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UNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR FACULTE DES SCIENCES DE TUNIS DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

UNIVERSITE DE CARTHAGE INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES ET DE TECHNOLOGIE

Thse DE DOCTORAT en BIOLOGIE


Spcialit : Gntique et Biologie Molculaire
Prsente par :

Aymen EZZINE

Intitule :

Technologie dExpression des Protines Recombinantes dIntrt Thrapeutique Chez Arabidopsis thaliana et Pichia pastoris

Soutenue le 28 Mai 2011 devant le jury compos de : Pr. Mohamed Amri Pr. Amel Salhi Hannachi. Pr. Sadok Boukhchina Dr. Sami Fattouch. Pr. Med Najib Marzouki Prsident Rapporteur Rapporteur Examinateur Directeur de thse

Anne Universitaire 2010/2011

Dieu Merci, De Maccorder La Force, La Patience Et Le Savoir Faire

Ddicace ;

A Mes Chers Parents Je Vous Adresse Tous Mes Sentiments Damour Et De Gratitude Je Suis Vraiment Fier Dtre Votre Fils Je Ne Trouve Aucun Mot Ni Expression Qui Peut Suffire Pour Vous Remercier Que Dieu Vous Rserve Toute La Joie Et Le Bonheur

A Mon Cher Frre Achref; A Ma Chre Sur Maha Et Ses Petites Filles Yasmine Et Hanine

"Si la nature apparut d'abord l'Homme comme une donn qu'il ne pouvait maitriser parce qu'il ne pouvait que l'observer dfaut de le comprendre, qui profitait son corps ou le menaait, jamais depuis qu'il est Homme il ne sut s'en contenter. Toujours, il lui a fallut chercher conserver ou modifier le vivant qui l'entourait, parce que d'abord il lui fallait protger son corps, sa vie mme."

Franois gros in "l'ingnierie du vivant", d. Odile Jacob, 1992.

Je voudrais remercier le professeur Med Najib Marzouki, responsable de lUnit de recherche de Gnie Biologique lINSAT pour mavoir intgrer au sein de son quipe. La confiance quil ma accord ma beaucoup soutenu lors de ma prsence au sein de lquipe. Ses conseils trs instructifs et ses qualits scientifiques trs exceptionnelles mtaient dun trs grand apport lors de laccomplissement de ce travail. Quil trouve ici lexpression de mon sincre respect. Javais la chance de participer au projet de collaboration avec Dr. Laura Baciou qui ma soulev de grands apports aussi bien scientifiques quintellectuelles. Merci pour l'accueil, les conseils, et ta gentillesse perptuelle. Grand merci du fond du cur. Merci tous les membres du Jury daccepter de lire et critiquer ce mmoire. Professeur Mohamed Amri, Merci pour votre intrt mon travail, de vos conseils prcieux et de votre disponibilit. Professeur Amel Hannachi Salhi, Vous m'avez toujours tmoign une grande gentillesse. Vous avez galement su me faire profiter de vos conseils et de vos encouragements. C'est pour moi un plaisir que vous soyez rapporteur de cette thse. Professeur Sadok Boukhchina, Je vous remercie daccepter de lire et critiquer ce travail. Vous avez toujours donn lexemple dans le srieux et lhonntet scientifique. Vos conseils et vos remarques mont beaucoup aid dans ce rapport. Docteur Sami Fattouch, Votre intrt et vos conseils m'ont vraiment encourag aussi bien dans le domaine de la recherche que dans lenseignement. Merci pour le sens de lamiti. Je vous remercie d'avoir accept d'examiner ma thse. Avec mon respect.

Cette page ne suffira pas, et j'en oublierai quand mme, mais je veux essayer de remercier tous ceux qui ont contribu ce travail, ou qui ont contribu me le rendre agrable. Un grand merci donc tous pour lamour, lamiti, la gentillesse, merci pour les sourires, merci de m'avoir support

Un grand Merci Ines Ben Khadija ; tu as guid mes premiers pas dans le laboratoire. Un remerciement exceptionnel adress mon cher ami Dr. Said Galai et sa femme Sihem pour la sympathie et lamiti quils mont fourni tout au long de ce travail avec des moments tant difficiles quagrables. Que Dieu vous accorde la chance et le bonheur. Je veux remercier aussi Dr. Sonia MHirsi et Dr. Farid Abidi pour leurs qualits humaines et leurs encouragements continus. A mon ami et collgue Dr. Issam Smali je te remercie pour tous les conseils et les discussions scientifiques. Je te souhaite un bon avenir et la russite dans la vie. A mon amie Imne Hadji Sfaxi, je te remercie du fond du cur pour lamiti et pour ton encouragement continu. Javais le plaisir de travailler et discuter des ides avec toi. Pour tous les membres du laboratoire, vraiment vous tes agrables. Haifa, Rym, Mouna, Sana, Feten, Ines, Nesrine, Souhir, Refka, Wafa et le fameux Mohamed. Je vous adresse toutes les expressions de considration et damiti. Merci beaucoup pour toutes les personnes qui mont aid scientifiquement, amicalement ou mme par les bonnes expressions de soutien moral. Je veux citer Sajiaa Keskes, Hassib Bouallagui, Eltaief Khelifi, Imne ben Dhifallah, Imne ben Abdelmalek, Sonia Belhadj Khlifa, Ines ben Rejab, Salma Khiari.... Je vous remercie tous. Un remerciement adress mes amies Aynur Ahmadova et Burak Gkmen pour leur sympathie et pour leur aide dans la lecture de larticle et leurs remarques pertinentes. Une ddicace tous mes tudiants lINSAT qui ont t agrables et ont montr beaucoup de srieux et de rigueur, je les souhaite un bon avenir et bon courage.

Sommaire

INTRODUCTION GENERALE................1 I. Technologie dexpression des protines recombinantes...................5 I.1. Gnralits sur la production des protines recombinantes....................5 I.2. Biosynthse et modifications post-traductionnelles des protines...........................7 I.3. La glycosylation des protines.......................10 I.4. Les diffrents systmes de production des protines recombinantes........................................15 I.4.1. Les bactries ..........................................................................................................................15 I.4.2. Les levures et les champignons.............................................................................................16 I.4.3. Les cellules de mammifres ..................................................................................................22 I.4.4. Les cellules d'insectes ............................................................................................................23 I.4.5. Production des protines recombinantes chez les plantes transgniques.........................24 I.4.5.1. Les techniques de transformation gntique des vgtaux........................................26 a- Les mthodes directes ......................................................................................................26 b- Les mthodes indirectes ...................................................................................................26 I.4.5.2. Transformation gntique in planta ............................................................................29 I.5. Comparaison des diffrents systmes dexpression des protines recombinantes...................29 I.6. Etudes sur le repliement des protines recombinantes ..............................................................34 I.6.1 Formation des corps dinclusion............................................................................................34 I.6.2. Renaturation des protines in vitro.......................................................................................36 I.6.3. Minimiser lagrgation in vivo .............................................................................................37 I.6.4. Contrle conformationnel des protines .............................................................................39 I.7. La purification des protines ........................................................................................................40 I.7.1. Dmarche globale de purification des protines recombinantes ......................................40 I.7.2. Chromatographie daffinit .................................................................................................41 I.7.3. Chromatographie dchange dions.....................................................................................42 I.7.4. Chromatographie dexclusion/diffusion (Gel filtration) ....................................................43 I.8. L'volution des protines ..............................................................................................................44 II. Les Papillomavirus Humains ..............................................................................................................50 II.1. Gnralits sur linfection gnitale PVH.................................................................................51 II.2. Morphologie et structure des Papillomavirus ...........................................................................54 II.3. Les protines virales du PVH......................................................................................................55 II.3.1. Les protines prcoces ........................................................................................................55 II.3.2. Les protines tardives...........................................................................................................56 a- La protine L1 .......................................................................................................................56 b- La protine L2 ......................................................................................................................56 c- Assemblage de la capside des papillomavirus .....................................................................57 II.3.3. Classification des Papillomavirus .......................................................................................58 II.4. Mcanismes de linfection par les Papillomavirus.....................................................................59 II.5. Du virus HPV au vaccin VLP ..................................................................................................62 II.5.1. Principe du vaccin prophylactique ....................................................................................62 II.5.2. Comment dvelopper une mmoire immunitaire?............................................................64 II.5.3. Points forts portant sur lefficacit du vaccin ...................................................................67 II.6. Conclusion.....................................................................................................................................68 III. Les Nanobodies un nouveau concept dans lingnierie des anticorps............................................70 III.1. Introduction ................................................................................................................................70 III.2. Structure des VHH ou Nanobodies ....................................................................................71 III.3. Donc, cest quoi les Nanobodies ?..............................................................................................73 III.4. Proprits biochimiques et fonctionnelles des Nanobodies ....................................................75 III.5. Production des anticorps VHH recombinants .........................................................................76 III.6. Applications biotechnologiques et mdicales des Nanobodies ...............................................80 MATERIEL ET METHODES MATERIEL I. Les systmes dexpression et cellules htes..........................................................................................84 I.1. Le systme Levure Pichia pastoris .......................................................................................84 I.2. Le vecteur dexpression pPICZA.............................................................................................85

I.3. Le systme plante ........................................................................................................................86 I.4. Vecteur binaire dexpression .....................................................................................................87 I.5. Les souches bactriennes ............................................................................................................88 II. Milieux de culture, solutions et produits de biologie molculaire....................................................89 II.1. Milieu de culture des graines ...................................................................................................89 II.2. Les antibiotiques ........................................................................................................................89 II.3. Milieux de culture bactriens ...................................................................................................89 II.4. Milieux de culture pour Pichia pastoris ...................................................................................90 II.5. Solutions dextraction dADN plasmidique par mthode de lyse alcaline............................91 II.6. Tampon de charge pour protines ........................................................................................91 II.7. Gels de polyacrylamide pour PAGE-SDS................................................................................92 II.8. Solutions pour technique western blot ....................................................................................92 II.9. Enzymes et ractifs de biologie molculaire ...........................................................................93 METHODES PARTIE I. UTILISATION DE LA PLANTE ARABIDOPSIS THALIANA COMME SYSTEME DEXPRESSION DE LA PROTEINE L1 DE LA CAPSIDE DU HPV16 III.1. Strilisation des graines dArabidopsis thaliana ....................................................................96 III.2. Germination des graines sur milieu MS ................................................................................96 III.3. Culture des plantes sur terreau ..............................................................................................96 III.4. Extraction dADN gnomique de la plante Arabidopsis thaliana : Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega)................................................................................................................97 III.5. Amplification du fragment spcifique du gne L1 de HPV16 (450pb) par PCR................97 III.6. Synthse dADNc partir des ARN totaux de plantes..........................................................98 III.6.1. Extraction des ARN totaux de plante Arabidopsis thaliana: SV Total RNA Isolation System (Promega)..........................................................................................................................98 III.6.2. Synthse de lADNc par la Reverse Transcriptase........................................................98 III.7. Analyse des gnomes des plantes Arabidopsis thaliana par Southern blot..........................99 III.8. Protocole dextraction des protines totales partir de plante............................................99 PARTIE II. UTILISATION DE LA LEVURE PICHIA PASTORIS POUR LEXPRESSION DE LANTICORPS VHH22 III.9. Extraction dADN plasmidique pPICZA ..........................................................................100 III.9.1. Mini prparation par lyse alcaline................................................................................100 III.9.2. Mini prparation de plasmides utilisant un systme de purification sur colonne de silice : QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)........................................100 III.10. Amplification de lADNc du VHH22 par PCR utilisant des amorces spcifiques..........101 III.11. Purification de lADN sur colonne de silice partir du gel dagarose : MiniElute Gel Extraction (Qiagen)..........................................................................................................................101 III.12. Traitement enzymatique de lADN.....................................................................................102 III.12.1. Digestion du vecteur pPICZA avec XbaI.................................................................102 III.12.2. Traitement du vecteur par la Phosphatase Alcaline CIP.........................................102 III.12.3. Digestion de lADNc par XbaI ....................................................................................103 III.13. Purification de lADN directement partir des ractions enzymatiques : MiniElute Reaction Cleanup Kit (Qiagen).......................................................................................................103 III.14. Ligation pPICZA- Insert...................................................................................................104 III.15. Transformation des bactries E. coli par les mlanges de ligation..................................104 III.16. Vrification du sens dintgration de linsert par digestion avec BlpI............................104 III.17. Protocole de transformation de Pichia pastoris par la mthode de choc thermique......104 III.18. Protocole dextraction dADN gnomique de levure : Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega)...............................................................................................................105 III.19. Protocole dextraction dARN totaux partir de cellules de Levure: RNeasy Mini Kit (Qiagen)......................................................................................................................................106 III.20. Protocole de purification des protines VHH22 (His6) par technique IMAC

(Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography)....................................................................107 III.21. Sparation des protines sur gel dacrylamide en conditions dnaturantes SDSPAGE.................................................................................................................................................109 III.21.1. Protocole de SDS-PAGE .............................................................................................109 III.21.2. Rvlation au nitrate dargent ...................................................................................110 III.22. Traitement de lanticorps avec le Peptide N-Glycosidase F.............................................110 III.23. Technique western blot .......................................................................................................111 III.23.1. Transfert des protines ...............................................................................................111 III.23.2. Fixation des anticorps..................................................................................................111 III.24. Test dactivit ELISA...........................................................................................................112 RESULTATS ET DISCUSSION PARTIE I. MISE AU POINT DE LEXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES DANS LE SYSTEME ARABIDOPSIS THALIANA Chapitre I : expression de la protine capside L1 du papillomavirus humain de type 16 chez Arabidopsis thaliana Introduction ......................................................................................................................................116 Rsultats & Discussion ....................................................................................................................119 1- Analyse de lintgration et le nombre de copies du gne L1 dans le gnome des plantes transgniques...............................................................................................................................119 2- Synthse de lADNc de L1 partir des plantes transgniques grce la RT-PCR.........120 3- Purification de la protine recombinante et analyse par western blot .............................122 Conclusion ........................................................................................................................................123 ARTICLE 1.......................................................................................................................................125 Chapitre II : Analyse de lexpression et de la stabilit du transgne L1 chez de plantes transgniques T2 dArabidopsis thaliana Introduction......................................................................................................................................137 Rsultats & discussion ....................................................................................................................139 Conclusion ........................................................................................................................................140 ARTICLE 2.......................................................................................................................................141 PARTIE II. MISE AU POINT DE LEXPRESSION DUNE PROTEINE ANTICORPS RECOMBINANTE DE TYPE VHH DANS LE SYSTEME PICHIA PASTORIS Chapitre III : Clonage et expression d'un anticorps recombinant de type VHH chez la levure Pichia pastoris Introduction......................................................................................................................................144 Rsultats & Discussion.....................................................................................................................147 1. Clonage de lADNc du VHH22 et transformation de la levure Pichia pastoris..............147 2. Analyse du gnome des cellules P. pastoris transformes.................................................149 3. Analyse du transcriptome par RT-PCR.............................................................................151 4. Production de lanticorps recombinant .............................................................................152 5. Analyse de lactivit de neutralisation de lanticorps VHH22 glycosyl.........................155 Conclusion.........................................................................................................................................157 ARTICLE 3.......................................................................................................................................158 CONCLUSION GENERALE.................................................................................................................190 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...............................................................................................194

Introduction Gnrale
Grce aux avances scientifiques spectaculaires des vingt dernires annes en matire de gnie gntique et de biologie molculaire, il est aujourd'hui envisageable de modifier le patrimoine gntique d'un organisme vivant en lui incorporant un fragment d'ADN provenant d'une espce diffrente, et de lui faire exprimer cette information gntique trangre. Ces savoir-faire nouveaux de la gntique ont permis d'ouvrir des voies de recherche et de dveloppement nouvelles aux perspectives considrables. Il devient alors possible aujourd'hui, en s'appuyant sur ces mthodologies, de reprogrammer le code gntique d'un organisme en lui insrant un gne prcis, qui lui permettra de produire une protine recombinante prcieuse usage mdical ou industriel. Les biotechnologies ouvrent ainsi aujourd'hui des perspectives considrables pour le secteur de la sant. Les protines recombinantes avec un intrt thrapeutique occupent d'ailleurs une place primordiale dans le march mondial des biotechnologies. Les protines recombinantes d'intrt thrapeutique sont le plus souvent des glycoprotines, o la glycosylation joue un rle essentiel dans leurs proprits, notamment pharmacocintiques. Toutefois, les diffrents systmes d'expression de protines utiliss ne permettent pas de reproduire le profil de glycosylation observ la surface des protines humaines, ce qui peut constituer un inconvnient l'utilisation de la protine dans une application thrapeutique chez l'Homme. La matrise de la glycosylation des protines recombinantes reste un enjeu considrable pour le dveloppement de tels systmes de production. Les modifications (principalement glycosylation et formation des ponts disulfures) ne se produisent pas dans les bactries. D'ailleurs, les oligosaccharides spcifiques attachs aux protines par des enzymes de glycosylation sont dites tissu-spcifiques. Ces considrations limitent souvent le choix des cellules htes aux systmes dexpression eucaryotes pour la production de protine htrologue. Les cellules htes utilises pour la production de protines recombinantes doivent rpondre aux besoins des processus industriels de point de vue quantit et qualit. Cependant, la cration des varits de cellules recombinantes par des moyens conventionnels est un processus coteux et parfois inefficace d l'imprvisibilit de l'expression du transgne par les cellules htes. Les mthodes exiges pour lexamen de ces varits de cellule haut pouvoir dexpression sont longues et chres. Il existe essentiellement cinq systmes de production de molcules recombinantes : les bactries, les levures, les cultures de cellules de mammifres, les animaux transgniques et les ~1~

Introduction Gnrale
plantes transgniques. Les avantages relis la production de protines dintrt commercial dans les bactries sont la simplicit du transfert de gnes dans cet hte et la facilit de gnrer rapidement un volume de production important. Par contre, les cellules bactriennes ne peuvent servir qu lexpression de molcules relativement simples, ne requrant pas de mcanismes de modification post-traductionnelle pour tre actives, comme linsuline, linterfron ou lhormone de croissance humaine, puisque ces mcanismes demeurent totalement absents chez les bactries (Gomord et al., 2004b). Certains problmes associs aux modifications post-traductionnelles des protines peuvent tre rsolus par lutilisation de cultures de levures (Capell et al., 2004). Par contre, lactivit de certaines molcules ncessite la prsence dun mcanisme de glycosylation similaire celui retrouv chez ltre humain pour assurer la fonctionnalit de ces protines. Les systmes animaux prsentent lavantage dutiliser un mcanisme de glycosylation menant lobtention de produits identiques la molcule dorigine (Daniell et al., 2001). Les cultures de cellules de mammifres, notamment les CHO, sont utilises depuis des dcennies pour produire la plupart des molcules recombinantes retrouves sur le march. Cependant, Morrow et al., 2001 estimaient que la capacit actuelle de production mondiale de cultures de cellules animales devait doubler afin datteindre les volumes requis uniquement pour la production des nouveaux anticorps dvelopps. Lchance est prs dtre atteinte et la capacit de production globale des cultures de cellules de mammifres est encore loin de suffire (Gomord et al., 2004a). La plupart des anticorps recombinants actuellement approuvs par la FDA (Food and Drug Administration) sont produits dans des cultures de cellules animales, telles que les CHO (Chinese Hamster Ovary). Cependant, considrant les quantits importantes danticorps ncessaires en immunothrapie, de lordre de deux cinq grammes par patient par anne, et la grande varit danticorps diffrents produire, il est vident que les systmes de culture de cellules animales ne peuvent suffire la demande. En effet, lobtention dun rendement lev dans un systme possdant un mcanisme de glycosylation identique ltre humain est possible par lutilisation danimaux transgniques. Cependant, leur obtention est un processus extrmement long et coteux. De plus, la possibilit de produire une molcule recombinante contamine par un pathogne humain endogne, tel un virus ou un prion, ou par une squence dADN (acide dsoxyribonuclique) oncognique est toujours prsente en utilisant un systme animal (Capell et al., 2004).

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Introduction Gnrale
Il savre donc indispensable que lindustrie des biopharmaceutiques se dote de systmes de production alternatifs offrant une capacit de production importante au cot le plus bas, tout en permettant lobtention dun produit actif et scuritaire (Daniell et al., 2001a). Les plantes transgniques offrent une combinaison unique davantages par rapport aux autres modes de production. Dabord, la capacit de production de ce systme est extrmement leve et peut facilement tre ajuste la demande. Ensuite, Twyman (Twyman et al., 2003) estime que les cots de production relis aux plantes transgniques reprsentent entre 2 et 10% des cots engendrs par lutilisation de cultures de cellules de microorganismes en fermenteur et seulement 0,1% des cots relis aux CHO. Ainsi, les plantes transgniques demeurent le mode de production le moins dispendieux. Des espces de levure essentiellement Pichia pastoris sont particulirement utilises rcemment par les industries pour la production d'enzymes extracellulaires. Des tudes ont donc t menes sur l'utilisation de ces organismes pour l'expression de protines htrologues. Les travaux prsents dans ce manuscrit ont t raliss essentiellement au sein de lUnit de Gnie Biologique 99UR09-26 visant dvelopper des mthodes de base pour permettre la mise en place de la technologie de production des protines recombinantes intrt thrapeutique et industriel dans diffrents systmes dexpression htrologues principalement la levure Pichia pastoris et Arabidopsis thaliana. Chez ces deux systmes, nous avons russi exprimer deux types de protines dintrt thrapeutique : La protine L1 de la capside du papillomavirus humain de type 16. Cette protine ayant une forte capacit dautoassemblage forme des particules virales non virulentes capables dtre utilises comme des vaccins prophylactiques. Cette protine a t exprime avec succs chez la plante modle dans la transgnse vgtale Arabidopsis thaliana . Un anticorps de type VHH dirig contre la neurotoxine AahI du scorpion Androctonus australis hector a t exprim chez la levure Pichia pastoris. Etant produit sous une nouvelle forme glycosyle, cet anticorps a montr plus defficacit vis--vis de la neurotoxine AahI considre. Ce rsultat prsente une nouvelle solution pour le traitement srologique des envenimations scorpionique avec plus de fiabilit.

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Synthse Bibliographique

TECHNOLOGIE DEXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES

I. Technologie dexpression des protines recombinantes : I.1. Gnralits sur la production des protines recombinantes :

Les protines d'intrt thrapeutique (enzymes, interfrons, hormones) taient extraites de sources naturelles telles que le sang, le placenta ou d'autres tissus humains, voire mme, dans certains cas, de tissus animaux. Toutefois, cette approche est limite surtout par la quantit de tissus humains disponibles. Les protines extraites partir de telles sources prsentent aussi des risques de contamination par des virus, notamment ceux du sida et de l'hpatite B, ou par des prions. Les protines d'origine animale prsentent galement le risque de dclencher des ractions allergiques chez l'homme. L'avnement de la technologie de l'ADN recombinant dans les annes 70, stimule par la dcouverte d'outils permettant de couper (enzymes de restriction) et de lier (ligases) des fragments d'ADN (Linn et Arber 1968), accompagn de mthodes de squenage de l'ADN (Maxam et Gilbert 1977 ; Sanger et al., 1977) a permis le dveloppement de nouvelles approches de conception et de production de protines, en utilisant divers systmes d'expression. Les gnes gouvernant la synthse des principales protines humaines d'intrt thrapeutique ont t identifis et clons, ce qui a permis une production de ces protines en grandes quantits par des organismes htrologues. Ces protines recombinantes constituent alors une alternative de choix aux protines naturelles. Aujourd'hui cette mthode est la plus utilise pour produire des protines d'intrt thrapeutique. Par exemple, l'insuline, au dpart isole du pancras de buf ou de porc, peut tre maintenant produite, grce cette technologie, dans la bactrie Escherichia coli. La protine ainsi obtenue est identique la protine humaine et est prpare l'chelle industrielle, sans le risque que le produit final soit par exemple contamin par les virus prsents chez les mammifres. Cela a ainsi abouti la commercialisation de l'insuline recombinante intrt thrapeutique par Eli Lilly en 1982 (Swartz, 2001). Aujourd'hui, l'insuline utilise pour traiter le diabte provient presque exclusivement de bactries ou de levures gntiquement modifies. Les protines recombinantes (d'intrt thrapeutique ou alimentaire) sont produites partir d'un transgne introduit dans un organisme htrologue par gnie gntique.

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TECHNOLOGIE DEXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES

Au sens large, un systme adapt la production d'une protine recombinante donne, est un procd biotechnologique qui s'appuie principalement sur : - l'emploi d'un vecteur d'expression (en gnral un plasmide ou un virus) jouant le rle de transporteur du gne codant pour la protine d'intrt, avec en amont du gne insr une squence de contrle de la synthse de la protine (promoteur inductible), trs utile lorsque le produit est toxique pour la cellule; - l'utilisation d'une cellule hte ou d'un organisme complexe (bactries, levures, insectes, plantes, animaux suprieurs), pour excuter les instructions fournies par le transgne; - une phase de production proprement dite permettant de synthtiser les protines souhaites; - une phase de sparation et d'extraction de la protine du milieu de culture ou du milieu intracellulaire, suivie de sa purification; - enfin, une phase de caractrisation/validation des proprits biochimiques, biophysiques, et fonctionnelles de la molcule recombinante obtenue. Une vaste gamme de systmes de production de protines recombinantes est aujourd'hui disponible (Andersen et Krummen ; 2002), chacun d'eux prsentant des avantages et des inconvnients. Avec une gamme de fonctions biologiques trs large, les protines sont communment utilises de nos jours pour de multiples applications biotechnologiques ou mdicales : - en recherche : enzymes isoles de microorganismes utilises dans des techniques de biologie molculaire (par exemple les enzymes de restriction ou les ADN polymrases); - dans l'industrie pharmaceutique: agents mdicamenteux (hormone de croissance, facteur de coagulation, anticorps,); - dans l'industrie agroalimentaire, dans les lessives. Parmi les protines ayant des applications mdicales produites sous forme recombinante, on peut citer l'insuline (traitement du diabte), le vaccin contre l'hpatite B, l'rythropotine (traitement de certaines formes d'anmies). D'autres procds sont susceptibles de concurrencer ces systmes de production de molcules intrt thrapeutique : - la synthse chimique, incluant les hmisynthses: celle-ci convient la synthse de peptides, avec une activit fonctionnelle quivalente aux protines recombinantes; mais la synthse chimique ncessite au pralable une connaissance des mcanismes d'action des protines;

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la thrapie gnique: elle consiste administrer un gne vectoris (vecteur viral ou vecteur de synthse) plutt qu'une protine; cependant, cette thrapie se situe encore au stade de l'exprimentation clinique. Les protines recombinantes actuellement commercialises sont produites majoritairement

par les systmes bactriens, levures ou cellules de mammifres. De nombreuses socits travaillent notamment au niveau des essais cliniques sur des protines recombinantes produites par des animaux ou des plantes transgniques. Toutefois, ce jour aucun de ces produits n'a achev son dveloppement clinique. Actuellement, le nombre de molcules recombinantes en cours d'tude clinique s'lve plusieurs centaines.

I.2. Biosynthse et modifications post-traductionnelles des protines : Les protines sont des constituants extrmement importants des cellules vivantes, tant d'un point de vue quantitatif (puisqu'elles reprsentent en gnral plus de la moiti du poids sec des cellules), que du point de vue qualitatif. A ct des protines dites structurales on trouve des protines ayant un rle biologique capital, en particulier les enzymes, catalyseurs biologiques indispensables au droulement des ractions dans les cellules des organismes vivants.

Figure 1. Rles biologiques des protines dans un organisme vivant

Certaines protines stockent et transportent une grande varit de particules et de molcules comme des lectrons, des cations mtalliques, de l'oxygne... En tant qu'hormones, les protines

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transmettent chez les organismes complexes l'information entre des cellules spcifiques et les organes. Notre systme immunitaire, qui nous protge contre une varit d'agents pathognes potentiels tels que les bactries ou les virus, repose sur les proprits de diffrentes protines ancres la surface des cellules ou bien circulantes (les plus connues sont les anticorps), qui participent la reconnaissance et l'limination de ces corps trangers. D'autres protines jouent un rle dans le contrle de l'expression des gnes en se liant des squences spcifiques d'acides nucliques, rgulant ainsi la transcription/traduction du gne impliqu. Elles sont aussi les composantes cruciales des muscles et d'autres systmes qui assurent la conversion de l'nergie chimique en nergie mcanique. Finalement, de nombreuses protines sont "simplement" structurales, impliques dans l'architecture des cellules ou d'autres matriaux prsents dans les cheveux, les ongles, les tendons ou les os. Malgr leurs fonctions biologiques trs diffrentes, les protines constituent une classe relativement homogne de molcules, savoir un polymre linaire construit partir de combinaisons varies des mmes 20 acides amins. Ces macromolcules diffrent seulement dans l'enchanement de ces units. Les protines naturelles possdent une taille et une squence d'acides amins qui leur sont propres, conformment l'information stocke dans le gnome. Leur diversit fonctionnelle repose en partie sur la diversit des caractristiques chimiques de leurs acides amins constitutifs, mais principalement sur la diversit de structures tridimensionnelles que l'enchanement de ces derniers peut former. La biosynthse des protines dans les cellules eucaryotes s'effectue partir de l'information gntique contenue dans l'ADN. Le code gntique est la cl qui permet le passage de la squence d'acides nucliques la squence d'acides amins. Dans une phase de maturation, les protines subissent d'abondantes modifications covalentes pendant et aprs leur synthse sur le ribosome. Ces modifications co et posttraductionnelles par la suite rsumes sous le terme "modifications post-traductionnelles" peuvent notamment servir en plusieurs niveaux la rgulation de l'activit des protines; leur tiquetage pour une reconnaissance par des partenaires mtaboliques ou par des systmes de dgradation; leur ancrage dans une membrane; la participation des cascades de signalisation; leur adressage pour qu'elles se rendent au bon endroit dans la cellule; dfinir une identit immunologique (comme les groupes sanguins,), etc.

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Les informations relatives ces modifications ne sont pas portes par les acides nucliques, mais dpendent de la nature de la squence protique, de la prsence dans la cellule hte de complexes enzymatiques, et parfois de systmes membranaires. Les modifications post-traductionnelles des protines permettent une meilleure adaptation de la protine sa fonction. Il existe diffrents types de modifications post-traductionnelles. Le tableau 1 prsente une liste partielle de celles que l'on peut rencontrer dans une protine. Cela peut tre l'ajout/retrait de groupements divers, l'acylation (ajout d'acides gras divers), l'ajout/retrait de glucides (simples ou complexes) ou de polypeptides...

Tableau 1. Exemples de modifications post-traductionnelles des protines. La dcouverte, le dveloppement, la production et les applications cliniques des protines recombinantes intrt thrapeutique chez l'Homme constituent un domaine de recherches scientifiques et mdicales en plein essor. Cela a engendr un considrable intrt dans l'tude des implications biologiques et thrapeutiques des modifications post-traductionnelles des protines,

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en particulier la glycosylation, sans doute la modification la plus sophistique. Ds lors, de nombreuses tudes sont apparues dans la littrature (Kobata 1992).

I.3. La glycosylation des protines : De trs nombreuses protines, dotes ou non d'une fonction enzymatique, sont des glycoprotines, et la prsence de glucides lis la chane polypeptidique accrot encore leur diversit. La plupart des glycoprotines sont typiquement des protines scrtes l'extrieur des cellules (enzymes, hormones, transporteurs, anticorps,), des protines localises la surface cellulaire ou dans la membrane plasmique. Elles sont trs largement rpandues dans les tissus animaux et vgtaux, et galement prsentes chez les micro-organismes et les virus (Spiro 2002). La glycosylation des protines est l'une des modifications post-traductionnelles les plus courantes puisque l'on estime que prs de 50% des protines produites par la cellule seraient glycosyles (Apweiler et al., 1999). Depuis la description de la liaison GlcNAc (1-)-Asn dans l'ovalbumine par Johansen et al. en 1961, de nombreuses autres liaisons sucre-protine ont t dcrites (Figure 2). 13 monosaccharides et 8 acides amins diffrents participent la formation des liaisons sucreprotine. Sur la base de la liaison forme entre les parties peptidique et glycanique, on distingue diffrents types de glycosylation (Figure 2) : - les liaisons N-glycosidiques, principalement sur les chanes latrales de l'asparagine; - les liaisons O-glycosidiques, sur les hydroxyles des chanes latrales de la srine, thronine, ou d'acides amins modifis comme l'hydroxylysine (Hyl) et l'hydroxyproline (Hyp); - les liaisons C-glycosidiques (C-mannosylation); - les liaisons P-glycosidiques via un pont phosphodiester; - la liaison entre l'ancre GPI et l'extrmit C-terminale de la protine. Les principaux types de glycosylation restent la N- et lO-glycosylation. Une mme protine peut porter la fois des structures N- et O-glycaniques. La glycosylation s'effectue en des positions dtermines de la squence, en nombre et en structure trs variables d'une protine l'autre. Ainsi, une mme protine peut exister sous plusieurs isoformes ou "glycoformes" (Rademacher et al., 1998) qui diffrent seulement par leur composition en glycanes : on parle de macro- et de micro-htrognit de la protine (Cunningham et al., 1996).

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Figure 2. Reprsentation des 5 types de glycosylation connus des protines (Spiro 2002). Abrviations : Ara, L-arabinose; DiAcTridH, DiActridsoxyhexose; Fuc, LFucose; FucNAc, Nactyl-L-Fucosamine; Gal, D-Galactose; GalNAc, N-actyl-DGalactosamine; Glc, D-Glucose; GlcNAc, N-actyl-D-Glucosamine; Man, DMannose; P, Phosphate; Pse, acide -Pseudaminique; Rha, L-Rhamnose; Xyl, DXylose. Les deux configurations et peuvent tre trouves. Dans les glycoprotines courantes les glycanes sont rpartis en courtes chanes renfermant des units caractristiques qui constituent la base des communications entre cellules, entre cellules et certaines hormones, entre cellules et particules virales, Les structures des glycanes la surface des protines sont trs varies car elles sont spcifiques de chaque type cellulaire. Toutefois, les glycanes prsentent des caractres communs. Par exemple, quelle que soit leur origine, les glycanes dits de type mucine possdent tous le "noyau" GalNAc (1-)-Ser/Thr, et les glycanes des N-glycoprotines contiennent tous le mme "noyau" pentasaccharidique :

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Sur ces noyaux se greffent des structures oligosaccharidiques spcifiques que l'on appelle "antennes". Les protines sont glycosyles d'une manire spcifique, dtermine notamment par leur cheminement travers l'appareil de Golgi, o la phase essentielle des N- et O-glycosylations est effectue. Cette modification est catalyse principalement par les enzymes de la famille des glycosyltransfrases. La localisation cellulaire ordonne et l'activit des enzymes impliques dans la glycosylation dfinissent la squence et la structure des glycanes associs la protine. A ce stade, la N- et la O-glycosylation sont traites sparment du fait des diffrences existant dans la biosynthse et les structures des glycanes. La N-glycosylation par exemple, schmatise ci-dessous, dbute dans le rticulum endoplasmique (elle est donc en cela co-traductionnelle) mais elle se poursuit dans l'appareil de Golgi o la maturation des N-glycanes de la protine a lieu ; elle est donc galement posttraductionnelle (Hubbard et Ivatt 1981). Les N-glycanes sont tout d'abord synthtiss sous la forme d'un prcurseur oligosaccharidique li par un groupement pyrophosphate un lipide particulier, le dolichol au niveau du rticulum endoplasmique (Abeijon et Hirschberg 1992). Le dolichol est une longue chane hydrocarbone (75-105 atomes de carbone), de structure polyisoprnique, capable de traverser plusieurs fois la membrane du rticulum endoplasmique. Le rsidu asparagine, site de la N-glycosylation, est situ dans une squence particulire reconnue par le complexe OST. Cette squence consensus (ou squon) est constitue du tripeptide Asn-X-Ser/Thr, o X peut tre n'importe quel acide amin except la proline (Gavel et Von Heijne 1990) (ce dernier ne peut d'ailleurs pas tre prsent immdiatement aprs la squence du tripeptide). Toutefois, mme si la glycosylation a lieu dans le rticulum endoplasmique sur une chane naissante d'une protine, la structure primaire du polypeptide n'est pas le seul facteur dterminant de la N-glycosylation de la protine car des rsidus asparagine situs dans une squence consensus et qui entrent dans le rticulum endoplasmique ne sont pas ncessairement glycosyls. Chez les mammifres, la maturation des N-glycoprotines dans l'appareil de Golgi conduit la synthse de trois principaux types d'oligosaccharides: les N-glycanes de type oligomannosidique; les N-glycanes de type hybride;

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les N-glycanes de type complexe (ou type N-actyllactosamine).

Figure 3. Biosynthse des N-glycoprotines (Sears et Wong 1998)

La synthse de ces trois types de N-glycanes est finement rgule par l'action (voire la comptition) de glycoside hydrolases et de glycosyltransfrases. Mis part le noyau chitobiosyle GlcNAc (1-4) GlcNAc, les N-glycanes de type oligomannosidique contiennent presque uniquement des rsidus mannose, lis entre eux par une grande varit de liaisons glycosidiques. Les N-glycanes de type complexe contiennent en plus du noyau pentasaccharidique commun toutes les N-glycoprotines, des rsidus galactose et N-actylglucosamine et peuvent possder leurs extrmits des rsidus galactose, N-actylgalactosamine, fucose et/ou des acides sialiques. Ces N-glycanes peuvent exister sous la forme de structures bi-, tri-, ttra- ou penta-antennes.

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Les N-glycanes de type hybride possdent gnralement les caractristiques des N-glycanes de type oligomannosidique sur la branche Man (1-6) et des N-glycanes de type complexe sur la branche Man (1-3). Plusieurs sites de N-glycosylation sur la mme protine peuvent tre glycosyls de manire diffrente. La squence peptidique, mais surtout la conformation de la protine, peut influer sur les diffrentes tapes rticulaires et golgiennes de la N-glycosylation en favorisant ou non l'accessibilit du substrat aux diffrentes glycosyltransfrases. Le type de cellule ainsi que l'tat physiologique de la cellule ont une influence sur la glycosylation (Goochee et Monica 1990). D'autres facteurs incluant le mtabolisme des nuclotides-sucres, leur transport dans le rticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi, la localisation et le taux d'expression des diffrentes glycosyltransfrases contribuent probablement l'htrognit des structures glycaniques observes dans les N-glycoprotines. Les rsidus glycaniques la surface des protines peuvent galement tre lis par une liaison de type O-glycosidique la chane latrale d'acides amins tels que la srine ou la thronine (Van den Steen et al., 1998). Dans le cas du collagne, on peut trouver galement des O-glycanes lis la chane latrale de l'hydroxylysine ou de l'hydroxyproline. Les liaisons O-glycosidiques sont diverses par leur structure, et sont caractrises par leur fragilit en milieu alcalin. La N-actylgalactosamine lie en la thronine est une situation frquente, mais ce n'est pas la seule. On la trouve par exemple dans les protines des groupes sanguins, des globulines plasmatiques, dans les glycoprotines membranaires. Chez les levures et les champignons, c'est souvent le mannose qui est li la srine ou la thronine. Chez les plantes, l'arabinose est souvent li l'hydroxyproline par une liaison plus rsistante l'hydrolyse alcaline que les liaisons O-glycosidiques communes. Les O-glycanes ne sont pas aussi faciles classer que les N-glycanes, du fait de leur trs grande varit. En effet, les structures lies aux protines peuvent tre aussi simples qu'un monosaccharide (par exemple le glucose ou la N-actylglucosamine) ou peuvent contenir plusieurs monosaccharides. Les structures glucidiques des groupes sanguins sont un exemple dO-glycanes. Ces derniers peuvent tre des oligosaccharides riches en galactose et en Nactylgalactosamine, o le fucose et l'acide sialique occupent des positions terminales. La Oglycosylation de type mucine reste l'une des plus courantes et donc des plus tudies.

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I.4. Les diffrents systmes de production des protines recombinantes: I.4.1. Les bactries : La bactrie Escherichia coli fut et reste encore le premier hte utilis pour l'obtention de protines recombinantes (Swartz, 2001; Andersen et Krummen 2002; Baneyx 1999). La gntique de cette bactrie est tout d'abord trs bien connue. De nombreux vecteurs plasmidiques ont t construits et sont donc disponibles afin d'insrer et d'exprimer un gne tranger au sein de la bactrie. De nombreuses souches ont t amliores afin d'optimiser l'expression de la protine d'intrt. Cette bactrie est facilement manipulable et se prte trs bien la culture de masse en fermenteur. Enfin, les taux d'expression obtenus sont levs (jusqu' plusieurs grammes de protine par litre de culture). Toutefois, la protine synthtise est souvent toxique pour la bactrie, empchant d'atteindre des cultures cellulaires de haute densit. Une alternative peut tre d'effectuer la production de la protine en deux tapes : une phase de croissance de la biomasse puis une phase d'induction de la biosynthse par ajout de l'inducteur du promoteur insr en amont du gne dintrt. D'autre part, il est souvent ncessaire de lyser la bactrie afin de rcuprer la protine qui est gnralement peu ou pas scrte (ce qui induit des problmes de purification, ou de solubilisation et de renaturation, quelquefois au dtriment des rendements). L'inconvnient majeur son utilisation vient surtout du fait que E. coli n'effectue pas de modifications post-traductionnelles caractristiques des protines humaines (en particulier la glycosylation, la carboxylation,) car les enzymes responsables de ces modifications ne sont pas prsentes naturellement dans la bactrie. Cela peut conduire au rejet des protines d'intrt thrapeutique par le systme immunitaire, rduire leur dure de vie dans l'organisme voire leur activit biologique. La protine produite peut notamment ne pas tre correctement replie. Enfin E. coli tant une entrobactrie, il est ncessaire de s'assurer de l'absence d'endotoxines dans les protines purifies. D'autres systmes de production bactriens se dveloppent galement aujourd'hui: Bacillus subtilis, Streptomyces. Ceux-ci possdent des capacits de scrtion suprieures E. coli. Cependant, leur gntique est souvent moins connue, et le niveau de production de protines recombinantes reste dans la plupart des cas infrieur celui obtenu avec E. coli. L'utilisation d'extraits d'E. coli in vitro est galement une option qui est envisage.

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Pour pallier les limitations du systme bactrien, l'utilisation d'autres organismes producteurs non-bactriens comme les levures ou les champignons, puis de cellules de mammifres ou d'insectes, voir de plantes ou de mammifres a t dveloppe.

I.4.2. Les levures et les champignons : Les levures offrent les mmes facilits exprimentales ou industrielles que les bactries, en particulier une culture aise en fermenteurs haute densit cellulaire, tout en possdant une machinerie cellulaire proche de celle d'une cellule humaine. La levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae est utilise depuis des millnaires dans l'alimentation humaine. Des exemples de protines recombinantes produites chez cet organisme sont l'antigne de surface du virus de l'hpatite B, l'insuline ou l'hirudine. Le matriel gntique de cette levure est simple et elle ne prsente aucune toxicit. De bons vecteurs d'expression (nombre de copies et stabilit) sont disponibles aujourd'hui. Les taux d'expression des protines sont relativement levs (de l'ordre de la centaine de milligrammes par litre de culture). La levure permet la production de protines complexes et la ralisation de modifications post-traductionnelles (glycosylations simples, carboxylations, acylations, formation des ponts disulfures, rupture protolytique). Nanmoins, les protines synthtises sont gnralement localises l'intrieur du cytoplasme et une tape de lyse de la cellule est ncessaire afin de les rcuprer. La scrtion est possible, mais en gnral au dtriment des rendements: elle fonctionne bien pour des petits polypeptides tels que l'insuline, mais beaucoup moins bien pour des protines de masse molculaire leve. D'autre part, la prsence de protases actives entrane la dgradation des protines htrologues exprimes, rduisant ainsi les rendements. Chez la levure Pichia pastoris (Cereghino et al., 2002), la surexpression des protines est bien rgule. De hautes densits cellulaires peuvent tre atteintes et la scrtion est efficace. La fermentation de cet organisme est donc bon march. Toutefois, les protines peuvent tre dgrades et la croissance des cellules est lente. D'autres levures sont galement utilises: Kluyveromyces lactis (production de la chymosine, enzyme alimentaire), Hanseluna polymorpha, Yarrowia lipolytica (production d'interfron-) Les champignons filamenteux sont des scrteurs naturels d'un certain nombre de glycoprotines (principalement des enzymes), souvent en quantits abondantes, et sont capables de se

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dvelopper sur des milieux relativement peu coteux. Des espces tels que Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae ou Trichoderma reesei sont particulirement utilises par les industries alimentaire et papetire pour la production d'enzymes extracellulaires. Des tudes ont donc t menes sur l'utilisation de ces organismes pour l'expression de protines htrologues (Maras et al., 1999). Les levures et champignons filamenteux produisent typiquement des glycanes de type oligomannosidique, en ajoutant jusqu' 100 rsidus mannose (dans le cas des levures) au niveau du noyau penta-saccharidique (hyperglycosylation) (Tanner et Lehle 1987 ; Herscovics et Orlean 1993). Cette hypermannosylation peut engendrer parfois une immunognicit de la protine chez l'homme. Chez les levures, le taux de glycosylation effectu par Pichia pastoris est plus faible (chanes plus courtes) que chez S. cerevisiae (Hamilton et al., 2003). De leur ct, les champignons filamenteux synthtisent le plus souvent des glycanes contenant un nombre

relativement faible de rsidus mannose (par comparaison avec les levures). Jusqu' maintenant, aucun oligosaccharide de type complexe contenant des acides sialiques, du galactose, du fucose et de la N-actylgalactosamine n'a t trouv dans les glycoprotines produites chez ces organismes. Le processus de N-glycosylation des protines chez les levures et les champignons filamenteux est semblable dans les tapes initiales au niveau du rticulum endoplasmique celui des mammifres, mais diffre de celui de l'homme au niveau de la maturation dans l'appareil de Golgi. Utilisation de la levure Pichia pastoris comme systme dexpression htrologue: Les levures offrent les mmes facilits exprimentales ou industrielles que les bactries, en particulier une culture aise en fermenteurs haute densit cellulaire, tout en possdant une machinerie cellulaire proche de celle d'une cellule humaine. La levure permet la production de protines complexes et la ralisation de modifications posttraductionnelles (glycosylations simples, carboxylations, acylations, formation des ponts disulfures, rupture protolytique). Nanmoins, les protines synthtises sont gnralement localises l'intrieur du cytoplasme et une tape de lyse de la cellule est ncessaire afin de les rcuprer. La scrtion est possible, mais

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en gnral au dtriment des rendements: elle fonctionne bien pour des petits polypeptides tels que l'insuline, mais beaucoup moins bien pour des protines de masse molculaire leve. D'autre part, la prsence de protases actives entrane la dgradation des protines htrologues exprimes, rduisant ainsi les rendements. Chez la levure Pichia pastoris, la surexpression des protines est bien rgule (Cereghino et al., 2002). De hautes densits cellulaires peuvent tre atteintes et la scrtion est efficace. La fermentation de cet organisme est donc bon march. Le processus de N-glycosylation des protines chez les levures, comme chez les champignons filamenteux, est semblable dans les tapes initiales au niveau du rticulum endoplasmique celui des mammifres, mais diffre de celui de l'homme au niveau de la maturation dans l'appareil de Golgi. Jusqu' maintenant, aucun oligosaccharide de type complexe contenant des acides sialiques, du galactose, du fucose et de la N-actylgalactosamine n'a t trouv dans les glycoprotines produites chez ces organismes. La levure Pichia pastoris est un systme performant de production dune large gamme de protines htrologues. Plusieurs facteurs ont rendu son acceptation trs rapide dans ce domaine, les plus importants sont ; (1) le promoteur puissant drivant du gne de lalcool oxydase I (AOXI) de Pichia pastoris comme seule lment de contrle de lexpression des gnes exognes, (2) la grande performance de cette levure la respiration pendant la culture, ce qui reprsente un avantage physiologique qui facilite sa culture haute densit relative la fermentation des levures et (3) la dcision de Phillips Petroleum en 1993 de la compagnie de Bartlesville Okla approuve par RCT (Research Corporation Technologies) de rendre la levure Pichia pastoris un systme dexpression dans les laboratoires de recherche universitaires, ce qui avait pour consquence de savoir plus les bases du systme comme tait dcrit dans diffrentes publications rcentes. Les plasmides conus pour l'expression de protines recombinantes chez P. pastoris prsentent plusieurs caractristiques communes. La cassette d'expression comprend le gne de lalcool oxydase comprenant ayant le promoteur puissant inductible AOX1, suivi d'un ou plusieurs sites uniques de restriction pour l'insertion du gne tranger, un lment de terminaison de transcription qui dirige le traitement efficace de la polyadnylation en 3' des ARNm.

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Comme pour Saccharomyces cerevisiae, l'ADN linaire produit des transformants stables de cellules Pichia pastoris par phnomne de recombinaison homologue entre les rgions homologues dans le gnome (Cregg et al., 1985 ; Cregg et al., 1989). De tels intgrants montrent une stabilit extrme en l'absence de pression slective mme lors dintgration en copies multiples. Notez que lvnement de simple crossing over (insertions) est beaucoup plus effectu que lvnement double (remplacements). Les vnements d'insertion au niveau des loci AOX1 (X-33 ou GS115) ou aox1::ARG4 (KM71H) rsultent d'un vnement de recombinaison homologue simple entre les loci et lun des deux rgions AOX1 du vecteur pPICZ ou pPICZ : le promoteur de AOX1 ou bien la rgion de terminaison de transcription (TT). Cependant, les insertions multiples se produisent spontanment environ 1-10% des vnements simples d'insertion. Le phnotype d'un tel transformant est Mut+ (X-33 ou GS115) ou MutS (KM71H). La linarisation du vecteur recombinant avec une enzyme de restriction dont le site est situ dans la rgion 5AOX1, donne naissance des transformants Mut+ ou MutS selon la souche Pichia utilise. Lintgration de la cassette dexpression au niveau du gnome de la levure P. pastoris se ralise souvent par recombinaison homologue au niveau des rgions 5AOXI (Mut+) et le gain de pAOX1, le gne d'intrt, et le gne de rsistance la zocine. Ceci se produit galement avec le plasmide non linaris mais une frquence infrieure.

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Figure 4. Evnement dinsertion de la cassette dexpression dans le gnome de Pichia pastoris Dans certains cas le phnomne de recombinaison seffectue au niveau des deux rgions 5 et 3 AOXI ce qui provoque le remplacement du gne AOXI en sa totalit. Pour une expression extracellulaire des protines recombinantes, on peut distinguer des vecteurs dexpression ayant une squence codante pour un peptide signal attach lextrmit Nterminale de la protine exprime. Ce peptide est le facteur de Saccharomyces cerevisiae compos de 72 acides amins et comprenant la fin un site de clivage reconnu par la protase Kex2. Certaines souches de Pichia pastoris (y compris X33) produisent naturellement la protase Kex2. La protine destine pour une expression extracellulaire sera mise laction de la Kex2 au niveau de lappareil de Golgi le moment de son adressage vers le milieu extracellulaire. Une autre caractristique de la levure Pichia pastoris comme tant un systme performant dexpression des protines recombinantes cest laugmentation du taux dexpression extracellulaire dans le cas o la protine exprime est N-glycosyle. En effet, Sagt et al., (2000) ont montr que lintroduction dun site de N-glycosylation au niveau de la squence de la protine recombinante exprime augmente son taux de scrtion extracellulaire.

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Ces vecteurs contiennent galement un site multiple de clonage (SMC) avec plusieurs sites uniques de restriction pour l'insertion de gnes avec pitope 6His et myc afin dobtenir des protines recombinantes tiquetes en C-terminal. Dans ce cas lidentification et la purification de la protine exprime sera plus aise. En cas dobtention de copies multiples de la cassette d'expression on peut raliser des digestions/ligations au niveau des sites BamHI/BglII prsents sur les vecteurs adopts. Le

processus de l'addition est rpt jusqu' six huit copies d'une cassette dans un mme vecteur qui est ensuite utilis pour transformer P. pastoris. Les vecteurs contenant un promoteur constitutif de P. Pastoris driv du gne de glycraldhyde-3-phosphate (GAP) sont aussi disponibles. Le promoteur de GAP est une alternative commode au promoteur AOX1 pour l'expression des gnes dont les produits ne sont pas toxiques pour P. pastoris et vite lutilisation du mthanol qui peut tre parfois problmatique. La levure P. pastoris possde le pouvoir d'effectuer plusieurs modifications post traductionnelles typiquement lies aux eucaryotes suprieurs. Ceci inclus lutilisation des peptides signal (pr et prpro-type), le repliement, la formation de ponts disulfures, et la N- et O-glycosylation. Par contre, les types de rsidus de sucre ajouts chez les eucaryotes infrieurs, y compris P. pastoris, ajoutent des O-oligosaccharides composs seulement de rsidus mannose (Man). Le nombre de rsidus Man par chane, leur faon de linkage, ainsi la frquence et spcificit d'O-glycosylation ne sont pas encore dtermins. Plusieurs faons efficaces de manipulation du systme de glycosylation de Pichia in vivo sont rcemment dcouvertes. Citant par exemple la dltion des gnes de glycosylation chez les levures et leur remplacement par des des gnes de glycosylation humains. Il existe aussi des vecteurs dexpression (srie des GlycoSwitch) qui favorisent la synthse de petits glycans de type uniforme lis lAsn sur n'importe quelle glycoprotine d'intrt. Les glycans en rsultant sont principalement Man8GlcNAc2 (GlycoSwitch-M8), Man5GlcNAc2 (GlycoSwitch-M5), GlcNAcMan5GlcNAc2 (GlycoSwitch-M5Gn) ou bien

GalGlcNAcMan5GlcNAc2 (GlycoSwitch-M5GnGal). Ces glycans ont la mme structure que ceux intermdiaires de la voie de N-glycosylation chez les mammifres.

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I.4.3. Les cellules de mammifres : Les cellules de mammifres ont permis de produire entre autres l'antigne du virus de l'hpatite B, l'hormone de croissance humaine, l'interleukine-2, l'interfron-, l'rythropotine ou des facteurs de coagulation Parmi les cellules de mammifres les plus utilises, on peut citer les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) et BHK (Baby Hamster Kidney). Les cellules CHO se prtent trs bien la culture de masse en bioracteur. Un avantage important de ces cellules rside dans leur capacit synthtiser des protines complexes (glycosyles) de masse molculaire leve. Certains vecteurs d'expression permettent d'introduire et de faire exprimer des gnes humains. Toutefois les rendements sont faibles (de l'ordre de 10 mg de protines par litre de culture au maximum). En outre les cellules CHO s'avrent fragiles et leur culture plus onreuse. D'autres systmes tels que les cellules NS0 (murine myeloma) ou les cellules humaines (HeLa) (Human cervical carcinoma), Jurkat (Human lymphocyte) sont galement tudis dans le but d'y produire des protines recombinantes. L'quipement des cellules de mammifres les plus couramment utilises (CHO et BHK) en enzymes impliques dans la synthse et le transport des nuclotides-sucres, ainsi qu'en glycosyltransfrases, apparat suffisant pour garantir une glycosylation des protines recombinantes de type complexe avec un haut degr de sialylation 2-3. Toutefois, ces systmes manquent d'enzymes telles que les 1,3/4-fucosyltransfrases ou les 2,6- sialyltransfrases, qui transfrent des motifs glycosidiques caractristiques en position terminale des N-glycanes des tissus humains. Chez la souris, la prsence de rsidus tels que l'acide N-glycolylneuraminique (Neu5Gc) sur les N-glycanes, driv de Neu5Ac potentiellement immunognique, est une limitation l'utilisation de ces cellules pour l'expression de protines recombinantes. Une autre voie consiste aujourd'hui utiliser des bioracteurs vivants en tant que systme de production de protines recombinantes. Il s'agit ici d'animaux vivants transgniques (lapine, chvre, brebis, vache) produisant dans leur lait, leur sang, leur urine ou mme leur sperme, une protine humaine. Diffrentes techniques de transgnse sont utilises : micro-injection dans les pronuclei ou dans le cytoplasme de l'embryon, vecteurs rtroviraux... Les animaux transgniques peuvent tre utiliss afin de produire des protines htrologues: production du facteur IX de la coagulation

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dans le lait de brebis transgnique, de lactoferrine humaine obtenue dans le lait de vache transgnique, d'hormone de croissance humaine dans le lait de souris, d'hmoglobine humaine produite dans le sang de porc L'intrt d'une production de protines recombinantes dans le lait ou le sang d'animaux transgniques se heurte cependant des niveaux d'investissements trs lourds et des problmes thiques.

I.4.4. Les cellules d'insectes : L'expression de protines recombinantes dans les cellules d'insectes (Spodoptera frugiperda ou Trichoplusia ni par exemple) (Altmann et al., 1999) est possible via l'utilisation de vecteurs d'expression dvelopps partir des Baculovirus pour l'infection des cellules. Ce systme prsente l'avantage de permettre une bonne expression de la protine, mme si ensuite les rendements finaux restent faibles par rapport ceux obtenus avec les bactries ou les levures mais bien meilleurs que ceux obtenus avec les cellules de mammifres. Les protines peuvent tre obtenues correctement replies. Les cellules d'insectes cultives en suspension, sont capables de scrter la protine recombinante et d'effectuer des oprations posttraductionnelles (similaires celles effectues dans les cellules de mammifres), notamment la glycosylation de la protine. Le cot de production, mme s'il est plus important que pour des systmes d'expression dans des bactries ou des levures, reste plus abordable que la production dans des cellules de mammifres. Toutefois, il est difficile de travailler avec ce systme sensible. Il prsente l'inconvnient d'tre un systme lytique, avec une protolyse possible de la protine cible, limitant ainsi les rendements. La glycosylation dans les cellules d'insectes conduit des structures glycaniques proches des structures d'origine humaine (type complexe) mais elle reste tout de mme incomplte (types oligomannosidique et hybride), avec l'absence ou le trs faible niveau de galactosyltransfrases et de sialyltransfrases dans les cellules. L'incapacit des cellules d'insectes synthtiser une forme d'acide sialique reste un sujet de controverse (Marchal et al., 2001). Dans certaines lignes d'insectes, il est possible de trouver des rsidus Fuc (1-3) qui s'avrent tre immunognes chez l'homme, limitant l'utilisation de ce systme pour la production de protines thrapeutiques. Enfin, la prsence d'une activit N-actylglucosaminidase indsirable a t dtecte dans ces cellules.

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I.4.5. Production des protines recombinantes chez les plantes transgniques : Les industriels misent de plus en plus sur les plantes pour produire des protines recombinantes, car elles prsentent de nombreux avantages (Giddings et al., 2000 ; Larrick et Thomas 2001 ; Fischer et al., 2004). Les cellules vgtales tant des cellules eucaryotes, elles disposent d'une machinerie cellulaire complexe et sophistique qui leur permet de produire des protines ayant des proprits thrapeutiques quivalentes aux protines humaines. Les diffrentes plantes utilises peuvent tre : Arabidopsis thaliana, le tabac, la luzerne, le colza, le mas, le carthame, le soja, le riz ou la pomme de terre. Le feuillage ou la graine sont les cibles prfrentielles de l'expression du transgne. La mise au point de plantes transgniques partir de vgtaux permet de produire une varit de protines recombinantes prcieuses ("molculture") : interfron, interleukine, facteur VIII de la coagulation, hirudine, anticorps ("planticorps") Les cellules vgtales transformes peuvent tre multiplies in vitro dans des bioracteurs, mais elles sont de plus en plus cultives dans des conditions qui permettent la rgnration de plantes mres, constituant ainsi l'usine de production. Malgr leur extrme diversit apparente, les plantes utilisent en grande partie les mmes fonctions, codes par des gnes semblables dune espce une autre. Les connaissances acquises sur une plante modle peuvent donc tre transposes aux plantes de grande culture, avec dautant plus de succs quelles sont proches du modle. La premire plante modle choisie par la communaut internationale pour linventaire des gnes vgtaux est une petite crucifre, cousine du colza et du chou, cest larabette ; Arabidopsis thaliana. Elle ne possde aucune qualit agronomique, mais son gnome de 125 millions de nuclotides est trs compact, compar ceux du mas ou du bl, respectivement 20 et 160 fois plus grands. Par ailleurs, A. thaliana est parfaitement adapte au travail de laboratoire : elle est si petite quelle peut tre cultive en tube essais, et une seule plante peut donner en quelques semaines plusieurs dizaines de milliers de graines. Le squenage des cinq chromosomes dA. thaliana, commenc en 1996 et achev la fin de lanne 2000, a repos sur une collaboration internationale de laboratoires publics avec la contribution du centre de recherche Franais Gnoscope.

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Toutefois, linventaire des gnes de larabette peut encore tre amlior par le squenage dADN complmentaires (ADNc), issus de la transcription des gnes de la plante. Le Genoscope, en collaboration avec lUnit de Recherche en Gnomique Vgtale Evry (INRA) et la socit Invitrogen, est engag dans lun des trois programmes de squenage dADNc dA. thaliana. Les protines recombinantes produites chez les plantes transgniques possdent une trs bonne qualit pharmacologique, les cellules vgtales disposant des enzymes ncessaires la maturation des protines. Les modifications post-traductionnelles des protines ralises dans des cellules de mammifres diffrent toutefois de celles ralises dans une cellule vgtale, ce qui ncessite quelques ajustements pour viter les risques d'allergie. Contrairement au dveloppement et l'levage d'animaux transgniques, trs coteux, il est possible d'obtenir avec les plantes, de grandes quantits de biomasse dans des conditions conomiques trs comptitives (cot de production des protines thrapeutiques rduit). En effet, l'extension de la culture des plantes productrices avec les infrastructures agricoles existantes permet une monte en puissance rapide et conomique des capacits de production. Les plantes ne sont pas porteuses des agents pathognes couramment associs aux infections humaines. Il n'existe pas, en l'tat actuel des connaissances, de pathognes vgtaux capables d'infecter l'animal ou l'homme. La synthse de la protine mdicament peut tre oriente dans les organes/tissus de la plante les plus faciles stocker et pour lesquels les procds d'extraction sont dj bien matriss dans le secteur agroalimentaire. Ainsi, lorsque la protine peut tre administre oralement, il est possible d'orienter sa synthse dans les organes comestibles de la plante : les semences de crales, dharicot ou de pois, les tubercules de pomme de terre, les racines de carottes ou de betterave, mais galement les fruits des bananiers par exemple. Restent donc principalement rsoudre les problmes de niveau d'expression des protines (rendements faibles), ainsi que d'extraction et de purification. Les plantes transgniques pourraient alors reprsenter un moyen de production efficace et peu coteux. La N-glycosylation des protines chez les plantes (Lerouge et al., 2000) est semblable celle des protines humaines dans ses premires tapes. Les structures glycaniques de type complexe sont possibles. Toutefois, comme chez les cellules d'insectes, la glycosylation reste incomplte (prsence des types oligomannosidique et hybride). L'addition de rsidus Xyl (1-2) et Fuc (13) est caractristique des N-glycanes des protines chez les plantes. Ces deux rsidus sont

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fortement immunognes chez l'homme et compromettent donc l'utilisation de protines thrapeutiques d'origine vgtale. Enfin, les acides sialiques ne sont pas prsents dans les protines chez les plantes.

I.4.5.1. Les techniques de transformation gntique des vgtaux : a- Les mthodes directes : Les principales techniques de transformation directe sont la biolistique, la microinjection, llectroporation, et le transfert utilisant le PEG (Poly Ethylne Glycol). La biolistique a t mise au point pour permettre la transformation gntique de plantes monocotyldones, plus difficiles transformer par les mthodes indirectes que les dicotyldones. Dans la biolistique ou bombardement de particules (Klein et al., 1987; Sanford, 1988), des cellules vgtales sont bombardes par des particules de tungstne ou dor sur lesquelles est adsorb lADN transfrer. Quand un de ces projectiles atteint le noyau, lADN port y est introduit, sintgre dans le gnome et peut exprimer ses gnes. Cette technique ncessite lutilisation dun appareil capable dacclrer les particules mtalliques ou canon particules. Il est possible de transfrer des organites subcellulaires et de lADN grce la microinjection. Le transfert dADN dans des protoplastes issus de cellules de msophylle de tabac a permis dobtenir 14% de transformant sans avoir recours la slection (Crossway et al., 1986). Llectroporation de protoplastes et de cellules intgres (Fromm et al., 1985; Lrz et al., 1985; Fromm et al., 1986; Arencibia et al., 1995) est base sur la capacit quont les macromolcules prsentes dans le milieu extracellulaire dtre acceptes lintrieur de cellules vivantes aprs un cours choc lectrique (Neumann et al., 1982).
2+

Le transfert en prsence de Ca /PEG a t utilis pour la premire fois par Uchimiya et ses collaborateurs (Uchimiya et al., 1986).

b- Les mthodes indirectes Les mthodes indirectes utilisent des agents pathognes tels que les virus ou les bactries. Les souches pathognes les plus souvent utiliss sont les Agrobactries: Agrobacterium tumefaciens (responsable de la galle du collet ou crown gall), et rhizogenes (responsable de la prolifration du chevelu racinaire ou hairy roots). Les transformations utilisant Agrobacterium tumefaciens prsentent beaucoup davantages sur les mthodes directes. Le nombre de copies du transgne ~ 26 ~

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transfr la plante est rduit, ce qui diminue le risque potentiel de co-supression et dinstabilit du transgne (Hansen et al., 1997). Cest aussi un systme o une cellule unique est transforme, ce qui vite ainsi lobtention de plantes chimres comme cest trs souvent le cas en transformation directe (Enriquez-Obregon et al., 1997; Enriquez-Obregon et al., 1998).

Figure 5. Mcanismes et principaux gnes impliqus dans le transfert de lADN-T dans les cellules vgtales. La plante blesse met des composs phnoliques et des sucres qui sont perus grce au complexe virA/virG. Leur phosphorylation dclenche lactivation des gnes de virulence dAgrobacterium tumefaciens. Lattachement de la bactrie la surface de la cellule vgtale se fait grce ses gnes chromosomiques (chv et att). Une copie simple brin de LADN-T est synthtise grce au complexe virD1/virD2, puis, elle est conduite dans la cellule vgtale grce aux protines virD2. Les protines virF et virB tablissent un canal entre la cellule bactrienne et la cellule vgtale. Le complexe T form de lADN-T et des protines virD2 (en 5 de lADNT) et virE2 (le long de la squence) entre dans la cellule vgtale, o VIP1 facilite leur migration dans le cytoplasme. Puis, il se dirige vers le noyau de la cellule vgtale et lADN-T sintgre dans le gnome vgtal notamment grce H2A-1. (Gelvin, 2003) Dans le cas de la transformation gntique des plantes par un ADN-T modifi, il a t dmontr que lADN-T est parfois rejet du gnome-hte, y laissant quelques empreintes de son intgration passe (Marton et al., 1994). Cette instabilit semble cependant tre limite au

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processus dintgration, puisquune fois intgre dans le gnome des plantes, lADN-T ragit comme lADN hte et est transfr dans la descendance (Tinland, 1996). Lutilisation des transposons comme transgne fait toutefois exception, puisque, par nature, ils se dplacent dans le gnome au cours des gnrations. Dans le cas de plantes transgniques destines la commercialisation, les semenciers font des tests de stabilit afin de vrifier la stabilit du transgne, le but tant dobtenir des lignes stables.

Figure 6. Modle simplifi reprsentant lintgration de lADN-T dans une squence dADN gnomique vgtale daprs Tinland, 1996. (a) Lextrmit 3 de lADN-T se fixe sur lADN gnomique par homologie, (b) puis lextrmit 5, associe virD2, se lie lADN gnomique par une homologie restreinte de un quelques nuclotides. (c) Il y a une digestion enzymatique dune partie de lADN vgtal, puis, la machinerie cellulaire synthtise le brin complmentaire en prenant lADN-T comme matrice. (d) LADN-T est intgr dans le gnome vgtal. La transgnse vgtale utilisant la bactrie Agrobacterium repose gnralement sur la stratgie binaire de transfert des gnes. Cette stratgie met en vidence deux plasmides. Lun porteur des gnes de virulences ncessaires pour le transfert de lADN-T vers le gnome de la plante (exemple pMP90 prsent dans la souche GV3101 dAgrobacterium), lautre est un plasmide binaire qui porte lADN-T avec ses deux bordures droite et gauche et contenant le gne dintrt au milieu. Cette stratgie est gnralement adopte dans le cas de la transformation des plantes par technique in planta (Clough et Bent 1998).

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I.4.5.2. Transformation gntique in planta : Plusieurs protocoles de transformation in planta ont t dcrits. Cette approche permet de transformer des plantes pour lesquelles la culture in vitro et la rgnration sont difficiles. Le principe de cette mthode consiste linoculation de la plante dans une suspension de bactries Agrobacterium contenant le vecteur binaire recombinant, ceci va permettre la transformation de certaines zones (exemple les ovules) qui seront lorigine de lignes germinales. Certains des descendants seront donc transforms avec le gne dintrt. Linoculation avec Agrobacterium se fait soit sur les organes reproducteurs, soit sur de jeunes pousses, ce qui permet de distinguer deux types de protocole. Ces protocoles sont faciles utiliser, ne ncessitent aucun savoir-faire complexe et permettent lobtention rapide de plantes transgniques. Nanmoins, peu despces vgtales peuvent tre transformes avec ces techniques (Bent, 2000). Jusqualors, Arabidopsis thaliana, Brassica campestris L., quelques autres brassicaces (Bent, 2000), Medicago truncatula (Trieu et Harrison, 2000), le sarrasin (Kojima et al., 2000) et larachide (Rohini et Sankara Rao, 2000) ont pu tre transformes par cette approche. Le faible nombre despces pouvant tre transformes par ce type de mthode peut certainement sexpliquer en partie par un manque de comprhension du phnomne de transformation gntique. I.5. Comparaison des diffrents systmes dexpression des protines recombinantes: Il est gnralement reconnu qu'il n'y a pas de systme d'expression universel disponible pour la production (biopharmaceutique) de protines, et que la slection d'un systme d'expression de protines htrologues dpend d'un certain nombre de critres. Tout d'abord, il y a les contraintes lies la protine exprime: qualit de la protine recombinante (repliement, modifications), ciblage cellulaire (rticulum endoplasmique, membrane cellulaire), immunognicit de la protine. Ensuite il y a des contraintes d'ordre exprimental: facilit de purification, cot/rendement du systme, cellules htes (densit de culture, temps de gnration), vecteurs (stabilit, nombre de copies, promoteurs).

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Figure 7. Critres de choix des systmes d'expression des protines recombinantes.

Les problmes majeurs dans le choix du systme restent le rendement, la protolyse, la toxicit de la protine envers la cellule hte, les modifications post-traductionnelles et le repliement de la protine. Aucun systme d'expression ne satisfait tous les besoins, et la production d'une protine X n'aura rien de comparable avec la production d'une protine Y. Un des plus importants critres considrer dans le choix d'un systme d'expression est de savoir si la protine d'intrt a besoin d'tre (correctement) glycosyle pour son application thrapeutique (Cumming 1991; Jenkins et Curling 1994). En effet, la glycosylation module de nombreuses caractristiques de la protine: repliement, scrtion, fonction biologique, temps de demi-vie, antignicit... Pour un certain nombre de glycoprotines, la prsence de sites spcifiques N-glycosyls est importante, mais la structure prcise des glycanes n'influence apparemment pas directement la fonction biologique de la protine. Le glycane va donc influer dans le choix de l'hte (Tableau 2) (Jenkins et al., 1996). Si la glycosylation n'a pas d'influence sur les fonctions biologiques de la protine, alors l'expression chez la bactrie E. coli est prfre. Si la glycosylation n'est pas indispensable pour les fonctions

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biologiques mais peut aider stabiliser la protine, alors la levure sera choisie (utilisation de souches mutes pour viter toutefois des chanes oligomannosidiques trop longues).

Tableau 2. Caractristiques des profils de N-glycosylation des diffrents systmes d'expression de protines htrologues.
(a : Compares avec le profil de glycosylation des protines humaines)

Dans le cas o la glycosylation est ncessaire l'activit biologique de la protine ou l'augmentation de sa dure de vie plasmatique, les cellules de mammifres seront prfres. Pour l'instant, les bactries (E. coli) et les levures (P. pastoris et S. cerevisiae) restent les systmes de choix. Cependant certaines protines, pour tre actives, doivent prsenter une glycosylation plus complexe et ne peuvent tre produites que dans des organismes suprieurs, des animaux (cellules CHO), ou des vgtaux. Jusquau milieu des annes 90, la bactrie tait lhte de choix pour produire une protine recombinante. Cette position dominante dcoulait essentiellement de ses proprits de croissance rapide, de son faible cot de production, de sa gntique trs tudie, et des rgles de scurit imposes pour la manipulation de lADN recombinant. Actuellement, avec le dveloppement des technologies de cultures cellulaires grande chelle, environ 60% 70% des protines dintrt pharmaceutique sont produites dans les cellules animales.

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Lautre raison de ce changement est laccroissement de la demande pour les anticorps recombinants humains ou humaniss (Brekke et al., 2003), qui sont frquemment peu produits dans la bactrie.

Figure 8. Critres de choix entre les diffrents systmes dexpression


Raskin et al., 2002

Le choix du systme dexpression est principalement guid par les modifications que la protine doit subir pour tre biologiquement active. Bien quil existe des techniques permettant le transfert rapide des gnes clons entre diffrents systmes dexpression, le vecteur gntique utilis pour exprimer le gne recombinant, doit tre adapt lhte choisi. De mme, il est important de connatre le compartiment cellulaire dans lequel la protine dintrt se replie ou

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exerce son activit biologique naturelle. Selon que cette protine est cytoplasmique, membranaire ou se replie dans un compartiment extra cytoplasmique (Figure 1), le vecteur devra contenir des squences spcifiques permettant ladressage correct de la protine.

Figure 9. Voies de repliement cellulaire des protines. Dans son contexte cellulaire, le repliement des protines est plus complexe que dans un tube essais. La compartimentation cellulaire, qui est une source de complexit rarement mime dans les tudes de repliement in vitro, impose un contrle prcis du repliement des protines qui doivent sinsrer ou franchir une membrane lipidique au cours de leur biogense. ce stade, lutilisation doutils informatiques prdictifs facilite lanalyse de la structure primaire des protines en apportant des indications quant sa localisation cellulaire. Ainsi, la prsence dune hlice hydrophobe indique que la protine est insre dans une membrane, ou doit ventuellement la traverser au cours de sa biosynthse pour atteindre un compartiment cellulaire diffrent du cytoplasme dans lequel elle est synthtise. La construction du vecteur gntique devra donc tenir compte de tous ces lments indispensables ladressage correct de la protine dans lhte cellulaire, surtout en cas dexpression htrologue. La glycosylation des protines oriente, videmment, vers une production extra-cytoplasmique dans les systmes dexpression eucaryote bien documents, comme les levures (Gerngross et al., 2004), les cellules de mammifres (Wurm 2004) ou encore les cellules vgtales (Hellwig et al., 2004). Cependant, une modification post-traductionnelle souvent nglige au sein des structures protiques est la

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formation des ponts disulfures. Indpendamment du systme utilis, procaryote ou eucaryote, il nest pas rare de trouver dans la littrature des essais de production infructueux, dans lesquels la protine est produite dans un compartiment cellulaire inappropri ne permettant pas cette modification. La formation des ponts disulfures est catalyse par un complexe enzymatique doxydorductases prsent dans un compartiment mtaboliquement oxydant, qui est soit le priplasme (Ritz et Beckwith 2001) pour les bactries Gram-ngatives, soit le rticulum endoplasmique (Wilkinson et Gilbert 2004) pour les cellules eucaryotes. Les protines possdant des ponts disulfures sont gnralement actives dans un milieu extra-cytoplasmique, et cette liaison covalente est le plus souvent ncessaire leur stabilit. Par consquent, la production des protines ponts disulfures dans lenvironnement rducteur du cytoplasme conduit le plus souvent des problmes de repliement. ct du choix eucaryote versus procaryote, une troisime possibilit a t apporte rcemment par lamlioration des systmes acellulaires qui, fonds sur le couplage des ractions de transcription et traduction in vitro, ont aujourdhui des rendements de synthse levs (Spirin 2004). Bien quils soient onreux, ces systmes permettent la production de protines toxiques et offrent une flexibilit incomparable, par rapport aux systmes cellulaires, pour manipuler les paramtres dexpression (Betton 2003). Enfin, le choix dun systme dexpression repose sur dautres critres comme sa simplicit dutilisation, le cot de production et de purification de la protine, la capacit de contrler le produit final et les modifications introduites, le temps requis du clonage du gne la protine purifie, et les contraintes rglementaires.

I.6. Etudes sur le repliement des protines recombinantes : I.6.1. Formation des corps dinclusion : Pour remplir leur fonction, les protines doivent adopter une conformation tridimensionnelle prcise, ltat natif, acquise au cours du repliement cellulaire. La synthse des protines au niveau des ribosomes est un processus universellement conserv, ce qui permet une bactrie de produire des protines humaines (Braun et al., 2002), par exemple. Cependant, de nombreuses protines ne sont pas produites dans leur tat natif, mais sagrgent dans un tat le plus souvent biologiquement inactif, que lon appelle corps dinclusion. Ce phnomne dagrgation est le principal obstacle la production de protines et, contrairement ce qui est couramment admis,

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la formation des corps dinclusion nest pas lapanage des systmes bactriens, mais sobserve galement dans des cellules eucaryotes. Le mcanisme molculaire de lagrgation des protines recombinantes suggre que les chanes polypeptidiques naissantes, adoptant des conformations partiellement replies et instables (les intermdiaires de repliement), peuvent emprunter deux voies alternatives et comptitives, selon une partition cintique (Kiefhaber et al., 1991): le repliement correct, qui conduit la forme native, ou le repliement incorrect, qui conduit lagrgation. Les corps dinclusion sont des agrgats protiques non ordonns (Fink 1998), relativement homognes et denses ; ils sont de plus en plus considrs comme des systmes en quilibre dynamique (Carrio MM, Villaverde 2002) entre association et dissociation despces partiellement ou incorrectement replies (Figure 2).

Figure 10. Formation des corps dinclusion. Illustration, partir dune chane polypeptidique naissante, des diffrentes ractions conduisant la distribution cellulaire des protines entre les tats replis, agrgs ou dgrads. La concentration trs leve des chanes polypeptidiques naissantes dans une cellule recombinante favorise les ractions dagrgation aux dpens de la raction productive vers ltat natif. Dans le contexte cellulaire, le repliement est facilit par un ensemble dacteurs : les chaperons, qui assistent les protines en cours de repliement des catalyseurs, qui interviennent sur les tapes lentes de ce processus, les oxydorductases, qui catalysent la formation des ponts

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disulfures, et les peptidyl-prolyl isomrases, qui catalysent lisomrisation cis-trans des liaisons peptidiques (Fischer 1996). En agissant sur les conformations intermdiaires, les protines chaperons contrlent directement le processus de repliement, en collaboration avec les protases cellulaires. En effet, les protines incorrectement replies sont galement les substrats cellulaires de systmes de dgradation en assurant llimination rapide (Wickner et al., 1999). Dans certains cas, lagrgation rsulte de la disponibilit limite des chaperons et induit une rponse au stress dans la cellule qui produit des quantits non physiologiques dune protine inutile. Cependant, la formation des corps dinclusion peut avoir un effet bnfique en protgeant la protine recombinante de la dgradation par les protases cellulaires.

I.6.2. Renaturation des protines in vitro : Bien quil nexiste pas dapproche universelle favorisant le repliement correct des protines qui sagrgent, plusieurs techniques permettant lobtention dune forme native sont couramment utilises, avec des taux de succs trs varis. Parmi elles, on distingue celles qui visent renaturer la protine in vitro partir des corps dinclusion purifis (Middelberg 2002) et celles qui interviennent directement sur lexpression cellulaire afin de minimiser les ractions dagrgation (Baneyx et Mujacic 2004). La purification des corps dinclusion est rarement une tape critique, dans la mesure o ces agrgats sont facilement isols par centrifugation aprs lyse cellulaire et contiennent la protine recombinante un degr de puret trs lev. Ltape suivante de solubilisation est en revanche souvent plus dlicate, car elle ncessite la dnaturation chimique complte de la protine agrge par des dnaturants forts comme lure 8M ou la guanidine 6M, ventuellement en prsence dun agent rducteur. Enfin, intervient ltape critique dlimination du dnaturant qui, ralise par dialyse ou forte dilution, favorise la renaturation de la protine. cette tape, certaines petites molcules peuvent tre additionnes la solution de renaturation, comme des dtergents, des alcools, des amides, ou de larginine (Clark 1999). En gnral, ces additifs, dont le mcanisme daction est souvent peu document, diminuent lagrgation des protines en inhibant leurs interactions intermolculaires. De mme, les paramtres de temprature et de concentration de protine sont contrls pour favoriser le repliement correct aux dpens de lagrgation. Pour les protines possdant une

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squence polyhistidine, la chromatographie de chlation mtallique constitue un troisime moyen permettant llimination du dnaturant tout en maintenant la protine fixe (Middelberg 2002). Cette mthode permet une sparation physique des protines lors de la renaturation sur la colonne, et limite donc les ractions dagrgation. Les inconvnients de ces diverses techniques de renaturation in vitro sont souvent les faibles taux de renaturation obtenus, les difficults doptimisation des conditions exprimentales spcifiques de chaque protine et la prcipitation de la protine renature. Pour ces raisons, il est souvent souhaitable dintervenir en amont, sur le systme dexpression ou sur le gne codant pour la protine, afin de promouvoir le repliement cellulaire. I.6.3. Minimiser lagrgation in vivo : Les mthodes doptimisation du repliement productif des protines recombinantes peuvent tre schmatiquement prsentes en deux catgories. Dans la premire, les facteurs cellulaires et les paramtres de culture qui influencent lexpression et le repliement des protines sont systmatiquement tests. Parmi ceux-ci, citons le contexte gntique de la cellule recombinante, la composition du milieu culture, la temprature de croissance des cellules, le nombre de copies du gne recombinant par cellule et son niveau de transcription ou de traduction, la surexpression des chaperons et linactivation des gnes codant pour les protases. En rgle gnrale, llvation de temprature augmente la vitesse dagrgation, puisque cette raction multimolculaire est domine par les interactions hydrophobes. En diminuant la temprature de croissance et le niveau de production, le repliement correct de la protine sera donc favoris. La variation de ces deux paramtres donne souvent des rsultats encourageants. Cependant, la manipulation de ces facteurs extrinsques nest pas toujours suffisante, et lon peut recourir une stratgie qui modifie gntiquement la squence de la protine recombinante, par lingnierie des protines. La premire approche, utilise le plus souvent pour faciliter leur purification, est la construction dune protine de fusion. Il est frquemment observ quune protine fusionne une protine dintrt par son extrmit N-terminale a une influence positive sur le repliement de cette dernire. Pour cette application, les systmes de protines de fusion les plus utilises sont la protine affine du maltose (MBP), la glutathion S-transfrase ou encore NusA pour lexpression chez E. coli. Cette stratgie augmente la stabilit intracellulaire de la protine recombinante et

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simplifie sa purification, qui est ralise en une simple tape chromatographique sur une colonne daffinit contenant le ligand immobilis de la protine de fusion. Cependant, la conservation de ces proprits bnfiques nest pas toujours assure aprs purification et clivage du partenaire de fusion. Une seconde approche est de rechercher, laide des techniques dvolution molculaire dirige, des variants de la protine dintrt qui ne sagrgent plus. Les grands programmes internationaux de protomique structurale, dans lesquels le nombre de protines cibles tudi est important, ont considrablement contribu aux dveloppements de cette approche qui requiert des dbits de criblage levs. Bien sr, les systmes dexpression bactrienne se prtent plus facilement ce type dapproche exprimentale.

Figure 11. Principe dune fusion par la GFP (Green Fluorescent Protein) pour tester le repliement cellulaire des protines recombinantes. La fluorescence spcifique de la GFP est acquise uniquement partir de sa structure tertiaire correctement replie. Si le repliement dune protine test, fusionne la GFP, conduit sa structure native, les bactries produisant la fusion seront fluorescentes. Au contraire, si la protine test sagrge au cours du repliement, la formation des corps dinclusion (visualiss par microscopie lectronique) bloquera le repliement de la GFP, et les bactries ne seront pas fluorescentes. Le principe est relativement simple et repose sur une proprit fonctionnelle spcifique de la protine de fusion utilise, indpendante de la protine cible. Dans ces approches, la protine de fusion la plus documente est la protine fluorescence verte (GFP), dont les proprits de fluorescence sont acquises par sa structure native et peuvent tre directement relies la solubilit intracellulaire des protines (Waldo et al., 1999).

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En effet, si une protine dintrt fusionne la GFP sagrge, elle entranera dans les corps dinclusion la GFP qui sera incapable de se replier: la cellule exprimant la fusion ne prsentera pas cette fluorescence verte caractristique. linverse, si la protine dintrt se replie correctement, la fluorescence spcifique de la GFP native sera mise par la cellule qui produit cette fusion. partir dune banque de mutants du gne cible, contenant des mutations ponctuelles, les variants fluorescents, donc solubles, seront ainsi isols. Gnralement, les substitutions dacides amins qui acclrent le repliement vers la forme native de la protine sont localises en surface, et contribuent une plus forte solubilit de la protine sans toutefois modifier sa fonction. Trs rcemment, cette technique a t amliore par lintroduction dun systme de deux fragments complmentaires dans la GFP qui limine un grand nombre dartfacts inhrents la technique originale (Cabantous 2005).

I.6.4. Contrle conformationnel des protines : La production dune protine ayant pour objectif dobtenir celle-ci dans une conformation proche de son tat natif, il est important de pouvoir contrler le produit final. Ce contrle final revt un caractre essentiel dans les cas o la protine recombinante est purifie aprs renaturation des corps dinclusion, ou dans le cas dune application thrapeutique (Chirino AJ, Mire-Sluis 2003), lobtention dune protine soluble ne signifiant pas toujours quelle est dans un tat natif. Un ensemble de techniques biochimiques comme llectrophorse et la chromatographie par gel filtration, ou biophysiques comme la spectromtrie de masse et le dichrosme circulaire, sont conduites pour tester lintgrit, lhomognit et la qualit des structures protiques. Si la protine est produite afin de dterminer sa structure tridimensionnelle, par cristallographie aux rayons X ou par rsonance magntique nuclaire, lobtention de cette structure est une excellente validation du processus complet. Mais les tests dactivits biologiques qui dpendent de la protine dintrt, et qui sont par nature trs varis, reprsentent la meilleure sonde de la structure native. Lvolution molculaire dirige est une mthode exprimentale qui mime, de faon acclre, le processus dvolution naturelle. La premire tape consiste crer un grand ensemble de mutations gntiques, par des techniques de mutagense alatoire, comme la PCR de basse fidelit (error prone PCR) ou la recombinaison de fragments de gnes (DNA shuffling). Puis on

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recherche dans la banque de variants, par slection ou criblage, les protines qui prsentent la proprit dsire, comme le caractre soluble de la protine recombinante. Laccroissement des connaissances aussi bien sur les principes gouvernant le repliement correct et incorrect des protines que sur le dveloppement doutils sophistiqus pour modifier le patrimoine gntique des cellules ou lautomatisation des mthodes dvolution molculaire sont autant de voies suivies ouvrant les perspectives les plus encourageantes dans ce domaine. De mme, la possibilit rcente de modifier gntiquement la bactrie pour quelle ralise la glycosylation des protines recombinantes (Zhang et al., 2004), qui tait hier encore une utopie, est devenue un pari technologique accessible.

I.7. La purification des protines : I.7.1. Dmarche globale de purification des protines recombinantes : Ce sont ses caractristiques intrinsques, celles qui rendent une protine unique et qui permettent sa sparation de ses congnres cellulaires. Une protine possde une masse, une forme, des structures primaire, secondaire, tertiaire et peut-tre quaternaire; elle a une certaine charge un pH donn, elle prsente une certaine densit; elle possde un certain degr dhydrophilicit ou d'hydrophobicit. Elle a peut-tre des isoformes suite un pissage alternatif. Elle se retrouve peut-tre dans une certaine rgion de la cellule ou dans une organelle donne. Elle a peut-tre t nantie, par gnie gntique, dun quelconque marqueur facilitant son identification, on cite comme exemple lHis6-Tag, la GST-Tagtout dpendant du choix du vecteur au dpart. En effet, les techniques de sparation utilisent diffrents aspects physico-chimiques des protines, telles que leur charge (chromatographie d'change d'ions), leur masse (filtration sur gel, gradients de densit) et leur solubilit (prcipitation diffrentielle au sulfate d'ammonium). En cas de lajout dune squence Tag, on est dirig vers la caractristique de laffinit utilisant des colonnes de rsines spciales ou des billes magntiques ayant des marqueurs daffinit. Lquipement disponible dans le laboratoire est lun des facteurs les plus importants dans le choix de cette stratgie. On nest pas oblig d'utiliser tous les paramtres en mme temps. Toutefois, les techniques et les mthodes dextraction et purification des protines recombinantes varient aussi en fonction du compartiment cellulaire o la protine est exprime.

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Diagramme montrant la procdure gnrale de purification des protines recombinantes partir de cellules en culture. Les squences dadressage dirigent la protine vers une expression extracellulaire ou bien membranaire. En labsence de ces derniers la production de la protine est intracellulaire. En gnral, la procdure de purification des protines recombinantes est prsente par le diagramme ci-dessus. I.7.2. Chromatographie daffinit : En cas de purification de protines recombinante exprime en fusion avec un marqueur protique (tiquette) on a recours la chromatographie daffinit.

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Figure 12. Principe de la chromatographie daffinit Cette mthode repose sur lutilisation dun type spcifique de rsine ou de billes magntiques qui fixent les protines dintrt par adsorption. Un lavage avec du tampon va liminer tout le matriel non fix. En dernire tape, la protine dintrt est rcupre par lution avec un agent comptitif qui dtache les protines fixes pour prendre leur place. I.7.3. Chromatographie dchange dions : En cas dabsence de squences de fusion on peut se baser sur le fait que chaque protine prsente son propre pHi, la sparation seffectue donc en fonction de la charge globale qui varie selon le pH du milieu tampon. Le principe de cette mthode repose sur le fait de passer un extrait brut sur une colonne contenant un tampon de pH bien dtermin. A ce pH la charge des protines dintrt doit tre loppos de celle de la rsine pour quelle sadsorbe sa surface. Un lavage avec du tampon est ncessaire pour dbarrasser des protines non fixes et des contaminants, puis on passe un gradient de sel pour luer et collecter les protines fixes. Les fractions collectes sont par la suite analyses pour identifier la protine dintrt. Ainsi les fractions gardes sont celles qui contiennent la protine dintrt la plus pure possible.

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Une fois la concentration dlution est connue, llution de la protine dintrt peut seffectuer directement avec un tampon de pH prcis sans passer par un gradient.

Figure 13. Principe de la chromatographie dchange dions I.7.4. Chromatographie dexclusion/diffusion (Gel filtration) : Une autre variante de chromatographie qui se base sur la sparation selon la masse des protines est le gel filtration, appele aussi technique de sparation par diffusion/exclusion. Gnralement cette tape vient aprs lchangeuse dions en dernire tape de purification.

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Figure 14. Principe de la Gel filtration

Plusieurs mthodes de dosage des protines ont t dcrites dans la littrature ; parmi lesquelles on peut citer la mthode Bicinchoninic acid (BCA) (Smith et al., 1985) et la mthode de Bradford qui prsentent une sensibilit de dtection importante. La sparation et identification des protines se ralise sur des gels dacrylamide en conditions natives ou dnaturantes (PAGE-Native ou PAGE-SDS). Ainsi la rvlation des protines est effectue gnralement par les mthodes de coloration au bleu de coomassie ou au nitrate dargent. Les protines recombinantes produites sont identifies et analyses grce diffrentes techniques partir du western blot utilisant les anticorps spcifiques pour dtecter la prsence de la protine une fois exprime passant par les techniques dHPLC, dlectrophorse 2D, la spectromtrie de masse jusqu la technique de dichrosme circulaire qui permet de dterminer le mode de repliement des protines synthtises et leurs structures secondaires. Les techniques de purification sont trs diverses en se basant sur la nature et les caractristiques physico-chimiques des protines produites qui sont en effet sujettes de plusieurs tudes allant du fondamental jusqu lappliqu et des fins structurales.

I.8. L'volution des protines : Dans certains cas, il est ncessaire de modifier une enzyme afin d'amliorer ses performances. De telles modifications peuvent tre introduites pour des objectifs divers: augmenter sa stabilit

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et sa solubilit, accrotre sa rsistance aux variations de pH et tempratures ou des agents agressifs ou encore amliorer son activit vis--vis d'un substrat d'intrt. Les premiers essais de modifications des protines taient bass sur des approches chimiques ou enzymatiques, mais plus tard l'introduction des outils d'ingnierie gntique a permis de raliser des modifications au niveau du gne, rendant possible des changements prcis tels que les substitutions, dltions ou insertions/extensions d'acides amins seuls ou de larges squences. La Figure 15 regroupe diffrents exemples d'ingnierie des protines la disposition du chercheur. On distingue les modifications par des voies chimiques ou enzymatiques, et les modifications effectues par gnie gntique. Une perce majeure dans le domaine de la modification de protines a t le dveloppement de mthodes de mutagnse dirige au niveau du gne codant pour la protine, en utilisant des oligonuclotides synthtiques (Hutchison et al., 1978). La PCR ("Polymerase Chain Reaction" ou amplification en chane par polymrase) a permis aux chercheurs d'amplifier de petites quantits d'ADN (Saiki et al., 1985). Des variations de la mthodologie dcrite l'origine ont eu un grand impact comme outils pour l'introduction de mutations spcifiques ou alatoires dans la squence d'ADN (Ling et al., 1997). Ces outils gntiques sont utiliss en routine aujourd'hui pour la conception et la production de mutants des protines par ingnierie. L'arsenal des outils disponibles est en perptuelle augmentation, avec la mise au point de mthodes de synthse de peptides et de petites protines artificielles (Merrifield, 1963), l'introduction d'acides amins non-naturels (Noren et al., 1989 ; Bain et al., 1989) (qui peuvent ensuite subir des modifications chimiques) et la cration de mutations distribues alatoirement le long de la squence du gne. L'ingnierie des protines peut impliquer l'une et/ou l'autre des approches suivantes. Dans la premire, les informations structurales et mcanistiques sont utilises pour identifier les changements ncessaires l'obtention d'une protine possdant les proprits souhaites. Dans une seconde approche, l'emploi de mthodes alatoires permet d'effectuer des recherches de nouvelles fonctions sans avoir une connaissance trs prcise des modifications requises. Dans certains cas, l'approche alatoire peut tre combine avec la conception rationnelle pour rduire la taille de la squence d'ADN sur laquelle l'volution est effectue en ralisant des substitutions, des insertions et/ou des dltions d'acides amins seuls ou de squences plus importantes, voire de domaines entiers.

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Figure 15. Exemples de principes d'ingnierie des protines disponibles l'heure actuelle. GA, glutaraldhyde; P, phosphate; PEG, polythylne glycol.

Des connaissances sur la protine tudie sont ncessaires pour dterminer les modifications ncessaires effectuer. La croissance rapide du nombre de structures tridimensionnelles rsolues par cristallographie des rayons X ou par RMN (Berman et al., 2000), la protine tant seule ou en complexe avec d'autres molcules, a contribu normment la comprhension des relations structure/fonction des protines. Les informations structurales peuvent permettre d'identifier des

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rsidus ou rgions importants impliqus dans la catalyse, les liaisons au substrat ou au ligand, et de faire des prdictions pour modifier la protine dans le but, par exemple, d'augmenter sa stabilit, sa solubilit et/ou altrer d'autres proprits, notamment sa spcificit de substrat. Dans le cas o des donnes structurales ne sont pas disponibles, la mthode appele "scanning mutagenesis" peut tre une option. Les zones qui peuvent tre importantes sont analyses par substitution d'un acide amin la fois, suivie par une analyse fonctionnelle des mutants exprims pour explorer l'effet de la substitution. L'alanine est un des acides amins le plus souvent utilis comme substitut; on parle "d'alanine scanning". En effet, l'alanine est considr comme un bon rsidu de substitution car il ne modifie pas l'orientation de la chane peptidique, contrairement la glycine ou la proline, et ne possde pas de caractristiques striques ou lectrostatiques particulires (Cunningham et Wells, 1989). Cette mthode peut galement tre utilise pour analyser la contribution de chaque acide amin potentiel impliqu dans une fonction spcifique. Diffrentes approches de conception rationnelle sont disponibles l'heure actuelle : - la mutagnse dirige : une ou plusieurs substitutions, identifies par des mthodes trs diverses (modlisation molculaire par exemple), sont ralises; - les extensions ou les troncatures : cela comprend la construction de protines de fusion ou de mutants possdant des domaines dlts; - la conception de novo de protines. Les altrations de la squence peptidique sont principalement cibles sur des positions au niveau ou proches des rgions directement relies la fonction tudie, tel que le site actif des enzymes. Toutefois, des effets dramatiques sur la fonctionnalit peuvent aussi avoir lieu grce des modifications au niveau de rgions loignes de la partie active de la protine. Mais de telles substitutions seraient trs difficiles prdire par une simple approche rationnelle. C'est ce niveau qu'intervient l'volution dirige des protines. L'volution dirige runit un ensemble de mthodes qui tentent de mimer au laboratoire les processus de l'volution naturelle, dans un laps de temps trs court. Les dveloppements rcents de la biologie molculaire permettent de reproduire efficacement dans un tube essai les deux moteurs de l'volution que sont la mutation et la recombinaison. Combines des stratgies de criblage de plus en plus puissantes et sophistiques, ces mthodes aboutissent en quelques cycles faire voluer une protine dans la direction dfinie par l'exprimentateur.

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Les premiers champs d'application de ces mthodes concernent les biocatalyseurs et les anticorps, domaines o la diversit naturelle peut sembler immense, mais pour lesquels l'volution naturelle a slectionn des fonctions selon une logique biologique, qui ne rpond pas forcment aux critres des biotechnologies. Pour raliser une telle volution dirige des protines, il faut donc : - une stratgie efficace d'volution; - un systme d'expression dans lequel l'enzyme modifie sera exprime sous forme fonctionnelle; il peut s'agir de l'organisme d'origine, d'un organisme recombinant ou mme d'un systme in vitro; en gnral les bactries ou les levures sont utilises; - un crible ou une mthode de slection adapte la proprit recherche. Les sources de diversit la disposition du chercheur sont nombreuses. L'tape commune toutes les stratgies employes est la cration d'une banque de gnes partir desquels seront produites les protines. Selon le projet et la classe de protines tudis, de telles banques peuvent tre gnres partir de diverses sources naturelles et/ou la variabilit gntique peut tre gnre par l'homme in vivo ou in vitro par des techniques d'ingnierie gntique trs sophistiques. Parmi les mthodes de mutagnse alatoire, on peut citer la mutagnse chimique, l'irradiation UV, la recombinaison homologue, la mutagnse alatoire par cassette. L'utilisation de souches mutatrices inactives au niveau de leur systme de rparation de l'ADN permet d'obtenir des plasmides comportant des mutations. La PCR mutagne, ou sujette erreurs ("error prone PCR"), repose sur l'infidlit d'ADN polymrases (notamment la polymrase Taq); les erreurs sont introduites pendant l'amplification de l'ADN et peuvent varier en nombre selon la concentration en ions magnsium ou manganse dans le milieu ou par abaissement de la concentration d'un nuclotide. Le rarrangement d'ADN ou redistribution de l'ADN ("DNA shuffling"), dvelopp en 1994 par Stemmer et al. 1994, consiste fragmenter de multiples copies d'un gne (avec plus ou moins de mutations introduites) puis les rassembler alatoirement. Ces mthodes de mutagnse alatoire peuvent gnrer un trs grand nombre de mutants qui doivent ensuite tre tudis pour la nouvelle proprit recherche. L'identification des mutants avec la proprit cible peut tre effectue selon deux approches : le criblage (examen de chaque mutant sparment pour une proprit prcise) et/ou la slection (seuls les mutants possdant la nouvelle proprit survivent). Pour cela, de nombreuses mthodes d'analyse sont disponibles

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pour tester les fonctions des protines produites, souvent adaptes chaque protine. Ensuite, l'tape suivante est la dtermination des mutations introduites dans la squence protique. L'amplification et le squenage de l'ADN tant faciles mettre en uvre, de nouvelles mthodes ont t dveloppes afin de lier physiquement chaque protine produite sa squence d'ADN correspondante, autrement dit des techniques o le phnotype et le gnotype sont lis (Lin et al., 2002). On peut citer par exemple des techniques telles que le "phage display" (prsentation de phage) ou le "cell surface display" (prsentation la surface des cellules).

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II. Les Papillomavirus Humains : sont estims tre attribus aux agents infectieux (Pisani et al., 1997). Linfection par les papillomavirus (PVH) compte peu prs 30% de ces infections; soit environ 5% du total des cancers. Les PVH infectent les strates de lpithlium squameux de la peau et des muqueuses o ils causent des lsions bnignes dont quelques-unes peuvent se dvelopper en cancers invasifs (Lowy et Howley, 2001; Zur Hausen, 2002; Bosch et al., 2003). Pour tablir linfection, il est possible que lrosion se produit au niveau des couches externes de lpithlium afin daboutir la couche basale, o se trouvent les cellules souches. Les traumatismes prennent place vers les derniers mois ou annes de linvasion puisque le gnome viral parasite toute la couche externe de cellules, ainsi le virus vite le systme immunitaire par la limitation de lexpression de la majorit des gnes virales et la rplication dans les couches cellulaires supra basales. Cest pour cela que la plupart des infections se limitent vraisemblablement cause de la russite de la rponse immunitaire. Les lsions bnignes induites par PVH englobent les verrues de peau urognitales et non gnitales, les papillomes orales et laryngales et les condylomes mucorales et anognitales qui sont en gnrale sexuellement transmissibles. Une longue dure dinfection par un type de Papillomavirus peut induire une tumeur anognitale maligne, citant les cancers de lanus, du penis, du vagin et du cerveau (Frisch, 2002; Gillison et Shah, 2003 ; Schiffman et Kjaer, 2003). Une proportion des cancers buccognitaux est contribue aux PVH (Gillison et Lowy, 2004 ; Szentirmay et al., 2005) mais occasionnellement avec le cancer de lsophage et de la peau (Gillison et Shah, 2003 ; Pfister, 2003) parmi les cancers attribus aux infections par PVH, le cancer cervical a reu la plus grande attention (Yang et al., 2004). En effet, il compte environ 10% des cas de cancers chez les femmes dans le monde. Cest la seconde cause de cancer mortel chez les femmes aprs le cancer des seins. Lintervalle entre lacquisition de linfection par le virus et la progression maligne est gnralement de 10 ans et cest frquemment plus longtemps (Schiffman et Kjaer, 2003 ; Snijders et al., 2006). Les incidents augmentent progressivement pour les femmes plus que 25 ans et elles sont plus importantes au-del de lge de 40 ans.

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Parmi les 10 millions des cas de cancer dvelopps chaque anne dans le monde, plus que 15%

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Environ 80% des cancers cervicales sont localiss dans les pays moins dvelopps, cancer cervical pour la dtection danormalits via Pap smear testing ou pour la prsence dADN de PVH (Wright et al., 2002). Pratiquement tous les cas des cancers cervicaux sont attribus lacquisition dune infection sexuelle par le PV (Bosch et al., 2002), bien que cette infection prsente une proportion variable (les deux tiers) des autres tumeurs dont le virus est impliqu tiologiquement. La plupart des infections gnitales par PVH sont bnignes, supra cliniques et autolimites. Aussi une proportion importante des infections associes aux dysplasies cervicales de faible degr encore rgressent spontanment (Schiffman et Kjaer 2003 ; Baseman et Koutsky, 2005). Par contre, les types oncogniques, essentiellement types 16 et 18, prsentent un facteur de risque pour une dysplasie de haut degr (Khan et al., 2005) et cest un type de lsion qui est reconnu comme prcancreux et qui doit tre trait pour arrter le dveloppement dun cancer invasif (John Doorbar, 2005). Ce type de cancer peut tre induit par nimporte quel virus des 15 types oncogniques de PVH, mais les types 16 et 18 prdominent avec environ 50 et 20%, respectivement (Munoz et al., 2004). Ces deux types prsentent aussi un rle important dans linduction des cancers gnitaux et mucorales (Gillison et Shah, 2003). Ainsi, les tudes statistiques ont conduit penser que linfection gnitale par PVH sera la plus commune des infections virales sexuellement transmissibles avec une prvalence estime 20-40% des femmes sexuellement actives lge de 20 ans. II.1. Gnralits sur linfection gnitale PVH : Les papillomavirus sont extrmement rpandus. Il en existe plus d'une centaine de types qui prsentent un tropisme cutano-muqueux. Des PVH sont retrouvs dans prs de 100% des cancers du col de l'utrus. L'association entre ce cancer et la prsence de PVH (16 ou 18) est de 50 fois plus leve que celle entre tabagisme et cancer du poumon. Ce cancer, volution lente, met plus de 10 ans se dvelopper depuis la premire infection jusqu'aux diffrentes lsions histologiques prcancreuses accompagnant la persistance de l'infection. Donc, prcd de nombreuses lsions prcancreuses curables, ce cancer est un candidat idal au dpistage, mais un grand pourcentage de femmes chappent ce dpistage,

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premirement parce quils manquent de programmes didentification dune qualit leve de

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surtout dans les pays en voie de dveloppement. Par consquence, la persistance du virus peut Linfection HPV est responsable, chaque anne, de plus de 470 000 cas de cancer du col de lutrus dans le monde et denviron 190 000 dcs dont 35 000 aux tats-Unis et en Europe (Ferlay et al., 2002).

Figure 16 : Etude pidmique des infections par le papillomavirus humains Mme si le dpistage rduit le risque de cancer cervical, il nempche pas le dveloppement des lsions prcancreuses et le taux de couverture de la population est trs insuffisant, particulirement dans les pays en voie de dveloppement mais galement dans certains pays dvelopps. Linfection par les PVH gnitaux est une infection sexuellement transmissible, touchant principalement les jeunes femmes entre 20 et 30 ans, acquise trs prcocement lors de la vie sexuelle (40% dans les deux ans qui suivent le premier rapport). En France, 18% des adolescentes de 15 ans auraient eu des relations sexuelles, avec un ge moyen des premiers rapports 17ans (Bozon 2003). Actuellement, environ 25 30 millions de femmes seraient porteuses de PVH gnitaux en Europe. Une tude franaise portant sur 3832 patientes donne une

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conduire au dveloppement de lsions malignes.

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prvalence globale des PVH de 14,32% dans la population gnrale (Boulanger et al., 2004). Le lorigine de condylomes mais elle est aussi responsable des lsions au niveau du col avec des frottis anormaux, des lsions intra-pithliales et des cancers invasifs (Bosch et al., 1995).

Figure 17. Histoire naturelle de linfection au PVH et du cancer du col de lutrus.

Les condylomes sont des lsions bnignes dues des papillomavirus. Parmi les gnotypes de PVH bas risque oncognique, les types 6 et 11 seraient retrouvs dans prs de 90% des lsions (condylomes et LSIL). On estime quen France surviennent chaque anne 300.000 600.000 nouveaux cas de condylomes, ce qui place linfection PVH en tte des infections sexuellement transmissibles, avec un cot psychologique et conomique important. Des papillomavirus sont retrouvs, selon une tude mondiale, dans prs de 100% des cancers du col (Walboomers et al., 1999). En France par exemple, le cancer du col de lutrus aurait une incidence de 3400 nouveaux cas et serait lorigine de 1000 dcs fminins par an (Figure 29). Quant aux gnotypes dHPV haut risque oncogne impliqus dans le dveloppement du cancer du col, les types 16, 18, 31, 33, et 45 sont 83% au niveau mondial. La prdominance dun tel gnotype ou autre peut varier selon les pays. Les types 16 et 18 reprsentant plus de 70% des cas

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risque de contracter une infection HPV durant une vie entire serait de 80%. Cette infection est

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de cancer du col en Europe occidentale (Bosch 2003). Mais la rpartition gnotypique nest pas

Figure 18. pidmiologie des infections PVH et du cancer du col de lutrus en France (donnes prsentes par lInstitut National de Veille Sanitaire, 2003). Les papillomavirus sont galement impliqus dans le dveloppement dautres cancers des muqueuses gnitales (anus, vulve et pnis) et lorigine dun pourcentage lev de cancer de loropharynx, du larynx ou encore de la cavit buccale. Une vaccination contre les papillomavirus pourrait ainsi prvenir 15% des cancers de la femme et 10% des cancers de lhomme.

II.2. Morphologie et structure des Papillomavirus : Les papillomavirus appartiennent la famille des Papillomaviridae, ceux sont des virus capside icosadrique de 45 55 nm de diamtre, forme de 72 capsomres. Leur gnome (8Kb) se prsente sous forme dADN bicatnaire circulaire dont un seul brin est codant. Parmi les neuf protines codes, L1 et L2 forment la capside protique (L1 tant la plus majoritaire) tandis que E6 et E7 sont impliques dans la transformation maligne des cellules pithliales en se liant, respectivement, aux protines p53 et p105Rb (Fig. 19).

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ce jour connue en France.

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Figure 19 : Organisation des gnes et protines virales du PVH Daprs des tudes de lInstitut Pasteur de France (Mai 2008), ils existent actuellement environ 200 types de papillomavirus susceptibles d'infecter l'homme. Certains de ces virus affectent la peau, d'autres les muqueuses buccales, anales ou gnitales. Parmi les PVH tropisme muqueux, on distingue ceux bas risque oncogne dont la prsence peut conduire au dveloppement de lsions de bas grade (condylome ou LSIL [Low grade Squamous Intraepithelial Lesion]) et dautres haut risque oncogne impliqus dans le dveloppement de lsions de haut grade (HSIL [High grade Squamous Intraepithelial Lesion]) ou de cancer.

II.3. Les protines virales de PVH: II.3.1. Les protines prcoces : Ces protines se prsentent en 7 types nommes E1 E7 ayant chacune une fonction bien dtermine. La protine E1 est implique dans la rplication virale. Cest une phosphoprotine nuclaire avec une fonction hlicase ncessaire la rplication virale et au maintien du gnome viral sous forme pisomique. Cette protine reprsente avec la protine E4 une structure de fusion E1E4 qui sassocie avec les tonofilaments et joue un rle dans la destruction des assemblages de kratine dans les cellules hautement diffrencies, permettant ainsi la libration des particules virales (C. Mougin et al ; 1998).

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La protine E6 des PVHs haut risque possde des proprits immortelles et de transformation. p53 via le systme de lubiquitine entranant alors la dgradation cellulaire des protines. Ainsi la protine E7 possde la capacit de se lier avec le gne suppresseur de tumeur du rtinoblastome avec la protine p21 qui intervient dans la rgulation du cycle cellulaire. Elle coopre avec la protine E6 pour limmortalisation des cellules pithliales et des kratinocytes, et participe leur transformation lorsque les cellules sont transfectes par les gnes v-ras et cmyc. La protine E7 peut galement transformer des cellules de rongeurs NIH3T3 sans tre associe la protine E6.

II.3.2. Les protines tardives : a- La protine L1 : La protine L1 dont la masse molculaire varie de 55 60 KDa selon le type de papillomavirus considr. Elle est la protine structurale majeure de capside puisquelle reprsente 80% des protines de la capside. Une analyse de la squence primaire a permis de dfinir 4 sites de N-glycosylation dont le rle nest toute fois pas clairement dfini, ainsi que deux signaux fonctionnels de localisation nuclaire (NLS) situs en position C-terminale. La protine L1 seule, possde la capacit de sauto assembler in vivo pour former des capsides virales lorsquelle est exprime dans diffrents systmes dexpression, et in vitro dans des conditions stringentes dfinies. La protine L1 a par ailleurs la capacit de fixer lADN par lintermdiaire dun domaine correspondant aux 11 acides amins de la rgion C-terminale. Ce domaine de liaison identifi initialement partir de la protine L1 du PVH 11 na cependant pas t retrouv sur la protine L1 du HPV 16. b- La protine L2 : La protine L2, protine mineure de la capside virale, a un poids molculaire de 70 KDa. Deux signaux de localisation nuclaires situs en positon N et C-terminale ont t dcrits. Elle possde galement un domaine trs conserv, riche en lysine et arginine, qui correspond aux 11 acides amins N-terminaux lui confrant des proprits de liaison lADN. Par ailleurs, la protine L2 joue un rle important dans lencapsidation de lADN viral.

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La voie daction de cette protine virale passe par la dgradation de la protine anti-oncogne

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De point de vue morphologie, les protines L1 et L2 sont semblables et forment toutes les deux

c- Assemblage de la capside des papillomavirus : La capside icosadrique des papillomavirus est compose de 72 capsomres. Lanalyse en microscopie lectronique a montr lexistence de 12 pentons et 60 exons disposs selon un angle de triangulation T=7. La capside est ainsi constitue par lassemblage de 360 protines L1 et 12 protines L2. La prsence de la protine L2 ne modifie pas la structure des capsomres. Lexpression des protines L1 et L2 dans diffrents systmes dexpression a permis dtudier leurs rles respectifs au sein de la capside et de dterminer les squences indispensables pour la formation de la capside virale (H. Warzecha et al ; 2003). Des capsides recombinantes (VLPs)des papillomavirus ont t obtenues par expression de la protine L1 seule ou bien L1 associe la protine L2 dans diffrents systmes dexpression eucaryotes comprenant lutilisation de baculovirus, de virus de la vaccine, de virus de la fort de Semliki et de levures recombinantes.

Figure 20. Structure dune particule virale de Papillomavirus (E1 E7 : gnes prcoces ; L1 et L2 : gnes tardifs).

Quand la protine L2 est co-exprime avec la protine L1 dans les cellules eucaryotes, celle-ci est incorpore de faon stable dans les capsides avec un rapport dune protine L2 pour 30 L1.

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la capside virale.

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Les VLPs (Virus Like Particles) sont constitues soit de la protine L1 seule, soit de la protine

II.3.3. Classification des Papillomavirus : Les Papillomavirus reprsentent un trs vaste groupe de virus qui taient reconnus et identifis chez plus de 20 diffrentes espces de Mammifres, aussi bien que chez les oiseaux et reptiles. Vue limportance mdicale de ces virus, ils ont t largement tudis et plus que 100 diffrents types sont prsent identifis (Bernard, 2005). Bien que la classification des papillomavirus soit base sur lhomologie des squences nuclotidiques, la diffrence entre les groupes volus est reflte un certain point que les diffrences biologiques sont tranchantes.

Figure 21: Diffrences de lorganisation des cycles de vie durant lvolution des types varis de PVH. Lors de la comparaison avec les PVH du supergroupe A exemple PVH2 ou PVH11 (fig A), ceux du supergroupe E exemple PVH1 ou 63 (fig B) dbutent leur cycle de vie partir de la ligne cellulaire basale. Dans le cas des lsions causes par ces types de PV, il nexiste pas de compartiment sparant les protines E7 et E4, et lamplification du gnome viral dbute partir des lignes cellulaires basales (Peh et al., 2002). Les PVH transmis par voie gnitale appartiennent au super-groupe A (connus aussi papillomavirus de type alpha), (De Villiers et al., 2004; Myers et al., 1994) les virus pathognes bas risque et les plus transmis parmi ce groupe sont les types 6 et 11 qui affectent environ 1%

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L1 associe la protine L2.

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des populations sexuellement actives (Brentjens et al., 2002). Ces virus peuvent aussi infecter

Par contre, les virus haut risque de ce groupe A comme les PVH de types 16 et 18 causent des lsions mucorales qui peuvent voluer chez certaines personnes en noplasie de haut grade et cancer (Bosch et al., 2002; Walboomers et al., 1999). Bien que les virus du super groupe A incluent ceux premier tropisme cutan, exemple PVH 2 et 10, ils prsentent un cycle de vie diffrent de celui des autres PV des autres groupes (Middleton et al., 2003; Peh et al., 2002). Le second groupe majeur de PVH est prsent par le super-groupe B. les virus du sous-groupe B1 tel que PVH5 (bta papillomavirus) (De Villiers et al., 2004; Myers et al., 1994) causent des infections inapparentes ou latentes dans la population en gnral, mais peuvent se transformer en un grand problme dindividus immunosuppresseurs ou pour individus ayant un dficit hrditaire (Ramoz et al., 2002). Par contre, les virus du sous-groupe B2 exemple PVH4 (aussi connu les Gamma papillomavirus (de Villiers et al., 2004) causent des irritations cutanes qui ressemblent superficiellement celles provoques par les PVH du super groupe A. Le reste des PVH sont classs dans le super-groupe E (Myers et al., 1994) (aussi classs Mu et Nu-papillomavirus (de Villiers et al., 2004). II.4. Mcanismes de linfection par les Papillomavirus: Les PVH pntrent les pithliums cutans ou muqueux la faveur de microlsions et infectent les cellules basales, sige du renouvellement permanent de lpithlium, en se liant un rcepteur encore inconnu ce jour. LADN viral (sous forme pisomale) se rplique en mme temps que le gnome cellulaire dans les cellules basales. Durant leur migration dans les couches suprieures de lpithlium, les cellules filles infectes continuent leur diffrenciation qui conditionne la fin du cycle de multiplication virale et en particulier lexpression des protines tardives L1 et L2 formant la capside des papillomavirus. Ces protines vont sauto-assembler pour former des particules dans lesquelles lADN circulaire viral est encapsid. Les virions noforms seront librs et le virus pourra se propager ainsi au sein dun mme pithlium ou tre transmis un autre individu par contact direct.

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les organes gnitaux o ils saccompagnent de formation dun papillome bnigne.

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Figure 22. Organisation du cycle de vie et production des protines infectieuse durant linfection par les PVH. La rplication clonale du virus dans les cellules infectes et la stimulation de la croissance cellulaire par les protines virales prcoces sont lorigine de lacanthose et de la prolifration bnigne caractristique du papillome (Hebner, 2006). Prs de 100% des cancers du col contiennent de l'ADN de PVH haut risque mais une infection virale chronique par un PVH, si elle est ncessaire, n'est pas suffisante au dveloppement du cancer; des cofacteurs endognes et exognes sont galement impliqus. Si le processus tumoral est trs complexe, il est trs gnralement plurifactoriel, il met en jeu des modifications de l'ADN de la cellule-hte, modifications telles que lchappement des cellules tumorales au contrle de la multiplication cellulaire. Parmi les cofacteurs lis au dveloppement du cancer cervical il y a : le type du virus, variant, intgration ; systme immunitaire de lhte, type HLA ; lenvironnement (Tabac, hormones, parit, nutrition) Linfection par un tel type de PV peut voluer selon deux modes : clairance virale ou latence (Dalstein et al., 2003). La majorit volue dans le sens dune clairance virale qui aboutit la gurison spontane de linfection. Cependant, dans certains cas (dpendants de lhte ou du type viral), lADN viral peut soit persister sous forme pisomale ltat latent, soit voluer vers une infection productive lors dune ractivation, soit persister sous forme intgre au gnome cellulaire et entraner ensuite lapparition de lsions prcancreuses ou cancreuses.

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L'infection au PVH se manifeste par l'apparition de verrues, condylomes plats ou acumins,

sont des petites tumeurs (augmentation du volume d'un tissu) douloureuses mais bnignes au niveau de la sphre anognitale. Une grande partie de ces lsions passe inaperue. Elles peuvent aussi se produire chez le sexe mle; les condylomes acumins gnitaux externes affectent garons et filles dans les mmes proportions; la prvalence de la maladie est estime 8-10% entre 15 et 25 ans; souvent extensive, rcidivante et difficile traiter, elle affecte donc le couple et cause un nombre de dsagrments y compris psychologique. Parmi les lsions histologiques, selon le degr d'atteinte dans l'paisseur de l'pithlium utrin, on peut classer les noplasies cervicaux intra pithliales, ou CIN: (le diagnostic des CIN se fait par le dpistage). Selon certaines tudes, 1% des CIN1, 5% des CIN2 et 12% des CIN3 voluent vers un cancer. Parmi les anomalies cytologiques, on distingue les HSIL et les LSIL: Les HPV haut risque oncogne peuvent conduire des Lsions Haut Grade, HSIL pour High grade Squamous Intraepithelial Lesion, en franais: lsion malpighienne intrapithliale de haut grade.

Figure 23. Evolution des Noplasies cervicales intra pithliales. CIN1 de bas grade, les lsions occupent le tiers basal de l'pithlium. CIN2 de grade intermdiaire, les lsions occupent les deux tiers de l'pithlium. CIN3 de haut grade, tout l'pithlium est concern par la lsion. Les Lsions bas grade sont appeles LSIL pour Low grade Squamous Intraepithelial Lesion, en franais: lsion malpighienne intrapithliale de bas grade.

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crtes de coq, qui sont des excroissances de peau (verrues gnitales externes). Les condylomes

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Une lsion prcancreuse peut rgresser, persister ou progresser. Pour certains auteurs, ces

plus de 60% des cas, et progresse dans 8.5% des cas, alors qu'une dysplasie haut grade rgresse dans moins de 40% des cas et progresse dans galement 40% des cas. Cette capacit voluer vers une lsion haut grade caractrise le PVH 16.

II.5. Du virus HPV au vaccin VLP : II.5.1. Principe du vaccin prophylactique : Les Papillomavirus Humains comportent dans leur structure diffrentes protines dont leur expression varie avec lvolution de linfection. On distingue: - les protines de capside dont L1 qui a fourni la base des vaccins Gardasil et Cervarix, - protines d'expression plus prcoces (Early) dont les gnes E6 et E7 sont impliques dans la transformation maligne des cellules de l'pithlium infest en se liant aux protines p53 et pRb (protines de rgulation du cycle cellulaire). La trs forte corrlation entre la prsence de PVH et lapparition dun cancer du col a rendu envisageable le dveloppement dun vaccin contre les infections papillomavirus en gnral et contre le cancer du col en particulier. Parmi les diffrentes approches envisages, la vaccination laide de pseudo-particules virales constitues de la protine L1 de la capside donne des rsultats trs encourageants la lumire des essais cliniques raliss depuis quatre ans par les laboratoires qui ont mis au point ces vaccins. L'incidence mondiale du cancer du col de l'utrus value 500000 nouveaux cas par an et la mise en vidence quasi constante des PVH dans ces lsions cancreuses justifient pleinement le dveloppement de vaccins efficaces. La mise au point de ces nouveaux outils qui sont les VLP a considrablement modifi les perspectives vaccinales et permis leur mise au point. Le cancer du col de l'utrus est la consquence d'une infection virale par un papillomavirus, et les vaccins contre de nombreuses maladies virales (poliomylite, rougeole ou variole) sont efficaces: pourquoi ne pas prvenir le cancer du col par une vaccination antivirale. Malgr les mcanismes mis en jeu par le virus pour assurer sa persistance et lutter contre la rponse immunitaire de l'hte, plus de 90% des infections PV gurissent spontanment, ce qui laissait esprer le dveloppement de vaccins prophylactiques et de vaccins thrapeutiques curatifs.

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diffrentes dysplasies sont 2 maladies diffrentes: une dysplasie de bas grade qui rgresse dans

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Les travaux des 20 dernires annes montrent que diffrents gnotypes sont prsents dans 99%

C'est donc principalement contre ces 2 gnotypes que l'effort de recherche a port. Il existe 2 approches vaccinales, l'une prventive, l'autre thrapeutique.

Figure 24. Principe de la prvention contre le PVH utilisant un vaccin prophylactique

Le vaccin prophylactique vise protger prventivement l'individu contre l'infection en lui faisant produire des anticorps tourns contre le PVH. Le vaccin thrapeutique correspond une stratgie plus rcente qui consiste augmenter les rponses immunitaires de l'individu contre une infection dj en place (augmentation de la rponse immunitaire mdiation cellulaire). Le vaccin thrapeutique vise faire rgresser les infections persistantes et leur volution en cancer invasif, ce qui repose sur l'induction d'une immunit cellulaire par des lymphocytes T cytotoxiques dirige contre les cellules exprimant les oncoprotines virales. Au stade o les cellules infectes ne sont pas encore transformes, la thrapie viserait agir sur la rplication virale en induisant une rponse immunitaire contre les protines E1 et E2 dont la rupture des gnes lors de l'insertion de l'ADN viral dans l'ADN cellulaire est implique dans le passage au stade cancreux, ou contre les protines L1 et L2 de la capside du virus. ~ 63 ~

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des cancers et que plus de la moiti des lsions contiennent PVH16 et un grand nombre HPV18.

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C'est l'approche prophylactique qui a dbouch sur le dveloppement des 2 vaccins rcemment

protines L1, protines majeures de la capside virale.

Figure 25. Etapes de la synthse des VLPs (le systme de baculovirus est utilis par la firme GSK).

II.5.2. Comment dvelopper une mmoire immunitaire? Les vaccins vivants attnus restent potentiellement trop oncognes, interdisant leur utilisation titre prventif chez les individus en bonne sant. PVH pose la difficult de ne pas pouvoir se dvelopper en culture cellulaire et les premires tentatives visant produire cette protine partir de bactries ont chou: la protine purifie tait le plus souvent malforme et n'induisait pas une production suffisante d'anticorps neutralisant dans les modles animaux. Le dveloppement a port sur les VLP (Virus Like Particule). Les protines L1 sont les protines majeures de la capside virale et elles sont capables de s'autoassembler en pseudovirions d'HPV, pseudo-particules virales nommes VLP, ayant une morphologie voisine de celle du HPV, dpourvues de matriel gntique, non oncognes mais trs immunognes lorsqu'elles sont associes un adjuvant adquat.

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disponibles, Cervarix et Gardasil. Les anticorps produits sont principalement dirigs contre les

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Historique sur les vaccins contre HPV :


1982 1998 1991 1995 2001 Etudes prospectives sur les noplasies induites par HPV 1999 2001 2006 et 2007 autorisation de mise sur le march de deux vaccins base de VLP Dcouverte de HPV16 et Premires HPV18, dmonstration de VLP l'activit oncogne et produites tudes sur le cancer du col de l'utrus HPV est reconnu Essais et ncessaire au preuves dveloppement du d'efficacit cancer du col. dbut des essais cliniques utilisant des vaccins VLP

Quelques exemples de VLP produites HEV: Virus de l'hpatite E HPV: Human Papilloma Virus SIV-HIV: Virus de l'immunodficience simienne-humaine HCV: Virus de l'hpatite C BTV: Virus bluetongue (fivre catharrale maligne du mouton)

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Bertrand Bellier, CNRS UMR7087, Hpital Piti-Salptrire, Paris

Deux options vaccinales anti-papillomavirus ont t choisies (Munoz et al., 2004) : un vaccin VLP bivalent (types 16 et 18) ciblant la protection contre le cancer du col puisque les HPV 16 + 18 sont responsables en Europe de 70 % des cancers du col et un vaccin VLP quadrivalent (types 6, 11, 16 et 18) permettant de protger la fois contre le cancer du col et contre les condylomes acumins (les HPV type 6 et 11 seraient impliqus dans environ 90% des condylomes), tous deux administrables par voie intramusculaire. Des tudes dimmunognicit ont surtout t menes sur des femmes de 15 25 ans ; mais les hommes sont eux aussi rpondeurs. Actuellement, deux vaccins prophylactiques contre papillomavirus rpondant chacun une de ces deux options vaccinales, en tude de phase III. Tous deux utilisent des VLP de la protine de capside L1 obtenus par gnie gntique et ncessitent trois injections intramusculaires sur six mois (zrounsix ou zrodeuxsix mois). Le vaccin de Sanofi Pasteur MSD (Gardasil) est produit sur levures et cible le cancer du col (HPV 16 + 18) et les condylomes (HPV 6 + 11). Il contient comme adjuvant de lhydroxyde daluminium. Le vaccin de GSK (Cervarix) est

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produit sur baculovirus et cible le cancer du col (HPV 16 + 18). Il contient comme adjuvant de La vaccination prophylactique a pour but dinduire la synthse danticorps neutralisants dirigs contre la protine de capside L1 de lHPV (Schiller et Lowy, 2004). Lapproche choisie pour le dveloppement dun vaccin prventif est fonde sur lutilisation de pseudo-particules virales ou VLP (Virus Like Particles) non infectieuses, produites par gnie gntique suite lintroduction du gne L1 dans diffrents vecteurs dexpression eucaryotes permettant la synthse de lantigne viral. Cette approche a t envisage la suite de la dcouverte de la proprit que possde la protine L1 des HPV de sautoassembler en pseudoparticules virales lorsquelle est produite en cellules eucaryotes et en grande quantit (Hagensee et al., 1993). De plus, ces VLP possdent une morphologie presque identique celle des virions et sont capables dinduire la production de hauts titres danticorps neutralisants contre des pitopes conformationnels du virus (Rose et al., 1994). II.5.3. Points forts portant sur lefficacit du vaccin : A partir des deux tudes pivots ayant inclus plus de 17500 femmes ges de 16 26 ans : - le vaccin Gardasil est associ une prvention de 100% des lsions cervicales de haut grade (CIN 2/3) et des adnocarcinomes in situ associs linfection par les HPV 16 et 18 dans la population. - Gardasil est galement efficace contre 99 % des condylomes et des lsions vulvaires de haut grade lies aux HPV 6, 11, 16 et 18. En revanche, dans la population gnrale qui inclut des sujets qui peuvent tre dj infects par les gnotypes contenus dans le vaccin lors de la 1re injection vaccinale, lefficacit vaccinale est nettement moindre (39%) contre les CIN2/3 ou adnocarcinomes in situ associs aux infections par les HPV 16 et 18. Le profil de scurit demploi de Gardasil a t valu sur plus de 11000 sujets exposs au Gardasil et gs de 9 26 ans. Lanalyse de lensemble des donnes de tolrance suggre une tolrance globale satisfaisante avec une prdominance de ractions au site dinjection et de ractions fbriles transitoires. Aucun risque grave na t identifi durant la phase de dveloppement clinique du Gardasil.

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lhydroxyde daluminium et du MPL (3-deacyclated monophosphoryl lipid A).

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Nanmoins, il a t dcid la mise en place dun plan de gestion des risques adapt afin de lorsque le vaccin sera dans les conditions relles dutilisation y compris chez la femme enceinte. En rsum, le vaccin Gardasil anti-HPV 6, 11, 16 et 18 est un vaccin prventif et ne peut tre utilis vise thrapeutique. Il est dirig contre certains HPV oncognes (16 et 18) et ne protge pas contre les infections par les autres HPV oncognes, son efficacit est de 100 % contre les lsions cervicales de haut grade lies linfection par les srotypes 16 et 18 chez les sujets nayant pas t en contact avec ces HPV. Une couverture vaccinale de 100 % ne confrerait une protection que contre 70 % des cancers du col de lutrus. Pour toutes ces raisons, la vaccination doit saccompagner du maintien du dpistage y compris chez les populations vaccines, ainsi de la mise en place dun plan de gestion des risques. Cependant, il est signaler que les effectifs sont insuffisants pour pouvoir dtecter des effets indsirables rares et trs rares. Les donnes prliminaires ont montr la stabilit des titres en anticorps jusqu 60 mois chez des jeunes femmes. Cependant certains points ne sont tablir comme la persistance long terme de cette immunit chez les adolescents des deux sexes de 9-15 ans, la capacit de protection croise contre dautres gnotypes dHPV, limmunognicit de ce vaccin dans les populations dimmunodprims, haut risque dinfection volutive HPV et linterfrence ventuelle avec dautres vaccins, autres que le vaccin hpatite B, administrs concomitamment.

II.6. CONCLUSION : Depuis les annes 1970, le dpistage des anomalies cytologiques du col utrin par frottis cervicovaginal et par colposcopie constituait la seule dmarche prventive du cancer du col mais le taux de couverture de cet examen est encore de trs loin insuffisant et linterprtation parfois dlicate ncessite une lecture par un cytopathologiste entran. la fin des annes 1990, des progrs dcisifs ont t raliss dans le domaine de la vaccination prventive contre les HPV. Les premiers essais cliniques des vaccins prophylactiques disponibles sont en faveur dune efficacit et dune innocuit de ces vaccins chez lHomme. Avec le recul dont on dispose, il semble quils confrent une immunit sur plus de cinq ans et probablement dix ans. La stratgie vaccinale propose comporte une vaccination en trois injections selon un schma zrounsix ou zrodeuxsix mois.

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dtecter aussi prcocement que possible et de traiter tout signal deffets indsirables nouveaux

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Paralllement la mise en place de cette vaccination, la poursuite du dpistage du cancer du col

gnitaux, restera indispensable. La surveillance pidmiologique devra porter sur la rpartition des gnotypes impliqus dans les condylomes et les lsions de haut grade avant vaccination puis aprs la mise en place de celle-ci chez les vaccines et les non-vaccines. Si le taux de couverture est lev, on peut penser que, grce une immunit de masse, on assistera une redistribution de la circulation des HPV y compris chez les non-vaccines. La mise au point et lvaluation de vaccins anticancreux tel le vaccin anti-papillomavirus est enthousiasmant et doit permettre, sur le plan thorique avec une couverture vaccinale importante, de prvenir la quasitotalit des cas du deuxime cancer le plus frquent chez la femme.

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laide de la technique des frottis, en combinant celle-ci la recherche et au typage des HPV

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III. Les Nanobodies un nouveau concept dans lingnierie des anticorps: III.1. Introduction : La technologie des anticorps recombinants a t rapidement progresse durant les deux dernires dcennies, principalement cause de leur intrt dans le domaine de la thrapie humaine. La possibilit de slectionner des anticorps spcifiques humains par la technologie phage display et de prouver leur affinit, stabilit et la quantit exprime par volution molculaire a pouss considrablement ce domaine. La technologie de lhybridome de souris dcrite par Khler et Milstein en 1975 a reprsent une tape importante dans le dveloppement de la technologie des anticorps et a ouvert la voie la thrapie par les anticorps monoclonaux pour merger (AcsM) (Khler and Milstein, 1975). En 2005, 18 types danticorps monoclonaux produits ont t sur le march et plus que 100 autres dans le procs clinique ; il t claire que les anticorps produits par ingnierie sont devenus des produits biopharmaceutiques. En effet, partir de 2008, lingnierie des anticorps est prdite plus que 30% des revenues totales des produits mis sur le march et qui sont approuvs par lorganisation de Food and Drug Administration (FDA) pour lusage clinique, la majorit de ces produits sont prsents sur le site de la FDA : http://www.fda.gov (Holliger and Hudson, 2005; Pavlou and Beslsey, 2005; Reichert and Pavlou, 2004). Les anticorps sont des molcules complexes constitues gnralement de chaines lourdes et de chaines lgres. Elles contiennent des oligosaccharides attachs par des liaisons N-glycosidiques au domaine constant de la seconde chaine lourde (CH2) qui est ncessaire pour la fonction effectrice de lanticorps et pour retenir un temps de demi-vie plus long dans le srum. Bien que les chaines lourdes (Utsumi and Karush 1964) et lgres (Yoo et al. 1967) peuvent retenir leurs capacits de neutraliser les antignes, leurs affinits et leurs solubilits diminuent considrablement (Ward et al. 1989). Par contre, les extrmits N-terminales des domaines variables des chaines lourde (VH) et lgre (VL) ; sont suffisantes pour la neutralisation des antignes (Sundberg and Mariuzza 2002). De tels anticorps peuvent tre produits sous forme de fragment monovalent (Fab) ou bien sous forme de simple chaine Fv (scFv) dont les domaines VH et VL sont rejoins par un peptide de liaison. Leurs production dans les cellules microbiennes est souvent lourde, surtout lors de la production de formes multivalentes et ceci cause du domaine dassociation.

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Rcemment, des fragments recombinants de moindre taille, par exemple fragments monovalents classiques (Fab, scFv et des variant recombinants comme les diabodies, triabodies, minibodies et les anticorps simple domaine) sont prsent produits comme alternatives crdibles. Ces fragments retiennent la spcificit de neutralisation de la totalit de lanticorps monoclonal mais peuvent tre produits dune manire plus conomique et peuvent possder dautres proprits et capacits pour une gamme dapplications de diagnostique ainsi que thrapeutiques (Holliger and Hudson, 2005). Les fragments simple chaine Fvs reprsentent une forme populaire dans laquelle les domaines VH et VL sont rejoints par un polypeptide linker flexible empchant leur dissociation. Les anticorps de type Fab et scFv comprenant les deux domaines VH et VL retiennent habituellement leur spcificit et leurs affinits par rapport lIgG correspondant, bien quils prsentent une pharmacocintique amliore de pntration dans les tissus (Harmsen and De Haard, 2007; Holliger and Hudson, 2005). Un grand intrt est repris pour lingnierie des anticorps lors de la dcouverte chez deux types dorganismes ; les camlids (Camel et llamas) et les poissons cartilagineux (exemple le requin), dun domaine variable affinit volue appel VHH ou Nanobody pour les camlids (Figure 1b) et V-NAR pour les requins (Figure 1c) qui surmontent une structure quivalente au domaine constant Fc comme un composant intgratif et crucial pour leur systme immunitaire (Hamers-Casterman et al., 1993; Harmsen et De Haard, 2007; Holliger et Hudson, 2005; Roux et al., 1998). Les Nanobodies reprsentent les plus petits fragments intacts neutralisant les antignes, avec seulement 15 KDa de masse molculaire et 2.5nm de diamtre et environ 4nm de hauteur (CortezRetamozo et al., 2004; Revets et al., 2005). Ces fragments danticorps possdent des avantages trs significatifs pour des applications biotechnologiques et mdicales. Ils sont exprims en grande quantits chez les microorganismes et possdent une grande stabilit et solubilit. En outre, ils sont trs rpondus dans la construction de plus grosses molcules et les systmes de slection comme les phages, les levures, et ribosomes display (Harmsen et De Haard, 2007).

III.2. Structure des VHH ou Nanobodies : Les anticorps conventionnels sont constitus de deux chaines lourdes et deux autres lgres identiques deux deux relies entre elles par des ponts disulfures. Pour le type le plus abondant des anticorps circulants, Immunoglobuline G, la rgion charnire est de structure tendue du a sa

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richesse en proline, ainsi elle est vulnrable au attaques protolytiques. En fait, cette molcule peut tre facilement partage in vitro en deux fragments Fab identiques chacune avec un site de fixation dantigne, et un troisime fragment Fc qui manque de spcificit aux antignes (Roitt et Delves, 2001) Figure 1a. Les anticorps IgG des Camelids (comme Camelus dromedarius, Camelus bactrianus, Lama glama, Lama guanaco, Lama alpaca and Lama vicugna) forment une exception tonnante ce paradigme de leur srum qui contient aussi une fraction considrable danticorps chaine lourde (AcsHc).

Figure 26. Reprsentation schmatique de diffrentes formes danticorps, montrant la molcule dIgG intacte classique et les immunoglobulines VHH-Ig des camlids et le Ig-NAR de requins. La structure des VhH-Ig des camlids et le Ig-NAR de requins ressemble celle des immunoglobulines comprenant une paire dhomodimre de deux chaines des domaines V-like et C-like, dans lequel le domaine variable est actif indpendamment tout seul. Les Ig-NARs comprennent un homodimre de chaine variable (V-NAR) et cinq domaines constants C-like (C-NAR). Une varit de fragments danticorps sont reprsents ; Fab, scFv, simple domaine VH, VhH, V-NAR et dautres formes multimriques comme les minibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies et les chimioconjugus Fab (les tailles en kilodaltons sont approximatives).

Philipp H. and Peter J.H. (2005) Nature Biotechnology. Les AcsHc des Camelidae possdent une structure unique comprenant un seul domaine variable (VHH ou Nanobody), la rgion charnire et les deux domaines constants (CH2 et CH3) Figure 22. Ces derniers prsentent une grande homologie avec la rgion Fc (CH2-CH3) des anticorps
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classiques (Muyldermans et al., 2008). Ces AcsHc sont dpourvus du premier domaine de la rgion constante (CH1) qui est prsente dans le gnome mais elle est excise durant le processus dpissage de lARNm. Labsence du domaine CH1 explique labsence de chaine lgre dans lAcsHc, au niveau de ce domaine se repre le lieu dancrage de la chaine lgre. Par consquent, lAcsHc volue naturellement pour confrer plus de spcificit pour la neutralisation des antignes et la grande affinit par les trois CDRs de lanticorps conventionnel ou de ses drivs (Muyldermans, 2001 ; Revets et al., 2005). III.3. Donc, cest quoi les Nanobodies ? Les Nanobodies ou VHH sont les plus petits fragments intacts capables de neutraliser les antignes, seulement 15 kDa, comprenant la totalit de la capacit de neutralisation des antignes volue pour tre fonctionnelle en absence totale de chaines lgres (Cortez-Retamozo et al., 2004 ; Revets et al., 2005).

Figure 27. Reprsentation schmatique des diffrences entre VH et VHH bases sur la comparaison de squences de clones dADNc. La position de la CDR entre les cadres de lecture est indique. La CDR1 et CDR3 du VHH sont plus longues que celles pour les VH, et sont gnralement connects par un pont disulfure (ligne en orange). Les substitutions dacides amins au niveau des rgions Framework 1 et 2 sont reprsentes. Les nombres rfrant les positions des acides amins le long de la squence correspondent la numration de Kabat (Kabat et al., 1991).

Ils ont t dcouverts la fin de lanne 1980 au niveau le sang de dromadaire par le professeur Raymond Hamers de luniversit de Vrije Bruxelles (Belgique) (De Haard, 2008). Les
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S11

L11

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structures en solution et cristallines de plusieurs Nanobodies ont t rsolues et montrent que leurs structures de base est reprsentes par deux chaines similaires au niveau du point dancrage des VH des immunoglobulines conventionnels (Ahmadvand et al., 2008 ; Revets et al., 2005). Lorsquon observe les structures des boucles de neutralisation dantigne des Nanobodies on trouve quelles dvient normment de ce quon connait pour les anticorps humains et de souris. Cette dcouverte fournit une vidence pour dire que les boucles des Nanobodies possdent un rpertoire de structure plus large que celui observ pour les anticorps conventionnels VH. En plus, les rgions CDR3 des Nanobodies sont en moyenne plus longues que celles du VH pour 12 9 acides amins, respectivement, tandis que pour les Nanobodies drivs du dromadaire une chaine de 16 18 acides amins est frquemment observe, bien que pour les lamas, une fraction considrable des Nanobodies semble avoir un CDR plus rduit de moins de 6 acides amins. La squence des Nanobodies contient aussi des substitutions dacides amins au niveau du cadre de lecture qui ne sont pas observs pour les domaines VH qui se fixent aux VL. Ces substitutions ont volu pour compenser labsence du domaine VL au niveau du site de fixation de lantigne et elles confrent probablement une flexibilit plus importante pour le VH. Les substitutions des acides amins hydrophobes en acides amins hydrophiles (V37F ou V37Y, G44E, L45R et W47G) dans la 2me ORF sont accessibles chez les Nanobodies (les rsidus de cette rgion du VH interagissent avec le domaine VL et sont trs bien conservs durant lvolution). Par consquent, ils sont assigns pour amliorer leurs solubilits (Harmsen, 2007; Muyldermans, 2001; Revets et al., 2005; Riechman and Muyldermans, 1999; Roovers, 2007).

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Figure 28. Rarrangement des gnes VDJ pour la formation des anticorps VHH

Il tait dmontr que les Nanobodies possdent une grande homologie (approximativement 90%) avec le carde de lecture des VH humains et pour lutilisation dans la thrapeutique, peuvent tre humaniss jusqu 99% en effectuant quelques petites substitutions dans la rgion Framework 2 (Harmsen et De Haard, 2007 ; Vaeck 2004). Cette homologie entre les Nanobodies et les Framework de VH humains ouvre la voie de production danticorps simple domaine contenant le minimum de rsidus non humains formant partir desquels des agents de la thrapie (Davies et Riechmann, 1994 ; Tanha, 2001).

III.4. Proprits biochimiques et fonctionnelles des Nanobodies : Les anticorps conventionnels possdent plusieurs proprits importantes, exemple leur grande affinit et leur slectivit pour les cibles, leur facilit de dcouverte et la faible toxicit cellulaire (Ablynx, 2005). Les Nanobodies sont devenus alors plus meilleurs parce que, en plus de ces caractristiques, ils possdent dautres avantages technologiques et biophysiques qui leur permettent dtre plus performants que les anticorps conventionnels dans diffrents cas (Ablynx, 2005 ; Revets et al., 2005).

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Premirement, les VHH sont de petites protines ayant le dixime de la taille des anticorps conventionnels (De Genst et al., 2006; Harmsen and Haard, 2007), ils pntrent dans les tissus avec plus defficacit et peuvent neutraliser des cibles inhabituelles ou des pitopes cachs. En deuxime lieu, les diffrents types de Nanobodies sont plus homognes ne montrant aucun signe de dimrisation spontane au contraire des scFv qui dimrisent souvent en scFv2. En plus, le simple domaine mature du petit VHH rend de cet anticorps le meilleur candidat pour produire des anticorps bispcifiques ou immuno-conjugus par ltablissement dune jonction entre les gnes codant pour les VHH, une enzyme ou bien une toxine au niveau de lunit dexpression. Ces anticorps sont naturellement solubles dans les solutions aqueuses et nont pas de tendances pour agrgation, probablement du la substitution des rsidus hydrophobes par des rsidus hydrophiles dans la rgion Framework 2 par comparaison aux VH des anticorps conventionnels qui interagissent au niveau des rgions hydrophobes avec les domaines CH1 et VL. Comme consquence, lexpression spare des domaines VH permettent tout simplement de former des corps dinclusion ou bien des domaines replis exposant des pices hydrophobes qui les rendent cohsives (Muyldermans, 2001). Dautre part, les anticorps VHH sont hautement stables la temprature, ainsi ils retiennent 80% de leur activit de neutralisation aprs une semaine dincubation 37C en indiquant que les VHH possdent une dure de demi-vie importante. Ainsi, leurs points de fusion varient entre 67 et 78C (De Genst et al., 2006). En plus de leur rsistance la temprature, les Nanobodies prsentent une grande stabilit face leffet dnaturant des agents chao-tropiques en prsence des protases et aux pH extrmes. Donc, ce type danticorps est considr capable de rester actif dans les conditions extrmes comme celles au niveau de lestomac et de lintestin crant des opportunits pour ladministration orale de ces anticorps pour traiter des maladies gastro-intestinales (Ablynx, 2005; Harmsen and De Haard, 2007; Revets et al., 2005). Ainsi, la combinaison de telles caractristiques est propre aux anticorps VHH et non pour dautres.

III.5. Production des anticorps VHH recombinants : Le clonage dun rpertoire de fragments danticorps partir dun animal immunis dans un vecteur phagique et slection par technique de phage display, est devenue une mthode de routine dans la dernire dcennie pour slectionner des molcules ciblant des antignes bien

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spcifiques (Muyldermans, 2001 ; Revets et al., 2005). A nos jours, par lapplication de la technologie de nano clonage, il est possible de cloner directement les Nanobodies partir de cellules B antigne-spcifique. Gnralement, lADNc est prpar partir de lymphocytes rcuprs de sang de priphriques, isols partir de dromadaire immunis ou de lamas (Ablynx, 2005).

Figure 29. Alignement des squences dacides amins au niveau des chaines variables danticorps conventionnel (VH), chameau (VHH) et de requin (V-NAR). Mmes couleurs attribues pour les diffrentes rgions de CDR que les figures prcdentes. En rose : motif hydrophile dans le FR2. Les squences sont dduites de domaines VH anti-lysozyme (mAbVH), VHH (cAb Lys3), et V-NAR qui sont reprsents dans la figure a, b et d. VHH s+16a est un anticorps bloquant une enzyme, driv de Lama immunis avec des cellules T murines ecto-enzyme AR T2.2. Par consquence, le rpertoire de Nanobodies compltement mature in vivo chez un animal immunis peut tre amplifi par une seule paire damorces. Une technique de Nested PCR est ncessaire pour produire plus de matriel et pour inclure des sites de restriction pour des buts de clonage (Muyldermans, 2001). Aprs le clonage des fragments danticorps gnrs dans le vecteur dexpression appropri, une banque de Nanobodies contenant le rpertoire des sites de reconnaissance intacts est obtenue sous forme mature (Arbabi Ghahroudi et al., 1997). A cause de la maturation in vivo des AcsCH, de petites banques denviron 106-107 gnes de Nanobodies individuels sont obtenues habituellement lors de son isolement avec des affinits de nano molaire pour leurs antignes (Arbabi Ghahroudi et al., 1997 ; Cortez-Retamozo, 2004 ; Muyldermans, 2001).

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Figure 30. Diagramme schmatique du domaine VHH des chaines Lourdes des anticorps de camlids. a : les trois CDRs (Complementarity Determining Regions) du paratope de neutralisation de lantigne sont reprsentes comme boucles colores : CDR1 rouge, CDR2 vert, CDR3 bleue. b : le pont disulfure canonique connecte les rgions Framework 1 et 3 (FR1 et FR3) dans les deux feuillets du domaine de limmunoglobuline indiqu en jaune. Plusieurs anticorps de camlids contiennent un pont disulfure (S-S) additionnel connectant les rgions CDR3 et CDR1 (chameaux) ou le dbut de CDR2 (lamas). H : (Hinge) rgion charnire, M : domaine transmembranaire de lisoforme de membrane, G : site de Glycosylation, S : codon Stop de lisoforme secrte. Wesolowski et al., (2009) Med Microbiol Immunol. Laffinit des anticorps simple domaine peut souvent tre prouve par imitation in vitro, par exemple grce la mthode de mutagense dirige des sites des rgions CDR et des ponts plus loign de lantigne immobilis sous des conditions de faibles stringences (tempratures
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leves, concentrations faibles ou importantes de sels, des bas ou hauts pH, et de faibles concentrations dantignes). Les Acs simple domaines drivant des camlids et des requins (hcAbs) sont exprims et purifis partir du priplasme de bactries E. coli des niveaux plus importants que ceux danticorps conventionnels. Les sdAbs disposent gnralement dune stabilit importante et peuvent tre produits dans les levures, plantes et cellules de mammifres (Harmsen et De Haard 2007) Les sdAbs recombinants prsentent plusieurs avantages en comparaison avec les anticorps conventionnels et les fragments simples chaines variables (scFv) telles que la grande stabilit, la capacit importante de repliement, et leurs pntration importante dans les tissus in vivo (Muyldermans 2001 ; Cortez-Retamozo et al., 2002 ; Dumoulin et al., 2003) qui plaident pour lutilisation des Nanobodies dans les diffrentes applications biotechnologiques et mdicales. En plus de ces caractristiques, les anticorps simple domaine peuvent tre clons et exprims sous diffrentes formes par la fusion avec dautres protines ou peptides, ainsi pour tendre leur utilisation pour certains diagnostics et/ou applications thrapeutiques (Conrath et al., 2001). Par exemple, leur fusion des protines fluorescentes pour les utiliser comme sondes (Fluorobody) afin de suivre le chemin vers lantigne dans les cellules (Rothbauer et al., 2006 ; Olichon et Surrey 2007). Le clonage en tandem de deux molcules sdAbs connectes par un peptide linker donne naissance un bivalent de plus haute affinit pour lantigne (Conrath et al., 2001). Le bivalent produit peut tre aussi exprim ltat coupl un domaine Fc dun anticorps conventionnel, exemple dun IgG1 humain ou de souris. En raison de leur capacit de repliement et leur grande stabilit dans des conditions environnementales diffrentes, des sdAbs galement ont t dirigs avec succs vers le cytosol en liminant le peptide signal (Gueorguieva et al., 2006) et aux vsicules intracellulaires telles que les chloroplastes (Jobling et al., 2003) ou le rticulum endoplasmique (Serruys et al., 2009) par gntique de fusion pour viser le trajet de la protine. Le succs remarquable des anticorps anti-TNF- conventionnels (Tumor Necrosis Factor) dans la thrapie du rhumatisme articulaire et d'autres maladies inflammatoires (Feldmann 2002) ont aliment la recherche pour d'autres outils thrapeutiques bass sur lutilisation des anticorps. Beaucoup de nouveaux ractifs bass sur les anticorps ont t par consquent autoriss pour le traitement des maladies auto-immunes et des allergies, aussi bien que pour limmunothrapie des cancers (Lonberg 2008).

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Les Nanobodies sont produits habituellement des quantits de 10mg/l lorsquils sont exprims chez E. coli (Arbabi Ghahroudi et al., 1997). Le processus de production peut tre plus important ainsi que des systmes dexpression autre que la bactrie peuvent tre utiliss. De plus grandes quantits de Nanobodies produites par des champignons (joosten et al., 2005) et des souches de levures ont t obtenues (Frenken et al., 2000 ; Rahbarizadeh et al., 2006; Thomassen et al., 2002), avec une scrtion chez Saccharomyces cerevisiae des quantits >100 mg/l partir de simples cultures et >1g/l partir de fermentation fed batch. Soit >1Kg de Nanobodies sont obtenus de 15m3 de fermentation (Harmsen et De Haard, 2007 ; Muyldermans, 2001).

III.6. Applications biotechnologiques et mdicales des Nanobodies : Les Nanobodies sont distingus des autres anticorps conventionnels par leurs proprits uniques de taille, solubilit, stabilit intrinsque, reconnaissance dpitopes inhabituels ou cachs, pntration dans diffrentes cavits et sites actifs de cibles denzymes, facilit et rapidit de dcouverte et fabrication de mdicaments. Ces caractristiques vont surement conduire des applications mdicales et biotechnologiques importantes dont les Nanobodies doivent surpasser les autres types danticorps (Revets et al., 2005). A nos jours, plusieurs laboratoires les Nanobodies sont utiliss comme des thmes de recherche et dans diffrentes applications thrapeutiques ou de diagnostic (Muyldermans et al., 2008). Plusieurs maladies ont t efficacement traites par des Nanobodies ; ainsi ils ont t utiliss comme cibles pour des enzymes toxiques ou pour bloquer des interactions molculaires spcifiques. Les Nanobodies peuvent tre utiles pour diffrentes applications biotechnologiques. Par exemple, le criblage et le traage dantigne dans des cellules vivantes peuvent tre raliss grce de Nanobodies fluorescents spcifiques de protines endognes, mais leurs modifications post-traductionnelles et les composs non protiques restent invisibles et ne peuvent pas tre tudis. Rcemment, des protines de fusion appeles Chromobodies comprenant un Nanobody spcifique dun antigne li une protine fluorescente sont synthtiss pour surmonter ce problme. Ces chromobodies peuvent reconnaitre et cibler lantigne dans les diffrents compartiments subcellulaires durant la phase S de synthse chromatinienne et la mitose (Rothbauer et al., 2006).

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Malgr tous ces tranglements de dtermination des structures travers la cristallographie et diffraction aux rayons X, la production actuelle de cristaux reste la plus critique.

Figure 31. Structure en 3D de laction dinhibition de lenzyme par lanticorps sdAbs driv de chameau et par le hcAbs de requin. Image gnre par le programme PyMOL. Trois boucles CDR colores comme pour la figure 30. a : lysozyme de poulet en complexe avec un hcAbsV-NAR inhibiteur de requin (pdb code 1t6v). Le V-NAR se trouve en contact avec lenzyme seulement par les rgions CDR1 et CDR3, ce dernier se prolonge et bloque le site actif. b : lysozyme de poulet en complexe avec un sdAbs inhibiteur de chameau (pdb code 1mel). Le CDR3 se prolonge lintrieur du site actif et le bloque. c : lysozyme de poulet en complexe avec son substrat (pdb code 1 lsz). d: lysozyme de poulet en complexe avec VL et VH domaines dun anticorps monoclonal de souris (pdb code 1 mlc). La surface plane dinteraction avec lanticorps conventionnel est situe loin du site actif de lenzyme.

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Dernirement, des techniques varies ont t dveloppes pour dpasser cet obstacle majeur. Des protines naturelles peuvent efficacement prouver la probabilit dobtenir des cristaux par la stabilisation de la protine dintrt et par la cration de plusieurs surfaces de contact. Rcemment, la cristallisation de lEpsl : Epsl pseudopilin (qui forme la partie centrale du pseudopilus du systme de scrtion sophistique type 2 de la bactrie, htro dimre de Vibrio vulnificus), a t beaucoup acclre par lutilisation du Nanobody (Lam et al., 2009). Le VHH-pigFc est un anticorps chaine lourde compos disotype de Fc de porc li un Nanobody, cet anticorps chimrique est utilis pour gnrer des anticorps monoclonaux contre des isotypes dIgG de porc (Muyldermans et al., 2008). Donc, les Nanobodies avec leurs petites tailles qui leurs permettent une particularit de neutralisation des antignes dans des rgions obstrues telles que les tumeurs, ainsi avec leurs immunognicit trs faibles et leurs affinits trs importantes doivent tre idalement placs comme nouvelle classe danticorps pour des applications mdicales et thrapeutiques.

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SYSTEMES DEXPRESSION ET CELLULES HOTES

MATERIEL : I. LES SYSTEMES DEXPRESSION UTILISES : I.1. Le systme Levure Pichia pastoris : Pendant les deux dernires dcennies, la levure Pichia pastoris fut un systme dexpression de grand intrt dans la production des protines htrologues surtout de petite taille. Plusieurs souches mutantes de Pichia pastoris sont disponibles pour lexpression des protines recombinantes (GS115, KM71, S1186). La souche utilise dans ce travail est la souche sauvage X33. Cest une souche qui produit la protase Kex2 responsable du clivage du peptide signal dadressage extracellulaire au moment de la maturation de la protine recombinante. Elle contient le gne sauvage de lalcool oxydase I (AOXI) et permet dobtenir des transformants de type Mut+. Les vecteurs plasmidiques dsigns pour lexpression des protines htrologues dans cette levure possdent des caractristiques communes. La cassette dexpression est lune des caractristiques les plus intressantes de ce systme ; elle contient dans lordre ; un promoteur fort inductible qui est le promoteur du gne AOXI suivi par un ou plusieurs sites de restriction ncessaires pour linsertion des gnes dintrt et la squence de terminaison de transcription du gne AOXI de P. pastoris et qui dirige la polyadnylation en 3 chez les ARNm. Des caractristiques additionnelles prsentes dans certains vecteurs dexpression dans Pichia et qui dirigent des fonctionnalits spcifiques selon la ncessit. Pour la scrtion extracellulaire des protines recombinantes, il y a des vecteurs spciaux qui possdent une construction spciale de dADN immdiatement aprs le promoteur AOX1 et qui codent pour un peptide signal de scrtion. Le peptide le plus adopt est la pr-pro squence signal du facteur de S. cerevisiae. Une srie de vecteurs utiliss pour lexpression dans Pichia cest la srie des pPICZ, contenant le gne Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus. Ce gne confre la rsistance au antibiotique zocine chez E. coli, les levures et autre organismes eucaryotes. Ces vecteurs donnent aussi le choix pour lexpression de protines couples une tiquette Histidine grce aux His6 et myc pitopes qui peuvent tre ajouts lextrmit C-terminale des protines exprimes.

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SYSTEMES DEXPRESSION ET CELLULES HOTES

I.2. Le vecteur dexpression pPICZA : Pour faire le choix entre les souches de Pichia pastoris utiliser, la firme Invitrogen a mis en place de larges gammes de vecteurs dexpression y compris les vecteurs pPICZ et pPICZ pour lexpression de protines chez les souches X33 et GS115 de Pichia. Ces vecteurs sont conus pour le clonage avec une construction simple ou multiple de la cassette, l'expression haut niveau, ainsi que la dtection et la purification rapides de la protine recombinante. Ces vecteurs contiennent le gne de rsistance lantibiotique zocine pour le choix direct des souches rsistantes ayant intgr le transgne. L'augmentation du nombre de copies du gne d'intrt au niveau des cellules recombinantes peut avoir comme consquence le niveau d'expression plus important.

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Les vecteurs pPICZ et pPICZ offrent les dispositifs suivants : Un promoteur AOX1 inductible pour l'expression niveau lev dans Pichia pastoris ; Un pitope c-myc pour la dtection correspondante avec l'anti-myc anticorps ; Une tiquette poly histidine du ct C-terminal (6xHis) pour la purification rapide avec la rsine de nickel-chlation et la dtection avec des anticorps anti-His ; Rsistance la Zeocine pour le choix direct des clones intgrants plusieurs copies; La srie des vecteurs pPICZ comportent galement le peptide signal de scrtion du facteur- pour le transport efficace des protines vers le milieu extracellulaire.

I.3. Le systme plante Arabidopsis thaliana :

- Classification classique : Rgne : Plantae Division : Magnoliophyta Classe : Magnoliopsida Ordre : Capparales Famille : Brassicaceae Genre : Arabidopsis - Nom binomial: Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., 1842

Arabidopsis thaliana Cest une plante herbace de 10 15cm de hauteur ltat adulte. Elle est forme dune rosette de feuilles de 2 5 cm de diamtre situes au ras du sol. Les fleurs de quelques mm de couleur blanche sont typiques des crucifres avec quatre spales et quatre ptales disposs en croix, quatre tamines et un pistil. Le mode de reproduction est principalement lautofcondation. Chaque fleur se transforme en un fruit qui est une capsule allonge appele silique. Chaque silique contient de 30 50 minuscules graines. Cette plante est un organisme modle pour la recherche gntique dans le monde vgtal, ce fut le premier gnome vgtal squenc ; les raisons de ce choix sont nombreuses :

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SYSTEMES DEXPRESSION ET CELLULES HOTES

- Taille rduite de la plante mme ltat adulte ce qui permet la culture dun millier de pieds sur un mtre carr dans le laboratoire ; - Cycle de dveloppement relativement court qui ne dure que deux mois pour passer graineplante-graine. - Plante trs prolifique ; un plant produit environ 40000 graines. - Son gnome est considr parmi les plus petits gnomes connus dans le monde vgtal. - Absence dintrt conomique sur cette espce, ce qui facilite la diffusion des informations entre laboratoires. I.4. Vecteur binaire dexpression :

Figure 32: Vecteur Binaire pBI121 Conformment la constitution des plasmides binaires, le vecteur binaire pBI121 comporte, outre que les fonctions de mobilisation dans E. coli et Agrobacterium tumefaciens deux systmes de slection dans les bactries et dans la plante grce la prsence du gne nptII, codant pour la nomycine phosphotransfrase de type II et confrant la rsistance la kanamycine. Ce gne est encadr par le promoteur et le terminateur de la nopaline synthase (nos). Dans la plante, une copie synthtise partir de lADN-T flanqu par les bordures droite (RB) et gauche (LB) va tre transfre vers le gnome de la plante au moment de la transformation. Ce fragment comprend deux gnes placs en tandem comprenant au milieu le SMC (Site Multiple de Clonage).

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SYSTEMES DEXPRESSION ET CELLULES HOTES

Un gne gus A (uidA), codant pour la -glucuronidase, contrl par le promoteur du CaMV35S et servant comme gne rapporteur. I.5. Les souches bactriennes : Escherichia coli : utilises dans les tapes de clonage pour le maintient et la multiplication des plasmides intacts et recombinants. - TOP10F : {lacIq, Tn10(TetR)} mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 araD139 (ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG. - NEB5 : fhuA2 (argF-lacZ)U169 phoA glnV44 80 (lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17.
(Plus dinformations sur les gnomes bactriens sont fournies dans la partie Annexe)

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MILIEUX DE CULTURE, SOLUTIONS & PRODUITS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

II. MILIEUX DE CULTURE SOLUTIONS ET PRODUITS UTILISES :


II.1. Solution de strilisation des graines : Hypochlorite de Sodium : 50 % Tween 20 : 0.1 % H2O strile : 49.9 %

Le milieu de culture des graines dArabidopsis utilis est le milieu MS/2 additionn dantibiotiques ncessaires dans le cas de slection de graines transformes. Ce milieu est fourni par SIGMA sous le nom de Murashige and Skoog basal Salt mixture avec des vitamines en poudre (1000X).

II.2. Les antibiotiques :


Concentration finale utilise dans le milieu (g/ml) 50 50 40 250 25 (bactries) 100 (Levures)

Antibiotique Kanamycine Rifampicine Gentamicine Carbenicilline Zocine

Solvant Eau Mthanol Eau Eau Eau

Les solutions dantibiotiques sont stockes -20C. Elles sont additionnes aux milieux de culture dans des conditions dasepsie. Les milieux de culture additionns dantibiotiques sont conservs +4C pour une dure maximale de 15 jours. II.3. Milieux LB (Lauria et Bertoni) pour de culture dE. coli : Peptone pancratique : 1% Extrait de levure : 0.5% NaCl : 1%

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MILIEUX DE CULTURE, SOLUTIONS & PRODUITS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

Ajuster le pH 7.2 avec une solution de NaOH 1M puis autoclaver. Pour obtenir un milieu solide LBA ajouter 1.5% dagar avant lautoclavage. II.4. Milieux de culture pour Pichia pastoris : Milieu YPD(A) pour culture et slection des cellules de levure : Extrait de levure 1% Peptone 2% Dextrose 2% Agar 2% pour milieu solide YPDA

10X D (20% Dextrose): Dissoudre 200g de D-glucose dans 1L deau puis autoclaver pendant 15 minutes ou bien filtrer pour striliser. La dure de validit de cette solution est approximativement une anne. Milieu BMGY (Buffered Minimal Glycerol medium for Yeast) pour induction de la Biomasse : Extrait de levure : 1% Peptone : 2% Phosphate de Potassium : 100mM pH6 Yeast Nitrogen Base (YNB): 1.34% Biotine: 4x10-5% Glycrol: 0.5%

Pour 1L de milieu BMGY, autoclaver 700ml de YP. Ajouter ensuite : 100ml Tampon Phosphate de Potassium 1M pH6 ; 100ml YNB 10X ; 2ml Biotine 500X et 100ml Glycrol 10X. Garder le milieu BMGY +4C pour un maximum de 2 mois. Les solutions spares peuvent tre stockes +4C pendant une anne. N.B: 500X B (0.02% Biotine): Dissoudre 20 mg de biotine dans 100 ml deau puis filtrer pour striliser. Conserver 4C. La dure de validit de cette solution est approximativement une anne. 10X GY (10% Glycrol): mlanger 100 ml de glycrol avec 900 ml deau. Striliser par filtration ou bien par autoclavage. Conserver temprature ambiante. La dure de validit de cette solution est approximativement une anne. 10X YNB (13.4% Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate without amino acids) dans leau puis filtrer pour striliser. Conserver 4C. La dure de validit de cette solution est approximativement une anne.

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MILIEUX DE CULTURE, SOLUTIONS & PRODUITS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

Milieu BMMY (Buffered Minimal Methanol medium for Yeast) pour linduction du promoteur AOXI et expression du gne: Extrait de levure : 1% Peptone : 2% Phosphate de potassium : 100mM pH6 Yeast Nitrogen Base (YNB): 1.34% Biotine: 4x10-5% Methanol: 0.5%

Pour 1L de milieu BMMY, autoclaver 700ml de YP. Ajouter ensuite : 100ml Tampon Phosphate de Potassium 1M pH6 ; 100ml YNB 10X ; 2ml Biotine 500X et 100ml Mthanol 10X. Garder le milieu BMMY +4C pour un maximum de 2 mois. Les solutions spares peuvent tre stockes +4C pendant une anne. N.B : 10X M (5% Mthanol): mlanger 5ml de Mthanol avec 95ml deau. Striliser par filtration. Conserver 4C. La dure de validit de cette solution est approximativement deux mois. II.5. Solutions dextraction dADN plasmidique par mthode de lyse alcaline : Solution I : Glucose 50 mM Tris-HCl 25 mM (pH 8) EDTA 10 mM (pH 8) Lysozyme 4 mg/ml Solution II : NaOH 200 mM SDS 1% Solution III : Actate de potassium 5M (pH 4.8)

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Le tampon TE (pH8):

II.6. Tampon de charge pour protines : 1M Tris-HCl (pH6.8), 0,5M 2- mercaptothanol, 50% v/v glycrol, 10% SDS, 0,5% Bleu de bromophnol.

II.7. Gels de polyacrylamide pour PAGE-SDS: Gel de concentration : 5% polyacrylamide (avec un rapport de 29/1 en acrylamide/bisacrylamide) - 0,125 M Tris-HCl pH 6,8 ; 0,1% (p/v) SDS ; 0,1% (p/v) APS ; 0,05% (v/v) TEMED. Gel de sparation : polyacrylamide 5 15% (avec un rapport de 29/1 en acrylamide/bisacrylamide) - Tris-HCl 0,275 M pH 8,8 - SDS 0,1% (p/v) - APS 0,1% (p/v) - TEMED 0,05% (v/v). Tampon Laemmli : Tris-HCl 25 mM pH 8,3 - glycine 0,25 M - SDS 0,1% (p/v)

II.8. Solutions pour technique western blot : Tampon de transfert (stock 10X) : - 14.4% Glycine - 3.03% Tris - 0.1% SDS - 20% Ethanol ( ajouter au moment de faire la solution 1X) Tris-Buffer-Salt solution pH 8 (TBS 10X) - 8.76% NaCl - 1.21% Tris - 0.4% HCl TBS-TWEEN 0.1% - 10% de solution stock TBS 10X - 0.1% TWEEN 20

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Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM

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Tampon de stripping pH 6.7: - 62.5mM HCl - 2%SDS - 100mM -mercaptothanol Rvlateur: - 109ml rvlateur Kodak - 391ml eau Ultra pure Fixateur : - 109ml fixateur Kodak - 391ml eau Ultra pure

II.9. Enzymes et ractifs de biologie molculaire : Enzymes de restriction : XbaI, BlpI, PmeI Les ADN Polymrase: Go Taq DNA polymerase Taq DNA polymerase Pfu DNA Polymerase Reverse Transcriptases: MuMLV Reverse Transcriptase Autres enzymes: Phosphatase alcaline (CIP) RNase A DNase I T4 DNA Ligase La P-NGase F New England Bio Labs Bio Basic Inc. (Canada) Takara Promega New England Bio Labs Invitrogen Promega New England Bio labs Bio Basic Inc. (Canada) New England Bio Labs

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Marqueurs de Poids Molculaire : Marqueurs pour ADN :

1kb DNA Ladder (BioBasic Inc) sur gel dagarose 0.8%

100pb DNA Ladder (BioBasic Inc.) sur gel dagarose 1.5%

1Kb DNA Ladder (Promega) sur gel dagarose 0.8%

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Marqueurs de Masse Molculaire pour protines : * MagicMark Western Protein Standard (Invitrogen)

MagicMark Standard spar sur Gel NuPAGE 4-12% Bis-Tris et ensuite transfr sur membrane de nitrocellulose. Le blot a t mis en contact avec 1:5000 dilution danticorps primaire spcifique de souris et la dtection a t ralise par des anticorps secondaires anti-IgG de souris coupls la phosphatase alcaline et utilisant le WesternBreeze Chromogenic Kit.

MagicMark Standard

* Dual Color Protein standard (BioRad)

Marqueur de taille de protines standard spares sur PAGE-SDS 10%.

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Kits de biologie molculaire : - Mini Elute Gel Extraction kit - MiniElute Reaction Cleanup Kit - QIAprep Spin Miniprep Kit - RNeasy Mini Kit - Wizard Genomic DNA purification kit - SV Total RNA Isolation System - ECL Plus Western Blotting Detection Reagents Autres ractifs: - Ni-NTA Sephrose - Rabbit IgG anti 6His - Polyclonal anti-Rabbit IgG - Murashige & Skoog basal salt mixture (MS) - Murashige & Skoog Vitamin powder (1000X) - Agarose - Glycrol - Lysosyme (from Chicken White Egg) Qiagen Sigma Sigma Sigma Sigma Invitrogen SIGMA Bio Basic Inc. Qiagen Qiagen Qiagen Qiagen Promega Promega Amersham

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PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

III. METHODES:

PARTIE I. UTILISATION DE LA PLANTE ARABIDOPSIS THALIANA COMME SYSTEME DEXPRESSION DE LA PROTEINE L1 DE LA CAPSIDE DU HPV16: III.1. Strilisation des graines dArabidopsis thaliana : Mettre les graines dArabidopsis dans un tube eppendorf additionnes de 1ml de la solution de strilisation vortexer pendant 2mn et centrifuger 30s 10000rpm. Pipeter strilement le surnageant et effectuer 4 cycles de lavage pour les graines dans des conditions dasepsie. Chaque cycle consiste ajouter 1 ml deau strile, vortexer pendant 2 mn pour liminer les traces du dtergent, centrifuger 30s 10 000rpm et jeter le surnageant. A la fin des tapes de lavage, rcuprer les graines dans 1 ml deau strile et stocker +4C.

III.2. Germination des graines sur milieu MS : Couler le milieu enrichi strile (MS/2, saccharose 1.5% et Agar 0.8%) additionn de kanamycine 50g/ml dans des boites de ptri. Dposer les graines en suspension dans leau sur les boites, tout en veillant les espacer pour que deux systmes racinaires de deux plantes voisines ne sentremlent pas. Incuber +4C pendant 1 2 jours afin de synchroniser la germination et liminer une ventuelle dormance. Placer les boites dans la chambre de culture rgle une temprature de 22C 3 sous clairage continu (10000 Lux, lumire blanche). Dans les conditions optimales, la germination des graines se ralise dans 3 4 jours.

III.3. Culture des plantes sur terreau : Imbiber le terreau dans de leau puis lessorer ; il ne doit pas tre trop humide, puis le disposer dans des pots de culture de plantes. Les plantules denviron 1cm (2 3 rosettes de feuilles) y sont transfres dlicatement en vitant daltrer les racines. Les pots sont placs dans la chambre de culture une temprature de 22C 3 et sous clairage de 10000 Lux selon une photopriode J/N de 16h/18h, une longue photopriode favorise la floraison.

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PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

Arroser les plantes quotidiennement avec de leau (les pots sont placs dans 1 2 cm deau garder le terreau humide jusqu ce que les siliques deviennent brunes. III.4. Extraction dADN gnomique de la plante Arabidopsis thaliana : Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) Broyer le matriel vgtal (feuilles et tiges) dans un mortier utilisant de lazote liquide jusqu obtenir une poudre. Peser 40mg dans un tube eppendorf strile de 1.5ml puis ajouter 600l de Nuclei Lysis Solution , bien vortexer 1 3s et incuber 15mn 65C (Etape de lyse des cellules vgtales). Laisser refroidir 5mn le lysat, puis ajouter 3l dRNase. Agiter pour homogniser ensuite incuber 37C pendant 15mn (Elimination des ARN totaux prsents dans lextrait). Ajouter 200l de solution de prcipitation des protines et vortexer pendant 20s puis centrifuger 3mn 13000rpm (Prcipitation et limination des protines). Pipeter soigneusement le surnageant et le mettre dans un autre tube contenant 600l disopropanol. Bien agiter par inversions puis incuber 10mn temprature ambiante (Prcipitation de lADN gnomique). Centrifuger 1mn 13000rpm, dcanter doucement le tube et laver le culot par 200l dthanol 70% (faire attention le culot est trs lche). Centrifuger 1 mn 13 000rpm puis enlever lthanol doucement. Bien scher le culot puis resuspendre le culot dans 100l de solution de rhydratation et incuber 1h 65C ou bien laisser +4C pendant une nuit. Conserver lADN 2-8C.

III.5. Amplification du fragment spcifique du gne L1 de HPV16 (450pb) par PCR: Aprs broyage et extraction de lADN gnomique des plantes, des amplifications PCR ont t ralises partir de 50ng dADN gnomique, en prsence de 15moles de dNTP, 10 pmoles de chaque amorce (MY09 et MY11) et 2.5U de lenzyme GoTaq DNA polymerase. Le volume ractionnel est ajust 50l avec du H2O dpourvue de nuclases. Le programme damplification effectu comporte 35 cycles (Dnaturation 1mn 94C, Hybridation 1mn 42C, Elongation 1mn 72C) prcds par une tape de dnaturation pendant 5mn et suivis dune tape dlongation pendant 10mn. Les produits PCR sont par la suite analyss sur gel dagarose 1.2% ~ 98 ~

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pendant une heure chaque jour) et quelques fois avec la solution de fertilisation de manire

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

III.6. Synthse dADNc partir des ARN totaux de plantes :

System (Promega) Protocole conu pour une quantit de plante 30mg : Peser 30mg de poudre de matriel vgtal broy dans lazote liquide et le mettre dans un tube eppendorf strile. Ajouter 175l de RNA Lysis Buffer et agiter 5 6 fois, ne pas vortexer ; puis additionner 350l de RNA Dilution Buffer. Mlanger par inversions et centrifuger 13000rpm pendant 10 mn. Transfrer le surnageant dans un nouveau tube et ajouter 200l dthanol absolu. Bien mlanger par pipetage puis transfrer dans la colonne monte sur le tube collecteur. Centrifuger 1 mn 13000 rpm, vider le tube collecteur et y remettre la colonne. Ajouter 600l de la SV RNA Wash Solution, centrifuger 1mn 13000rpm puis vider le tube collecteur et y remettre la colonne. Prparer ex-temporairement le milieu ractionnel de la DNaseI {40l de Yellow Core Buffer, 5l de MnCl2 (0.09M) et 5l DNase I (10U/l)} et le garder dans la glace. Dposer les 50l de la solution de DNase I directement sur la colonne et incuber 15 mn temprature ambiante. Ajouter 200l de la solution DNase Stop et centrifuger 1 mn 13000 rpm. Ajouter 600l de SV RNA Wash solution et Centrifuger 1 mn 13000rpm. Vider le tube et y remettre la colonne. Ajouter ensuite 250l de SV RNA Wash solution, centrifuger 2 mn 13000rpm puis transfrer la colonne dans un tube eppendorf strile et luer lARN dans 100l de Nuclease Free Water par une centrifugation de 1mn 13000rpm. Stocker lARN -70C. III.6.2. Synthse de lADNc par la Reverse Transcriptase : 0,25g dARN totaux on est utiliss directement dans une raction de synthse dADNc. Cet ARN a t incub avec 0,5g doligodT 80C pendant 20mn pour crer une zone damorage de la synthse de lADNc. 5U de MuMLV (RT) avec le tampon 1X, 15moles de dNTP sont incubs 37C pendant une heure. Le mme protocole est appliqu dans le cas de plantes transgniques que de plantes non transgniques. A partir de 5l du mlange ractionnel, on ralise lamplification de lADNc en prsence de 10moles de dNTP, 20nmoles de chaque amorce (MY11 et MY09) et 2.5U denzyme GoTaq DNA polymerase. Le volume ractionnel est de 50l. ~ 99 ~

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III.6.1. Extraction des ARN totaux de plante Arabidopsis thaliana: SV Total RNA Isolation

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

40 cycles PCR ont t effectus selon le programme de la PCR ralise dans les conditions

1,2%.

III.7. Analyse des gnomes des plantes Arabidopsis thaliana par Southern blot : Le nombre dintgrations du gne L1 dans le gnome de plantes Arabidopsis thaliana a t identifi grce la technique Southern blot. Cette analyse a t effectue utilisant lADN gnomique de plantes suivant les instructions de Sambrouk et al. 1989. LADN gnomique a t isol partir de 150mg de plantes transgniques broyes et de gnration T1 utilisant le kit Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). 10g dADN gnomique de chaque ligne transgnique ont t digrs avec lenzyme XbaI puis spars sur gel dagarose 0.8%. LADN est ensuite transfr sur filtre de nylon et fix par exposition la lumire UV pendant 5mn. Comme contrle ngatif on a utilis lADN de plante non transgnique dans les mmes conditions. Pour prparer la sonde radioactive, 25ng de produit PCR L1 (450pb) on t marqus chaud avec le -[32P] 2-doxycytidine 5-triphosphate utilisant lenzyme kleenow pendant 60mn 37C suivant la mthode damorage au hasard (Amersham, Buckinghamshire, UK). III.8. Protocole dextraction des protines totales partir de plante : 100g de poudre de plantes transgniques fraiches broyes ont t utiliss pour extraire les protines totales. Ajouter 500l de tampon dextraction [50mM TrisHCl (pH 6.8), 5mM MgCl2, 1mM EDTA, 1mM EGTA (Ethylen Glycol bis (2-aminoethyl ether)-N,N,NN-Tetraacetic Acid), 5mM -Mercaptothanol, 1.5mM PMSF (Phenyl Methane Sulfonyl Fluoride) et 15% glycrol] et bien broyer avec un pilon. Vortexer pour bien mlanger. Les extraits ont t centrifugs pendant 5mn 10000rpm et 4C. Un volume du surnageant a t additionn avec du tampon dchantillon contenant le SDS. Aprs dnaturation la temprature, 10 30g de protines totales ont t spares par lectrophorse sur gel de polyacrylamide 12% (SDS-PAGE) puis transfres sur membrane de nitrocellulose (Hybond C; Amersham Pharmacia Biotech, Braunschweig, Germany).

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dcrites prcdemment. Ainsi les produits damplification ont t visualiss sur gel dagarose

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

PARTIE II. UTILISATION DE LA LEVURE PICHIA PASTORIS POUR

III.9. Extraction dADN plasmidique pPICZA: On peut extraire les plasmides partir des bactries grce deux techniques diffrentes : la premire repose sur une lyse alcaline et prcipitation par lthanol, la deuxime utilise un kit dextraction. III.9.1. Mini prparation par lyse alcaline : Le protocole suivant est optimis pour extraction partir de 1.5ml de culture bactrienne en phase stationnaire Prparer une culture bactrienne de nuit en inoculant 2ml de milieu LB additionn de zocine 25g/ml avec une colonie bactrienne contenant le plasmide pPICZA. Centrifuger 1.5 ml de la culture dans un tube eppendorf pendant 2mn 10000rpm, resuspendre le culot obtenu dans 200l de TE et centrifuger une autre fois 2mn 13000rpm (liminer le LB contenu dans le culot bactrien qui contient des inhibiteurs des ractions enzymatiques). Resuspendre le culot dans 150l de la solution I contenant le lysozyme, vortexer et incuber 5 mn sur glace (Etape de pr lyse). Ajouter 150l de la solution II et mlanger doucement par inversions; la solution devient claire et visqueuse (Lyse des cellules bactriennes). Ajouter 350 l de la solution III et inverser doucement pour mlanger ; la solution flocule (Etape de neutralisation des dbris cellulaires et lADN gnomique). Centrifuger 10mn 13000rpm puis transfrer le surnageant clair dans un nouveau tube contenant 600l disopropanol froid (v/v) ; mlanger par inversions et incuber au moins 30 mn temprature ambiante. Centrifuger 5mn 10000rpm, laver le culot avec lthanol 70% puis scher le culot sous la hotte. Suspendre le culot dans 30l de TE. Garder le plasmide -20C.

III.9.2. Mini prparation de plasmides utilisant un systme de purification sur colonne de silice : QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) (Ce protocole est dsign pour la purification de plus que 50g de plasmide partir de 1-5ml de culture bactrienne de nuit). Centrifuger la culture bactrienne dans des tubes eppendorf pendant 2mn 13000rpm puis resuspendre le culot dans 250l de Tampon P1. Ajouter 250l de Tampon P2 et mlanger par

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LEXPRESSION DE LANTICORPS VHH22 :

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

inversions 4-6 fois. Dans le cas dutilisation de la solution LyseBlue, sil y a lyse bactrienne la

Ajouter 350l de Tampon N3 et mlanger immdiatement par inversions. La solution flocule et revient incolore. Centrifuger 10mn 13000rpm puis prendre le surnageant et le dposer sur la colonne mise dans le tube collecteur ; centrifuger 1mn 13000rpm puis vider le tube collecteur. Recommandation : si la bactrie utilise est de gnotype endA+, ou bien une souche haute activit nuclasique, laver la colonne avec 500l de Tampon PB et centrifuger 1mn 13000rpm. Laver la colonne avec 750l de Tampon PE et centrifuger 1mn 13000rpm, vider le tube collecteur et refaire une centrifugation dune minute pour enlever le tampon rsiduel. Pour luer le plasmide, transfrer la colonne dans un tube eppendorf et ajouter 100l de tampon EB, incuber 1 mn temprature ambiante puis centrifuger 1mn 13000rpm. III.10. Amplification de lADNc du VHH22 par PCR utilisant des amorces spcifiques : La matrice utilise dans cette raction tait un plasmide recombinant fourni par Dr. Balkiss Bouhaouala Zahar de lInstitut Pasteur de Tunis. 50ng de cette construction a permis damplifier la squence correspondante en prsence de 20pmoles de chaque amorce (sens et anti sens), 10moles de dNTP, et 2,5U denzyme High Phusion DNA polymerase dans un volume ractionnel de 50l. Le programme de la PCR effectue comprend ; une tape de dnaturation primaire 95C pendant 30s suivie de 35 cycles composs de : Dnaturation 95C pendant 6s, 20s dhybridation 57C et 15s dextension 72C. Une tape dextension finale a t ralise pendant 7mn 72C. III.11. Purification de lADN sur colonne de silice partir du gel dagarose : MiniElute Gel Extraction (Qiagen): Ce kit est conu pour la purification dun maximum de 5g dADN double brin ayant une taille de 70pb-4Kb. Faire migrer les chantillons sur gel dagarose 1% voltage moyen pour bien sparer les bandes du mlange analys. Dcouper la bande dADN dintrt avec un scalpel propre nettoy lalcool. Peser la bande du gel dans un tube vide et ajouter 3V de tampon QG pour 1V de gel ~ 102 ~

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solution devient de couleur bleue.

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

(100mg). Incuber 50C pendant 10mn (jusqu dissolution totale du gel). Mlanger par

Pour un gel >2%, augmenter le temps dincubation. Vrifier que la couleur jaune de lchantillon na pas chang. Si la couleur vire vers lorang ou le violet, ajouter 10l dactate de sodium 3M de pH 5.0 et mlanger. Ajouter 1V du gel en isopropanol, mlanger puis placer une colonne dans le tube collecteur et dposer le mlange l-dessus. Centrifuger 1mn 13000 rpm (le maximum de la colonne est de 800l). Dposer 500l du tampon QG sur la colonne et centrifuger 1mn 13000rpm. Vider le tube collecteur et y remettre la colonne. Raliser le lavage de la colonne avec 750l du tampon PE ; centrifuger 1mn 13000rpm. Si lADN purifi va tre utilis dans une raction sensible aux sels, laisser lchantillon en incubation avec le tampon PE pendant 2-5mn avant de centrifuger. Raliser une autre centrifugation 1mn 13000rpm pour la colonne vide pour liminer le maximum de tampon PE. Placer la colonne dans un tube eppendorf strile pour luer lADN ; ajouter 10 30l de tampon EB sur la colonne, laisser incuber 2-5mn temprature ambiante puis centrifuger 1mn vitesse maximale. Vrifier llution sur gel dagarose 1% en prsence de BET. III.12. Traitement enzymatique de lADN : III.12.1. Digestion du vecteur pPICZA avec XbaI : Dans un mlange ractionnel de 20l, on a ralis la linarisation du vecteur pPICZA (3g) moyennant 15U denzyme XbaI et 1/10me du volume en BSA. La digestion enzymatique est ralise 37C pendant 1h30mn. Vrifier la raction de digestion sur gel dagarose 1%. Pour inactiver lenzyme, incuber 20mn 65C.

III.12.2. Traitement du vecteur par la Phosphatase Alcaline CIP : La dphosphorylation du vecteur linaris a t effectue pour empcher la recircularisation du vecteur au moment de la ligation. Dans un volume ractionnel de 25l, le vecteur linaris (2,5g) a t mis en incubation avec 15U de CIP (Calf Intestinal alcaline Phosphatase) 37C pendant une heure. ~ 103 ~

Matriel & Mthodes

inversions chaque 2 3mn durant lincubation.

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

Le mlange ractionnel est ensuite purifi directement sur colonne de silice utilisant le MiniElute

III.12.3. Digestion de lADNc par XbaI : 2.5g de produit PCR (ADNc de VHH22) ont t digrs par 15U denzyme de restriction XbaI dans un volume ractionnel de 25l pendant 3h 37C. Cette digestion permet de librer les sites de restriction des deux extrmits du produit PCR. Le produit de digestion est purifi ensuite sur colonne de silice et une fraction est vrifie sur gel dagarose. III.13. Purification de lADN directement partir des ractions enzymatiques : MiniElute Reaction Cleanup Kit (Qiagen) Ce kit est conu pour la purification dun maximum de 5g dADN double brin ayant une taille de 70pb-4Kb. Ajouter 300l de tampon ERC au mlange ractionnel et mlanger. (Si le volume de la raction enzymatique est plus que 100l aliquoter dans des tubes diffrents et ajouter chacun 300l de Tampon ERC). Vrifier que la couleur jaune de lchantillon na pas chang. Si la couleur vire vers lorang ou le violet, ajouter 10l dactate de sodium 3M de pH 5.0 et mlanger. Placer une colonne dans le tube collecteur et dposer le mlange l-dessus, centrifuger 1mn 13000rpm. Dposer 500l du tampon QG sur la colonne et centrifuger 1mn 13000rpm. Vider le tube collecteur et y remettre la colonne. Raliser le lavage de la colonne avec 750l de tampon PE et centrifuger 1mn 13000rpm. Raliser une deuxime centrifugation 1mn 13000rpm pour la colonne vide pour liminer le maximum de tampon PE. Placer la colonne dans un tube eppendorf strile pour luer lADN ; ajouter 10 30l de tampon EB sur la colonne, laisser incuber 2-5mn temprature ambiante puis centrifuger 1mn 13000rpm. Vrifier llution sur gel dagarose 1% en prsence de BET.

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Reaction Cleanup Kit et une fraction est vrifie sur gel dagarose.

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

III.14. Ligation pPICZA- insert:

(voir Annexe), on a ralis une ligation avec un rapport 2/1 Insert/Vecteur dans les conditions suivantes : Ligation contrle Vecteur 0.45g 0.45g Insert 0.3g T4 Ligase (20U/l) 1l Tampon 10X 1l H2O Qsp 10l > Incuber 1h 16C

III.15. Transformation des bactries E. coli par les mlanges de ligation : Ajouter strilement lADN plasmidique (10 100ng) 50l de bactries comptentes NEB5 et mlanger doucement par le bout du doigt puis incuber le mlange pendant 20mn dans la glace. Raliser le choc thermique par transfert du tube de la glace directement vers un bain marie rgl 42C pour une dure exacte de 30s puis de nouveau dans la glace pendant 5mn. Ajouter 950l de milieu LB prchauff, mlanger et incuber 1h sous agitation 37C. Etaler 10 et 100l de la suspension bactrienne sur LBA additionn de lantibiotique zocine 25g/ml et incuber O/N 37C. III.16. Vrification du sens dintgration de linsert par digestion avec BlpI : Environ 1.5g de vecteur recombinant ont t digrs avec 10U denzyme de restriction BlpI dans les conditions standards de la raction avec un volume final de 25l. Incuber pendant 30mn 37C puis visualiser le 10me du volume ractionnel sur gel dagarose 1%.

III.17. Protocole de transformation de Pichia pastoris par la mthode de choc thermique : (Manuel technique: Easy Select Pichia expression Kit; Invitrogen) Ajouter ~3g de vecteur recombinant linaris par PmeI 50l de levure comptente. Additionner 1ml de la solution II et agiter ;

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Selon la formule de calcul des rapports de quantit de vecteur et insert pour le clonage des gnes

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

Incuber pendant 2h dans un bain marie 30C en mlangeant chaque 15mn ensuite procder

Diviser la solution sur 2 tubes (525l dans chaque tube) et ajouter 1ml de milieu de culture YPD. Incuber 30C pendant 1h pour favoriser la rsistance lantibiotique zocine puis centrifuger 5mn 5000rpm et temprature ambiante ; Jeter les surnageant et resuspendre les culots chacun dans 500l de solution III. Combiner les deux suspensions dans un seul tube et centrifuger 5mn 5000rpm. Resuspendre le culot dans 100 150l de solution III et taler les cellules sur milieu YPDA additionn de zocine 100g/ml. III.18. Protocole dextraction dADN gnomique de levure : Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega) Dans un milieu YPD contenant la zocine 100g/ml, mettre en culture des cellules de levure Pichia pastoris pendant 20h 30C sous agitation continue de 220rpm. Centrifuger 1ml de cette culture dans un tube eppendorf pendant 2mn 13000rpm. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 293l dEDTA 50mM. Ajouter 7.5l de lyticase 20mg/ml et pipeter dlicatement pour mlanger. Incuber lchantillon 37C pendant 30 60mn pour favoriser la digestion de la paroi cellulaire puis laisser reposer temprature ambiante. Centrifuger lchantillon 13000rpm pendant 2mn et jeter le surnageant. Resuspendre dlicatement le culot dans 300l de solution de lyse (Nuclei Lysis Solution). Ajouter 100l de solution de prcipitation de protines et vortexer vigoureusement pendant 20s. Laisser lchantillon reposer pendant 5mn puis centrifuger 3mn 13000rpm. Transfrer le surnageant contenant lADN dans un nouveau tube eppendorf contenant 300l disopropanol ; viter de toucher le culot. Mlanger doucement par inversions jusqu obtention de prcipit dADN visible puis centrifuger pendant 2mn 13000rpm. Eliminer soigneusement le surnageant et laver le culot avec 300l dthanol 70%. Centrifuger 2mn 13000rpm puis aspirer le surnageant et scher sous la hotte. Resuspendre le culot dADN dans 50l de solution de rhydratation et incuber 1h 65C ou bien over night 4C. Pour liminer lARN, ajouter 1,5l dRNase et incuber pendant 15mn 37C. Stocker lADN 2-8C. ~ 106 ~

Matriel & Mthodes

directement au choc thermique 42C pendant 10mn.

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

III.19. Protocole dextraction dARN totaux partir de cellules de Levure: RNeasy Mini

Avant de dbuter la manipulation, prparer ex temporairement les solutions suivantes : Ajouter 10l de -mercaptothanol (-ME) par ml de solution RLT. Prparer le tampon Y1 (1M Sorbitol + 0.1M EDTA pH 7.4) additionn de 0.1% -ME et 50U Lyticase/Zymolase pour 5x107 cellules strictement avant utilisation. Rcuprer les cellules ( 5x107 cellules) dans un tube de 15ml par centrifugation 5mn 1500rpm et 4C. Enlever totalement le surnageant par aspiration, resuspendre le culot dans 2ml de tampon Y1 fraichement prpar puis incuber 10 30mn 30C en mlangeant de temps en temps. Centrifuger 5mn 500rpm et enlever le surnageant dlicatement. (Le surnageant rsiduel va inhiber la lyse et diluer le lysat). Ajouter 350l de tampon RLT et mlanger vigoureusement pour lyser les cellules. Sil ya du matriel insoluble, centrifuger 2mn vitesse maximale et utiliser juste le surnageant pour terminer les tapes suivantes. Ajouter 1V (gnralement 350l) dthanol 70% au lysat et mlanger par pipetage. Ne pas centrifuger. Des prcipits peuvent apparaitre cette tape. Procder immdiatement ltape suivante. Transfrer lchantillon (~700l) sur la colonne RNeasy place dans un tube collecteur. Fermer avec le bouchon et centrifuger 15s 10000rpm. Si le volume de lchantillon excde les 700l faire des aliquotes. Etape Optionnelle : En cas de traitement avec DNase sur colonne, raliser les tapes suivantes : a. Ajouter 350l de tampon RW1 sur colonne et centrifuger 15s 10000rpm pour laver la colonne b. Mettre 10l de solution stock de DNase I avec 70l de tampon RDD mlanger puis faire un coup de centrifugation pour rcuprer le mlange. Ce dernier doit tre dpos directement au milieu de la colonne (80l) et incub 20-30C pendant 15mn. c. Laver la colonne avec 350l de tampon RW1 et centrifuger 15s 10000rpm. Ajouter 700l de tampon RW1 et centrifuger 15s 10000rpm pour laver la colonne (cette tape peut ne pas tre ralise si le traitement DNase sur colonne est ralis). Ajouter 500l de tampon RPE et centrifuger 15s 10000rpm pour laver la colonne. Laver la colonne une deuxime fois avec 500l de tampon RPE et centrifuger 2mn 10000rpm. ~ 107 ~

Matriel & Mthodes

Kit (Qiagen)

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

Eluer lextrait dARN dans un tube eppendorf strile avec 30 50l H2O dpourvue de RNase. Performer une deuxime lution dans les mmes conditions que la prcdente. La quantit obtenue sera 15 30% plus faible que celle obtenue dans la premire.

III.20. Protocole de purification des protines VHH22 (His6) par technique IMAC (Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography) :

En 1967, Porath invente une mthode de couplage des protines des gels d'agarose et dmontre que la chymotripsine fixe sur ce gel conserve son activit. Plus tard, les travaux de Porath et Sulkowski posent les fondations de ce qui est devenu quelques annes plus tard une mthode de routine dans les laboratoires de biologie molculaire (Porath et al 1975, Sulkowski 1985). Dans ces premiers dveloppements, cette chromatographie d'affinit = IMAC (Immobilized-Metal Affinity Chromatography) a permis de purifier des protines contenant naturellement des histidines. Le principe de cette chromatographie daffinit repose sur la proprit de fixation des histidines sur des ions mtalliques (C++, Ni++, Zn++ et Co++). Par gnie gntique, on peut donc ajouter la protine que lon veut purifier une tiquette compose de plusieurs histidines conscutives (gnralement 6 mais on peut en avoir jusqu 10) Cette tiquette est capable d'interagir fortement avec les ions mtalliques. On utilise cette proprit pour fixer la protine ainsi tiquete sur une rsine chromatographique sur laquelle dj chlat un ion mtallique.

En 1987, Hochuli introduit une nouvelle molcule, l'acide nitriloactique (NTA), pour raliser l'immobilisation du nickel sur les matrices de chromatographie (Hochuli et al 1987). ~ 108 ~

Matriel & Mthodes

Laisser incuber 2 5mn puis centrifuger 1mn 10000rpm.

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

L'acide nitriloactique(NTA) est un complexant quadridentate, c'est--dire qu'il forme 4 liaisons.

gardent 2 sites accessibles qui peuvent tre occups soit par des molcules d'eau soit par d'autres molcules (figure ci-dessous). Charges avec du Ni2+, les rsines Ni-NTA lient de manire trs spcifique les protines ou polypeptides prsentant plusieurs histidines conscutives en surface. Aprs lavage des protines non retenues, la protine est ensuite lue par une solution d'imidazole qui dplace la protine de l'ion mtallique par comptition. En effet, limidazole, de part sa structure, est capable dinteragir avec les ions mtalliques de la mme faon que lhistine. Si on en ajoute des quantits largement suprieures celles de cet acide amin, il y aura remplacement de linteraction histidine/support daffinit par une interaction imidazole/colonne. Llution peut-tre galement tre ralise en baissant le pH, l'histidine va alors se protonner (base faible) et ne peut plus avoir de liaison de coordination avec le Ni-NTA. Ltiquette polyhistidine permettra donc la purification de la protine de fusion.

Protocole exprimental : Toutes les tapes du protocole de purification sont ralises 4C. Ainsi les incubations effectues sont sous agitation sur une plaque agitation orbitale pour veiller surtout au bon contact entre les protines et la rsine. Laver la rsine avec 10V en H2O pendant 10mn pour liminer les traces de tampon de stockage; Equilibrer la rsine avec 10V en Tampon 1 (30mM Phosphate de Sodium pH7.5 ; 0.5M NaCl ; 10mM Imidazole). Cette tape permet dviter les fixations non spcifiques des protines. Centrifuger 5000rpm puis enlever le surnageant. ~ 109 ~

Matriel & Mthodes

Il complexe fortement le cuivre et le nickel qui sont de valence 6. Ces ions, une fois complexs,

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

Charger lextrait protique (surnageant de la culture de levure) mlang 50% avec le tampon 1

Centrifuger 5000 rpm puis enlever le surnageant (fraction non fixe). A partir de cette tape tous les surnageants rcuprs doivent tre gards. Laver la rsine avec 2V en tampon 1. Centrifuger 5000 rpm et rcuprer le produit de lavage. Procder llution de la protine avec tampons 2, 3 et 4 (V/V) en augmentant la concentration dimidazole progressivement (les Tampons 2, 3 et 4 sont composs de : 30mM Phosphate de Sodium pH7.5 ; 0.1M NaCl et 100mM, 200mM et 300mM imidazole, respectivement). III.21. Sparation des protines sur gel dacrylamide en conditions dnaturantes SDSPAGE : Llectrophorse sur gel acrylamide en conditions dnaturantes est une mthode danalyse dcrite par Laemmeli (1970). Sparant les protines en fonction de leur gomtrie, masse molaire et forme. Le SDS est un dtergent anionique qui se fixe sur les protines et rompt les liaisons hydrophobes leur donnant une charge globale ngative. Son action, couple celle du DTT ou Mercaptothanol et la chaleur, permet la rupture des ponts S-S et la solubilisation des protines. Les polypeptides dnaturs perdent leur structure tertiaire et deviennent des btonnets, entours dun nuage de charges. Ainsi sous laction dun champ lectrique, les molcules sont spares uniquement par effet de tamisage molculaire. Et comme il existe une relation de linarit entre le logarithme de la masse molaire et la mobilit lectrophortique sur gel, on peut dterminer le PM de la protine dintrt en se basant sur une courbe de rfrence trace sur chelle logarithmique partir de protines standards analyses dans les mmes conditions.

III.21.1. Protocole de SDS-PAGE : Les protines sont spares par migration lectrophortique dans un gel de polyacrylamide aprs dnaturation par des dtergents, des rducteurs et une lvation de la temprature. Les protines charges ngativement par le SDS migrent en fonction de leur masse (Laemmli 1970). Le gel est compos de deux parties ; un gel de sparation sur lequel est coul un gel de concentration. Les protines sont reprises dans du tampon de charge et dposes sur le gel aprs dnaturation 95C pendant 5mn. La migration est conduite dans du tampon Laemmli sous un amprage de 20mA pendant environ 2heures. Aprs la migration, le gel peut tre color de diverses manires ~ 110 ~

Matriel & Mthodes

sur la rsine et laisser incuber pendant 1h.

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

et sch. Le gel peut galement tre transfr sur une membrane de PVDF immdiatement aprs

poids molculaire (Bio-Rad). III.21.2. Rvlation au nitrate dargent : La coloration au nitrate dargent est une mthode trs sensible, elle assure une dtection des protines de lordre de nanogrammes. Les gels sont immergs dans une solution dacide actique/thanol/Eau Milli-Q (50/10/40) pendant 30mn 1h. Cette tape fixe les protines dans le gel. Puis transfrer dans une solution de sensibilisation 5% thanol/1% acide actique et agiter pendant 15mn. Les traces rsiduelles dacide actique et dthanol sont limines par 3 lavages successifs de 5mn dans leau Milli-Q. Les protines sont ensuite sensibilises laction du nitrate dargent par un bain de thiosulfate de sodium 0,2g/l pendant 1mn. Lexcdent de thiosulfate est limin avec trois lavages leau Milli-Q chacune 30s. Le gel est ensuite immerg dans une solution de nitrate dargent 0,2% et 0,75ml/l de formaldhyde 37% pendant 20 min. Les protines sont rvles par une solution de dveloppement compose de 200l formaldhyde 37%, 6% (m/v) carbonate de sodium et 2% (v/v) de la solution de thiosulfate de sodium. Agiter 2 5mn jusqu ce que la coloration convienne sachant quelle sclaircira avec la solution stop au moment opportun. Stopper la raction avec une solution dacide actique 5% (v/v) puis agiter 5mn jusqu ce que la coloration convienne, celle-ci ne bougera plus. Conserver les gels dans leau milli-Q ou les scher. III.22. Traitement de lanticorps avec le Peptide N-Glycosidase F: Le Peptide N-Glycosidase F, aussi connue comme PNGase, est une enzyme purifie partir de la bactrie Flavobacterium meningosepticum et possde la proprit de cliver les liaisons entre lAsparagine et le GlcNAc (N-Actyl Glucosamine) des rsidus mannose, hybride et complexes oligosaccharides dans les liaisons N-glycosidiques des glycoprotines.

~ 111 ~

Matriel & Mthodes

la migration. Les tailles apparentes des protines sont estimes par rapport un marqueur de

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

Conditions exprimentales : 10X de dnaturation et de lH2O si ncessaire. Dnaturer la glycoprotine par incubation 100C pendant 10mn. Ajouter au mlange ractionnel 2l de tampon de raction G7, 2l NP40 10%, 12l PNGase et ajuster le volume final 20l avec de lH2O. Incuber la raction pendant 1h 37C. Ne pas utiliser plus que 1/10me du volume en PNGase.

III.23. Technique western blot: III.23.1. Transfert des protines: Les protines dans le gel sont charges ngativement, elles migrent donc vers le ple positif. Ainsi, pour recueillir les protines sur la membrane, nous plaons le gel du ct du ple ngatif, et la membrane du ct du ple positif. Le tampon de transfert permet dune part de faire passer le courant lectrique, et dautre part, dextraire les protines du gel pour lamener sur la membrane. Nous appliquons un champ lectrique de 30 volts pendant 90mn environ. En colorant le gel au bleu de coomassie aprs le transfert, nous pouvons valuer la quantit de protines restante sur le gel.

III.23.2. Fixation des anticorps : Aprs transfert, les membranes sont laves 2 fois 15mn dans 0.1% TBS-TWEEN sur agitateur basculant pour exposer les sites antigniques. Incubation ensuite dans 0.1% TBS-TWEEN/5% lait (ou BSA 3%), sur agitateur basculant pendant une heure temprature ambiante (ou toute la nuit +4C). Lalbumine va se fixer de faon non spcifique sur tous les sites antigniques existants. Lavage 2 fois 15 mn dans 0.1% TBS-TWEEN avec agitation. Incuber avec lanticorps primaire anti-6xHis dilu au millime dans 0.1% TBS-TWEEN/1% BSA pendant la nuit 4C (ou 1h temprature ambiante ou mme pendant le weekend 4C) sous agitation. Le premier anticorps reconnait spcifiquement la protine dintrt et va dplacer lalbumine lie non spcifiquement. Pour cette manipulation nous utilisons des tubes falcons de 50ml dans lesquels nous enroulons la membrane, la face contenant les protines vers lintrieur, ou des boites avec de la membrane contenant les protines vers le haut, que nous plaons sur agitateur giratoire en chambre froide.

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Matriel & Mthodes

Dans un mlange de volume final de 10l, combiner 1 20g de glycoprotine, 1l de tampon

PROTOCOLES EXPERIMENTAUX

Effectuer deux lavages 2 de 15mn dans 0.1% TBS-TWEEN puis incubation avec lanticorps ambiante sous agitation. Lanticorps secondaire reconnait les IgG de lespce o lanticorps primaire a t produit. Lanticorps secondaire quon a utilis est un anti-IgG de souris. Laver la membrane 2 fois 15mn dans TBS/TWEEN 0.1%, sur agitateur basculant puis passer la rvlation lECL utilisant le kit Amersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents.

III.24. Test dactivit ELISA: Prparer la plaque ELISA par fixation des deux toxines AahI et AahII dans les puits (0,2g) pendant la nuit. Laver 2 fois les puits avec 250l de tampon PBS-T (10 mM tampon phosphate pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20). Ajouter 200l de solution de saturation contenant 5% de lait poudr et incuber pendant 45mn 37C. Laver les puits deux fois puis dposer lanticorps VHH22 dans les puits et incuber pendant 45mn 37C. Laver les puits 6fois avec le tampon PBS-T puis dposer la solution danticorps secondaire anti-His coupl la peroxydase. Laisser incuber pendant 45mn 37C puis laver les puits 2fois avec 250l de solution de lavage. Rvler la fixation des anticorps secondaires par ajout de 100l de solution de rvlation compose dune glule dOPD (O-Propylne Diamine) dissoute dans 20ml dH2O pour avoir un substrat contenant 0.4 mg/ml OPD, 0.4 mg/ml hydrogne peroxyde dure et 0.05 M citrate de phosphate, pH 5.0. Une coloration se dveloppe son maximum aprs 20 30mn. Ne pas attendre pour comparer les colorations car au bout de quelques minutes les diffrences sestompent. Il faut stopper la raction avec 100l dacide sulfurique 2N. Dterminer la densit optique au niveau dun lecteur de plaques ELISA qui assure la mesure de la DO 450nm.

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Matriel & Mthodes

secondaire dilu au dix millimes dans TBS/TWEEN 0.1%/BSA 1%, 30mn temprature

Rsultats & Discussion

PARTIE I. MISE AU POINT DE LEXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES DANS LE SYSTEME ARABIDOPSIS THALIANA

CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA CHAPITRE II. ANALYSE DE LEXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2

CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA

Le cancer du col de lutrus, second cancer de la femme dans le monde, est responsable denviron 250 000 dcs par an au niveau mondial (Parkin et al., 1999). Des travaux rcents ont permis de dcouvrir que la quasi-totalit des cancers du col sont estims lis aux infections par les papillomavirus humains, lun des virus sexuellement transmissibles. Au moins 40 types de HPV infectant la rgion gnitale ont t identifis, mais vu que l'infection cervicale gnitale des femmes par les types 16 et 18 est fortement associe au cancer du col de l'utrus, ces types de HPV ont suscit la majeure partie de l'attention des tudes scientifiques. La protine L1 dont la masse molculaire est de 55kDa, reprsente la majeure protine structurale de la capside virale des Papillomavirus Humains de type 16. Cette protine glycosyle, de squence hautement conserve entre les diffrents types de Papillomavirus, porte les antignes de surface spcifiques du genre et du type. La portion C-terminale de la protine L1 dHPV16 comporte deux signaux de localisation nuclaire qui permettent son transport dans le noyau cellulaire o il y a lieu lassemblage des diffrents constituants du virus. Cette protine possde la capacit de sauto-assembler toute seule in vivo pour former des capsides dans les systmes dexpression eucaryotes sous forme de particules virales (VLPs: Virus Like Particles) portant les antignes de surface capables dinduire des ractions immunologiques spcifiques. Le gne codant pour la protine L1 a t identifi, squenc et exprim dans diffrents systmes dexpression eucaryotes comme le tabac (Hong-Li et al., 2005; Maclean et al., 2007)

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Rsultats & Discussion

Introduction :

CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA

Papillomavirus ont t dvelopps par diffrents laboratoires pour tre approuvs par la FDA et autoriss pour la commercialisation. Le premier vaccin qui a dj obtenu l'autorisation de mise sur le march (AMM) europen est le Gardasil. Ce vaccin quadrivalent recombinant dvelopp par le laboratoire Merck, contient certaines protines de la capside des virus de type 6, 11, 16 et 18 et qui permet une protection de 90 % contre les lsions cervicales gnitales. Le deuxime vaccin anti papillomavirus est le Cervarix, vaccin bivalent fabriqu par le laboratoire GlaxoSmithKline partir de protines L1 de type 16 et 18 et qui ont t dvelopps pour des traitements prventifs pour les filles de 15 23ans. Dans notre laboratoire, la plante Arabidopsis thaliana reprsente lun des systmes dexpression utiliss pour la production des protines recombinantes. En sappuyant sur les caractristiques de cette plante, elle a t choisie pour exprimer la protine L1 de la capside du Papillomavirus humain de type 16. Cette plante est dsigne parmi les meilleurs htes dans lassemblage des protines recombinantes et la formation de particules virales. Daprs des travaux raliss par Thomas et al. 2007, la protine L1 de HPV11 exprimes chez Arabidopsis reprsente moins de dgradation protolytique que celle exprime chez le tabac. Ainsi que son assemblage en particules virales est plus meilleur chez Arabidopsis. Dans un travail prcdent, lADNc correspondant (1,5Kb) a t intgr dans le gnome de cette plante suivant la stratgie binaire utilisant les caractristiques du vecteur pBI121 et la bactrie Agrobacterium tumefaciens souche GV3101 qui contient le plasmide (Ti) de virulence dsarm. La mthode de transformation adopte tait la mthode de transformation indirecte in planta qui est trs utilise dans la transgnse vgtale.

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Rsultats & Discussion

et Pichia pastoris (Boschi et al., 2009). Ainsi des vaccins reconnaissant plusieurs types de

CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA

un seul des chromosomes homologues au niveau des ovules localiss au niveau des fleurs de cette plante (hmizygotie). La descendance de cette gnration reprsente par de minuscules graines ont donn naissance des plantes transgniques comprenant chacune une seule copie du gne dintrt et qui sont rsistantes lantibiotique kanamycine ; ces plantes reprsentent la premire gnration de plantes transgniques T1. Ces dernires ont t analyses par PCR sur ADN gnomique et on a pu rvler des plantes transgniques qui ont incorpor le gne dintrt par amplification dune squence spcifique de taille 450pb. Les tudes ralises et discutes dans le prsent travail concernent les plantes transgniques obtenues partir de la gnration T2. Nous avons analys la transmission du gne clon chez les plantes des gnrations T2 et T3 par PCR sur ADN gnomique. Lexpression et la stabilit de lARNm du gne L1 ont t confirmes par technique RT-PCR. Grace la technique Southern blot nous avons montr que ctait une seule copie dADN-T intgre dans le gnome des plantes transgniques. Ainsi la protine L1 recombinante produite chez ces plantes a t identifie par western blot utilisant des anticorps spcifiques.

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Rsultats & Discussion

Les plantes transformes sont conues de gnration T0. La copie dADN-T sinsre dans

CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA

1- Analyse de lintgration du gne L1 dans le gnome des plantes transgniques et dtermination du nombre de copies: Grce la slection sur antibiotique, nous avons obtenu les plantes rsistantes de gnration T2 partir de la culture des graines issues de T1. Selon le mode de reproduction de la plane Arabidopsis thaliana, qui est lautofcondation, 25% de la descendance ne contient aucune copie dADN-T, donc elles vont tre limines suite leur sensibilit lantibiotique kanamycine. LADN gnomique de certaines plantes a t extrait par un kit et 50ng ont t utiliss comme matrice dans une raction damplification par PCR en prsence de 2,5U de Taq ADN polymrase et 0,04M damorces internes MY09/MY11 amplifiant une squence de 450pb spcifique du gne L1. Les bandes damplification obtenues partir de la PCR sur ADN gnomique de plantes T2 et T3 montrent bien que les plantes transgniques analyses contiennent au moins une copie du gne dintrt dans leurs gnomes. Pour que le rsultat soit certain et fiable, nous avons utilis des contrles positif et ngatif, dans les mmes conditions pratiques. Comme contrle positif on a utilis une squence dADN spcifique comme matrice amplifie par les mmes amorces et dans la mme temprature dhybridation. Dans des conditions pratiques pareilles, nous avons ralis une amplification contrle sur lADN gnomique de plantes non transgniques. Le rsultat montre

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Rsultats & Discussion

Rsultats & Discussion :

CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA

de la plante. LADN-T est une molcule transposable qui peut se dplacer dans le gnome des plantes grce la prsence des bordures droite et gauche qui assurent son intgration et son dplacement. La confirmation de la stabilit dun gne au niveau du gnome dune plante transgnique doit tre alors dtermine aprs 5 ou 6 gnrations successives. En effet, cette stratgie doit tre adopte surtout lors de lutilisation de la plante transgnique dans un objectif commercial. En appliquant la technique PCR on a pu amplifier une squence de 450pb spcifique du gne L1 et ainsi dmontrer avec succs sa transmission vers les gnrations T2 et T3 de plantes transgniques. Plusieurs facteurs peuvent influencer sur lexpression des transgnes chez les systmes htrologues. On sait actuellement que le transgne silencieux ne provient pas seulement partir des mcanismes de transcription couramment associs la mthylation du promoteur du transgne (Meyer 2000) mais le phnomne est aussi post-transcriptionnel ; i.e. le transgne est transcrit mais lARNm rsultant est instable (Meins 2000). Un tel phnomne est frquemment associ une intgration multiple du transgne dans la cellule. Les plantes transgniques produites par des mthodes directes de transfert d'ADN (par exemple, polythylne glycol ou transformation par des liposomes, lectroporation, ou le bombardement de particules) intgrent souvent un grand nombre de copies du transgne de faon rpte en tandem ou inverses, dans un mme ou multiples loci (Kohli et al., 1999). Ce

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Rsultats & Discussion

bien la spcificit des amorces utilises et labsence de complmentarit entre elles et lADN

CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA

systme recombinant. En vue de dterminer le nombre dintgrations de lADN-T au niveau des plantes transgniques slectionnes, 10g dADN gnomique purifis partir de 3 lignes de plantes transgniques de la gnration T3 et digrs avec lenzyme XbaI ont t utiliss dans une technique dhybridation molculaire sur support solide : technique Southern blot. Le marquage chaud de la sonde utilise pour lhybridation a t ralis par la mthode de radioactivit utilisant le 32P, ainsi la rvlation tait par autoradiographie. Lauto radiogramme rvle une seule tche dhybridation qui reprsente une seule copie du gne dintrt. La copie dADN-T intgre a t rvle au niveau dun fragment dADN de taille denviron 8Kb.

2- Synthse de lADNc de L1 partir des plantes transgniques grce la RT-PCR : Bien que la transformation par Agrobacterium ait habituellement comme consquence un nombre de copie infrieur dADN-T insrs en tandem au niveau dun mme locus (Jorgensen et al., 1987), toutefois le transgne peut tre silencieux mme en cas de simple intgration (Elmayan et Vaucheret 1996). Pour sassurer de la fonctionnalit du gne intgr au niveau du systme htrologue plante, nous avons eu recours la technique RT-PCR. Pour cela, les ARN totaux ont t extraits grce un kit de purification et 250g dARN ont t le sujet dune raction de rverse transcription puis amplification de lADNc double brin par PCR utilisant toujours les mmes amorces spcifiques MY09 et MY11.

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Rsultats & Discussion

phnomne peut effectivement avoir un effet ngatif sur lexpression du transgne dans le

CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA

transcriptionnel.

3- Analyse de lexpression de la protine L1 recombinante par western blot : La cellule vgtale comporte de nombreuses protases qui assurent diverses fonctions de rgulation, de maturation protolytique et la demi-vie (turnover) des protines (Schaller, 2004). Bien qu'essentielles au mtabolisme cellulaire, ces protases reprsentent une menace importante contre la stabilit des protines recombinantes qui peuvent subir des clivages partiels, parfois dltres pour leur activit biologique (Outchkourov et al., 2003; Badri et al., 2007a). Le produit final devient alors plus htrogne, s'loignant parfois considrablement de sa contrepartie naturelle. Dans d'autres cas, la protolyse peut tre totale, entranant des rendements faibles (Takaiwa et al., 2007). En systme htrologue, la dgradation des protines exognes peut se produire in planta, durant les phases d'expression, ou ex planta, durant les diverses tapes post-rcolte, en cours d'extraction ou de purification. Dans ce dernier cas, la protolyse peut tre importante car l'homognisation et le dbris des cellules librent les protases et autres composs dnaturants des diffrents organites (en particulier la vacuole), directement dans l'extrait brut (Rivard et al., 2006). Diverses stratgies ont t envisages depuis quelques annes pour limiter la dgradation protolytique in planta comme ex planta.

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Rsultats & Discussion

Les rsultats montrent bien que la fonction du gne L1 intgr ntait pas affecte au niveau

CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA

western blot afin de montrer lexpression effective de la protine L1 recombinante exprime dans les diffrentes parties ariennes de la plante (Tige et Feuilles). En effet, les protines totales ont t extraites partir de plantes transgniques et de plantes non transgniques. Ces dernires ont servi comme contrle ngatif dans la raction. Le rsultat du western blot ralis montre que la protine L1 a t produite sous forme recombinante dans la plante Arabidopsis thaliana ayant la taille de ~55kDa. Ce rsultat est confirm par lutilisation de protines VLP produites chez le tabac comme contrle positif. Ainsi labsence de signal au niveau des plantes non transgniques permet de prouver la spcificit des anticorps anti L1 utiliss. Quelques petites dgradations remarques au niveau de la protine L1 exprime et qui expliquent leffet de ltape dextraction.

Conclusion : Dans cette partie nous avons illustr le succs de lexpression dune protine dintrt thrapeutique et pharmacologique chez la plante Arabidopsis thaliana. Etant un modle dans la transgnse vgtale, nous avons choisi cette plante pour exprimer et produire la protine L1 majeure de la capside du papillomavirus humain de type 16 sous forme recombinante. Plusieurs essais ont t en faveur de la production de cette protine sous forme recombinante vue quelle possde la capacit de sauto-assembler dans certains systmes htrologues en particules virales considres effet prophylactique. Ces particules sont produites et commercialiss sous forme de vaccins capables dinduire une raction immunologique protectrice une fois administres un individu quelconque.

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Rsultats & Discussion

Les protines totales de plantes transgniques ont t le sujet dune analyse par technique

CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA

des plantes Arabidopsis thaliana comme systme dexpression reprsente un avantage intressant et un atout considrable dans ce domaine. Il nous reste pour cette partie de vrifier la formation des particules virales dans la plante ainsi que leur capacit de dclencher une raction immunogne, donc capable dtre utilise comme vaccin prophylactique. Toutefois, les vaccins conus pour une commercialisation doivent passer par des tapes de tests et validation afin de dcider lautorisation de leur mise sur le march.

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Rsultats & Discussion

La production des vaccins est un domaine trs sensible et trs coteux, donc lutilisation

CHAPITRE I. EXPRESSION DE LA PROTEINE CAPSIDE L1 DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN DE TYPE 16 CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

CHAPITRE II. ANALYSE DE LEXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2

INTRODUCTION :

LADN, support du patrimoine gntique de tous les organismes vivants, est une molcule stable mais qui peut occasionnellement subir des modifications. Un ensemble de mcanismes de rparation complexes permet la cellule de contrecarrer ces changements de squences afin de sauvegarder lintgrit du gnome et dassurer le maintient de linformation gntique. Les plantes, en raison de leur immobilit, doivent faire face couramment diffrents agents mutagnes. Afin de maintenir lintgrit de leur gnome, les vgtaux doivent se dfendre des erreurs de rplication de lADN et acqurir un systme particulirement efficace qui les protge des mutations et des recombinaisons gntiques. Lintgration de lADN-T qui contient le gne dintrt dans le gnome de la cellule hte est ralise de manire alatoire, plutt dans les rgions transcrites. Lorsquon gnre une plante transgnique, lADN sintgre dans un seul des chromosomes homologues. Pas de locus correspondant sur lautre chromosome ; cest lhmizygotie. Seulement la moiti des gamtes porteront le transgne en question. En effet, la premire gnration de plantes transgniques est htrozygote vis--vis du gne. La T2 reprsente la premire gnration de plantes transgniques ayant reu lADN-T contenant le gne dintrt comme locus. Donc on sest intress ltude de la transmission du gne vers cette gnration ainsi que sa fonctionnalit par des techniques de biologie molculaire simples et efficaces.

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Rsultats & Discussion

CHAPITRE II. ANALYSE DE LEXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2

Comme le mode de reproduction de la

plante

Arabidopsis

thaliana

est

lautofcondation, la gnration des plantes T2 se compose thoriquement de trois types de plantes: - Des plantes homozygotes contenant deux copies du gne et qui reprsentent 25% du total de la descendance; - 50% de plantes htrozygotes comprenant une seule copie du gne ; - Et 25% homozygotes ne contenant aucune copie dADN-T et qui ne vont pas pousser sur milieu slectif additionn dantibiotique kanamycine. Des plantes rsistantes de cette gnration T2 ont t le sujet dune analyse par PCR et RTPCR afin de dterminer la stabilit et la fonctionnalit du gne dintrt.

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Rsultats & Discussion

CHAPITRE II. ANALYSE DE LEXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2

Rsultats & Discussions : Rsultats & Discussion

Dans le but de suivre la transmission du gne L1 clon chez Arabidopsis thaliana, des plantes transformes de deuxime gnration T2 sont slectionnes sur milieu contenant lantibiotique kanamycine et sont analyses par amplification dun fragment spcifique de taille 450pb par technique PCR utilisant des amorces spcifiques MY09 et MY11. Ceci tant le dbut dun processus de suivie des gnrations pour confirmer la stabilit du transgne. Au niveau de cette gnration on voulait faire une mise au point de protocoles fiables et applicables la plante utilise comme systme dexpression. Vrifier les contrles positifs et ngatifs, optimiser les amplifications PCR de point de vue quantits de matrice, quantit damorces utiles, temprature dhybridation convenable afin de mettre au point les conditions exprimentales ncessaires tous au long des gnrations qui suivent. Les rsultats de PCR montrent bien que cette gnration de plantes transgniques contient lADN-T insr et par consquence le gne dintrt codant pour la protine L1. Comme contrle ngatif la raction on a utilis un ADN gnomique extrait de plantes non transgniques en vue de dterminer la spcificit des amorces utilises. Ainsi le contrle positif est reprsent par un vecteur pBI121 recombinant contenant le gne L1 insr dans lADN-T. La transmission de lADN-T vers les plantes transgniques de la deuxime gnration ne suffit pas pour confirmer la fonctionnalit du gne dintrt. Pour cela nous avons vrifi son niveau transcriptionnel. En fait, nous avons extrait les ARN totaux grce un kit de purification, on a synthtis lADNc par une transcriptase reverse et ensuite on la amplifi par PCR utilisant les mmes amorces spcifiques MY09 et MY11. ~ 139 ~

CHAPITRE II. ANALYSE DE LEXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2

Cette technique nous a montr que le gne L1 intgr est fonctionnel et il a tait transcrit en ARNm.

Conclusion :
Dans cette partie on sest intress la premire gnration ayant reu une rpartition gnotypique du gne intgr selon le mode de transmission des gamtes dans le cas de lautofcondation (Plantes Transgniques (T2)). En effet, un locus est dfinit au niveau de lun des chromosomes de la plante et qui est transmis des plantes de premire gnration vers la deuxime et ainsi vers les autres. La stabilit et la fonctionnalit de cette squence dpend de plusieurs facteurs influenant sur le dveloppement du gnome des plantes. Les deux techniques utilises PCR et RT-PCR peuvent dterminer la stabilit du gne au niveau de lADN gnomique et prouver sa fonctionnalit.

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Rsultats & Discussion

CHAPITRE II. ANALYSE DE LEXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2

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Rsultats & Discussion

CHAPITRE II. ANALYSE DE LEXPRESSION ET DE LA STABILITE DU TRANSGENE L1 CHEZ DES PLANTES TRANSGENIQUES T2

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Rsultats & Discussion

PARTIE II. MISE AU POINT DE LEXPRESSION DUNE PROTEINE ANTICORPS RECOMBINANTE DE TYPE VHH DANS LE SYSTEME PICHIA PASTORIS

- CHAPITRE III. EXPRESSION DUN ANTICORPS DE


TYPE VHH ANTI NEUROTOXINE AahI DE SCORPION CHEZ LA LEVURE PICHIA PASTORIS

CHAPITRE III. EXPRESSION DUN ANTICORPS DE TYPE VHH ANTI NEUROTOXINE AahI DE SCORPION CHEZ LA LEVURE PICHIA PASTORIS

Dans les pays tropicaux et subtropicaux, lenvenimation scorpionique reprsente un srieux problme de sant publique. Le nombre lev des dcs enregistrs daprs la Direction de Soin et de Sant de Base (DSSB) cause des envenimations scorpioniques reste inacceptable. Daprs des tudes statistiques, le scorpion Androctonus australis hector est responsable de 80% des cas denvenimations scorpioniques dans les pays du nord de lAfrique. Quelques srums anti-scorpioniques utiliss sont gnralement des anticorps de type F (ab)2 et Fab obtenus par protolyse amnage dimmunoglobulines dirigs contre tout le contenu du venin (Ismail 1994). Rcemment, lidentification des anticorps simple chaine variable lourde (VHH), appels aussi Nanobodies , chez les camlids vient douvrir de nouveaux horizons sur les mthodes de traitement de ces envenimations scorpioniques ainsi que pour la srothrapie en gnral. Ce type danticorps a montr aussi une grande capacit dtre un outil de choix dans le traitement thrapeutique de plusieurs maladies et cancers ainsi que pour des applications biotechnologiques et industrielles. Dans cette partie on montre lutilisation de la levure Pichia pastoris comme systme dexpression htrologue afin de produire une protine anticorps de type VHH dirige contre la neurotoxine AahI du scorpion Androctonus australis hector. Des travaux rcents ont t effectus au sein du Laboratoire des Venins et Toxines de lInstitut Pasteur en vue de produire des Nanobodies ayant une capacit de neutralisation importante vis--vis de cette toxine. Lun des clones slectionns qui a montr une affinit

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Rsultats & Discussion

INTRODUCTION:

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rsultats ntaient pas satisfaisantes de point de vue activit et quantit de protine produite. Nous avons donc envisag dans ce travail dexprimer cet anticorps chez le systme eucaryote Pichia pastoris afin de dmontrer de nouvelles caractristiques et proprits visant augmenter sa production et amliorer son activit de neutralisation. A nos jours, la levure Pichia pastoris a gard une place importante dans le domaine de la biotechnologie et de la production des protines recombinantes. Ce systme unicellulaire possde dnormes capacits dans la synthse et le bon repliement des protines htrologues surtout celles de petite taille (Joosten et al., 2003). Elle possde les caractristiques des cellules procaryotes dans la simplicit morphologique et structurale, dans le cot rduit de culture et maintient cellulaire, et en mme temps elle possde les caractristiques des cellules eucaryotes dont la capacit de raliser les modifications transcriptionnelles et post traductionnelles. Ainsi, la possibilit dutilisation des promoteurs inductibles comme celui du gne de lalcool oxydase AOXI favorisant le choix du systme Pichia pastoris dans la production des protines toxiques. En plus des normes performances de ce systme dexpression, des travaux rcents mens par Harmsen et al., ont montr en 2009 que la N-glycosylation des anticorps VHH augmente la capacit de scrtion des protines htrologues dans le milieu extracellulaire et amliore de trois cinq fois leur capacit de neutralisation vis--vis de lantigne. A la lumire de ces donnes, nous avons choisi Pichia pastoris pour exprimer lanticorps VHH22. Les rsultats obtenus montrent bien que cet anticorps a t exprim entirement dans le milieu extracellulaire sous forme glycosyle. En se basant sur la prsence de ltiquette histidine additionne du ct C-terminal, notre protine a t purifie sur colonne de Nickel Spharose avec un rendement qui a dpass les 95%.

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Rsultats & Discussion

importante la toxine dintrt a t produit sous forme recombinante chez E. coli mais les

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traitement avec une Glucosidase; (peptide N-Glycosidase F) permet de vrifier que lanticorps produit peut tre dglycosyle in vitro. Lactivit de neutralisation de lanticorps recombinant synthtis a t analyse par test ELISA contre les toxines AahI et AahII utilisant des quantits variables danticorps recombinant. Les rsultats taient satisfaisants puisquon a dtermin une activit considrable et spcifique avec des quantits minimes de lordre du 10-1ng.

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Rsultats & Discussion

Quant la modification glucosidique remarque, nous avons montr aussi que le

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1. Clonage de lADNc du VHH22 et transformation de la levure Pichia pastoris : La squence codante pour le VHH22 (393pb) a t amplifie partir dune banque dADNc utilisant des amorces spcifiques et contenant des sites de restriction XbaI. Cette squence a t clone au niveau du site XbaI du plasmide pPICZA (3.6Kb) sous le contrle du promoteur AOXI et en phase de lecture avec le facteur de Saccharomyces cerevisiae afin de permettre une expression extracellulaire de la protine. Nous avons utilis donc lenzyme XbaI pour traiter la squence VHH et pour linariser 3g de plasmide pPICZA. Le vecteur est ensuite dphosphoryl par la phosphatase alcaline (Calf Intestinal Phosphatase ou CIP ; NEB Labs) afin dempcher sa recircularisation. Aprs traitement enzymatique, le vecteur et linsert ont t purifis sur colonne de silice utilisant le kit Mini Elute Reaction Cleanup Kit (Qiagen) puis mis en mlange de ligation en prsence de la T4 DNA Ligase (NEB Labs) pendant 1h 16C.

Figure 1: La cassette dexpression pPICZA/VHH22. La squence VHH22 (393pb) a t clone en phase de lecture avec le facteur sous le contrle du promoteur inductible AOXI. La prsence dun seul site unique BlpI au niveau du vecteur et de la squence clone nous a permis de dterminer le sens dintgration par restriction enzymatique. Les sites dhybridation des amorces utilises sont localiss sur le schma ci-dessus.

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Rsultats & Discussion

Rsultats & Discussion :

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protocole appropri puis tales sur milieu LB contenant lantibiotique zocine (25g/ml) et incubes pendant une nuit 37C. Les bactries rsistantes obtenues sur milieu slectif ont t vrifies pour la prsence de vecteurs recombinants. Nous avons extrait les plasmides selon la mthode de lyse alcaline dcrite par Sambrook et al., 1989, puis ensuite digr par lenzyme BlpI afin didentifier les vecteurs recombinants et de vrifier le sens dintgration de la squence dintrt.

Figure 2: Analyse de lorientation du gne clon. Puits 1-3: Vecteurs suspects recombinants digrs par lenzyme BlpI. Puit 4: Contrle ngatif (vecteur intact linaris avec BlpI), M1 and M2: 100bp and 1Kb DNA Ladders respectivement (NEB Labs).

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Rsultats & Discussion

50l de bactries NEB5 comptentes ont t transformes par le produit de ligation selon le

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sens. Ce vecteur a t squenc utilisant lamorce -factor primer et nous avons vrifi que le gne est en phase de lecture avec le facteur et la squence du site de protolyse Kex2. Cette squence de clivage est ncessaire pour dtacher la squence dadressage au milieu extracellulaire (facteur ) lorsque la protine passe par ltape de maturation au niveau de lappareil de Golgi. Le vecteur recombinant obtenu a t linaris par PmeI et utilis pour la transformation de cellules P. pastoris comptentes selon les instructions du kit de transformation fourni par Invitrogen. Ensuite ont t tales sur milieu slectif contenant la zocine. Les clones rsistants qui ont pouss ont probablement incorpor la cassette dexpression.

2. Analyse du gnome des cellules P. pastoris transformes : Lintgration de la cassette dexpression au niveau du gnome de la levure P. pastoris se ralise par phnomne de recombinaison homologue. Deux modalits de recombinaison sont possibles, lune seffectue au niveau du ct 5AOXI seulement pour laisser le gne AOXI intact et dans ce cas les levures transformes sont de phnotype Mut+ (capables de mtaboliser le mthanol), lautre consiste au remplacement de la totalit du gne AOXI par intgration des deux cts 5 et 3 et dans ce cas les clones obtenus sont de phnotype MutS (sensibles au mthanol) ne pouvant pas mtaboliser le mthanol. Le phnomne de recombinaison simple au niveau 5 seul est le plus observ. Pour vrifier cette intgration on a utilis la technique PCR. LADN gnomique de clones recombinants a t analys par PCR utilisant deux couples damorces. Un premier couple damorces externes au gne dintrt et shybridant au niveau des rgions 5 et 3 AOXI

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Rsultats & Discussion

Un vecteur recombinant a t rvl incorporer la squence dADNc du VHH22 dans le bon

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squence dADNc du VHH22 (393pb). Par contre, si le clone nest pas recombinant, uniquement la squence de 588pb va tre amplifie. Dans notre cas les clones sont recombinants montrant une amplification de la squence de 1Kb pour tous les clones.

Figure 3: Analyse de lADN gnomique des cellules P. pastoris recombinantes par technique PCR. A: Amplification PCR avec les amorces AOX1. Ligne 1: pPICZA/VHH22 recombinant, Ligne 2: pPICZA intact, Lignes 3-5: ADN gnomique de cellules P. pastoris recombinantes, ligne 6: Contrle ngatif (ADN Gnomique de cellules non recombinantes). B: Amplification PCR avec des amorces internes spcifiques. Ligne 1: Nested-PCR sur la squence VHH (Contrle Positif); Ligne 2: pPICZA/VHH22 recombinant, Lignes 35: ADN Gnomique de P. pastoris recombinant; Ligne 6: ADN Gnomique de levure non recombinante (Contrle Ngatif); Ligne 7: vecteur intact. M: 1Kb DNA Ladder (Promega).

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Rsultats & Discussion

permettent damplifier une squence de ~1Kb comprenant 588pb du gne AOXI qui flanque la

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amorces, on remarque la prsence dune bande supplmentaire de taille 2,2Kb et qui reprsente le gne AOXI complet qui est amplifi. La prsence de cette bande donne une information sur le phnotype du clone recombinant obtenu. La raction PCR effectue montre bien que les clones qui ont pouss sur milieu slectif sont bien des clones recombinants et ont un phnotype Mut+. Pour mieux vrifier la prsence du gne dintrt au niveau du gnome des levures transgniques, ont a utilis le deuxime couple damorces internes amplifiant une squence de 289pb spcifique de lADNc de VHH22. Alors tous les clones analyss ont t rvls transgniques.

3. Analyse du transcriptome par RT-PCR : Les diffrents clones ont t mis en culture sur milieu BMMY contenant linducteur mthanol 0.5%. Aprs 24h de culture sous induction, les ARN totaux des diffrents clones ont t extrait par le RNeasy Mini kit (Qiagen) ensuite une raction RT-PCR t ralise. Dans cette raction PCR on a utilis les amorces internes pour identifier spcifiquement lARNm du gne VHH22.

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Rsultats & Discussion

Si le clone recombinant est Mut+ (cas des cellules obtenues dans ce travail), utilisant ces

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Figure 4: Analyse de lexpression du gne par RT-PCR. Ligne 1: contrle positif (PCR sur pPICZA/VHH22 recombinant), Lignes 2 et 3: ADNc de cellules Pichia recombinantes, Ligne 4: contrle Ngatif (ADNc de cellules Pichia non recombinantes). Lignes 5 et 6: PCR directe sur extrait dARN totaux de cellules Pichia recombinantes, M: 1Kb Ladder (Promega).

Une bande damplification dADNc correspondant la taille suspecte a t obtenue pour les diffrents clones tests montrant que le gne dintrt a t bien exprim chez les clones recombinants.

4. Production de lanticorps recombinant : Le but dexprimer cet anticorps dans la levure cest de le produire en grande quantit, avec un repliement plus proche au naturel puisque la levure est un systme eucaryote qui a montr de grandes performances dans la production des protines htrologues et dassurer les modifications post-traductionnelles propres aux eucaryotes telle que le bon repliement, la formation des ponts disulfures, laddition des rsidus glucidiques ou lipidiques, etc. ncessaires pour assurer lactivit biologique de la protine. ~ 152 ~

Rsultats & Discussion

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Figure 5: Analyse de lexpression de la protine VHH22 par Immunoblot. Lignes 1-6: Analyse de la production extracellulaire du sdAb VHH22 par les clones de levure transformes. Ligne 7: contrle ngatif (cellules de levure transformes par le vecteur pPICZA intact). 100ng de protines extracellulaires ont t utilises dans chaque chantillon. M: Magic Mark Western Protein Standard (Invitrogen).

Les clones recombinants ont t cultivs sur milieu riche en glycrol 0.5% pour augmenter la biomasse cellulaire. Ensuite, une tape de production de la protine dintrt est ralise par induction du promoteur 5AOXI avec du mthanol 0,5% qui reprsente dans ce cas la seule source de carbone pour la levure Pichia pastoris transgnique pendant 48h et dans 10ml de culture. La production de la protine VHH22 a t analyse dans les deux milieux intra et extracellulaire par technique western blot utilisant des anticorps primaires monoclonaux anti6His Tag. Le rsultat du western blot a montr que la protine VHH22 est entirement secrte dans le milieu extracellulaire et ayant une taille denviron 23kDa. Aucune expression intracellulaire na t rvle.

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Rsultats & Discussion

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Figure 6: Purification de lanticorps VHH22 recombinant par IMAC. Ligne 1 : Extrait brut (milieu de culture), Ligne 2 : Fraction non fixe ; Ligne 3 : Lavage avec du tampon ; Lignes 4, 5 et 6 : Elutions avec 100, 200 et 300M dImidazole, respectivement. M : Marqueur de masse molculaire : Dual Color Protein Standard (BioRad).

La protine VHH22 possde normalement une taille de 15kDa, caractristique des anticorps simple domaine. Lobtention dune forme recombinante de taille suprieure la normale nous a laiss penser la possibilit dune modification post-traductionnelle par addition dun rsidu glycosidique surtout quon a localis un site potentiel de N-glycosylation (NDTA) au niveau de lacide amin Asparagine 91. Lanticorps recombinant a t purifi par chromatographie daffinit IMAC utilisant une rsine de Spharose charge de Nickel capable de fixer les tiquettes 6xHis prsentes sur les protines recombinantes exprimes. Le rendement de la purification a dpass 95%.

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Rsultats & Discussion

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Figure 6: Vrification de la dglycosylation du VHH22 par western blot. Anticorps VHH22 trait (2) et non trait (1) par la PNGase F. M: MagicMark Western Protein Standard (Invitrogen).

La protine purifie a t traite avec la Glucosidase F ; (ou peptide N-Glycosidase). Cette enzyme enlve les chaines oligo-glycanes fixs sur la protine. Les rsultats montrent bien le shift de la bande au niveau du gel aprs traitement, ce qui explique que la protine anticorps produite est sous forme glycosyle et aussi elle peut tre dglycosyle in vitro.

5. Analyse de lactivit de neutralisation de lanticorps VHH22 recombinant : Pour vrifier lactivit de neutralisation de lanticorps recombinant purifi sous sa forme glycosyle, nous avons ralis un test ELISA utilisant des quantits diffrentes de lanticorps. La capacit de reconnaissance de lantigne a t vrifie par lutilisation de quantits croissantes danticorps. Ainsi la spcificit la toxine AahI a t teste par son incubation avec une autre toxine (AahII) utilise comme antigne.

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Rsultats & Discussion

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Test ELISA
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0,375 0,75 1,25 2,5 5 10 AahI AahII

DO A490

Quantit de VHH22 (ng)

Figure : Test ELISA avec le VHH22 recombinant

Le test ralis montre bien que lanticorps VHH22 exprim et produit chez la levure Pichia pastoris sous forme glycosyle est efficace ainsi il reconnait spcifiquement la toxine AahI du scorpion Androctonus australis hector. Leffet de neutralisation est de plus en plus important que la quantit de VHH22 recombinant utilise est importante. La raction de reconnaissance dantigne obtenue est spcifique. Ce rsultat est dgag suite lutilisation dune autre toxine produite par le mme type de scorpion qui est lAahII. Alors aucun signal considrable na t obtenu. En outre, laugmentation de la quantit danticorps dans le milieu ractionnel na pas favoris la reconnaissance de la toxine AahII.

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Rsultats & Discussion

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Dans cette partie nous avons illustr des rsultats intressant sur lutilisation de la levure Pichia pastoris comme systme dexpression de lanticorps VHH22 sous une nouvelle forme glycosyle qui a montr plus defficacit dans la neutralisation de la toxine AahI de scorpion. Des techniques bien assistes de biologie molculaire nous ont permis de maitriser la manipulation de ce systme dexpression et dcrocher loriginalit dans la scrtion extracellulaire dun anticorps de type VHH sous forme glycosyle pour la premire fois chez la levure Pichia pastoris. Cette levure a t montre une autre fois comme un systme performant dans la production des protines recombinantes.

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Rsultats & Discussion

Conclusion :

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

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Rsultats & Discussion

Conclusion & Perspectives

CONCLUSION & PERSPECTIVES

La production de protines recombinantes est une biotechnologie qui entre dans une phase de maturit, entranant ainsi un essor de la production industrielle. Cependant, le processus de conversion de linformation gntique en protine biologiquement active se heurte au problme fondamental du repliement cellulaire des protines. Le choix du systme dexpression est principalement guid par les modifications que la protine doit subir pour tre biologiquement active. Bien quil existe des techniques permettant le transfert rapide des gnes clons entre diffrents systmes dexpression, le vecteur gntique, utilis pour exprimer le gne recombinant, doit tre adapt lhte choisi. De mme, il est important de connatre le compartiment cellulaire dans lequel la protine dintrt se replie ou exerce son activit biologique naturelle. Les systmes dexpression possdent un certain nombre de caractristiques biologiques qui peuvent tre optimiss, telle que le systme promoteur, le nombre de copies et la stabilit avec les squences signal. Mais le systme biologique entier et son rseau rgulateur sont extrmement complexes. Ainsi l'amlioration biologique de production par modification dirige et sa fine rgulation consomme beaucoup de temps avec un cot trs cher. Les travaux prsents dans ce manuscrit visent dvelopper des mthodes de base pour linstallation de la technologie de production des protines recombinantes intrt thrapeutique et industriel dans diffrents systmes dexpression htrologues principalement la levure Pichia pastoris et la plante Arabidopsis thaliana au sein du laboratoire. Les protines exprimes reprsentent un intrt considrable dans le traitement thrapeutique et prophylactique.

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CONCLUSION & PERSPECTIVES

La premire protine produite tait la protine L1 de la capside du papillomavirus humain de type 16. Cette protine possde une forte capacit dautoassemblage et forme des particules virales non virulentes mais qui sont capables dinduire les ractions immunologiques anti PVH16. Ces particules prsentent de bons candidats pour tre utilises comme vaccins prophylactiques. La production de cette protine a t ralis avec succs chez la plante modle Arabidopsis thaliana et la protine recombinante a t identifie dans lextrait protique des plantes transgniques. Comme perspectives ce travail, on prvoit la purification de cette protine et lidentification microscopique et par ELISA de lassemblage des particules virales, ainsi que lutilisation des particules virales dans des tests immunologiques chez des souris. Dans un second volet, nous avons russi exprimer une protine anticorps de type VHH dirig contre la neurotoxine AahI du scorpion Androctonus australis hector chez la levure Pichia pastoris. En fait, cest la premire fois quun anticorps de ce type est produit sous forme glycosyle chez ce type de levure. Le motif glycosidique fix sur lanticorps produit peut tre limin grce la Peptide N-glycosidase F. La protine anticorps VHH22 est confirme exprime totalement vers le milieu extracellulaire en fusion avec une tiquette histidine qui a facilit sa dtection par technique western blot, et par la suite sa purification via une colonne de rsine charge de nickel. En effet, grce la technique de chromatographie IMAC, nous avons pu purifier notre protine plus de 95%. Le VHH recombinant sous sa forme glycosyle a t vrifi pour son affinit la toxine AahI par un test ELISA. Alors on a obtenu des rsultats trs encourageants.

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CONCLUSION & PERSPECTIVES

La continuit du travail se prsente dans le test de lactivit de neutralisation de lanticorps VHH22 recombinant sous sa forme dglycosyle, ainsi que la dtermination de ses caractristiques biochimiques et pharmacocintiques et sa comparaison par rapport la forme recombinante produite chez la bactrie E. coli. Les deux systmes dexpression utiliss se prsentent parmi les systmes les plus performants dans la production des protines recombinantes. En effet, la plante est connue la meilleure dans lassemblage des protines produites sous forme recombinante. Par contre, la levure Pichia pastoris est le plus souvent efficace dans la production des protines secrtes de petite taille.

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Rfrences Bibliographiques

Rfrences Bibliographiques

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