Universidad Nacional Mayor de San Marcos 26 de abril de 2012

PURIFICACION DE PROTEINAS ENZIMA N 6

Nombre: Figueroa Ildefonso, Erick Gianpierre

RESUMEN La actividad enzimtica es afectada por la temperatura, el pH, la concentracin de la enzima y del sustrato, as como otros factores. El presente trabajo muestra algunos de los factores fsico-qumicos para la realizacin de la purificacin de la enzima 6. Esta enzima se caracteriza por ser estable hasta temperaturas de 40C y entre valores de pH de 5 y 11. En el intercambio inico se indico que el pH buffer adecuado resulta ser 6.1 y se trabaja en un rango de pH de 5.8 y 6.3; para lograra una buena purificacin con 98.7 % de enzima y 33.6 mg de protenas. Abstract Enzyme activity is affected by temperature, pH, concentration of enzyme and substrate as well as other factors. The present work shows some of the physico-chemical factors for carrying out the purification of the enzyme 6. This enzyme is characterized by being stable up to temperatures of 40 C and pH values between 5 and 11. In the ion exchange indicated that the appropriate buffer pH 6.1 and appears to be working in a pH range of 5.8 to 6.3, to achieve a good purification with 98.3% and 33.4 mg of enzyme protein.

INTRODUCCIN Las enzimas, catalizadores del sistema biolgico, son molculas de gran inters que determinan la pauta de las transformaciones qumicas. Tambin intervienen en la transformacin de un tipo de energa a otro. Las caractersticas ms sobresalientes de las enzimas son su poder cataltico y especificidad. La mayora de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar drsticamente su actividad. As, la pepsina gstrica tiene un pH ptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10.Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalizacin de la protena, los seres vivos han desarrollado sistemas ms o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiolgicos. En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse.

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MATERIALES Y MTODOS Se utilizo el software PROTEIN, este es un simulador de trabajo de purificacin de protenas, a partir de un extracto que contiene 20 enzimas diferentes. La metodologa consiste en aplicar tratamientos que precipiten o inactiven las otras 19 enzimas del extracto inicial procurando mantener la mayor cantidad de la enzima seleccionada.

RESULTADOS Y DISCUSIONES Termoestabilidad: Luego de aplicar una temperatura de 40 C por a partir de 60 minutos y prologando cada vez ms el tiempo, se puede apreciar que la concentracin de la protena y de la enzima no vara. Luego se vara la temperatura utilizando un lapso de tiempo fijo (30 min), rpidamente se puede notar que a temperaturas mayores a 40 C la concentracin de protena disminuye, pero al mismo tiempo la de la enzima decrece en gran cantidad, por lo que se comprueba que la temperatura optima de esta enzima N 6 es de 40 C. Esto se indica en la tabla N 1.

Tabla N 1 Tratamiento con temperatura a la enzima 6 Temperatura C -(Inicial)40 40 40 40 45 50 60 70 80 100 Tiempo (min) 60 120 240 30 30 30 30 30 30 30 [Protena] mg 511 511 511 511 511 354.8 295.8 112.6 25.1 5.6 0.3 Unidades de Enzima 3400 3400 3400 3400 3400 1606 759 169 38 8 0

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Saturacin optima de sulfato de amonio para precipitar la protena: Luego de probar diferentes porcentajes de saturacin de sulfato de amonio, se llega a obtener que la mejor concentracin es de 40% la precipitacin de la enzima es de 99.7%, en comparacin a los dems porcentajes donde se obtiene una precipitacin de enzima menor al y protenas precipitadas en grandes cantidades, esto se tomo aun con el porcentaje de protena precipitada de 35.4%, pero para disminuir esto se realizaran unos pasos siguientes mas. Se trabajo con el precipitado. Ver tabla N 2. Tabla N 2 Saturacin con sulfato de amonio [Sulfato de amonio] % -(inicial)0-20 0-35 0-36 0-40 0-50 0-70 0-90 0-96 %Actividad precipitada 62.3 99.1 99.1 99.7 99.7 99.7 99.7 100 % protena precipitada 13.8 30.1 30.1 35.4 51.7 83.8 98.4 100 %Enzima soluble 37.7 0.9 0.9 0.3 0.3 0.3 0.3 0 [Protena] 511 69.4 154.0 154.0 181.0 264.3 428.4 502.8 511.0 Unidades de enzima 3400 2119 3370 3370 3390 3390 3390 3390 3400

Cromatografa de intercambio inico Para el desarrollo de este mtodo se utilizo la opcin DEAE-cellulose, y se utilizo como pH de equilibro 6.1, tipo de gradiente usado fue de pH y el rango en el que se encontr fue de 5.8 6.3. Tabla N 3 Datos utilizados en la cromatografa de intercambio inico pH de equilibrio DEAE 6.1 Tipo de gradiente pH Rango de gradiente 5.8-6.3

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PURIFICACIN DE LA ENZIMA N6

Con los datos obtenidos se puede empezar a realizar la purificacin de la enzima. Primero se hace precipitar con el sulfato de amonio, con 40%.Paso seguido se trabaja con el precipitado ya que en este se encuentra la mayor concentracin de enzima (99.7%) y la de protenas es de fcil trabajo para con los pasos posteriores disminuirla.

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Luego de realizada la precipitacin se procede con la filtracin en gel con el Ultrogel AcA 54, la grafica nos muestra curvas con poca elevacin, de este grafico se seleccin una fraccin en la cual se encuentra la actividad enzimtica en mayor cantidad; se tomo la fraccin desde 40 a 65. El porcentaje de enzima en esta fraccin fue de 99.3% y haban 82.5mg de protenas.

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Paso seguido fue la cromatografa de intercambio inico con DEAE-cellulose se utilizo para esto como pH de equilibrio 6.1 y una gradiente de pH de un rango de 5.8 a 6.3; de la grafica resultante se realiza una nueva seleccin de fracciones siguiendo la zona donde se encuentra la mayor cantidad de actividad enzimtica 98.7% y solo 33.6 mg de protena; esta fraccin va de 40 a 45.

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Universidad Nacional Mayor de San Marcos 26 de abril de 2012 A este resultado se le aplico electroforesis la de 1 dimensin y la de 2 dimensiones.

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Universidad Nacional Mayor de San Marcos 26 de abril de 2012 CONCLUSIONES

La enzima presenta una alta resistencia a la temperatura en cuestin de tiempo, pero al aumentar la temperatura esto varia. El punto isoelctrico de la enzima esta aproximadamente en 6,1. Para la purificacin de la protena tambin puede utilizarse el mtodo del foco isoelctrico, pero esto aumenta el costo por lo que es ms recomendable los pasos realizados.

BIBLIOGRAFA

Bioquimica; Lubert Stryer, Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko http://www.medmol.es/tecnicas/25/ http://payala.mayo.uson.mx/Programa/regulaci%C3%B3n_de_la_actividad_enzim.htm

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