resultados obtenidos, son necesarios estudios adicionales para contrastar la utilidad in vivo de las cepas productoras de sustancias bioactivas, dado que en ocasiones los probiontes han demostrado actuar como patgenos frente al organismo hospedador (Mette et al. 2004). As mismo es necesario llevar a cabo estudios de la utilidad de tales microorganismos in-vivo, dado que la produccin de compuestos bioactivos con actividad antagonista frente a Vibrio harveyi no es suficiente para confirmar su utilidad como probitico, siendo necesario analizar, entre otros factores, su capacidad para colonizar el tracto gastrointestinal del hospedador. Por otro lado, identificar los mecanismos de accin a travs de los que las cepas potencialmente probiticas ejercen su accin tambin sera de gran utilidad a la hora de desarrollar estrategias ms eficientes de control de la enfermedad, dado que a pesar de

que en la ltima dcada han sido publicado un gran nmero de estudios sobre probiticos, las limitaciones metodolgicas y ticas de los estudios en animales han dificultado su comprensin. En cuanto a las cepas que no han dado lugar a halos de inhibicin, no es posible desechar su posible utilidad como organismos probiticos, dado que su efecto beneficioso puede venir dado por otros mecanismos, como son la competicin por los nutrientes o la estimulacin del sistema inmunitario. Por ltimo, el que no hayamos observado inhibicin en algunos de las cepas empleadas puede ser debido a que la masa bacteriana inoculada en los pocillos no era idntica en todos los casos, de modo que es posible que la cantidad sembrada no fuera suficiente como para poder generar un halo de inhibicin.

CONCLUSIN A pesar del elevado grado de virulencia mostrado por la cepa de V. harveyi aislada en este trabajo, los resultados indican que el aislado no presenta actividad hemoltica. En el caso de la capacidad quitinasa, los resultados obtenidos han permitido confirmar que el aislado tiene capacidad de degradar este polisacrido. Por su parte, en los estudios llevados a cabo para la identificacin de estrategias alternativas para la lucha contra el patgeno, es de destacar que el empleo de organismos probiticos se ha mostrado como la estrategia ms eficiente para combatir los brotes de Vibrio harveyi ya existentes, habindose mostrado la cepa DFC 12.10 como la aspirante ms prometedora. La microalga Chlorella a la proliferacin del microorganismo, ni en el caso del co-cultivo del alga viva ni al ser sonicada. Finalmente, los resultados obtenidos a partir de los ensayos llevados a cabo con los extractos de macroalgas han indicado que ninguna de las siete especies analizadas produce compuestos bioactivos frente a V. harveyi, al menos bajo las condiciones empleadas, mientras que el co-cultivo con Dyctiota dichotoma si se ha revelado como una estrategia potencialmente eficaz.

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