INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE CIUDAD HIDALGO

DEPARTAMENTO: ING. BIOQUIMICA

Manual de pruebas bioqumicas

ALUMNA: XIUTLALZIN GARCIA PEREZ

CARRERA: ING BIOQUIMICA

GRUPO: 065J

GRADO: 5 SEMESTRE

PROF: IB. LIZETH SORIA LEAL

CD. HIDALGO Mich. a 15 de octubre de 2011. ndice INTRODUCCION.1

Fermentacin de la lactosa (Mc Conkey).2 Agar Hierro de Kliger (KIA)..3 Prueba del Indol ..5 Citrato de Simmons ..6 Agar Hierro Lisina (LIA) 7 Agar Urea de Christiansens .8 Prueba de la Fenilalanina (PPA)..9 Agar glucosa nitrato.10 RM VP.12 TSI.14 AGAR DNAsa ...16 Coagulasa.17 Prueba de bilis esculina19 Prueba de leche con tornasol.20 Prueba de licuefaccin.21 Introduccin a tinciones22 Tincin de Gram..23 Rodamina-Auramina...25 Naranja de acridina25 ZIEHL-NEELSEN (BAAR)..26 Blanco de calcoflor..26 Identificacin de levaduras27 Bibliografa.30

PRUEBAS BIOQUIMICAS

Las pruebas bioqumicas consisten en diversos test qumicos aplicados a medios de cultivo, los cuales en base su a su reaccin respuesta nos dan la pauta para identificar los diversos microorganismos presentes en el medio. Su funcionamiento depende enteramente en determinar la actividad de una va metablica basada en un sustrato que se incorpora al medio de cultivo y el cual ser incorporado o no durante el crecimiento del microorganismo. Otro mtodo para identificar y estudiar de mejor manera a los microorganismos es el uso de las tinciones, las cuales crean un contraste destacando la estructura y composicin de los microorganismos de tal manera que su identificacin sea ms precisa. Muchos colorantes utilizados en tinciones con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. La mayora de estos colorantes son de origen orgnico presentando as afinidad por los componentes de los microorganismos sin desnaturalizar a los mismos, generando as una ayuda de importancia en el mbito de la microbiologa. A continuacin se presentaran algunos de los mtodos mas comunes de tinciones y pruebas bioqumicas con el fin de auxiliar en la aplicacin practica en laboratorio de microbiologa. Las pruebas bioqumicas mas frecuentes son: Fermentacin de la lactosa (Mc Conkey) Agar Hierro de Kliger (KIA) Prueba del Indol Citrato de Simmons Agar Hierro Lisina (LIA) Agar Urea de Christiansens Prueba de la Fenilalanina (PPA) Agar glucosa nitrato RM - VP AGAR DNAsa TSI Coagulasa Prueba de bilis esculina.

Fermentacin lactosa (Mc Conkey) El agar Mc Conkey es un medio slido, diferencial y selectivo. Se usa para la descarte de bacterias con capacidad de fermentar la lactosa (Lac + y Lac -). Composicin : Peptona 20.0: fuente de nitrgeno y carbono para las Lac -. Lactosa 10.0: fuente de carbono para las Lac +. Sales biliares 2.5: le confiere carcter selectivo, inhibiendo el crecimiento de Gram +. Cloruro sdico 5.0: para mantener la tonicidad del medio (evitar osmosis). Rojo neutro 0.05: indicador que va hacer que el medio vire de coloracin. Si las bacterias son Lac +, producirn cidos derivados de la fermentacin que darn al medio un aspecto rosceo; si por el contrario son Lac -, el medio se basificar por el uso de la peptona y se tornar amarillo. Cristal violeta 0.001: interfiere junto con las sales biliares en la selectividad del medio. Agar 15.0: da consistencia al medio.

Lactosa +

Lactosa -

Test kligler
En este test se emplean AGAR KIA (Agar hierro de kligler) para determinar si el microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, producir gas o la formacin de acido sulfhdrico. La composicin del medio KIA es a un pH 7.4: Extracto de carne 3 g/l Extracto de levadura 3 g/l Peptonas 15 g/l Lactosa 10 g/l Glucosa 1 g/l Tiosulfato sdico 0,3 g/l Sulfato ferroso (Fe2+) 0,2 g/l Rojo de fenol 0,024 g/l NaCl 5 g/l Agar 12 g/l

Para llevar a cabo este procedimiento requiere una inoculacin especial: Inocular los microorganismos aislados en la placa de EMB (Eosina Azul de Metileno) en un tubo de medio KIA con el asa de siembra. La siembra se har de la siguiente manera: sembrar la superficie por estra y sembrar la parte interna del medio por picadura. Incubar 1824 h a 37C. De este test obtendremos la siguiente informacin: a) Fermentacin de glucosa o lactosa. Debido a que el medio contiene una pequea cantidad de glucosa y una gran cantidad de lactosa. Los microorganismos capaces de fermentar cualquiera de estos compuestos darn lugar a la formacin de cidos que bajan el pH del medio. Como consecuencia el rojo fenol vira a amarillo. Las reacciones metablicas que sucedern se enlistan a continuacin: Como los microorganismos utiliza la fuente de carbono ms asequible en el medio, la glucosa es la primera en ser degradada pero como su concentracin en el medio es muy baja agota rpidamente. Los productos de su degradacin acidifican el medio que cambia de rojo a amarillo. Al agotarse la glucosa empieza a utilizar las peptonas, pero solamente en aerobiosis (se corresponde a la zona de la lengeta del tubo). Este consumo da lugar a residuos amoniacales, produciendo una basificacin del medio. El indicador vira a rojo en esta parte del tubo. Posteriormente se produce el consumo de lactosa, en el caso de los microorganismos que sean capaces de utilizar este disacrido. Esto da lugar a un descenso de pH por lo que cambiar el medio de rojo a amarillo. El uso de la lactosa es gracias a la enzima -galactosidasa

b) Produccin de gas. La produccin de gas se detecta por la formacin en el medio de burbujas de gas perfectamente visibles ya que cuartean el medio. El gas se origina mediante la reaccin catalizada por la formiatoliasa a partir de cido frmico. Por lo tanto nos darn gas + los microorganismos que contengan esta enzima. c) Produccin de SH2. A partir del tiosulfato aadido al medio, algunos microorganismos producen el acido sufhidrico este se detecta ya que reaccionan con las sales de los metales pesados (Fe2+), y da la formacin de sulfuro de hierro que se deposita en gran parte del tubo, sobre todo en el fondo, oscureciendo el medio.

+SH2, degradacin glucosa y peptonas

de Degradacin de lactosa, Degradacin de glucosa y glucosa y peptonas lactosa,+ formiatoliasa

Prueba del indol El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces deshidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismo. La prueba de indol esta basada en la formacin de un complejo rojo; cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehido. El medio de cultivo debe ser rico en triptfano. Medios y reactivos a) Caldo triptofano Peptona o digerido pancretico de casena2 g NaCl .5g Agua destilada 100ml b) Reactivo de Kovacs p-dimetilaminobenzaldehido 10g alcohol amlico o isoamilico 150ml HCl concentrado 50ml El procedimiento a seguir para este test es: Inocular el caldo de triptfano con el microorganismo, e incubar a 35C durante 18 a 24 horas, al pasar este tiempo agregamos 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo. De este test obtendremos los siguientes resultados: Si hay presencia de indol se formar un anillo rojo en la superficie, sino este ser amarillo. Los controles para este test son Escherichia coli: positiva Klebsiella pneumoniae: negativa (mayora de cepas) Indol + Indol -

Citrato de Simmons

La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. La utilizacin de este reactivo se detecta en un medio de Simmons con citrato como la nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al pH alcalino de 7,6. Medio y reactivos a) Medio de Simmons pH=6.9 Fosfato diacido de amonio 1g Fosfato dipotasico 1g NaCl 5g Citrato de sodio 2g Agar 15g MgSO4 0.2g Agua destilada 1L b) Reactivo Azul de bromotimol 0.08g El procedimiento de este test es: inocular la superficie del agar inclinado con una sola estria en el pico. Utilizar un cultivo de 24 en un medio solido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos, incubamos a 35C durante 4 dias. Los resultados de este test son: Las bacterias que metabolizan el citrato liberan iones amonio al medio (degradacin del fosfato amnico) lo que provoca que este se alcalinice y el indicador vire azul.

Tabla de resultados para la imagen de la izquierda Cit+ Cit -

Agar hierro lisina (lia)

Este ensayo permite diferenciar los microorganismos que producen descarboxilacion o desanimacin de la lisina. Se puede detectar a dems la produccin de H 2S. Es muy utilizado en las tcnicas para la bsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto parecido en los medios diferenciales utilizados durante su aislamiento selectivo. En la desaminacin se produce un cido carboxlico y NH3 y se visualiza en la superficie la aparicin de un color rojo intenso. La produccin de H2S a partir de tiosulfato se visualiza por la precipitacin de sulfuro ferroso de color negro. Medio y reactivos a) Medio a pH=6.7 2 Peptona 5g Extracto de levadura3g Glucosa 1g L-lisina HCl 10g Citrato ferrico amoniaco 0.5g Tiosulfato de sodio 0.04g Agar 15g Agua destilada 1L b) reactivo Purpura de bromocresol. Durante las primeras etapas de la incubacin el fondo virar el indicador de pH del medio al cido (amarillo) por la fermentacin de glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado se formarn aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al bsico (color violeta). La informacin que nos arroja el test es: Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa (LDC). Cuando la lisina se descarboxila, el medio se acidifica y el indicador vira amarillo en el fondo. Si es productora de cido sulfhdrico, en cuyo caso el precipitado negro nos impedir ver si es LDC + o -. Si es productora de gas. LDC+ PRODUCCION GAS LDC+,H2S, PRODUCCION GAS LDC- PRODUCCION DE GAS

Ag ar

urea christensen Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad uresica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos. En el medio de cultivo, la triptena y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentacin de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella. Medio y reactivo. a) Medio a pH 6.8 2 Tripteina 1g Glucosa 1g NaCl 5g Fosfato monobsico 2g Agar 15g Agua destilada 1L b) Reactivo Rojo fenol 0.012ml Se siembra a partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubacin. Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color. Se incuba en aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 C. Este test nos otorga la siguiente informacin: El medio lleva como indicador Rojo fenol, que se torna amarillo cuando es negativo y rosa cuando es positivo. Hay que tener precaucin por que tambin puede ocurrir que no se produzca cambio de coloracin, en este caso es negativo. el medio posee un color rosceo (mucho menos intenso que los verdaderos positivos) lo que puede llevarnos a error (considerar falsos positivos) Urea Urea +

Prueba de la fenilalanina desaminasa (ppa) Medio de cultivo utilizado para diferenciar Morganella morganii biogrupo 1 y 2, Proteus spp. y Providencia spp., de la mayora de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae, en base a la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa. En el medio de cultivo, el extracto de levadura aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano. El aminocido fenilalanina sufre la desaminacin oxidativa catalizada por la enzima fenilalanina deaminasa (flavoprotena), para producir cido fenilpirvico y amonaco. La presencia del cido fenilpirvico se demuestra con el agregado de cloruro frrico en medio cido, con el cual se forma un quelato de color verdoso entre el cido fenilpirvico y los iones Fe3+. Adems, en este medio se suele poner en evidencia la produccin de pigmentos melnicos, como en el caso de Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, etc. Medio y reactivo a) Medio a pH= 7.30.2 Extracto de levadura 3g DL-fenilalanina 2g Fosfato disodico NaCl 5g Agar Agua destilada 1L b) Reactivo Cloruro frrico 10% 3ml Se siembra a partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar un inculo denso estriando la superficie del medio. Se incuba 18 a 24 horas a 35-37 C, en aerobiosis. Despus de lo cual se hace un revelado agregando unas gotas de una solucin acuosa de cloruro frrico al 10%. El anlisis de los resultados debe realizarse dentro de los primeros 5 minutos. Positivo: desarrollo de color verde plido a intenso en el pico de flauta y en el lquido de condensacin. Negativo: sin cambios de color. El medio permanece amarillo debido al color del reactivo cloruro frrico. PPAPPA+

AGAR

GLUCOSA

NITRATOS/movilidad. Medio desarrollado por Casellas, para estudiar simultneamente la reaccin de oxidacin o fermentacin de glucosa y la reduccin de nitratos a nitritos, por bacilos Gram negativos de fcil desarrollo. Esta prueba es til para diferenciar especies bacterianas. En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de carne aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, la glucosa es la fuente de energa y el azul de bromotimol es el indicador de pH. El nitrato de potasio es el sustrato de la enzima nitrato reductasa. El contenido de agar, otorga la propiedad de ser un medio semislido, que permite determinar la movilidad y la distribucin de los productos cidos sobre la superficie o en el medio de cultivo. Algunas bacterias pueden fermentar anaerbicamente la glucosa, otras la oxidan y algunas pueden metabolizarla por ambos mtodos, mientras que otras son incapaces de usarla. Asimismo, las bacterias muestran diferencias en los ciclos utilizados para esos procesos finales. Estas diferencias ayudan a la identificacin bacteriana. La hidrlisis de la glucosa acidifica el medio, haciendo virar el azul de bromotimol de verde a amarillo. Si este viraje ocurre solo en la parte superior del tubo, indica oxidacin de la glucosa; si todo el medio vira al amarillo, hay reaccin fermentativa, y si no vira o adquiere un color azulado, se presume que el microorganismo no utiliza glucosa. En este medio, adems, puede detectarse la movilidad observando si el crecimiento se aleja de la lnea de puncin, enturbiando el medio. La reduccin del nitrato a nitrito o gas nitrgeno por medio de la enzima nitrato reductasa, es un proceso de oxidacin por el cual el nitrato proporciona oxgeno para ser usado como aceptor de electrones. Medio y reactivo. Medio a pH=7.4 0.2 Peptona 10g/l Cloruro sdico 5g/l Extracto de carne 3g/l Glucosa 10g/l Agar 4g/l Nitrato de potacio 1g/l Agua destilada 1L

c) Reactivo

Azul de bromotimol0.01g/l Griess A y B Britania

Se siembra por puncin en profundidad con asa recta a partir de un cultivo puro de 24 horas, y se incuba 48 horas a 35-37C (algunos microorganismos requieren 4 das otros asta 14 das de incubacin) Los resultados que nos arroja este test son: a) Metabolismo de la glucosa: Microorganismos oxidativos: color amarillo en la parte superior del tubo. Microorganismos fermentadores: color amarillo en todo el medio de cultivo. Microorganismos que no fermentan y no oxidan la glucosa: el medio permanece verde o adquiere un color azulado. b) Movilidad: Positiva: presencia de turbidez que se extiende mas all de la lnea de siembra. Negativa: solo se observa turbidez en la lnea de siembra. c) Reduccin de nitratos: Positiva: desarrollo de color rosado-rojo luego del agregado de los reactivos Griess A y B. Negativa: ausencia de color rosado rojo luego del agregado de los reactivos Griess A y B.

+reduccin, +movimiento.

+m.o.

oxidativos, -reduccin, -m.o. fermentadores u oxdativos,- a movimiento

Rojo de metilo-voges-proskever(rm-vp) Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentacin cido-mixta y lafermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente acido lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0(amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin de cido. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftoldando un color rojo-fucsia. Medios y reactivos a) Medios a pH= 6.9 0.1 Peptona7g/l Glucosa 5g/l Fosfato dipotasico5g/l Agua destilada 1L b) Reactivos Rojo de metilo 0.1g/300ml de etanol 95 Agua destilada 200ml Alfa-naftol( 5%en etanol 95) Solucin de KOH al 40% en agua destilada Se inocula el caldo RM-VP con un cultivo puro de no ms de 24 horas de nuestro microorganismo en estudio, este se incubara a 35C por 48 horas aprox. Luego de finalizado este tiempo se transfiere a un tubo de 1ml de caldo de cultivo limpio para VP. En nuestro caldo restante revelar RM agregando 4-8 gotas de indicador rojo de metilo. Para revelar el VP se debe agregar 0.6 ml de alfa-naftol al 5% y una gota de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxigeno atmosfrico y dejar reposar por 15 minutos. Podemos interpretar los resultados de la siguiente manera: La RM- es positiva si se desarrolla un color rojo, indicndonos que la produccionde acido es suficiente para producir un viraje del indicador, y nos deja en claro que el microorganismo impemento la ruta de acido mixta para fermentar la glucosa. Si aparece un colo naraja o intermedio entre rojo y amarillo es considerado negativo.

 La VP- es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15minutos, y nos indica que hay presencia de diacetilo, el cual es producto de la oxidacin de la acetona.

+ RM-RM

-VP

TRIPLE AZUCAR HIERRO (TSI) El agar TSI es un medio nutritivo y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de acido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambin permite la deteccin de produccin de H2S. Es un medio til para la identificacin de enterobacterias. Como en anteriores test este medio se prepara en tubos de ensayo en forma de pico de flauta. Esto ayuda a que existan dos cmaras de reaccin dentro del mismo tubo. La porcin inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxigeno es aerobia y la porcin inferior (fondo) es relativamente anaerobia. Al crecer un microorganismo en el TIS, el pico tiene a virar al pH alcalino (color rojo por el rojo fenol) por la produccin de aminas, debido a la utilizacin aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo la degradacin de peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se detecta la produccin de pequeas cantidades de acido( indicador vira amarillo). Al inocular microorganismos no fermentadores por consiguiente no se formara cidos y el medio quedara rojo completamente por la formacin de aminas en el pico. La glucosa en el TSI esta en una proporcin 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de acido producida por la fermentacin ser baja (ya que la concentracin de glucosa es baja). Durante las primeras horas de incubacin se produce el viraje del indicador al amarillo en pico y fondo, pero despus el pico del tubo retorna a rojo por la produccin de aminas debido a la degradacin de peptonas. Si el microorganismo fermenta lactosa o sacarosa, debido a que las concentraciones de estos azucares son 10 veces mayor se produce gran cantidad de acido (que no puede ser neutralizado por la produccin de aminas en la superficie), por lo tal todo el tubo virara al color amarillo. La produccin de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por la precipitacin de sulfuro ferroso (negro). Como esta reaccin se da preferencialmente en medio acido, el ennegrecimiento del tubo se leer como la fermentacin de algunos de los azucares del medio. A dems de que pueda ocurrir todo lo antes mencionado puede haber una produccin de gas, ya sea como burbujas en el fondo del tubo.

Medios y reactivo

a) Medio a pH= 7.4 0.2 Extracto de carne 3g/l Extracto de levadura 3g/l Peptona 15g/l Proteosa peptona 5g/l Lactosa 10g/l Sacarosa 10g/l Glucosa 1g/l NaCl 5g/l Sulfato ferroso 0.2g/l Agar 12g/l Agua destilada L b) Reactivo Rojo fenol 0.024g/l Inocular los tubo de TSI con punta, se introducir hasta de 3 a 5 mm del fondo, tras retirar la punta del fondo, estriar el pico, e inocular a 35C durante 18-24 horas, pero no mas de 24 horas. Los resultados siempre se interpretan en el siguiente orden: Pico alcalino/fondo alcalino,no existe formacin de gas ni H2S. donde no hay formacin de azucares. Pico Alcalino/ fondo acido, no existe formacin de gas ni H2S. donde la glucosa es fermentada, pero ni la lactosa ni la sacarosa son fermentadas. Pico acido/fondo acido, la glucosa, lactosa y sacarosa fermentadas, puede producirse H2S o no, y puede a ver produccin de gas, con precipitacin de sulfuro ferroso.

Agar dnasa Medio de cultivo utilizado para la deteccin de enzimas desoxirribonucleasas. Es especialmente til para la diferenciacin entre especies de estafilococos, as como para la diferenciacin de Serratia spp. de especies de Klebsiella y Enterobacter. En el medio de cultivo, la triptena es la fuente de nitrgeno, aminocidos, y aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. El cido desoxirribonucleico (ADN), se encuentra en grado altamente polimerizado, y es el sustrato de la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa), la cual lo hidroliza. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar es el agente solidificante. Este medio de cultivo, permite diferenciar bacterias que poseen la enzima desoxirribonucleasa de aquellas que no la poseen. La presencia de la enzima, se puede detectar mediante el agregado de cido clorhdrico 1N. El cido desoxirribonucleico hidrolizado presenta transparencia, mientras que el cido desoxirribonucleico polimerizado, precipita y torna opacidad al medio de cultivo. Medio y reactivo a) Medio pH= 7.3 0.2 Triptosa 20g/l Acido desoxirribonucleico 2g/l NaCl 5g/l Agar 15g/l Agua destilada 1L b) Reactivo Acido clorhdrico 1N. Azul de toulidina/ verde de metilo 0.1g/l Se estriara la superficie de la placa e incubamos a 35C durante 18-24horas, y se observara el viraje del indicador a rosado alrededor de las estras. Un resultado positivo esta dado por el viraje del indicador en la zona de la estria a rosado

Coagulasa la coagulasa es una enzima proteica con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibringeno en la fibrina, provocando la formacin de un coagulo visible en un sistema analtico adecuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitio de infeccin estafilococcica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza mas comnmente para diferenciar al staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros staphylococcus. La coagulasa se halla presente en dos formas, libre y fija, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de tcnicas de determinacin diferentes. Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija est unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las clulas suspendidas en plasma (que contiene fibringeno) provocan su aglutinacin, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos. Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima extracelular que se halla presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensin de bacterias productoras de coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un cogulo visible como consecuencia de la utilizacin de los factores de coagulacin del plasma de manera similar a cuando se aade trombina. Medios y reactivos Plasma de coagulasa (difco o BBL) Cultivo staphylococcus de 24 horas en un agar nutriente o caldo nutritivo.

Dependiendo del cado objeto en que emplemos ser : a) Prueba en porta objetos: Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos. Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensin cargada homognea. Agregar una gota de plasma reconstituido junto a la gota de la suspensin de los microorganismos. Mezclar bien con el asa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formacin inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos

b) Prueba en tubo Colocar aspticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo estril. Aadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensin en suero fisiolgico de un cultivo en placa).Mezclar por rotacin el tubo, evitando remover o agitar el contenido. Colocar en bao de agua a 37C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24 horas, la formacin de un coagulo visible. Los datos que esta prueba nos arroja son: Prueba en portaobjetos: una reaccin positiva se detecta usualmente en 15a 20 segundos por la aparicin de un precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinacin en 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que algunas cepas de Staphylococcus aureus no producen coagulasa fija. Prueba en tubos: a) pueden generar pequeos cogulos no organizados (negativa) b) pequeos cogulos organizados (negativa) c) todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando el tubo es volteado. (positiva) d) Gran coagulo organizado (positiva).

PRUEBA DE BILIS ESCULINA. La prueba de la bilis-esculina est basada en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los estreptococos del grupo D, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es, qumicamente, un derivado de la cumarina (6-bglucsido-7-hidroxicumarina), que por su estructura pertenece a los glucsidos. Por definicin, stos estn constituidos por dos restos unidos por un puente de oxgeno. En el caso dela esculina, uno de los restos es una glucosa y el otro la 7-hidroxicumarina (que no es un hidrato de carbono, y es denominado aglucona). Las bacterias capaces de desarrollar en bilis y tambin hidrolizar esculina, producen glucosa y esculetina (7,7 dihidroxicumarina) y sta puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, por formacin de un complejo marrn oscuro o negro. Algunos medios bilis-esculina incluyen tambin azida sdica para inhibir el desarrollo de organismos Gram negativos, transformndose en selectivos para estreptococos. MEDIO y REACTIVO a) Medio

Peptona 5g/l Extracto 3g/l Bilis de buey40g/l Esculina 1g/l Citrato ferrico 0.5g/l Agar 15g/l Agua destilada 1L

Se estra el organismo en estudio en placas o tubos en pico de flauta de medio bilisesculina. Se incuba a 37C durante 24 horas. La prueba nos arroja: La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reaccin es positiva si se observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrn oscuro o negro alrededor de las colonias en placa.

PRUEBA DE LECHE CON TORNASOL

Permite diferenciar organismos sobre la base de sus mltiples reacciones metablicas en un medio lcteo como: fermentacin de lactosa, caseolina, y coagulacin de la casena. El tornasol incorporado a la leche es un indicador de pH y de oxidacinreduccin que hace que el medio pueda indicar diversas funciones metablicas. La leche contiene lactosa, casena, lactalbumina y lactoglobulina, por lo tanto un organismo puede mostrar una o varias propiedades metablicas en la leche tornasolada ayudando as a la identificacin bacteriana.

a) Fermentacin de lactosa, produce cido lctico por lo que cambia el medio a color rojo-rosado. b) Reduccin del tornasol c) Formacin de cogulo, la enzima responsable es la renina d) Peptonizacin (digestin), es la hidrolisis de la casena produciendo un precipitado lquido claro. e) Formacin de gas, se produce CO2 y H2 por la fermentacin de la lactosa. Medio y reactivo 1. Medio pH=6.8 Leche decremadea Agua destilada 2. Reactivo Indicador de pH tornasol Color rojo(pH=4.5) Color azul(pH=8.3) Azul purpureo(pH=6.8) Inocula por difusin con punta, e incubar de 18-48 horas a una temperatura de 35 a 37C.Este test nos arroja como resultado: Fermentacin de lactosa: vira a un rojo-rosa, por la presencia de acido No hay fermentacin de lactosa: vira a azul purpureo sin cambio a indicador de pH Ausencia de fermentacin de lactosa: vira a azul ya que el organismo ataca las sustancias nitrogenadas que se encuentran en el medio. Leucobase: no genera un color blanco tras la reduccin del tornasol. Coagulacin de la protenas Cuando el medio se aclara: debido a la digestin de la protena. Produccin de gas.

PRUEBA DE LICUEFACCION DE GELATINA

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo proteoltico (gelatinasas) que licuan la gelatina. Las protenas que se producen naturalmente son demasiado grandes para entrar en una clula bacteriana; por lo tanto, para que una clula utilice las protenas, primero deben ser catabolizadas en componentes ms pequeos. Las enzimas exonucleares de tipo proteltico, gelatinasas, son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las protenas y esta capacidad ayuda a la identificacin bacteriana. Medio y reactivo a) Medio Extracto de carne Peptona Gelatina Agua destilada

Picadura en posicin vertical hasta una profundidad de 2 -2.5 cm, inculo denso. Condiciones de incubacin: Tiempo: 18 - 24 horas a una temperatura de 35- 37 Al trmino de la incubacin se coloca el tubo en un refrigerador o bao de hielo durante dos horas para determinar si se ha producido o no la digestin de la gelatina (licuefaccin). El medio de gelatina nutritiva para puncion no es conveniente para las puebas de rutina de la actividad de la gelatinasa dado que muchas especies requieren incubacin prolongada antes de que aparezcan muestras de licuefaccin. En los mtodos diagnsticos de rutina para identificar bacterias, la duracin de la incubacin deber alcanzar un periodo razonable. La interpretacin de resultados se da mediante Positivos: medio licuado( en estado liquido) Negativo: medio solido.

tinciones

Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente. Las tinciones ocupan la preparacin de un frotis, el cual se preparade la siguiente manera. a) Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua, que resulta suficiente. b) Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones aspticas, una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. c) Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el porta a la llama del mechero (fijar). En este caso hay que tener mucha precaucin de no calentar demasiado nuestro portaobjetos pues las clulas pueden deformarse o romperse. Para la fijacin de nuestro frotis se puede hacer: Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el portaobjetos entre los pases. Con metanol (para microorganismos procedentes de medio lquido). Aadir unas gotas de metanol sobre la extensin completamente seca. Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore completamente. Segn la modalidad a implementar se manipularemos la muestra y de esta manera hablaremos de diferentes tinciones. Tincin simple Tincin diferencial

Tincin simple:

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no acta sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduras uniformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos. Tincin diferencial Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin qumica. Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen. Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tincin. Este proceso sigue la siguiente metodologa. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tincin concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos. En ocasiones el colorante tie slo en caliente, por lo que el tiempo que dure su actuacin se deber sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no llegue a hervir ya que se producira la destruccin de las clulas. Lavar la preparacin con agua para eliminar el colorante. Esta operacin se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre l, pues podra arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la mxima cantidad de agua de los portaobjetos golpendolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo. Secar el portaobjetos presionando entre dos papeles de filtro, pero en ningn caso se debe frotar el portaobjetos. Observar la preparacin al microscopio llegando hasta el mximo aumento. Si se quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersin. Tincin de GRAM

La tincin de GRAM es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se basan justamente en la tincin de GRAM. Los reactivos para tincin GRAM son: Cristal violeta o violeta de genciana Lugol de Gram Alcohol- acetona Fuscina(safranina)

El cristal violeta sirve como colorante bsico unindose a la pared celular bacteriana, con la ayuda del lugol de gran el cual refuerza la unin del colorante. Las bacterias Gram positivas debido a la estructura composicin bioqumica de su pared celular retiene el complejo cristal violeta-lugol y aun despus del tratamiento con el decolorante conserva el colorante bsico, por lo que se observa al microscopio de color azul oscuro o violeta una vez concluida la tcnica de tincin. Las bacterias gram negativas pierden el colorante bsico cuando son tratadas con el alcohol-cetona, debido a que el alcohol disuelve el contenido lpidico de la pared celular lo que permite la permeabilidad celular, dando como resultado la perdida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias decoloradas captan entonces la fuscina (safranina), razn por la cual estas clulas bacterianas se observan al microscopio de color rosado una vez concluida la tcnica de tincin. La tcnica para esta tincin es: a) Marcar y realizar un extendido delgado de la muestra clnica de una colonia sobre un portaobjetos y dejar secar b) Fijar el materia a la placa pasndola 2 o 3 veces por la llama de un mechero evitando el excesivo calentamiento. c) Colocar la placa sobre un soporte y cubrirla con cristal violeta durante un minuto d) Lavar con agua corriente e) Cubrir la placa con el lugol de Gram durante 5 minutos f) Lavar con agua corriente g) Cubrir la placa con alcohol-acetona durante 5 minutos h) Lavar con agua corriente i) Cubrir la placa con fuscina(safranina) durante 1 minuto j) Lavar con agua corriente k) Dejar secar al aire l) Observar al microscopio con aceite de inmersin, objetivo 100x, condensador abierto totalmente para que la luz pase y se obtenga buena iluminacin.

Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas. 2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 3) Cultivos ms viejo de 24 horas puede perder su habilidad de retener el complejo cristalvioleta-yodo. El carcter de gram positivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son ms gram positivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces gram positivos y otras gram negativos.

RODAMINA-AURAMINA

Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos, auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos cido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes. Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten la diferenciacin morfolgica.

NARANJA DE

ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al cido ncleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin. El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tincin de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la deteccin inicial de hemocultivos positivos.

ZIEHL(BAAR) Las celulares

NEELSEN

de

paredes ciertos

parsitos y bacterias. contiene cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistente. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Se ha desarrollado una coloracin de cido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen cidos-grasos de unos 50 tomos de carbono), de los actinomicetos (muy semejantes pero no cido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla cido-alcohol estndar pero no por un tratamiento ms suave con cido sulfrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan cido-alcohol resistentes parciales o dbiles. El frotis se tie durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de HCl concentrado. Lavar y teir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar.

BLANCO

DE

CALCOFLOR Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescentes con luz blanco-azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.

Identificacin de levaduras La taxonoma y eptetos binomiales son decididos por consenso, pero cuando existen desacuerdos para nombrar un miroorganismo, esto sucede ya que muchas veces los teleomorfo de una levadura no es evidente, haciendo mas apropiado el nombre por su fase anamorfica. En el laboratorio de microbiologa identificar levaduras tiene una gran significancia clnica. Para lo cual se dispone de multiples sistemas bioqumicos rapidos; y tambin se deben seguir realizando sencillas pruebas que son utiles en la identificacin de tales, como: Tubo germinativo Susceptibilidad a la cicloheximida Produccin de ureasa Desarrollo de la pelcula Desarrollo a 42C

Tubo germinativo

Permite diferenciar las especies de Candida albicans de las no albicans. Es un hongo que est presente en todos nosotros. Se encuentra en las membranas superficiales y en las mucosas. En cantidades pequeas es indemne pero cuando su crecimiento aumenta drsticamente puede estar devastando su salud. Es considerada una de las enfermedades todava no-reconocidas que ms prevalece del hombre moderno. La Candida se alimenta de azcar, hidratos de carbono, comidas fermentadas como la cerveza, el vinagre y los embutidos. El hongo Candida suelta toxinas en el torrente sanguneo que tiene un efecto devastador en el sistema nervioso y el sistema inmune. Medio y reactivo a) Suero humano o de conejo 0.5ml Suspender un inoculo de la cepa pura de candida con 24 horas de desarrollo en suero de conejo o humano, incubar a 35-37 C de 2 horas. Colocar 2 3 gotas de la suspensin en una lamina de portaobjetos y cubrir con lamina cubreobjetos, observar al microscopio con objetivo de 40x. Las interpretaciones que esta prueba nos arroja son (esta prueba usa una cepa control en paralelo para estudio): Control positivo: C. albicans. Control negativo: C. glabrata

Susceptibilidad a la cicloheximida

La cicloheximida es un inhibidor de la sntesis proteica en organismos eucariotas, y se produce en la bacteria Streptomyces griseus .Esta acta interfiriendo en la actividad de la peptidil transferasa del ribosoma 60S, bloqueando la elongacin traduccional. Esta prueba permite distinguir a aquellas levaduras que son resistentes o sensibles a la cicloheximida o actidione. Medio y reactivo a) Agar micosel: Permite distinguir la susceptibilidad a la cicloheximida o actidione. Seguir las indicaciones proporcionadas por el fabricante. Autoclavar a 121 C por 15 minutos. Dispensar en tubo de vidrio estril y colocar en forma de plano inclinado. Almacenar a 4 La cepa se subcultiva sobre el agar micosel y se incuba a temperatura ambiente por tres das. El resultado se leer: Cepas que se desarrollen sobre el medio de cultivo se considerarn como resistentes.

- a la resistencia de cicloheximida

+ a la resistencia de cicloheximida Bibliografa

http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Manual%20Hongos.pdf http://es.scribd.com/doc/5203044/Medios-de-Cultivo-y-Pruebas-Bioquimicas http://perso.wanadoo.es/microdominguez/a.htm http://www.slideshare.net/morgax/morfologa-bacteriana http://www.britanialab.com.ar http://web.clark.edu/tkibota/240/Unknowns/TSI.htm http://imb.usal.es/Practicas2/P2/Practicas2.pdf

Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica; por Jean F. Mac Faddin; Edt Panamericana. 3er edicin.