REVISIN

Fisiopatologa de la isquemia cerebral focal: aspectos bsicos y proyeccin a la clnica

C. Arango-Davila a, M. Escobar-Betancourt a, G.P. Cardona-Gmez b, H. Pimienta-Jimnez a
PATHOPHYSIOLOGY OF FOCAL CEREBRAL ISCHEMIA: FUNDAMENTAL ASPECTS AND ITS PROJECTION ON CLINICAL PRACTICE Summary. Aim. To review the basic aspects of focal cerebral ischemia as a fundamental element in clinical practice and of neuroprotective strategies. Development. Ischemia triggers several different responses in nerve tissue which, according to the degree of energetic limitation, can be adaptive or lead to cell death due to necrosis or apoptosis. Establishing these processes is a complex task and the mechanisms involved have still not been fully explained; this is made more difficult by the fact that many of them are simultaneous and also because of the implications they may have, not only in cell death but also in the adaptation of the neurons that suffered ischemic stress and survived. We outline the foundations for understanding the physiopathological phenomena at work in ischemia: neuronal stress and death, and the reaction of the macroglial and microglial cells. This is also illustrated by original images from research into cell response to ischemia at a pre-clinical level in an experimental model of focal cerebral ischemia in rats, evaluated using, for example, hematoxylin-eosin and immunohistochemical techniques for several cell markers. Conclusions. Cell death in ischemia is a complex phenomenon that can have two different outcomes: necrotic death or apoptotic death. Basic knowledge of the pathophysiology of ischemia and of the response of microglial and macroglial cells is the foundation for elaborating neuroprotective-type strategies, which must not only be oriented towards preventing acute cell death, but also later modes of cell death or strengthening the surviving tissue. [REV NEUROL 2004; 39: 156-65] Key words. Apoptosis. Cerebral ischemia. Necrosis. Neuroprotection. Physiopathology.

INTRODUCCIN Las lesiones vasculares cerebrales son la primera causa de incapacidad permanente en los pases industrializados y, por esta razn, originan altos costos sociales y financieros; adems, es la tercera causa de muerte en el mundo [1]. Los procesos fisiopatolgicos de la isquemia cerebral son el resultado de la secuencia de fenmenos celulares y moleculares a corto y largo plazo que confluyen en dos modalidades de muerte: la primera, relacionada directamente con el dficit energtico, o muerte necrtica, y la segunda, que requiere de un adecuado suministro energtico de la neurona y corresponde a la muerte celular programada o apoptosis. La comprensin de estos mecanismos es cada vez ms amplia, y es el fundamento para el uso de estrategias neuroprotectoras de aplicacin en la clnica. La presente revisin est dirigida a presentar las bases para la comprensin de los fenmenos fisiopatolgicos en la isquemia: el sufrimiento y la muerte neuronal y la reaccin de la macrogla y de la microgla. Se ilustra con imgenes originales la respuesta celular ante la isquemia a nivel preclnico en un modelo experimental de isquemia cerebral evaluado con tcnicas como hematoxilina eosina y tcnicas inmunohistoqumicas. FISIOPATOLOGA DE LA ISQUEMIA CEREBRAL FOCAL La obstruccin aguda de una de las mayores arterias cerebrales, como la arteria cerebral media (ACM), produce una inmediata
Recibido: 12.01.04. Aceptado tras revisin externa sin modificaciones: 11.05.04. Centro de Estudios Cerebrales. Facultad de Salud. Universidad del Valle. Cali. b Grupo de Neurociencias. Escuela de Medicina. Universidad de Antioquia. Medelln, Colombia. Correspondencia: Dr. Hernn Pimienta. Universidad del Valle. Facultad de Salud. Calle 4B, n. 36-00, San Fernando. Santiago de Cali, Colombia. Fax: 5 725 570 775. E-mail: hernpim@telesat.com.co. 2004, REVISTA DE NEUROLOGA
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reduccin del flujo cerebral en el rea de irrigacin correspondiente (isquemia focal). La reduccin del flujo sanguneo no es homognea en el sector afectado, y puede cambiar en minutos u horas, especialmente cuando se instaura la reperfusin [2]. La isquemia se torna grave en el denominado foco isqumico, mientras que en la periferia de ste se establece un anillo denominado rea de penumbra, en el cual la disminucin del flujo es menos grave, gracias a los aportes sanguneos de las colaterales arteriales del tejido adyacente no isqumico [3]. El impacto de la isquemia cerebral depende de la gravedad y la duracin de la reduccin del flujo sanguneo. Una isquemia poco grave pero prolongada produce cambios equivalentes a una isquemia corta y grave; sin embargo, se ha determinado que algunos fenmenos moleculares, como la inhibicin de la sntesis proteica, son los mismos sin importar la duracin de la isquemia [4]. Cuando la obstruccin arterial cesa, se desencadena una fase de incremento del flujo sanguneo en el territorio isqumico que se ha denominado hiperemia postisqumica, ocasionada por la liberacin de metabolitos vasoactivos, la disminucin de la viscosidad sangunea y el desencadenamiento de mecanismos vasodilatadores neurognicos [5]. Esta hiperemia postisqumica va seguida de un periodo mas prolongado de hipoperfusin postisqumica dada por la obstruccin microvascular y la vasoparlisis (6]. La reperfusin postisqumica no se logra completamente; generalmente, quedan parches de tejido en los que no se vuelve a restablecer el flujo sanguneo, lo que se ha denominado fenmeno de falta de reflujo y que es ms destacado cuanto ms prolongada sea la isquemia. Este fenmeno de falta de reflujo se corresponde con los sitios de necrosis tisular y es consecuencia de la confluencia de varios factores, como el incremento de la viscosidad sangunea, la coagulacin intravascular, la obstruccin microvascular por edema de podocitos, el edema endotelial y la obstruccin venosa [5,7]. Los infartos cerebrales se definen como reas de necrosis que se desarrollan en sitios en los que se ha producido una is-

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quemia grave. Su morfologa es variada y puede consistir en infartos isqumicos o hemorrgicos. El infarto hemorrgico es consecuencia de la reperfusin postisqumica y puede ocasionarlo la reapertura de la luz arterial, la obstruccin parcial de la arteria o el suministro de sangre proveniente de otros vasos que irrigan el tejido necrtico. La isquemia grave se asocia con reas de infarto completo con necrosis tisular, edema e inflamacin; con el transcurso de las horas, el tejido se licua y se generan soluciones de continuidad. A este fenmeno se le denomina necrosis colicuativa (Fig. 1a, a). FISIOPATOLOGA MOLECULAR DE LA ISQUEMIA La isquemia cerebral desencadena una secuencia de fenmenos moleculares a corto y largo plazo que se inician con el fracaso energtico relacionado con la interrupcin de los procesos de fosforilacin oxidativa y el dficit en la produccin de trifosfato de adenosina ATP (Fig. 2). La interrupcin de los gradiantes inicos transmembranales debido a fallos en la bomba de sodiopotasio ATPasa y otras bombas inicas dependientes de energa son el punto fundamental relacionado con los mecanismos fisiopatolgicos de la isquemia y, especialmente, de la muerte celular en el foco isqumico cuando la obstruccin vascular se prolonga durante unos minutos [8]. Las neuronas y las clulas gliales se despolarizan exageradamente por la entrada de sodio, cloro, calcio y agua al citoplasma [9]; adems, sale potasio, lo que produce un incremento inusitado de potasio extracelular [10]. El fracaso energtico y los cambios inicos asociados ocasionan un incremento de glutamato, una hiperexcitacin de los receptores glutamatrgicos de N-metil-D-aspartato (NMDA) ionotrficos y metabotrficos, y de los receptores del cido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropinico (AMPA), lo que confluye en un incremento aun mayor de la concentracin de calcio intracelular (Fig. 2) [6,11,12]. Este incremento de calcio intracelular no depende exclusivamente de la activacin de receptores de glutamato, sino de la estimulacin de canales de calcio dependientes de voltaje [13]. La hiperexcitacin ocasiona el fenmeno de despolarizacin perinfarto, la cual incrementa el gasto energtico, especialmente cuando la membrana intenta repolarizarse [3,14,15]. El incremento de calcio, junto con la acidosis y la despolarizacin perinfarto, contribuyen a la iniciacin del dao; ms tarde, la inflamacin y la activacin de fenmenos apoptticos contribuyen a incrementar la lesin [6,16]. Durante la isquemia y, especialmente, durante la reperfusin se generan radicales libres, entre los que se incluye el monxido de nitrgeno (NO). Estas molculas altamente reactivas se producen en los estados iniciales y tardos de la isquemia cerebral mediante mecanismos fisiopatolgicos diferentes: en primer lugar, se producen especies reactivas de oxgeno por el metabolismo del cido araquidnico y la NO sintasa neuronal (nNOS); en estados intermedios, los radicales libres de oxgeno son el aporte correspondiente a la infiltracin de neutrfilos en el rea isqumica, y en estados ms tardos interviene la sntesis y activacin de las enzimas NO sintasa inducible (iNOS) y la cicloxigenasa-2 (COX-2) [17,18]. La isquemia cerebral desencadena una serie compleja de sucesos moleculares, entre los cuales se encuentra la activacin y expresin de genes. Algunos de estos fenmenos parten de la reaccin inmediata de la neurona al dao [19], otros se asocian a procesos celulares que determinan el destino prximo de la

neurona afectada [20] y otros coordinan los mecanismos de reparacin de la neurona y los tejidos [21,22]. Entre los fenmenos de transcripcin gentica reconocidos durante el proceso isqumico se encuentran la activacin de genes de expresin rpida (IEG) [19], la induccin de genes de protenas de choque trmico (HSP) [20], la activacin de genes relacionados con citocinas proinflamatorias y molculas de adhesin celular [23], la induccin de genes de las enzimas iNOS y COX-2 [17], la induccin de genes de productos relacionados con la muerte celular programada [24] y la induccin de genes relacionados con factores de crecimiento [21,22]. Muchos otros procesos tienen una repercusin en el dao final al tejido por la isquemia. Entre stos se encuentran la liberacin de citocinas [25,26], la activacin de proteasas de serina [27], la diferente vulnerabilidad a la isquemia de algunos grupos neuronales (por ejemplo, el sector CA1 del hipocampo, las lminas III y V de la corteza y el estriado son ms sensibles a la isquemia) [28,29] y los fenmenos de tolerancia isqumica desencadenados por episodios previos de isquemia (precondicionamiento) [30]. MUERTE CELULAR EN LA ISQUEMIA CEREBRAL La muerte celular en la isquemia puede suceder de dos maneras. La ms comn, descrita en los tratados clsicos, es la muerte necrtica, tambin denominada oncosis o necrofanerosis (Fig. 1a, a) [31,32]. Resulta del fracaso energtico agudo, con prdida de la morfologa celular y, finalmente, lisis con desencadenamiento de procesos inflamatorios [33,34]. Por otro lado, puede observarse la muerte apopttica o muerte celular programada, en la cual se activan mecanismos intracelulares dependientes de energa que llevan a una degradacin regulada de la clula, que, ms tarde, es eliminada por clulas fagocticas sin desencadenar reaccin inflamatoria [16,35,36]. En la isquemia cerebral aguda se dan los dos tipos de muerte celular, pero en la fase aguda hay confusiones, debido a que el proceso necrtico puede ocasionar tambin la activacin de enzimas proteolticas caractersticas de la va apopttica. Cada vez contamos con ms evidencias del desencadenamiento de mecanismos apoptticos de aparicin subaguda y otros ms tardos que permiten explicar la muerte celular das o meses despus de la lesin (Figura 1b, b) [37,38,39,40,41]. La liberacin del citocromo c de la mitocondria como respuesta a la despolarizacin isqumica y la acumulacin de calcio intramitocondrial hace posible la formacin del complejo citocromo c-protena proapopttica BAD-APAF (factor asociado a la apoptosis). Este complejo es capaz de activar las caspasas y otras proteasas de cistena encargadas de la fase efectora de la apoptosis, responsables directas de la muerte neuronal por su capacidad de digerir protenas vitales para la clula, como protenas de reparacin del cido desoxirribonucleico (ADN), protenas reguladoras de la apoptosis y protenas estructurales del citoesqueleto [16,35,36]. Tras la isquemia cerebral focal experimental se ha encontrado induccin de genes y factores proapoptticos, como los factores de necrosis tumoral (Fas y Apo-2L) [42], el receptor de muerte TR3 [43], el factor nuclear-B [44] y el gen ligado a la apoptosis 2 (ALG2, del ingls apoptosis-linked gene 2) [45]; adems, se detecta la expresin de factores antiapoptticos, como la protena Bcl- [46], el factor de crecimiento tumoral 1 (TGF-1, del ingls tumor growth factor) [47], el factor de transformacin y crecimiento (TGF , del ingls transforming growth fac-

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Figura 2. Secuencia de los principales eventos fisiopatolgicos como consecuencia de un infarto cerebral. Obsrvese que el incremento intracelular de calcio est implicado tanto en los fenmenos de muerte neuronal necrtica como en los fenmenos de muerte celular programada o apoptosis.

sugerimos el inhibidor de la PKC Ro320432 como un agente de inters teraputico [55]. RESPUESTA DE LA NEURONA ANTE LA ISQUEMIA: NFASIS EN EL CITOESQUELETO En el cerebro adulto ocurren, permanentemente, cambios adaptativos en la estructura y la funcin de las neuronas. Estos cambios, que corresponden a la denominada plasticidad cerebral, estn implicados en procesos como el aprendizaje y la memoria y, adems, desempean un importante papel en la recuperacin del sistema nervioso ante diferentes tipos de lesin [57,58]. El citoesqueleto de la neurona es uno de los principales elementos relacionados con su morfologa y su plasticidad. Est constituido por microfilamentos (7 nm), filamentos intermedios (10 nm) y microtbulos (24 nm). Estas estructuras son fundamentales, tanto en la morfognesis como en el mantenimiento de la estructura de la neurona, y cumplen, adems, funciones de transporte de macromolculas y orgnulos a travs del soma y las prolongaciones neuronales. Los microtbulos estn constituidos por unidades de y tubulina ensambladas de forma intercalada de tal manera que forman un largo y flexible cilindro de 24 nm de dimetro, el cual tiene su origen en el centro de organizacin microtubular (COM) cerca del ncleo neuronal y se dirige a la periferia del soma o a las dendritas. Los microtbulos tienen un polo estable () en el COM y un polo dinmico (+) en la periferia de la neurona, especialmente en las dendritas. Este polo dinmico se debate permanentemente entre el ensamblaje y el desensamblaje, fenmeno que puede repercutir en la arquitectura de la neurona. Una larga serie de protenas de la familia MAP2/, denominadas protenas asociadas a microtbulos 2 (MAP2) son en gran parte responsables de la polimerizacin, estabilidad y organizacin de las unidades de tubulina y que constituyen los microtbulos [59,60]. El ensamblaje de los microtbulos consta de una fase de nucleacin y una fase de elongacin:

Figura 1. a) Lesin cerebral focal experimental en el territorio de la arteria cerebral media en ratas y su aspecto anatomopatolgico tras tincin con hematoxilina-eosina. a) Despus de 72 horas de la lesin. Obsrvense la cavitacin por lisis tisular, los ncleos picnticos y la cariolisis. b) Inmunohistoqumica para la protena efectora de la apoptosis caspasa 3. b) Se observan neuronas piramidales inmunoreactivas a la caspasa 3, evidencia del desencadenamiento de mecanismos relacionados con la apoptosis. c) Disminucin de la inmunorreactividad a la MAP2. c) Fragmentacin de microtbulos en el rea adyacente al infarto cerebral. Obsrvese la poca inmunorreactividad del cuerpo celular, la amputacin dendrtica y la fragmentacin de microtbulos. 40. Laboratorio de Isquemia Cerebral Experimental, Centro de Estudios Cerebrales, Universidad del Valle. Cali, Colombia, 2003.

tor ) [48], la eritropoyetina [49] y el factor de crecimiento asociado a la insulina I (IGF-1, del ingls insulina-like growth factor I) [50,51]. La capacidad de una neurona de expresar uno u otro de estos factores est relacionada con su vulnerabilidad especfica a la isquemia y a la muerte necrtica o apopttica. Se ha descrito que en circunstancias de isquemia cerebral, el exceso de glutamato disminuye el efecto neuroprotector del IGF-I [52,53]. El glutamato ocasiona una disminucin de la sensibilidad del receptor neurotrfico para el IGF-I debido a la fosforilacin de este receptor a travs de una compleja va bioqumica que culmina con la activacin secuencial de la proteincinasa A (PKA) y la proteincinasa C (PKC) [54]. Asimismo, segn nuestros ltimos resultados [55], mediante un modelo experimental de isquemia cerebral en ratas, se logr una disminucin significativa del total del infarto (50%) mediante la administracin de un inhibidor selectivo de la PKC, el Ro320432. Teniendo en cuenta el efecto neurotrfico del IGF-I [56], se plantea que la interrupcin de las seales intracelulares del IGF-I por causa del exceso de glutamato puede constituir una ruta que contribuye a la lesin excitotxica. Por ello,

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(extracelular signal regulated kinases) y la GSK3 (glicogen synthase kinase 3), que fosforilan residuos de los sectores RII y PRD, pueden cambiar las caractersticas espaciales de la molcula de MAP2 y modificar su susceptibilidad a las enzimas o su relacin con otras protenas, adems de disminuir la capacidad de fomentar el ensamblaje de los microtbulos (Fig. 3). En general, se considera que la fosforilacin de diferentes sitios de la MAP2 puede modificar diferentes aspectos del ensamblaje de los microtbulos; C A M B I O S C O N F O R M AC I O N A L E S INTERACCIN CON TUBULINA es decir, ciertos residuos fosforilados po Incrementa la carga negativa Disminuye la unin de la MAP2 a la tubulina dran fomentar la nucleacin, mientras Disminuye la interaccin Cambia la susceptibilidad a las enzimas que otros residuos facilitaran la elonelectrosttica con tubulina Altera la localizacin subcelular Disminuye la unin con tubulina Modifica la interaccin con otras protenas gacin [71]. As como la estabilidad de los microtbulos del citoesqueleto se encuentra Figura 3. Aspectos moleculares de la protena MAP2 y los cambios ms comunes ocasionados por efecto de las proteincinasas (ver texto). RII: subunidad reguladora II; CD: dominio central; PRD: comprometida por el efecto de las proteindominio rico en prolina; BD: dominio de unin a tubulina; PKC: Ca2+/Phospholipid-dependent pro- cinasas sobre las protenas de la familia tein kinase; PKA: cAMP-dependent protein kinase; CAMKII: Ca2+/calmodulin-dependent protein MAP2/, las fosfatasas producen un efeckinase II; ERK: extracelular signal regulated kinases; GSK3: glicogen synthase kinase. to opuesto de desfosforilacin y, por tanto, fomentan la estabilidad de los microtdurante la nucleacin, la MAP2 fomenta la formacin de dme- bulos [72,73]. Las fosfatasas, como la PP1, la PP2A, la PP2B ros de tubulina, y durante la elongacin, facilita el ensamblaje (calcineurina) y la PP2C se encuentran en alta concentracin en de los dmeros. el cerebro y con una importante relacin con el citoesqueleto de Las MAP2 presentan una secuencia de 32 aminocidos en la neurona y con la MAP2 [74,75,76]. Se sabe que la calcineuel extremo amino terminal que corresponde a un sector regula- rina es abundante en las espinas dendrticas y las densidades dor (RII) [61]; adems, en el extremo carboxilo terminal se postsinpticas y tiene la capacidad de desfosforilar indistintaobservan tres o cuatro secuencias repetidas de 18 aminoci- mente las secuencias fosforiladas en la MAP2 por la PKA y la dos, separadas por secuencias de 13 a 14 aminocidos, que co- CAMKII [77,78]. rresponden a los dominios de unin a la tubulina (TBD) [62]. La fosforilacin y la desfosforilacin son las principales Justo antes de los TBD se encuentra un dominio rico en proli- maneras en las que las MAP2/ responden a las seales extracena (PRD) que tambin ejerce una funcin reguladora de la lulares [72,73,79]. La dinmica funcional de la MAP2 est MAP2 (Figura 3) [63]. determinada en gran parte por los puntos de fosforilacin de la Las MAP2 interactan con la regin carboxilo terminal de molcula, y no tanto por la cantidad de fosfato ligado (Fig. 3). la tubulina a travs del TBD; esta asociacin produce estabili- Un exceso de fosforilacin o un exceso de desfosforilacin disdad de la relacin de las unidades de tubulina entre s y dismi- minuye la unin de la MAP2 a los microtbulos [80]. nuye la flexibilidad del microtbulo [64]. Los cambios en el La alteracin del equilibrio entre cinasas y fosfatasas podra PRD modifican la unin de la MAP2 con los microtbulos y guardar relacin con el cambio en el estado de fosforilacin del fomentan su estabilizacin [65,66]. Las MAP2 establecen unio- citoesqueleto y las consecuentes manifestaciones patolgicas nes con la actina a travs del TBD, y esta relacin puede modi- [81]. Se considera que cambios transitorios en el estado de fosficar la estabilidad de los microtbulos [67]. Tambin pueden forilacin de las MAP2/ podran inducir modificaciones en la establecer uniones con otros neurofilamentos a travs de un reorganizacin de la terminal postsinptica sin cambios evidendominio de unin a neurofilamentos que parece ser diferente al tes en la morfologa de la neurona, y que variaciones prolongadas TBD [68,69,70]. en la fosforilacin podran generar modificaciones grandes del La MAP2 presenta una alta proporcin de sitios suscepti- citoesqueleto y desencadenar cambios morfolgicos claros [71]. bles de unirse al fosfato (46 moles de fosfato por mol de proteLos cambios en el ensamblaje de los microtbulos y en la na), ya que es el sustrato de muchos tipos de proteincinasas inmunorreactividad de las MAP2/ se han convertido en un (Fig. 3). Esto la hace muy sensible a diferentes vas de transduc- importante y sensible indicador de respuesta neuronal al dao cin de seales intracelulares. En general, el efecto que tienen isqumico [45,82,83,84,85,86]. Esta sensibilidad viene dada las proteincinasas al fosforilar la MAP2 consiste en una dismi- principalmente por los cambios dendrticos, por lo que constitunucin de su capacidad de interaccin con la tubulina; por tan- ye un mtodo de abordaje de la plasticidad cerebral estructural to, fomentan el desensamblaje de los microtbulos. Las protein- [45,85]. Durante las primeras horas tras la isquemia se observa cinasas ms relacionadas con este fenmenos son la PKC (Ca2+/ una disminucin de la inmunorreactividad de la MAP2 en el phospholipid-dependent protein kinase), la PKA (cAMP-depen- rea perinfarto (Fig. 1c, c) la cual tiende a recuperarse con el dent protein kinase) y la CAMKII (Ca2+/calmodulin-dependent paso de los das. Se considera que estos cambios estn relacioprotein kinase II), las cuales fosforilan aminocidos principal- nados con mecanismos compensatorios y de reparacin [83,84]. mente en el TBD. Por otra parte, las proteincinasas del grupo de Congruentemente con este hallazgo, se ha encontrado que la las PDPK (proline directed protein kinases), como la ERK PKC presenta una activacin excesiva despus de la isquemia, y

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que el grado de activacin depende de la duracin de dicha isquemia; como se mencion anteriormente, la PKC limita la capacidad de interaccin de la MAP2 con la tubulina, por lo cual promueve el desensamblaje de los microtbulos [87]. Como sealamos anteriormente, segn nuestros resultados, un inhibidor selectivo de la PKC, el Ro320432, acta como agente neuroprotector en circunstancias de isquemia focal [55]. Aunque hemos relacionado este resultado con la desinhibicin de la funcin del receptor neurotrfico IGF-I, se podra especular que la inhibicin farmacolgica de la PKC tambin podra tener repercusin en la proteccin del citoesqueleto neuronal, evitara as el desensamblaje de los microtbulos y, por tanto, facilitara la reaccin al estrs y la supervivencia ante el dao isqumico. Es interesante sealar que la estimulacin de algunos subtipos de receptores glutamatrgicos NMDA incrementa la desfosforilacin de las MAP2 por activacin de fosfatasas como la calcineurina y la PP1, que influyen sobre la reorganizacin y estabilizacin del citoesqueleto [88,89]. Se plantea que la tubulina soluble despolimerizada abunda en las espinas dendrticas y en las densidades postsinpticas; la desfosforilacin de estas unidades de tubulina desencadenada por la activacin de los receptores de glutamato favorecera la formacin de microtbulos y modificara, de esta manera, la reorganizacin local del citoesqueleto postsinptico [90]. Se ha comunicado que la estimulacin glutamatrgica desencadena un incremento de la concentracin de ARNm para MAP2, lo que hace pensar que el glutamato tiene repercusin, no slo sobre la fosforilacin de la MAP2, sino tambin sobre la biosntesis y la concentracin de la protena MAP2 [91,92]. Las anteriores observaciones son congruentes con nuestros datos recientes [93], en los cuales se muestra, mediante un modelo de isquemia cerebral experimental focal, una respuesta de hiperfosforilacin de la protena asociada a microtubulos y un incremento significativo en la asociacin de la con la subunidad 2/3 del receptor de glutamato AMPA en el hipocampo. Teniendo en cuenta el efecto neuroprotector de los estrgenos [94], las ratas fueron tratadas con 17--estradiol. Esto evit la hiperfosforilacin de la , lo que gener un efecto de resistencia al estrs isqumico y de neuroproteccin [93]. Se ha planteado que la activacin de la calpana y la subsiguiente degradacin del citoesqueleto es un indicador sensible de la respuesta celular al dao [85,95,96,97]. La calpana es una proteasa de cistena que se activa con la presencia de calcio, abunda en las dendritas y se ha implicado en procesos de remodelacin neuronal, potenciacin a largo plazo y crecimiento neurtico. El incremento significativo de calcio que se produce durante una isquemia cerebral desplaza el rango de accin de la calpana de un estado fisiolgico a un estado patolgico, ocasiona la degradacin proteoltica de la MAP2 y, por tanto, perturba la estabilidad del citoesqueleto [85,97]. La fosforilacin de la MAP2 disminuye su sensibilidad a la calpana [98,99], lo cual es un proceso cuidadosamente regulado. Se ha encontrado que existe una relacin entre la activacin de los receptores glutamatrgicos NMDA y la protelisis de los microtbulos mediada por calpana. Al antagonizar los receptores de NMDA durante una isquemia cerebral focal experimental, se observa una tendencia a la preservacin de la inmunorreactividad de los microtbulos y una reduccin de la capacidad de hidrlisis de la calpana, lo que muestra el vnculo entre sta, la excitotoxicidad y la protelisis microtubular [100].

Se concluye que la protena asociada a los microtbulos (MAP2) es esencial en las interacciones del citoesqueleto neuronal, confiere estabilidad a los microtbulos y, por ende, se requiere para preservar la morfologa y la conectividad neuronal. Tiene relacin con importantes cascadas bioqumicas de reaccin intracelular y extracelular, lo que la hace particularmente sensible a las alteraciones ocasionadas por la lesin cerebral. Durante la isquemia cerebral y despus de ella experimenta cambios en su expresin y su conformacin que pueden reconocerse con tcnicas inmunohistoqumicas mediante anticuerpos especficos. Se constituye, pues, en un sensible marcador de sufrimiento neuronal y representa un modelo de reorganizacin estructural y sinptica (Fig. 1c, c). DESPOLARIZACIN PERINFARTO Y DEPRESIN PROPAGADA El rea adyacente al foco isqumico presenta unas caractersticas fisiolgicas y fisiopatolgicas especiales y se denomina rea de penumbra. Es un sector inestable, en el cual hay una disminucin del flujo sanguneo (hasta 20 mL/100 g/min) y en el que an estn preservados el metabolismo energtico y la integridad de la membrana celular. En el rea de penumbra, el incremento de potasio extracelular procedente del foco isqumico facilita el proceso de despolarizacin perinfarto, el cual es similar a la despolarizacin anxica pero puede ser reversible de forma espontnea; sin embargo, la despolarizacin perinfarto puede contribuir al crecimiento del foco isqumico y la muerte celular [3,101,102]. En este sector pueden ocurrir fenmenos ms tardos de muerte celular programada, cambios en las propiedades de las neuronas, activacin de la microgla y reaccin inflamatoria [16,103,104]. Entre los cambios neuroqumicos se ha destacado la reduccin hasta en un 60% de los receptores GABAA [104]. Otro suceso significativo desde el punto de vista neurofisiolgico consiste en el establecimiento, poco despus de la lesin isqumica, de la denominada depresin propagada (spreading depression). Este fenmeno se ha relacionado con el incremento de potasio extracelular y la consecuente activacin de la red astroctica, la cual ejerce un mecanismo de tamponamiento espacial, mediante el desplazamiento de potasio del sector isqumico a otros sectores de la corteza. La depresin propagada es un mecanismo bien conocido que consiste en una alteracin transitoria de los gradiantes inicos que genera unas ondas lentas de despolarizacin que viajan a travs de la corteza cerebral a una velocidad de 1,5 a 7,5 mm/min. La presencia de estas ondas se ha relacionado con dao en el rea de penumbra, pero no tiene relacin con dao en el tejido normal [105]. ACTIVACIN DE LA MACROGLA La isquemia cerebral focal ocasiona una bien conocida respuesta de activacin de la macrogla, no slo en el sector focal y el rea de penumbra, sino tambin en sectores alejados del foco isqumico (Fig. 4) [106]. El trmino gliosis, o reaccin glial, se usa para indicar cambios estructurales y fisiolgicos de los astrocitos y la microgla como respuesta a lesiones traumticas, isqumicas o infecciosas en el sistema nervioso. Dichos cambios pueden ser temporales o desencadenar reorganizaciones estructurales definitivas, en cuyo caso se usa el trmino cicatriz glial. Sin embargo, la cicatriz glial no se forma exclusivamente a

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ven el avance axonal, mientras que el condroitinsulfato y el queratansulfato interfieren con el desplazamiento axonal [110]. Los proteoglicanos los secretan los astrocitos a la matriz extracelular, donde interactan con la laminina para producir su efecto. Durante la lesin isqumica, los astrocitos incrementan la sntesis y la liberacin de sustancias neurotrficas, como el factor de crecimiento neuronal, el factor de crecimiento fibroblstico y la neurotrofina 3 [109] e incrementan la esteroidognesis [111]. La produccin de estos factores por los astrocitos es mayor cuanto ms cerca se encuentren de la lesin focal. Como se sabe, estos factores foFigura 4. Astrocitos reactivos en un sector de la corteza occipital ipsilateral a la lesin isqumica focal experimental en ratas (b) marcados con anti-GFAP Ntese la hipertrofia del soma y el mentan la supervivencia de las neuronas, de . incremento en el nmero y extensin de las prolongaciones al comparar con la corteza occipi- los propios astrocitos y de la microgla. tal contralateral (a). 40. Laboratorio de Isquemia Cerebral Experimental, Centro de Estudios En conclusin, se puede observar que hay Cerebrales, Universidad del Valle. Cali, Colombia, 2003. mltiples estrategias mediante las cuales la macrogla, especialmente los astrocitos, enexpensas de los astrocitos, sino que en su conformacin particifrentan la lesin isqumica y se preparan para facilitar la reparapan otros tipos de clulas, como fibroblastos y clulas epiteliacin del tejido. En condiciones normales, se evidencia un sisteles. La cicatriz glial es una nueva barrera que asla al sistema ma neuroprotector gil, que interviene en los mbitos molecunervioso del entorno y permite el restablecimiento del ambiente lar, celular e histolgico. neuronal. Los astrocitos reactivos se caracterizan morfolgicamente ACTIVACIN DE LA MICROGLA por un aumento de tamao (hipertrofia) y un incremento en el nmero y extensin de sus prolongaciones (Fig. 4b). Se pueden La microgla es un grupo de clulas de origen mesodrmico, observar a partir de las primeras seis horas de la lesin isqumiderivadas de los monocitos sanguneos que emigraron en fases ca. El incremento de la protena acdica glial fibrilar (GFAP), precoces del desarrollo embriolgico hacia el sistema nervioso. que corresponde a un tipo de filamento intermedio especfico de Las clulas microgliales, que se asimilan a los macrfagos de la los astrocitos, se ha establecido como uno de los marcadores sangre, se consideran inmunomoduladoras. Expresan un antgems sensibles para observar la reaccin astrocitaria [107]. La no que corresponde al complejo principal de histocompatibiliactivacin de los astrocitos en la isquemia puede ser consecuendad (MHC) que permite detectar estas clulas mediante tcnicas cia directa del fracaso energtico. El incremento de glutamato, inmunohistoqumicas y diferenciarlas de otras clulas del sisteATP y potasio extracelular son factores que, en conjunto o indema nervioso (Fig. 5) [112]. Durante la isquemia cerebral, las pendientemente, desencadenan la reactividad de los astrocitos clulas microgliales se activan ms rpidamente que los astrocien los sectores adyacentes a la lesin. Ms tardamente intervietos y participan en procesos de inflamacin y reparacin del sisnen la liberacin de citocinas y los factores de crecimiento neutema nervioso adulto. Tienen capacidad fagoctica y durante su ronal [108]. La depresin propagada se asocia a la reactividad actividad liberan diferentes tipos de sustancias, como la enzima de astrocitos en sectores alejados del foco isqumico [105]. elastasa, algunos radicales libres oxidativos y citocinas proinflaLos astrocitos forman en el sistema nervioso un sincitio que matorias o antinflamatorias, como las interleucinas 1, 3, 5 y 6, el acta como un tamponador espacial de potasio. Se propone que factor de crecimiento neuronal, el factor de transformacin y durante la isquemia hay un traslado de potasio del sitio donde se crecimiento y el factor de necrosis tumoral [34,113]. encuentra en altas concentraciones a otros sitios, y de esta maLas caractersticas morfolgicas de la microgla varan de nera se controla en parte la hiperexcitabilidad neuronal en el acuerdo a su estado funcional. En el caso de la isquemia, depenrea de penumbra. Otra de las funciones importantes atribuidas de del grado de afectacin del tejido. El inmunofenotipo dado a los astrocitos deriva de su capacidad de recaptar neurotranspor el marcaje del antgeno MHC permite identificar los simisores y metabolizarlos. Desempean un importante papel en guientes tipos [2, 34]: la recaptura de glutamato y, de esta manera, pueden hacer dis Microgla ramificada o microgla de reposo (Fig. 5a). Se caminuir la excitotoxicidad. Se ha observado que tras la isquemia racteriza por presentar un cuerpo celular pequeo y un aumenta significativamente la recaptura de glutamato por los ncleo contenido en un citoplasma estrecho. Tiene una gran astrocitos y aumenta la sntesis, la concentracin y la actividad cantidad de prolongaciones ramificadas delgadas de las que de la glutamina sintetasa [109], enzima que transforma el glutaemergen en ngulo recto prolongaciones similares a espinas mato en glutamina. de corta extensin. En la sustancia blanca, especialmente en Los astrocitos secretan a la matriz extracelular sustancias el cuerpo calloso, estas clulas se observan alargadas sicon capacidad de fomentar o inhibir el crecimiento axonal. De guiendo el curso de las fibras nerviosas y presentan menos esta manera, hacen posible el redireccionamiento del creciprolongaciones. miento del cono axonal y la reparacin de las lesiones. La tena Microgla activa (Fig. 5b). Son clulas que han cambiado su cina y la janusina inhiben el avance del axn en crecimiento; los inmunofenotipo, pero que an no desempean la funcin de proteoglicanos, especialmente el sulfato de heparina, promuemacrfagos. Se observan en sitios donde la afectacin is-

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qumica es subletal. Se ven como clulas abultadas con un cuerpo celular grande y prolongaciones cortas y gruesas. La microgla se activa en el lapso de la primera hora de la lesin isqumica. Microgla reactiva (Fig. 5c). Se observa en el rea necrtica o cerca del foco isqumico. Las clulas desempean su papel de macrfagos, son esfricas, pequeas, con caractersticas ameboides y no presentan ramificaciones. Se observan en la lesin isqumica en el lapso de las primeras seis horas y aumentan su nmero de forma importante hasta las 24 horas.

Figura 5. Modificaciones en el inmunofenotipo de clulas microgliales marcadas con anti MHC a las 72 horas postisquemia cerebral experimental en ratas; a) clulas microgliales en reposo localizadas lejos del foco isqumico; b) clulas microgliales activas cerca de la lesin; c) clulas microgliales reactivas en el borde de la lesin, ejerciendo su funcin fagocitaria. 40. Laboratorio de Isquemia Cerebral Experimental, Centro de Estudios Cerebrales, Universidad del Valle. Cali, Colombia, 2003.

El papel de la microgla en las lesiones isqumicas del sistema nervioso depende del estado y grado de resolucin de la lesin isqumica. Durante las primeras horas y los primeros das, la microgla puede facilitar la muerte y la destruccin de las clulas nerviosas por la liberacin de agentes como el factor de necrosis tumoral , el monxido de nitrgeno, el perxido de hidrgeno y los aniones superxido; sin embargo, ms tardamente, la microgla puede fomentar la supervivencia de las clulas y la reparacin de los tejidos por la sntesis de factores de crecimiento como las interleucinas 1 y 3 y los factores de crecimiento celular, que estimulan la astrogliosis y la supervivencia neuronal. FUNDAMENTOS DE LAS ESTRATEGIAS EN NEUROPROTECCIN En los ltimos aos se ha progresado de forma importante en el conocimiento de sustancias que actan en diferentes puntos de las cascadas que conllevan a la muerte por necrosis o por apoptosis y que interfieren con estos procesos prolongando la vida de la neurona [55,93]. Estos frmacos aparecen promisorios como estrategia de neuroproteccin y son el sustrato para estudios en animales de experimentacin y estudios clnicos en el humano. Iadecola [2] ha propuesto diferentes momentos en las estrategias neuroprotectoras, dependiendo del evento molecular sobre el que se interviene. Neuroproteccin primaria La neuroproteccin primaria se produce cuando se utiliza un frmaco que incrementa la resistencia de la neurona al dao isqumico, hipxico, excitotxico o metablico. Los antagonistas de receptores de glutamato, los bloqueadores de canales de calcio, los bloqueadores de canales de sodio, los inhibidores de la NO sintasa neuronal, los antagonistas del factor activador de plaquetas y las sustancias fijadoras de radicales libres tienen la capacidad de disminuir el dao cerebral si se instauran rpidamente en los momentos iniciales de la lesin. Neuroproteccin secundaria La neuroproteccin secundaria se refiere a la intervencin farmacolgica que interfiere con los procesos patognicos que se desencadenan despus de que se ha instaurado la lesin isqumica, hipxica, excitotxica o metablica. Estos procesos ms tardos son responsables de la muerte neuronal de forma necrtica o apopttica. En este grupo, se incluyen sustancias que pueden

disminuir la muerte necrtica tarda, como los inhibidores de enzimas inductoras de inflamacin como la NO sintasa inducible o la cicloxigenasa-2, y sustancias que bloquean las citocinas proinflamatorias. Las sustancias inhibidoras de enzimas efectoras de la apoptosis, como los inhibidores de las proteasas de cistena, los inhibidores de la protena proapopttica BAD, y la inhibicin del factor asociado a la apoptosis disminuyen la muerte celular programada. Neuroproteccin terciaria La neuroproteccin terciaria se dirige a potenciar la capacidad de recuperacin del tejido nervioso previamente lesionado y disminuir la diasquisis. En este sentido, se han utilizado medicamentos que incrementan la disponibilidad de aminas bigenas como los inhibidores selectivos de la recaptacin de serotonina, inhibidores selectivos de la recaptacin de noradrenalina o las anfetaminas. El mecanismo mediante el cual estas sustancias mejoran la plasticidad neuronal y la recuperacin del tejido an no se ha dilucidado. Los factores trficos, como el factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento endotelial y la eritropoyetina, entre otros, han incrementado la recuperacin despus de una lesin cerebral, no slo por su capacidad de neovascularizacin, sino tambin por un efecto trfico directo sobre la neurona a travs de genes que facilitan la reparacin y supervivencia de la neurona. CONCLUSIONES La isquemia desencadena en el tejido nervioso una serie de respuestas que, dependiendo del grado de limitacin energtica, pueden ser adaptativas o llevar a la muerte celular por necrosis o por el desencadenamiento de mecanismos de muerte celular programada. El establecimiento de estos procesos es complejo y los mecanismos se encuentran en vas de dilucidacin. Especial dificultad ofrece la simultaneidad de muchos de ellos y las implicaciones que cada uno de ellos puede tener, no slo en la muerte celular, sino en la adaptacin de aquellas neuronas que sufrieron el estrs isqumico y sobrevivieron. Lipton [114], en un intento de sistematizar y simplificar los mecanismos implicados en la muerte de la neurona por isquemia, seala cuatro etapas en el proceso de muerte neuronal. La primera etapa, denominada de induccin, incluye los cambios iniciados por la isquemia y la reperfusin, como la disminucin del ATP, la inhibicin del transporte electrnico, la disminucin del pH, el incremento del calcio, la liberacin de glutamato, el

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incremento de cido araquidnico y la activacin de genes que permiten la sntesis de citocinas y de enzimas para la produccin de radicales libres. Estos cambios permiten la activacin de cinco eventos nocivos que Lipton denomina perpetradores del dao y que incluyen: la accin perjudicial de los radicales libres, la activacin de la calpana, la activacin de las fosfolipasas, la activacin de la poli-ADPribosa polimerasa y la activacin de las vas apoptticas. La segunda etapa la induce la presencia de los perpetradores e incluye las alteraciones a largo plazo de las macromolculas o de metabolitos importantes. La tercera etapa est relacionada con los efectos perjudiciales a largo plazo de las alteraciones de las macromolculas y los cambios metablicos, que definen una alteracin en la funcin celular y en la estructura que incluyen cambios en la membrana

celular, la mitocondria, el citoesqueleto, la sntesis proteica y la actividad de las cinasas. Por ltimo, la cuarta etapa consiste en la progresin de los cambios bioqumicos y morfolgicos hacia la muerte celular. El conocimiento de estas etapas se encuentra en continua investigacin y an se desconocen muchos aspectos, especialmente de las ltimas dos fases. Las estrategias neuroprotectoras se fundamentan en el conocimiento detallado de cada una de estas etapas, y se busca reconocer eventos claves para una intervencin farmacolgica o fsica que pueda limitar el dao neuronal y facilite la recuperacin. Posiblemente, en este intento deba intervenirse sobre varios procesos, debido a la gran complejidad del cuadro fisiopatolgico, para lo cual es necesario definir cada una de las intervenciones como neuroproteccin primaria, secundaria o terciaria.

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FISIOPATOLOGA DE LA ISQUEMIA CEREBRAL FOCAL: ASPECTOS BSICOS Y PROYECCIN A LA CLNICA Resumen. Objetivo. Revisar los aspectos bsicos de la fisiopatologa de la isquemia cerebral focal como fundamento de la clnica y de estrategias neuroprotectoras. Desarrollo. La isquemia desencadena en el tejido nervioso varias respuestas que, dependiendo del grado de limitacin energtica, pueden ser adaptativas o llevar a la muerte celular por necrosis o por apoptosis. El establecimiento de estos procesos es complejo y los mecanismos se encuentran en vas de dilucidacin; especial dificultad ofrece la simultaneidad de muchos de ellos y las implicaciones que puedan tener, no slo en la muerte celular, sino en la adaptacin de aquellas neuronas que sufrieron el estrs isqumico y que sobrevivieron. Se muestran las bases para la comprensin de los fenmenos fisiopatolgicos en la isquemia: el estrs y la muerte neuronal, y la reaccin de la macrogla y de la microgla. Se ilustra con imgenes originales procedentes de la investigacin sobre la respuesta celular ante la isquemia en un mbito preclnico, en un modelo experimental de isquemia cerebral focal en ratas, evaluado con tcnicas como hematoxilinaeosina e inmunohistoqumica para varios marcadores celulares. Conclusiones. La muerte celular en la isquemia es un fenmeno complejo que puede darse en dos modalidades: muerte necrtica o muerte apopttica. El conocimiento bsico de la fisiopatologa de la isquemia y de la respuesta de la microgla y la macrogla es el fundamento para plantear estrategias de tipo neuroprotector, las cuales no slo deben ir dirigidas a evitar la muerte celular aguda, sino tambin modalidades de muerte celular ms tardas, o a fortalecer el tejido superviviente. [REV NEUROL 2004; 39: 156-65] Palabras clave. Apoptosis. Fisiopatologa. Isquemia cerebral. Necrosis. Neuroproteccin.

FISIOPATOLOGIA DA ISQUEMIA CEREBRAL FOCAL: ASPECTOS BSICOS E PROJECO CLNICA Resumo. Objectivo. Rever os aspectos bsicos da fisiopatologia da isquemia cerebral focal como fundamento da clnica e de estratgias neuroprotectoras. Desenvolvimento. A isquemia desencadeia no tecido nervoso vrias respostas, que, dependendo do grau de limitao energtica, podem ser adaptativas ou levar morte celular por necrose ou por apoptose. O estabelecimento destes processos complexo e os mecanismos encontram-se em vias de esclarecimento; oferecendo especial dificuldade a simultaneidade de muitos deles e as implicaes que possam ter, no s na morte celular, mas tambm na adaptao daqueles neurnios que sofreram o stress isqumico e que sobreviveram. So apresentadas as bases para a compreenso dos fenmenos fisiopatolgicos na isquemia: o stress e a morte neuronal, e a reaco da macroglia e da microglia. Ilustram-se com imagens originais, procedentes da investigao sobre a resposta celular perante a isquemia a nvel pr-clnico num modelo experimental de isquemia cerebral focal em ratas, avaliado com tcnicas como hematoxilina-eosina e imuno-histoqumica vrios marcadores celulares. Concluses. A morte celular na isquemia um fenmeno complexo que pode resultar em duas modalidades: morte necrtica ou morte apopttica. O conhecimento bsico da fisiopatologia da isquemia e da resposta da microglia e da macroglia o fundamento para planear estratgias de tipo neuroprotectoras, as quais no devem apenas ser dirigidas a evitar a morte celular aguda, mas tambm modalidades de morte celular mais tardias, ou fortalecer o tecido sobrevivente. [REV NEUROL 2004; 39: 156-65] Palavras chave. Apoptose. Fisiopatologia. Isquemia cerebral. Necrose. Neuroproteco.

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